JP6660654B2 - コラーゲンの収率を高める方法、及びこれを用いて製造されたコラーゲン - Google Patents

Description

本発明の実施例は、コラーゲンの収率を高める方法、及びこれを用いて製造されたコラーゲンに関し、より詳細には、動物由来組織に放射線を照射して菌とエンドトキシンを除去することにより、保存性を高めるとともにコラーゲンの変性なしに収率を高めることができるようにしたものであって、コラーゲンの品質及び信頼性を大幅に向上させるので、ユーザーの多様なニーズを満たして良いイメージを植え付けることができるようにしたものである。

周知の如く、コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）とは、哺乳類と鳥類を含む様々な動物の皮膚・骨・軟骨などの組織及び魚類の鱗などを構成する硬タンパク質であって、現在２０種以上の種類が知られており、コラーゲンＩ型が組織の大部分を占めている。

このようなコラーゲンは、動物の組織から酵素分離法、有機溶媒分離法、酸・アルカリ・中性分離法などにより抽出及び精製工程を経て得られる。

コラーゲンの収率を増加させるための方法が研究されているが、現在のところでは分離工程期間の増加または特定の化学物質の混合なしで収率を高めることは難しい。

コラーゲンは、現在、産業的に医薬分野、食品分野、化粧品分野などで様々な形に加工されて利用されており、特に生体適合性及び組織親和性に優れるうえ、生体内で完全に分解された後に吸収される特徴によって医薬分野で大きく脚光を浴びている。

医療用の目的でコラーゲンを利用するために、ウイルスや細菌などを含む各種生物学的汚染源に対する安全性が確保されなければならない。

汚染源を除去するための滅菌方式としては、加熱処理（湿式、乾式）、化学的溶媒処理及び放射線処理などがある。

これらの方法は、滅菌される物質の特性変化または毒性を誘発することが可能な残留物を発生し、使用目的に適していない形にコラーゲンを変性させる可能性があるという問題点が生じた。

上述した問題点を解決するために、従来では下記の先行技術文献の技術が提案されたが、これらの技術も、依然として、前述した従来技術の問題点を一挙に解決することができないという大きな問題点があった。

韓国登録特許公報第０８３７８５８号（２００８年６月５日登録） 韓国公開特許公報第２０１２−００８４１８９号（２０１２年７月２７日公開） 韓国公開特許公報第２０１４−０１１８７５３号（２０１４年１０月８日公開）

そこで、本発明は、上述したような従来技術の諸般問題点を解消するためになされたもので、その第１目的は、動物由来組織に対して放射線照射、滅菌、洗浄、粉砕、分離及び抽出を行い、これに加えて、塩を除去してコラーゲンの収率を高めることができるようにした、コラーゲンの収率を高める方法及びこれを用いて製造されたコラーゲンを提供することにある。

上述した技術的構成による本発明の第２目的は、動物由来組織に放射線を照射して菌及びエンドトキシンを除去することにより、保存性を高めることができるようにした、コラーゲンの収率を高める方法及びこれを用いて製造されたコラーゲンを提供することにある。

本発明の第３目的は、コラーゲンの変性なしに収率を高めることができるようにした、コラーゲンの収率を高める方法及びこれを用いて製造されたコラーゲンを提供することにある。

本発明の第４目的は、組織の滅菌とコラーゲン収得の増加とが一つの工程によって行われるため、産業的に簡便であり、無駄なエネルギー消費を減らして経済性を持つようにした、コラーゲンの収率を高める方法及びこれを用いて製造されたコラーゲンを提供することにある。

本発明の第５目的は、環境にやさしくて産業利用可能性が高い放射線を利用した動物由来組織の滅菌及びコラーゲン収率の向上を図ることができるようにした、コラーゲンの収率を高める方法及びこれを用いて製造されたコラーゲンを提供することにある。

本発明の第６目的は、コラーゲンの品質及び信頼性を大幅に向上させるので、ユーザーの多様なニーズを満たして良いイメージを植え付けることができるようにした、コラーゲンの収率を高める方法及びこれを用いて製造されたコラーゲンを提供することにある。

上記の目的を達成するために、本発明は、コラーゲンの変性なしに放射線照射によって動物由来組織を滅菌し且つコラーゲンの収率を増加させるために：動物由来組織に放射線を照射して滅菌する段階と、前記滅菌された動物由来組織を洗浄及び粉砕する段階と、前記粉砕された組織を酸性または酵素溶液と反応させてコラーゲンを分離する段階と、その後、塩を添加してコラーゲンを抽出する段階と、前記分離されたコラーゲンから塩を除去する段階とを含んでなることを特徴とする、コラーゲンの収率を高める方法を提供する。また、本発明は、上述した方法を用いて製造されたコラーゲンを提供する。

上述したように、本発明は、動物由来組織に対して放射線照射、滅菌、洗浄、粉砕、分離及び抽出を行い、これに加えて、塩を除去してコラーゲンの収率を高めることができるようにしたものである。

上述した技術的構成による本発明は、動物由来組織に放射線を照射して菌とエンドトキシンを除去することにより、保存性を高めることができるようにしたものである。

また、本発明は、コラーゲンの変性なしに収率を高めることができるようにしたものである。

また、本発明は、組織の滅菌とコラーゲン収得の増加とが一つの工程によって行われる
ため、産業的に簡便であり、無駄なエネルギー消費を減らして経済性を持つようにしたものである。

また、本発明は、環境にやさしくて産業的利用可能性が高い放射線を用いた動物由来組織の滅菌及びコラーゲン収率の向上を図ることができるようにしたものである。

本発明は、上述した効果によってコラーゲンの品質及び信頼性を大幅に向上させるので、ユーザーの多様なニーズを満たして良いイメージを植え付けることができるようにした非常に有用な発明である。

以下、このような効果を達成するための本発明の好適な実施形態を添付図面に基づいて詳細に説明する。

本発明に係る放射線の照射により滅菌された動物由来組織からコラーゲンを分離する方法の一実施形態による工程図である。 本発明によって長期保存のために密封の後にガンマ線が照射された動物由来組織の図面代用写真である。 本発明によって豚皮膚組織にガンマ線を照射した後、細菌及び真菌の滅菌程度を示す図表である。 本発明によってカモの水掻き皮膚組織にガンマ線を照射した後、細菌及び真菌の滅菌程度を示す図表である。 本発明によってガンマ線の照射量を異ならせて酸処理方式によって分離されたコラーゲンの収率を示すグラフである。 本発明によってガンマ線の照射量を異ならせて酸処理方式によって分離した後、凍結乾燥させたコラーゲンの図面代用写真である。 本発明によってガンマ線の照射量を異ならせて酸処理方式によって分離されたコラーゲンをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した図面代用写真である。

本発明は、図１乃至図７に示すように構成される。
本発明を説明するにあたり、関連した公知の機能または構成に関する具体的な説明が本発明の要旨を無駄に曖昧にするおそれがあると判断される場合には、その詳細な説明は省略する。

そして、後述される用語は、本発明における機能を考慮して設定された用語であって、生産者の意図または慣例によって異なるので、その定義は本明細書全般にわたった内容に基づいて下されるべきである。

また、図面で示された各構成の大きさ及び厚さは説明の便宜のために任意に示したため、本発明は必ずしも図示の内容に限定されない。

まず、本発明は、コラーゲンの変性なしに放射線照射によって動物由来組織を滅菌し且つコラーゲンの収率を増加させるために、動物由来組織に放射線を照射して滅菌する段階を経る。

その後、前記滅菌された動物由来組織を洗浄及び粉砕する段階を経る。

このとき、前記放射線が照射された動物由来組織は蒸留水とエタノールを用いて２〜６時間洗浄することが好ましいが、この洗浄は原料の外部に付いている異物を除去する工程
である。蒸留水は特に血液、菌を含むその他の異物を洗浄するためのものであり、エタノールは脂肪を洗浄するためのものである。

次いで、前記粉砕された組織を酸性または酵素溶液と反応させてコラーゲンを分離する段階を経る。

その後、塩を添加してコラーゲンを抽出する段階を経る。

続いて、分離されたコラーゲンから塩を除去する段階を経て、コラーゲンの収率を高める方法を提供する。

特に、本発明に適用された前記動物由来組織は、哺乳類、鳥類及び魚類の中から選ばれたいずれかを含む。

前記放射線は、ガンマ線または電子線を使用することが好ましい。

このとき、前記放射線は、５ｋＧｙ〜４０ｋＧｙの照射線量を照射することが好ましい。

この際、５ｋＧｙ未満の放射線では滅菌効果を示すことができず、４０ｋＧｙ超過の放射線が照射されると、組織、特にコラーゲンの変性をもたらすので、前記放射線は５ｋＧｙ〜４０ｋＧｙの照射線量を照射することが好ましい。

前記放射線の線量率は２．７〜３．７ｋＧｙ／ｈｒを基準にして線量（線量率×時間）を調整することが好ましい。

また、前記粉砕された組織の粒子サイズは０．１〜５．０ｍｍであることが好ましい。このとき、前記粒子サイズを０．１ｍｍ未満にするためには、粉砕工程が長くなり且つ熱が大量に発生する可能性があり、さらに、コラーゲンの変性をもたらすおそれがあるので、前記粒子サイズは０．１ｍｍ以上であることが好ましく、粒子サイズが５．０ｍｍ超過である場合、酵素または酸によって組織が分解されるために露出する部位が減少して（表面積の減少）コラーゲン分離収率が低くなるので、前記粉砕された組織の粒子サイズは５．０ｍｍ以下であることが好ましい。

また、前記粉砕された組織の粒子は、粉砕された組織の重量に対して５０倍の酸性溶液（ｐＨ１．５〜３．５）に組織を混合して３〜７日間撹拌することが好ましい。

このとき、前記５０倍の酸性溶液を加える理由は、組織からコラーゲンを最も効率のよい収率で分離することができるためであり、ｐＨが１．５〜３．５である理由は、酸性条件で活性を有する酵素を使用するためである。その上、酸性溶液によって組織が軟化し、軟化した組織からコラーゲンを分離することができるためである。攪拌時間が３〜７日である理由は、攪拌時間を３日未満にするとコラーゲンの収率が低くなり、攪拌時間を７日超過にしても収率が増加しないためであり、つまり、最適のコラーゲン分離収率を得るためである。

また、前記酸性溶液は、リン酸、塩酸、クエン酸、ギ酸及び酢酸の水溶液から選ばれたいずれか一つを使用することが好ましい。

一方、前記酵素溶液は、ペプシン、パパイン及びトリプシンの水溶液から選ばれたいずれかを使用することが好ましい。

前記添加された塩の最終濃度は０．６〜１．０Ｍであることが好ましい。

これは、コラーゲンを選択的に分離するための塩濃度の範囲であって、すなわち、コラーゲンの分子量（１００〜３００ｋＤａ）に該当するタンパク質を選択的に分離するための塩濃度である。

一方、本発明は、上述の構成部を適用するにあたり、様々に変形を加えることができ、様々な形態を取ることができる。

本発明は、上述の詳細な説明に記載される特別な形態に限定されるものではないと理解されるべきであり、添付された請求の範囲によって定義される本発明の精神と範囲内にあるあらゆる変形物、均等物及び代替物を含むものと理解されるべきである。

以下、前述のように構成された本発明に係るコラーゲンの収率を高める方法、及びこれを用いて製造されたコラーゲンの作用効果について説明する。

まず、本発明は、動物由来組織に放射線を照射して菌とエンドトキシンを除去することにより、保存性を高めるとともに、コラーゲンの変性なしに収率を高めることができるようにしたものである。

このため、本発明は、従来の方法の問題点を補完してコラーゲンの変性を起こさず、動物由来組織の滅菌とコラーゲン収率の増加とが同時に行われる工程であって、経済的で環境にやさしく、産業的利用可能性が高い放射線を用いた動物由来組織の滅菌及びコラーゲン収率の増加方法に関する。

本発明において、コラーゲンとは、各種動物の組織に対して酸またはアルカリ処理を施すか或いはペプシンなどの酵素処理を施して抽出されるタンパク質のことをいう。
以下、添付図面を参照して本発明の実施形態を説明する。

図１は本発明に係る放射線の照射により滅菌された動物由来組織からコラーゲンを分離する方法の一実施形態による工程図である。これを参照して、放射線を照射したコラーゲンの収得方法を説明すると、次のとおりである。

本発明のコラーゲンは、
１）動物由来組織に放射線を照射して滅菌する段階、
２）前記滅菌された動物由来組織を洗浄及び粉砕する段階、
３）前記粉砕された組織を酸性または酵素溶液と反応させてコラーゲンを分離する段階、
４）塩を添加してコラーゲンを抽出する段階、及び
５）分離されたコラーゲンから塩を除去する段階
によって製造される。

本発明の方法を段階的に詳細に説明すると、次のとおりである。
まず、動物由来組織に５〜４０ｋＧｙの放射線を照射し、好ましくは５〜２５ｋＧｙの放射線を照射する。このとき、放射線の線量率は、２．７〜３．７ｋＧｙ／ｈｒを基準にして線量（線量率×時間）を調整する。

利用可能な動物由来組織は、哺乳類、鳥類、魚類などの様々な組織を含む。

放射線が照射された動物由来組織は、蒸留水と７０％のエタノールを用いて２〜６時間洗浄し、好ましくは３〜５時間洗浄する。

洗浄された動物由来組織は、０．１〜５．０ｍｍの大きさに粉砕し、好ましくは０．５〜３．０ｍｍの大きさに粉砕する。

粉砕された組織の重量に対して、５０倍の酸性溶液（ｐＨ１．５〜３．５）に組織を混合して３〜７日間撹拌し、好ましくはｐＨ２．０〜２．５の酸性溶液に組織を混合して４〜５日間攪拌する。

このとき、酸性溶液の製造のためにリン酸、塩酸、クエン酸、ギ酸及び酢酸などが使用可能であり、コラーゲンを分離する方式に応じて、アルカリ溶液或いはタンパク質分解酵素（ペプシン、パパイン及びトリプシンなど）を使用することができる。

コラーゲンを抽出するために、最終の塩濃度が０．６〜１．０ＭとなるようにＮａＣｌを添加し、好ましくは０．７〜０．９ＭのＮａＣｌを添加する。

抽出されたコラーゲンから塩を除去するために、コラーゲンの重量に対して、５〜２０倍の蒸留水を添加して限外濾過を行い、好ましくは１０〜１５倍の蒸留水を添加して限外濾過を行う。

塩を除去するために、コラーゲン溶液を中性化した後、遠心分離する方式が代替適用できる。

図２は本発明によって長期保存のために密封の後にガンマ線が照射された動物由来組織の図面代用写真である。

図３は、本発明によって豚皮膚組織にガンマ線を照射した後、細菌及び真菌の滅菌程度を示す図表であり、図４は、本発明によってカモの水掻き皮膚組織にガンマ線を照射した後、細菌及び真菌の滅菌程度を示す図表である。

上述したような放射線照射によって滅菌された動物由来組織を得ることができ、これを下記の［実施例１］によって調べてみる。

［実施例１］
蒸留水によって洗浄された豚皮膚組織またはカモの水掻き組織にそれぞれ０、５、１５、２５ｋＧｙのガンマ線を照射する。

ガンマ線照射済みの組織を取り、検体１ｇあたり等張緩衝溶液１ｍＬを入れて攪拌混合した後、これを細菌及び真菌培養固体培地に１ｍＬ塗布する。

細菌の場合は３０〜３５℃で２日間培養して総細菌数を測定し、真菌の場合は２０〜２５℃で５日間培養して総真菌数を測定する。

豚皮膚組織は、５ｋＧｙ以上のガンマ線が照射される場合、細菌及び真菌の両方が滅菌されることを確認し、カモの水掻き組織は、１５ｋＧｙ以上のガンマ線が照射される場合、細菌及び真菌の両方が滅菌されることを確認した。

図５は本発明によってガンマ線の照射量を異ならせて酸処理方式によって分離されたコラーゲンの収率を示すグラフであり、図６は本発明によってガンマ線の照射量を異ならせ
て酸処理方式によって分離した後、凍結乾燥させたコラーゲンの図面代用写真である。

前述したような製造工程によって動物由来組織からコラーゲンを分離することができ、これを下記の［実施例２］によって調べてみる。

［実施例２］
蒸留水によって洗浄されたカモの水掻き組織にそれぞれ０、５、１５、２５ｋＧｙのガンマ線を照射する。

放射線が照射されたカモの水掻き組織は、蒸留水で３回洗浄した後、重量に対して５倍以上の７０％エタノールに浸漬して攪拌する方式で洗浄する。

洗浄されたカモの水掻き組織を０．５〜３．０ｍｍの大きさに粉砕した後、粉砕された組織の重量に対して５０倍の酸性溶液（ｐＨ２．０）に混合して５日間撹拌する。

５日後にカモの水掻き組織が分解された酸性溶液からコラーゲンを抽出するために、最終の塩濃度が０．９ＭとなるようにＮａＣｌを添加する。

抽出されたコラーゲン体積の５倍に相当する蒸留水を入れて再溶解することで、コラーゲン溶液を製造する。

コラーゲン溶液から塩を除去するために、溶液のｐＨを７．０に調整した後、遠心分離する方式を用いてコラーゲンを得る。

得られたコラーゲンの収率（％）は、次の数式によって計算された。

Ｙ：得られたコラーゲンの収率（％）
ｘ：放射線照射線量（ｋＧｙ）

その結果、１５ｋＧｙのガンマ線が照射されたカモの水掻き組織から分離されるコラーゲンの収率は１１８．３±３．９％であり、２５ｋＧｙのガンマ線が照射されたカモの水掻き組織から分離されるコラーゲンの収率は１４３．２±３．８％であった。

また、図６に示すように、分離されたコラーゲンを凍結乾燥させた結果、肉眼で区分できるほどに分離収率が著しく増加した。

図７は本発明によってガンマ線の照射量を異ならせて酸処理方式によって分離されたコラーゲンをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した図面代用写真である。

上述したような製造工程によって動物由来組織から分離されたコラーゲンは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析法によってタンパク質分子の変性有無を確認することができ、これを下記の
［実施例３］によって調べてみる。

［実施例３］
それぞれ０、５、１５、２５ｋＧｙのガンマ線が照射されたカモの水掻き組織から分離
したコラーゲンは、蒸留水を用いて１０ｍｇ／ｍｌに希釈された。

希釈されたコラーゲン溶液は、５×サンプルローディングバッファー（０．３Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、０．１％ブロモフェノールブルー（Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ ｂｌｕｅ）、１０．０％ＳＤＳ、５０．０％グリセロール（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）、１２．５％β−メルカプトエタノール（Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）と混合した後、１００℃で３分間加熱した。

製造された試料は、１０．０％ポリアクリルアミドゲルのｗｅｌｌあたり１５μＬずつロードし、１００Ｖで１１０分間電気泳動した。

電気泳動済みのゲルは、０．３％（ｗ／ｖ）クマシーブリリアントブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｂｌｕｅ）−Ｒ２５０を用いて染色し、脱染色試薬（５０．０％精製水、４０．０％メタノール、１０．０％酢酸）を用いてバックグラウンドを脱色した後、分析した。

その結果、図７に示すように、ガンマ線が照射されたすべてのサンプルからコラーゲンＩ型の特性を代表するα_１、α_２、β鎖を確認したとともに、０〜２５ｋＧｙのガンマ線照射量の範囲内でコラーゲンの変性が起こらないことを確認した。

本発明に係るコラーゲンの収率を高める方法、及びこれを用いて製造されたコラーゲンの技術的思想は、実際に同じ結果を繰り返し実施可能なものであり、特にこのような本発明を実施することにより、技術発展を促進して産業の発展に貢献することができるため、保護する価値が十分である。

Claims (1)

1. コラーゲンの変性なしに放射線照射によって動物由来組織を滅菌し且つコラーゲンの収率を増加させるために：
   哺乳類、鳥類及び魚類の中から選ばれたいずれかを含む動物由来組織に５ｋＧｙ〜４０ｋＧｙの照射線量の放射線を照射して滅菌する段階と、
   前記滅菌された動物由来組織を、蒸留水とエタノールを用いて２〜６時間洗浄する段階及び粉砕する段階と、
   前記粉砕された組織の粒子を、粉砕された組織の重量に対して５０倍のリン酸又は塩酸水溶液の中から選ばれたいずれかの酸性溶液（ｐＨ１．５〜３．５）に混合して３〜７日間撹拌し、前記粉砕された組織を前記酸性溶液と反応させてコラーゲンを分離する段階と、
   その後、塩を最終濃度が０．６〜１．０Ｍとなるように添加してコラーゲンを抽出する段階と、
   前記分離されたコラーゲンから塩を除去するために限外濾過を行うか、又はコラーゲン溶液を中性化した後、遠心分離する段階とを含んでなることを特徴とする、コラーゲンの収率を高める方法。