CN1232264C - 低温超声波高压蛋白裂解法制取羊胎盘生物制剂的技术 - Google Patents
低温超声波高压蛋白裂解法制取羊胎盘生物制剂的技术 Download PDFInfo
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Abstract
一种低温超声波高压蛋白裂解法制取羊胎盘生物制剂的技术，该技术的生产加工过程是在GMP条件下进行，其工艺流程如下：胎盘预处理→胎盘变性→分散→裂解并超细分离→检验→成品。其中：胎盘预处理包括分离胎盘绒毛膜等，去除脂肪和结缔组织；清洗；溶血；绞碎成碎块。胎盘变性过程是按重量比1∶3称取胎盘和胎盘改性液(浓度0.2%)，置于容器内24小时，使之变性；之后更换改性液重复上述改性过程2次。分散过程是取出改性后的胎盘加4倍蒸馏水清洗后，置于全密闭的分散器中进行分散。分散过程不短于3个月。用低温高速涡旋粉碎器裂解并超细分离，将胎盘中的重金属分离出去，变成高分散性水乳剂。经过裂解与超细分离后即得产品。工艺简单，成本低，质量好。
Description
<一>技术领域：
本发明一种低温超声波高压蛋白裂解法制取羊胎盘生物制剂的技术，属于生物制剂的技术领域。
<二>背景技术：
我国具有应用动物药物的悠久历史，远在4000年前的甲骨文就记载有40多种动物入药。明朝李时针的《本草纲目》中收录440种，《中国药用动物志》收载了1500多种，这些药物均以动物性中药出现，动物胎盘是最常用的一种。
我国现阶段的生物药物也是从动物药物开始发展起来的，从20世纪50年代后期，我国陆续开展了动物药物的研究与生产，其中关于胰岛素和脑啡肽的研究均取得了重大进展。至1985年我国已能生产200多个种类的生化药物，以酶、辅酶、多肽激素及蛋白质、核酸及其降解物、氨基酸类、脂类等药物为主。
由于生物药物在提高免疫力、疾病预防与治疗方面具有其他药物不可替代的特点，进入20世纪90年代以后，生物药物引起更加广泛的重视，特别是现代生物技术在生物药物的研究与开发中的应用，使生物药物的发展走向了一个新纪元。
羊胎盘中含有多种具有生物活性的物质，这些成份在医疗、食品、化妆品和动物保健等行业中具有广泛的用途和奇特的功效，因而成为动物脏器制药中的一个热点。
目前，国内羊胎盘制剂与剂型主要有以下几种：
用于医学临床的：胎盘转移因子、羊胎盘注射液、口服羊胎精华素；
作为功能性食品的有：羊胎素口服液、羊胎肽胶囊；
作为化妆品原料的有：羊胎盘冻干粉、羊胎盘多肽。
现有技术状况：
羊胎盘冻干粉的技术工艺：目前，国内用于制备羊胎盘生物制剂的技术主要有物理制备法、生物酶解法、水解法等几种。
其中：
物理制备法主要用于羊胎盘冻干粉及冻干粉胶囊的制备，其工艺技术如下：胎盘预处理→剪碎→冷冻→低温粉碎→冻干→胶囊/包装
说明：
胎盘预处理：主要是在胎盘的清洁、去污的基础上，除去脂肪和结缔组织；
剪碎：用人工剪碎或机械方法破碎分离后的胎盘；
冷冻：-20℃条件下使胎盘碎块迅速冷冻，以便进行进一步粉碎；
低温粉碎：在4℃条件下，使胎盘碎块成粉末。
冻干：经50-55个小时制成冻干粉。
而生物酶解法和水解法主要用于多肽活性物质的制备：
生物酶解法：使用多种蛋白酶(如水解酶)把蛋白质降解，之后经过十分繁琐的生物化学过程进行进一步的分离或纯化。
水解法：包括碱法和酸法，主要原理是通过酸、碱处理控制pH，使蛋白质变性、降解或游离，最终达到分离、纯化的目的。
现有技术存在的问题：
物理制备法不能使大分子结构的蛋白质降解，因而无法分离胎盘中的有效成份，更不能进行纯分离纯化，故只能用于冻干粉这样的粗制产品的生产。其产品的吸收性差，生物利用率很低。
酶解法要求条件极高，分离过程繁琐冗长，中间产物过多，不易进行纯分离，而且，由于酶的继续作用，可导致部分活性物质的失活，且极易污染。通常多适用于实验室内制备，而真正用于规模化制备的较少。再者，使用酶解法生产的产量低，产成率＜5％，产品成本高。
水解法使用较多的是酸法，但不论是酸法还是碱法均可造成某些有效成份的损失，如酸解法可造成全部色氨酸、部分丝氨酸和酪氨酸的损失，而且劳动条件差，腐蚀性强，并产生大量废物；碱法可使氨基酸发生消旋作用，使苏氨酸、丝氨酸、精氨酸、胱氨酸等大部分失活。
水解法制备技术的产品出成率只有2-3％。
本发明一种低温超声波高压蛋白裂解法制取羊胎盘生物制剂的技术，其目的是：对现有的技术与方法存在的不足进行改良，充分利用丰富的羊胎盘资源，简化生产技术工艺，建立适用于产业化生产的技术；保持蛋白质降解物的活性，避免主要氨基酸的失活；降低生产成本，提高产品的生物利用率；除去产品中的激素和重金属成份。
<三>发明内容：
本发明一种低温超声波高压蛋白裂解法制取羊胎盘生物制剂的技术，该技术的工艺流程如下：
胎盘预处理→胎盘变性→分散→裂解并超细分离→检验→成品
其中：
胎盘预处理：主要包括(1)分离胎盘绒毛膜、尿囊膜和脐带，去除脂肪和结缔组织；(2)清洗；(3)溶血：使用去离子水进行溶血；(4)绞碎：用人工剪碎或绞碎机剪成碎块。
胎盘变性过程：按比例(1∶3重量比)称取胎盘和胎盘改性液(浓度0.2％)，置于容器内24小时，使之变性；之后更换改性液重复上述改性过程2次(共3次)。变性过程使胎盘蛋白质的非共价键和二硫键破坏，从而导致蛋白质三级结构的破坏，但不影响其肽键的完整性。
改性液的制备：按66∶66∶132(重量比)的比例分别称取氯酸钾、氯化钠和33％的硝酸，依次加入烧瓶中。反应所放出的气体通过导管导入另一装有22升蒸馏水的瓶中，经吸收后制成改性液。其化学反应式为：
分散过程：取出改性后的胎盘加4倍蒸馏水清洗后，置于全密闭的分散器中进行分散。分散过程不短于3个月，在此期间发生了一系列复杂的生物化学反应，是产生活性(营养)成份的重要基础。
分散原理：分散过程的化学机理就是蛋白质的水化拉伸作用，这种作用的明显与否取决于蛋白质分子的静电特性和空间结构特性。在一定的条件下，如酸碱度(pH值)偏酸时，羧基是不带电的，而碱基带有正电荷，可与氢离子发生排斥作用，这时丝氨酸、苏氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸与多肽间的肽键被明显拉伸，这是因为某些功能基团(如羧基)的分子内催化作用，导致分子内质子转移，即从未电离的羧基转移至氨基上。
裂解并超细分离：
裂解过程：分散后的胎盘物质用低温高速涡旋粉碎器(4℃，18000转/分)裂解，每次60分钟，共进行3次。最终使成高分散性水乳剂。
裂解原理：在低温条件下(4℃)，高速涡旋粉碎机产生机械和超声波2种破碎功能，使胎盘组织变成纳米级微粒。
超细分离：该技术步骤同样发生在高速涡旋粉碎过程，高速旋转所产生的离心力可分离重金属，将胎盘物质中的重金属成份分离出去。
需要强调的是在整个工艺流程中始终贯彻灭菌原理，整个生产加工过程是在药品生产管理规范(GMP)条件下进行的(整体10万级，局部万级)，避免了原料的污染。
胎盘改性液可释放氯离子(Cl-)，后者对细菌、病毒等病原微生物具有确实的杀灭作用。这是生产过程的一级灭菌过程。
涡旋式粉碎机在高速旋转情况下可产生超声波，利用超声波不仅可以降解大分子，而且能有效地破坏病原微生物，这是二级灭菌。
此高速涡旋机能在局部产生5000～7000个大气压的局域冲击力，该局域冲击力对病原微生物具有物理性灭活作用。
经过裂解与超细分离工艺流程后即得产品，最后检验包装出厂。
该产品羊胎盘生物制剂在进行检验时，主要是检查产品的主要成份含量是否达到如下重量百分比要求：
多肽含量20～26.0％
核酸含量0.2％左右
己糖醛酸含量1.6～1.8％
磷含量0.2％左右
总氨基酸8.00mg/ml以上
其它含氮物11.7％
其中氨基酸共有19种，6种是必需氨基酸。
本发明一种低温超声波高压蛋白裂解法制取羊胎盘生物制剂的技术，其优点和特点是：大大简化了生产过程，降低了生产成本；三级灭菌过程贯穿于产品生产过程，消除了污染，确保产品质量，提高产品的产出率达50％；除去了激素和重金属成份；保证小分子产品的有效成份不失活。
<四>附图说明：
图1本发明工艺流程方框图。
<五>具体实施方式：
取新鲜或-20℃保鲜的羊胎盘10kg，分离绒毛膜、尿囊膜和脐带，称重。用清水洗净，按重量比(1∶7)加入去离子水进行溶血，溶血时间为24小时，之后剪成碎块。
按重量比(1∶3)混合胎盘与改性液(改性液的浓度为0.2％，v/v，制备方法见前述)进行变性。变性共进行3次，每次24小时。
用4倍的蒸馏水清洗变性胎盘，置于全封闭的容器内进行胎盘分散，时间不低于90天。
分散后的胎盘物质在高速涡旋粉碎器(4℃，18000转/分)中进行裂解与超细分离，每次裂解60分钟，共3次，每台裂解器一次裂解量不超过10kg。3次裂解后所得产品即为羊胎盘高效生物制剂。最后进行产品检验包装出厂。
Claims (5)
1.一种低温超声波高压蛋白裂解法制取羊胎盘生物制剂的方法，其特征在于：该方法的整个工艺流程中始终贯彻灭菌原理，整个生产加工过程是在药品生产管理规范条件下进行，该方法的工艺流程如下：
胎盘预处理→胎盘变性→分散→裂解并超细分离→检验→成品；
其中，该胎盘变性过程是：按1∶3的重量比称取胎盘和浓度为0.2％的胎盘改性液，置于容器内混匀后共置24小时，每隔4小时搅拌1次，使之变性；之后更换改性液重复上述改性过程2次；
其中，该裂解过程是：分散后的胎盘物质用低温高速涡旋粉碎器在4℃、18000转/分下裂解，每次60分钟，共进行3次，使胎盘物质变成纳米级微粒而成高分散性水乳剂；在裂解过程中同时进行超细分离，该技术步骤同样发生在高速涡旋粉碎过程，高速旋转所产生的离心力可将胎盘物质中的重金属成份分离出去。
2.根据权利要求1所述的一种低温超声波高压蛋白裂解法制取羊胎盘生物制剂的方法，其特征在于：该胎盘预处理主要包括：(1)分离胎盘绒毛膜、尿囊膜和脐带，去除脂肪和结缔组织；(2)清洗；(3)溶血：使用去离子水进行溶血；(4)绞碎：用人工剪碎或绞碎机剪成碎块。
3.根据权利要求1所述的一种低温超声波高压蛋白裂解法制取羊胎盘生物制剂的方法，其特征在于：该改性液的制备是：按重量比66∶66∶132的比例分别称取氯酸钾、氯化钠和33％的硝酸，依次加入烧瓶中；反应所放出的气体通过导管导入另一装有22升蒸馏水的瓶中，经吸收后制成改性液。
4.根据权利要求1所述的一种低温超声波高压蛋白裂解法制取羊胎盘生物制剂的方法，其特征在于：该分散过程是：取出改性后的胎盘加4倍蒸馏水清洗后，置于全密闭的分散器中进行分散。
5.根据权利要求1或4所述的一种低温超声波高压蛋白裂解法制取羊胎盘生物制剂的方法，其特征在于：该分散过程不短于3个月。
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