BR112017010619B1

BR112017010619B1 - processo para produzir colágeno de alta concentração para utilização como material médico

Info

Publication number: BR112017010619B1
Application number: BR112017010619-1A
Authority: BR
Inventors: Cheong Ho Chang; Hyeong Woo Jeong; Ji Chul Yoo; Se Ken Yeo; Dong Sam Suh
Original assignee: Sewoncellontech Co., Ltd.
Priority date: 2014-11-21
Filing date: 2014-12-11
Publication date: 2020-11-03
Also published as: KR101531479B1; AR099566A1; ES2791281T3; JP2017537692A; AU2014412124A1; HUE049757T2; EP3222299A4; US11292827B2; PT3222299T; US20170334969A1; WO2016080578A1; AU2014412124B2; BR112017010619A2; CN107155305A; JP6383877B2; EP3222299B1; EP3222299A1; CN107155305B; PL3222299T3

Abstract

A presente invenção se refere a um método de produção de colágeno de alta concentração para utilização como material médico, incluindo: lavagem de tecido de um mamífero; submeter o tecido lavado à trituração e imersão em álcool etílico; submeter o tecido a tratamento enzimático com agitação em água purificada contendo ácido fosfórico e pepsina; adicionar cloreto de sódio ao colágeno submetido a tratamento enzimático, realizar agitação e agregar o colágeno; dissolver o colágeno agregado em água purificada para dar uma solução de colágeno, a qual é então filtrada utilizando um filtro e concentrada por remoção da pepsina, material de baixo peso molecular e cloreto de sódio da solução de colágeno utilizando um dispositivo de filtração de fluxo tangencial; submeter o colágeno concentrado a filtração estéril, agregar o colágeno utilizando uma solução de pH num tanque de neutralização e concentrar o colágeno por remoção de uma solução não agregada; e concentrar o colágeno concentrado utilizando uma centrífga e agitando o colágeno concentrado utilizando um misturador.

Description

CAMPO TÉCNICO

[001] A presente invenção se refere a um processo de produção de colágeno de alta concentração adequado para utilização como material médico e, mais particularmente, a um processo de produção de colágeno de alta concentração, no qual o colágeno pode ser preparado a várias concentrações, de modo a ser adequado para utilização como material médico e, especialmente, o colágeno de alta concentração pode apresentar um desempenho superior para uma finalidade correspondente e pode ser facilmente armazenado em comparação com colágeno de baixa concentração. Além disso, a presente invenção permite melhorias na qualidade e confiabilidade dos produtos para satisfazer, assim, as diversas necessidades dos consumidores, que são os seus usuários, e, é por isso muito útil.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] O colágeno é uma proteína que está distribuída em vários tecidos dos animais e constitui cerca de 30% do seu peso proteico total.

[003] Tipicamente, o colágeno é uma proteína fibrosa, e é uma das proteínas que compõem a pele, ossos e tendões. É distribuído principalmente nos tecidos conjuntivos do corpo, e os corpos humanos contêm cerca de 20% de proteína, colágeno constituindo cerca de 30% do mesmo. O colágeno tem uma estrutura molecular de tripla hélice configurada, de tal modo que três cadeias polipeptidicas são enroladas uma em torno da outra e ligadas através de ligações de hidrogênio. O colágeno tendo tal estrutura desempenha um papel na exibição de adesão de células, suporte do corpo e dos órgãos, ativação das funções celulares, proliferação celular, hemostasia e imunidade e, além disso, o colágeno é responsável pelas funções orgânicas do corpo, enquanto formam o mesmo, e é assim uma proteína que é essencial para o corpo.

[004] O colágeno, graças as suas propriedades acima, é atualmente utilizado como material ou aditivo em vários campos, incluindo os de beleza, bebidas saudáveis, alimentos saudáveis, medicamentos e cosméticos, e as suas aplicações estão a expandir-se gradualmente em virtude das suas propriedades funcionais.

[005] Conforme descrito acima, para separar o colágeno do tecido após a coleta de ossos e couro de bovinos e suinos, o colágeno pode ser obtido como um material insolúvel, através de extração com um solvente orgânico, tratamento ácido / base e depois adição de tripsina e hialuronidase, mas o seu peso molecular é elevado e, portanto, é dificil de digerir e absorver no corpo humano, e o colágeno está diminuído em pureza devido a várias impurezas nela contidas, e o campo de utilização do mesmo é limitado, o que é indesejável.

[006] Aproximadamente 20 tipos de colágeno são atualmente conhecidos, entre os quais o colágeno de Tipo 1 é o mais abundante, está morfologicamente presente como um sólido fibroso e está configurado de tal forma que os polipeptideos de cadeia tripla são retorcidos através de ligação de hidrogênio, com um peso molecular de cerca de 300 kDa.

[007] O colágeno é dissolvido em um ácido diluido ou alcalino e pode, assim, ser preparado numa fase liquida, e a sua viscosidade aumenta com um aumento na sua concentração.

[008] O colágeno é adequado para bio-tecido e é um material biodegradável, e, assim é diversamente utilizado como um dos materiais médicos, tais como agentes de reparação de tecidos, enxertos de pele, enxertos de ossos e culturas de células.

[009] Entretanto, o colágeno extraído de vários materiais e preparado numa fase liquida é tipicamente filtrado, de modo a servir como material médico por remoção de impurezas e microorganismos a partir do mesmo.

[0010] Um processo de filtração tipico é realizado de uma maneira na qual a pressão e o fluxo de fluido sejam formados perpendicularmente um ao outro numa membrana de filtração, pelo que materiais são maiores do que o tamanho de poro da membrana de filtração são filtrados e são passados materiais pequenos. Durante tal processo de filtração, o alvo de filtração é passado imediatamente, enquanto o material que não é passado pode acumular-se na membrana de filtração. A eficiência de filtração pode diminuir com um aumento na quantidade de filtração, e a membrana de filtração fica finalmente obstruída. O processo de filtração tipico é dependente da capacidade do alvo de filtração e da área da membrana, e é limitado pelo fato da concentração de filtração ser baixa.

[0011] Assim, para filtrar um colágeno proteico polimérico, tem de ser preparado numa fase liquida de baixa concentração. No caso de filtração estéril para remoção de microrganismos, o colágeno tem de ser preparado em uma concentração de cerca de 5 mg / mL ou menos de modo a passar através de uma membrana de filtração com um tamanho de poro pequeno de 0,22 a 0,45 pm.

[0012] Quanto aos processos de concentração elevada da solução de colágeno preparada a baixa concentração, um processo típico de concentração de evaporação é problemático porque há preocupação com a degradação térmica do colágeno e é necessário um longo período de tempo para realizar o processo de fabrico e também, Um processo de concentração utilizando um solvente volátil é inadequado para a preparação de materiais médicos porque o solvente restante tem de ser adicionalmente removido.

[0013] [Lista de citação]

[0014] (Documento de Patente 1) Publicação de Pedido de Patente Japonesa No. 2001-200000, que divulga um método de produção de colágeno derivado do mar, em que o tecido da pele de um organismo marinho é limpo, o colágeno é extraído com um ácido orgânico, resultando o A solução é passada através de uma membrana de purificação para remover impurezas, e a solução, extraída usando uma protease, é sujeita a filtração usando uma membrana de purificação, um processo de concentração usando uma membrana de concentração e um processo de filtração estéril, produzindo, deste modo colágeno concentrado.

[0015] (Documento de Patente 2) Publicação de Pedido de Patente Coreana No. 2014-0091435, que descreve um método de preparação de colágeno compreendendo a realização de um processo de concentração utilizando um dispositivo de filtração de fluxo tangencial, concentrando o colágeno concentrado utilizando uma centrífuga e concentrando o colágeno concentrado Utilizando um liofilizador.

[0016] (Documento de Patente 3) Patente US No. 4,894,441, que descreve um método de preparação de colágeno compreendendo a extração de tecido biológico da pele de um animal utilizando um ácido orgânico, a adição do tecido extraído com cloreto de sódio para extrair o colágeno e a preparação de colágeno Através de filtração tangencial.

[0017] (Documento de Patente 4) Publicação de Pedido de Patente Japonesa No. 2011-201837, que descreve um método de preparação de um hidrolisado de colágeno utilizando uma membrana de fibra oca porosa tendo paredes tubulares formadas de uma mistura de um polimero hidrofóbico e um polimero hidrofilico.

[0018] (Documento de Patente 5) (Documento de Patente Internacional 5) descreve um método de preparação de uma proteína possuindo uma estrutura de tripla hélice compreendendo a concentração de colágeno utilizando um processo de filtração em fluxo cruzado e depois purificando o colágeno através de centrifugação.

DIVULGAÇÃO DA INVENÇÃO Problema técnico

[0019] A presente invenção foi feita tendo em mente os problemas encontrados no estado da técnica relacionados, e o colágeno, que é uma proteína com baixa antigenicidade e alta biodegradabilidade e biocompatibilidade, é extraído de vários tecidos animais e pode, assim, ser amplamente utilizado não só como um material médico para dispositivos médicos e medicamentos, mas também como um material para cosméticos ou alimentos.

[0020] Para utilizar o colágeno como um material médico, a sua segurança biológica tem de ser assegurada. Quando o colágeno é extraído do tecido de um animal, um virus derivado de um animal tem de ser removido ou inativado para impedir a sua transferência e, além disso, os microorganismos têm de ser adequadamente eliminados.

[0021] Tipicamente, um virus é removido por morte a uma temperatura elevada ou através de filtração utilizando um filtro com poros de dimensão nanométrica. No entanto, o colágeno pode ser degradado a temperaturas elevadas de 37 ° C ou mais e, assim, a estrutura das cadeias de hélice tripla pode se desfazer em três cadeias simples para assim dar gelatina, perder indesejadamente as propriedades fundamentais do colágeno e dificultar a passagem de uma proteína polimérica com um tamanho de 300 nm, através de um filtro para remoção de virus.

[0022] Durante a extração de colágeno, os materiais de baixo peso molecular, tais como enzimas ou cloreto de sódio têm de ser removidos, de modo a assegurar a adequação para utilização médica.

[0023] Quando o colágeno é geralmente utilizado como uma forma de dosagem liquida para aplicações médicas, é necessário ter uma concentração elevada de 30 ~ 60 mg / mL, de modo a aumentar o tempo de retenção do colágeno ou para manter o seu volume. Quando o colágeno é preparado numa forma de dosagem sólida, através da liofilização, é necessário ter uma concentração elevada, de modo a reduzir a capacidade de um liofilizador e o seu tempo de funcionamento. Para satisfazer os critérios dos consumidores para um material médico, o colágeno tem de ser preparado com uma elevada concentração de 60 mg / mL ou mais.

[0024] Além disso, com o objetivo de preparar um produto de colágeno médico na forma liquida a uma concentração elevada, pode ser utilizado o pó de colágeno, mas a esterilização numa fase de pó, mantendo as propriedades inerentes e a estrutura do colágeno é impossível, e o equipamento asséptico e um longo periodo de tempo são necessários para a dissolução em um liquido, esterilização e concentração.

Solução Técnica

[0025] O tecido de um mamifero é tratado com álcool etilico a 70% durante 24 horas e com uma solução ácida durante 72 horas ou mais, realizando assim a inactivação do virus. Além disso, os microorganismos são removidos através de filtração utilizando um filtro com um tamanho de poro de 0,22 pm, assegurando, assim, a segurança.

[0026] O colágeno altamente puro é preparado através da extracção de colágeno utilizando pepsina, adição de cloreto de sódio, filtração, filtração tangencial e neutralização do pH.

[0027] Além disso, através de procedimentos de concentração utilizando filtração de fluxo tangencial, neutralização de pH e centrifugação, o colágeno é altamente concentrado até 120 mg / mL e pode ser homogeneamente misturado para assim fabricar vários produtos na forma de liquido, esponja ou pó.

Efeitos vantajosos

[0028] Tal como aqui descrito anteriormente, o tecido de um mamifero pode ser produzido em colágeno liquido asséptico adequado para uso médico através da inactivação de virus, remoção de materiais de baixo peso molecular, tais como enzimas ou cloreto de sódio usando filtração de fluxo tangencial e filtração usando um filtro com um tamanho de poro de 0,22 pm. Além disso, filtração de fluxo tangencial, neutralização de pH e centrifugação são realizadas, através do qual o colágeno liquido de alta concentração de 120 mg / mL pode ser concentrado e pode ser usado como um material para vários produtos de colágeno médico, mantendo a fase liquida e propriedades assépticas do mesmo.

[0029] As concretizações preferidas da presente invenção para alcançar tais efeitos são descritas em detalhe abaixo com referência aos desenhos anexos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0030] A FIG. 1 mostra um processo de filtração de colágeno utilizando um dispositivo de filtração de fluxo tangencial (TFF) , de acordo com a presente invenção;

[0031] A FIG. 2 mostra uma membrana de filtração de fluxo tangencial, de acordo com a presente invenção;

[0032] A FIG. 3 mostra a estrutura de um tanque de neutralização de acordo com a presente invenção; e

[0033] A FIG. 4 mostra um misturador.

[0034] [Descrição dos Números de Referência nos Desenhos>

[0035] 10: dispositivo de membrana de filtração tangencial

[0036] 11: tanque de armazenamento

[0037] 12: bomba

[0038] 13: membrana de filtração de fluxo tangencial

[0039] 14: válvula

[0040] 15: manómetro

[0041] 16: recuperação do material não passado

[0042] 17: descarte do material passado

[0043] 18: água purificada

[0044] 21: direção de escoamento da solução

[0045] 22: direcção da pressão

[0046] 23: membrana de filtração tangencial

[0047] 24: material não passado

[0048] 25: material passado

[0049] 31, a: junta

[0050] 32, b: fixador

[0051] 33: Entrada de solução de titulação de pH

[0052] 34: Eletrodo de pH

[0053] c: dispositivo de vedação de eixo rotativo

[0054] d: eletrodo de pH

Melhor Modo

[0055] A presente invenção é caracterizada por se extrair do tecido de um mamifero colágeno liquido de alta concentração, cuja segurança biológica é assegurada e que tem elevada pureza, de modo a ser utilizado como material médico.

[0056] Especificamente, o tecido de um mamifero é lavado com água limpa e álcool e depois mantido congelado. Como tal, a água é de preferência água purificada a partir da qual foram removidos microrganismos e ions e o álcool é preferencialmente álcool etilico a 70% para desinfecção.

[0057] Antes da extração, o tecido animal é pré- tratado de uma maneira de triturar finamente o tecido utilizando um triturador e depois imerge-se o tecido em álcool etilico a 70% durante 24 horas.

[0058] O tecido animal pré-tratado é rinsado com água purificada e depois extraido.

[0059] Para a extração primária, o tratamento enzimático é realizado colocando o tecido e uma protease em água purificada a um pH de 1,5 a 2,5 e depois efetuando agitação durante 72 h ou mais.

[0060] Aqui, a titulação do pH pode ser realizada utilizando qualquer solução ácida, tal como ácido fosfórico ou ácido clorídrico, e a protease é preferencialmente pepsina, a qual é capaz de remover a extremidade do colágeno para causar uma resposta imunitária no corpo humano sem danificar A estrutura de tripla hélice do colágeno.

[0061] Se o pH para tratamento enzimático for inferior a 1,5, é inadequado para a resistência quimica de um filtro para utilização no processo de filtração subsequente. Por outro lado, se o pH exceder 2,5 ou o tempo de reacção for inferior a 72 h, o efeito de inativação do virus pode diminuir.

[0062] O processo de pré-tratamento incluindo a imersão em álcool etilico durante 72 h ou mais e o processo de tratamento enzimático a um pH de 2,5 ou menos durante 72 h ou mais permitem a inativação de virus que podem estar presentes no tecido animal, assegurando, assim, a proteção biológica segurança.

[0063] Para a extração secundária e a purificação, a solução sujeita ao tratamento enzimático é submetida a um processo de tratamento de sal de uma forma, tal que é feita reagir com cloreto de sódio a uma concentração de 0,5 ~ 0,9 M. Isto é porque cada proteina é capaz de se agregar a Uma concentração de sal especifica e também porque o colágeno pode agregar-se e flutuar à concentração de sal acima, pelo que as outras impurezas não agregadas são descartadas para, assim, aumentar a pureza do colágeno.

[0064] O colágeno agregado é novamente dissolvido em água purificada de modo a realizar um processo de filtração.

[0065] Para a purificação terciária, a solução é primeiro filtrada usando um filtro com um tamanho de poro de 2,0 ~ 0,5 pm e é então tratada utilizando um dispositivo TFF de modo que materiais de baixo peso molecular tais como pepsina, cloreto de sódio, etc. Pode ser removido da solução.

[0066] 0 dispositivo TFF inclui, de preferência, uma membrana de filtração de peso molecular de 50 ~ 150 kDa (MWCO). A membrana de filtração de 150 kDa ou menos de MWCO funciona para evitar a perda de colágeno de cerca de 300 kDa, e a membrana de filtração de 50 kDa ou mais de MWCO funciona para remover a pepsina de cerca de 35 kDa.

[0067] O processo de filtração utilizando o dispositivo TFF é realizado utilizando um tanque de armazenamento 11, uma bomba 12, uma membrana de filtração 13, um manómetro 15 e uma válvula 14. A solução no tanque de armazenamento é transferida para a membrana de filtração através de modo que colágeno maior do que o tamanho de poro da membrana de filtração não é passado, mas é recuperado no tanque de armazenamento e também de modo que impurezas menores do que o tamanho de poro são passadas através dos poros e assim removidas. A água purificada é adicionada numa quantidade correspondente à quantidade das impurezas removidas através dos poros na membrana de filtração. Este procedimento é repetido, pelo que a pureza do colágeno pode ser aumentada enquanto se mantém a capacidade de escoamento da solução de colágeno no tanque de armazenamento (Figuras 1 e 2) . Os resultados da purificação utilizando o dispositivo TFF podem ser confirmados através de vários métodos, entre os quais a remoção de cloreto de sódio pode ser encontrada através de medição osmótica (Exemplo 3).

[0068] O dispositivo TFF é utilizado para um processo de concentração, para além do processo de purificação. Quando a filtração é repetida sem a adição de água purificada num momento em que a remoção de impurezas é completada, a água é removida através dos poros, e assim a quantidade de colágeno no tanque de armazenamento é aumentada. Consequentemente, a quantidade de colágeno pode ser concentrada até 10 mg / mL, e o colágeno assim obtido pode ser utilizado em campos que não requerem elevada concentração, tais como os de materiais cosméticos.

[0069] No entanto, uma vez que a viscosidade do colágeno é aumentada com um aumento na sua concentração, quando se realiza um processo de concentração para 10 mg / mL ou mais, o colágeno pode acumular-se na membrana de filtração e a fluidez da solução de colágeno pode Diminuindo significativamente, reduzindo assim o rendimento e exigindo um longo tempo de processamento. A fim de produzir colágeno para uso médico, é concentrado a 5 mg / mL ou menos, garantindo assim fluidez e viscosidade adequada para filtração estéril.

[0070] Após a finalização da purificação e concentração utilizando o dispositivo TFF, a solução resultante é filtrada através de um filtro com um tamanho de poro de 0,22 pm e depois transferida para um tanque de neutralização. Aqui, o filtro esterilizado e o tanque de neutralização devem estar num estado estéril. Em particular, o tanque de neutralização deve poder ser vedado utilizando uma junta 31 e um fecho 32 e deve incluir uma entrada de solução de titulação de pH, um eléctrodo de medição de pH e uma camisa para ajustar a temperatura da solução (Figura 3).

[0071] A solução de colágeno a partir da qual os microorganismos foram removidos através de filtração estéril é purificada e concentrada mais uma vez utilizando um processo de neutralização. 0 processo de neutralização é realizado de uma maneira em que o pH da solução de colágeno é ajustado a 6,0 ~ 8,0 usando uma solução de titulação de pH tal como hidróxido de sódio ou ácido clorídrico e a temperatura da solução é ajustada a 25 - 35 ° C para, desse modo agregar o colágeno.

[0072] Durante o processo de neutralização, se o pH da solução ficar fora da faixa acima ou a temperatura da solução for baixa, o colágeno pode não se agregar suficientemente. Por outro lado, se a temperatura da solução é elevada, a estrutura de hélice tripla pode se desenrolar devido à degradação térmica.

[0073] O colágeno é agregado através do processo de neutralização, e a solução, que não é agregada, é removida, pelo que a quantidade de um alvo de concentração pode ser diminuída antes de um processo de concentração usando centrifugação, tornando fácil a separação de água e colágeno de cada Outro e o processo de concentração pode ser realizado num curto espaço de tempo usando uma força centrifuga baixa, construindo finalmente um aparelho que permite a produção em massa a um custo relativamente baixo.

[0074] O colágeno, que é agregado através de neutralização, é colocado num vaso de centrifugação esterilizado, e é então concentrado durante 5 min a uma aceleração gravitacional de 4.000 ~ 6.000 g usando uma centrifuga.

[0075] Se o processo acima é conduzido usando uma força centrifuga mais baixa ou por um tempo mais curto, o rendimento de colágeno pode diminuir ou o valor de concentração final pode diminuir. Por outro lado, se for aplicada uma aceleração gravitacional mais elevada durante um longo periodo de tempo, é necessária uma centrifuga dispendiosa de alto rendimento adequada para o mesmo e o tempo de produção pode aumentar.

[0076] o colágeno assim concentrado é colocado num misturador (Figura 4) com uma estrutura fechada e é então homogeneamente misturado, obtendo assim colágeno de alta concentração para utilização num material médico. Aqui, a concentração de colágeno pode ser ajustada por adição de água a partir da qual os microorganismos e materiais exotérmicos foram removidos, dependendo dos fins desejados, e colágeno com uma concentração elevada de 120 mg / mL pode ser obtido nas condições acima.

[0077] Durante o processo de mistura acima, uma solução ácida tal como ácido clorídrico é adicionada como a solução de titulação de pH de modo que o pH da solução seja ajustado para 1,5 ~ 5,5. A solução com um pH ajustado pode ser armazenada de forma estável num estado homogéneo durante um longo periodo de tempo. Se o seu pH for demasiado baixo, é dificil titular o pH para um valor neutro para preparar um produto médico. Por outro lado, se o seu pH for superior a 5,5, o colágeno pode voltar a reagir, tornando dificil manter uma concentração uniforme.

[0078] Dependendo das necessidades, o colágeno, obtido através de processos de extracção, purificação, concentração e mistura, pode ser misturado e diluido com um solvente de mistura tal como água, uma solução isotónica, plasma rico em plaquetas (PRP) ou ácido hialurónico Para assim dar um produto liquido, e o colágeno concentrado pode ser proporcionado na forma de um produto sólido através de liofilizacão.

[0079] Em particular, um produto liquido pode ser proporcionado num estado em que a segurança biológica é assegurada na ausência de virus e microorganismos dentro de uma instalação de sala limpa minima que permita a mistura, o enchimento e a embalagem EXEMPLO 1 Preparação e utilização de colágeno médico utilizando tecido de pele de porco

[0080] 1) Tecido da pele de porco é lavado com água purificada e álcool e depois mantido congelado a -20 ° C ou menos.

[0081] 2) O tecido de pele de porco é finamente triturado.

[0082] 3) O tecido de pele triturado é imerso em álcool etilico a 70% durante 24 h.

Inativação primária do vírus

[0083] 4) 0 tecido é rinsado por colocação em água purificada, titulado a um pH ácido (pH 1,5 ~ 2,5) utilizando ácido fosfórico, e depois é feito reagir com agitação durante 72 horas ou mais pela adição de pepsina. Inativação secundária do vírus

[0084] Aqui, a quantidade de pepsina é 1/4 ~ 1/10 do peso do tecido da pele.

[0085] 5) O colágeno é adicionado com cloreto de sódio a uma concentração de 0,5 ~ 0,9 M, agitado e agregado, após o que a solução não agregada é removida.

[0086] 6) o colágeno agregado é dissolvido em água titulada a um pH de 1,5 ~ 4,0 e depois filtrado utilizando um filtro com um tamanho de poro de 2,0 ~ 0,5 pm.

[0087] 7) A fim de se obter colágeno adequado para uso médico, materiais de baixo peso molecular tais como pepsina e cloreto de sódio são removidos da solução usando um dispositivo TFF.

[0088] O dispositivo TFF inclui, de preferência, uma membrana de filtração MWCO de 50 ~ 150 kDa e adiciona- se água purificada numa quantidade correspondente à quantidade removida através dos poros da membrana de filtração de modo que a quantidade da solução de colágeno no tanque de armazenamento seja Para assegurar assim a fluidez.

[0089] 8) Após a conclusão da remoção de materiais de baixo peso molecular tais como pepsina e cloreto de sódio, o fornecimento de água purificada é interrompido e TFF é mantido, e assim um processo de concentração é realizado. Como tal, a concentração de colágeno é ajustada para 5 mg / mL ou menos de modo a passar através de um filtro com um tamanho de poro de 0,22 pm.

[0090] 9) Para remover microrganismos, a filtração é realizada utilizando um filtro com um tamanho de poro de 0,22 pm.

[0091] 10) A solução a partir da qual os microorganismos foram removidos é transferida para um tanque de neutralização esterilizado. o tanque de neutralização tem de ser esterilizado e tem de ter uma estrutura selada capaz de manter um estado estéril e inclui uma entrada de solução de titulação de pH e um eléctrodo de medição de pH.

[092] 11) para agregação de colágeno, deixa-se repousar a solução de colágeno durante um periodo de tempo que varia de 4 horas a um dia sob a condição de ser titulado até um pH aproximadamente neutro (pH 6,0 ~ 8 0) utilizando ácido clorídrico (HCI) E uma solução de hidróxido de sódio (NaOH) e a sua temperatura é ajustada para 25 ~ 35 0 C.

[0093] 12) A solução não agregada é rejeitada e o colágeno agregado é colocado num vaso de centrifugação e depois numa centrifuga e é centrifugado a uma aceleração gravitacional de 4.000 ~ 6.000 g, concentrando assim o colágeno.

[0094] 13) A água é decantada do recipiente de centrifugação e o colágeno concentrado, tendo sido separado da água, é colocado num misturador e depois agitado, obtendo-se assim colágeno com uma concentração de cerca de 120 mg / mL.

[0095] Como tal, o colágeno assim obtido é misturado com uma solução ácida tal como ácido clorídrico para ajustar o seu pH a 1,5 ~ 5,5, pelo que o colágeno pode ser armazenado a uma concentração homogénea.

[0096] 14) O colágeno, a partir do qual os microorganismos foram removidos e que tem elevada pureza, é preparado num estado em que as propriedades do colágeno são mantidas, utilizando o processo acima, e é assim adequada para uso médico e pode ter uma elevada concentração de 120 mg / mL e pode assim ser aplicada a vários produtos.

[0097] Por exemplo, o colágeno pode ser proporcionado na forma de um produto que pode ser injectado no corpo de uma maneira na qual o colágeno é misturado com um aditivo de modo a possuir a mesma composição que a solução salina no corpo humano enquanto Mantendo uma fase liquida e depois é carregada numa seringa pré-cheia. EXEMPLO 2 Verificação da inativação do virus

[0098] O processo de inativação do virus durante o processo de produção do Exemplo 1 foi realizado através de três simulações para verificar assim a inactivação do virus.

[0099] Adotaram-se como indicadores, virus PEDV (virus da diarreia epidêmica porcina), PRV (rotavirus porcino), PPV (parvovirus porcino) e virus Pseudorabies, dependendo dos genótipos, presença ou ausência de lipídeos envolvidos e resistividade.

[00100] Os quatro tipos de virus adotados são inoculados no tecido de porco triturado e depois incubados em álcool etilico a 70% durante 24 horas e numa solução ácida com um pH de 2,5, ajustada pela utilização de ácido fosfórico, durante 72 horas para reproduzir os procedimentos de tratamento prévio e enzimático do processo de preparação real.

[00101] As amostras nas quais o processo de inactivação do virus foi reproduzido são comparadas antes e depois do tratamento através de análise virai quantitativa.

[00102] Os resultados de três simulações sob as mesmas condições foram os mesmos. Todos os virus foram detectados até um limiar de detecção ou menos e o factor de redução logarítmica para cada processo de inactivação do virus foi medido como sendo um factor de redução de 2 log ou mais correspondente a um padrão tipico que é considerado como eficaz para a inactivação do virus. Os fatores de redução logarítmicos cumulativos máximos de PEDV, PRV, PPV e virus Pseudorabies por processo foram b 6,75, b 9,75, b 8,75 e b 8,75, respectivamente, dos quais se pode concluir que os efeitos de forte inativação do virus foram exibidos. Tabela 1

EXEMPLO 3

Remoção de cloreto de sódio utilizando TFF

[00103] Após o tratamento enzimático, tratamento com cloreto de sódio e filtração utilizando um filtro com um tamanho de poro de 2,0 ~ 0,5 pm do Exemplo 1, TFF foi conduzido utilizando uma membrana de filtração MWCO de 100 kDa.

[00104] Aqui foi adicionada água purificada numa quantidade correspondente à quantidade removida, através dos poros na membrana de filtração e este procedimento foi repetido, pelo que a fluidez da solução de colágeno no tanque de armazenamento foi assegurada e de baixo peso molecular Materiais tais como pepsina e cloreto de sódio foram removidos, e a quantidade total de água purificada que foi adicionada foi cinco vezes a quantidade inicial da solução de colágeno.

[00105] O processo TFF acima foi repetido três vezes e os resultados da remoção de materiais de baixo peso molecular foram verificados por medição da pressão osmótica utilizando cloreto de sódio, escolhido porque é um material tipico.

[00106] Consequentemente, as velocidades de remoção individuais foram 96,2%, 96,1% e 96,4% e a taxa de remoção média foi determinada como sendo 96,2%. Deste modo, a remoção de materiais de baixo peso molecular através de TFF é eficaz e o cloreto de sódio apresenta uma pressão osmótica de 31 - 33 mOsm, que é inferior a 285 mOsm, que é a pressão osmótica plasmática e pode ser utilizada como um meio médico Material em mistura com uma solução isotónica, conforme necessário. Tabela 2

[00107] [Exemplo 4] Concentração de colágeno por processo de concentração passo a passo

[00108] De acordo com o processo de preparação do Exemplo 1, foram utilizados 5 kg de pele de suino e 1 kg de pepsina e a concentração de colágeno para cada passo foi medida quando foi realizado um processo de concentração a 1/2 da quantidade inicial após TFF.

[00109] A concentração do processo de tratamento enzimático para o processo de filtração utilizando um filtro com um tamanho de poro de 2,0 ~ 0,5 pm caiu na gama de 1,6 ~ 2,4 mg / ml para cada caso e a concentração foi de 3,2 a 4,8 mg / ML após a remoção de materiais de baixo peso molecular durante TFF.

[00110] Isto é realizado para realizar a passagem através de um filtro de filtração estéril tendo um tamanho de poro de 0,22 pm após TFF. Quando a concentração é ajustada para 2 mg / mL ou menos, a quantidade de solução de colágeno é aumentada e assim o volume do tanque de neutralização é aumentado. Após o processo de neutralização, é necessário um longo periodo de tempo para realizar um processo de concentração usando centrifugação, aumentando os custos de produção. Por outro lado, quando a concentração da solução de colágeno foi ajustada para 5 mg / mL ou mais, a viscosidade é aumentada, tornando dificil passar através do filtro estéril com um tamanho de poro de 0,22 pm, pelo que o filtro estéril pode ser Obstruído cedo, indesejável causando a perda de colágeno e usando um grande filtro. Por esta razão, o valor de concentração antes de um processo de filtração estéril é de preferência ajustado para a gama de 2 ~ 5 mg / mL.

[00111] A água, que não foi agregada durante o processo de neutralização, foi essencialmente removida, pelo que o colágeno podia ser concentrado para 5,6 ~ 6,7 mg / mL de 3,2 ~ 4,8 mg / mL. Em conformidade, o colágeno é concentrado cerca de 1,4 a 1,8 vezes em comparação com o valor de concentração antes do processo de neutralização. Assim, durante o processo de concentração utilizando centrifugação, a capacidade inicial pode ser reduzida, resultando vantajosamente numa aplicação industrial na qual a capacidade da centrifuga e o tempo de processamento podem ser reduzidos.

[00112] Finalmente, a solução de colágeno agregada após o processo de neutralização é concentrada utilizando centrifugação, pelo que pode ser obtido colágeno de alta concentração na gama de concentrações de 114,6 ~ 122,3 mg / mL para cada caso, o qual é adequado para utilização como material para Um produto de colágeno liquido médico com uma concentração de 30 ~ 60 mg / mL e que também é capaz de reduzir a capacidade de um liofilizador Q O seu tempo de funcionamento quando se produz uma formulação sólida utilizando liofilização. Tabela 3

[00113] Nota) A: tratamento enzimático ~ filtração (com um tamanho de poro de 2,0 ~ 0,5 pm)

[00114] B: filtração tangencial (processo de concentração após remoção de material de baixo peso molecular)

[00115] C: neutralização (após remoção da solução não agregada)

[00116] D: processo de concentração utilizando centrifugação

[00117] Embora as concretizações especificas da presente invenção tenham sido reveladas para fins ilustrativos, os técnicos versado no assunto irão enteder que são possíveis várias modificações, equivalentes e substituições, sem se afastarem do escopo e espirito da invenção, tal como divulgado pelas reivindicações seguintes.

Claims

1. Processo para a produção de colágeno na concentração de 60 mg/ml ou mais para utilização como material médico, caracterizado pelo fato de que compreende: lavar o tecido de um mamifero; submeter o tecido lavado à trituração e imersão em álcool etilico; em que o tecido triturado do mamifero é imerso em álcool etilico a 70% durante pelo menos 72 horas e é então reagido com pepsina durante pelo menos 72 horas em uma solução titulada a um pH de 1,5 ~ 2,5 tal que um virus é inativado e colágeno é extraido; submeter o tecido a tratamento enzimático com agitação em água purificada contendo ácido fosfórico e pepsina; colocar o tecido pré-tratado com uma protease em uma solução aquosa titulada para um pH de 1,5 a 2,5 e agitar por pelo menos 72 horas para inativar o virus e extrair colágeno; adicionar cloreto de sódio ao colágeno submetido ao tratamento enzimático e tratamento com protease, realizar agitação e agregar o colágeno; dissolver o colágeno agregado em água purificada para dar uma solução de colágeno, a qual é então filtrada utilizando um filtro que possui tamanho de poro de 2,0 a 5, 0 mm e concentrada por remoção da pepsina, material de baixo peso molecular e cloreto de sódio da solução de colágeno utilizando um dispositivo de filtração de fluxo tangencial; submeter o colágeno concentrado utilizando o dispositivo de filtração de fluxo tangencial a filtração estéril, agregando o colágeno utilizando uma solução de pH em um tanque de neutralização e concentrando o colágeno removendo uma solução não agregada; e ainda concentrar o colágeno concentrado utilizando uma centrifuga e agitar o colágeno concentrado utilizando um misturador.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o colágeno sujeito ao tratamento enzimático ser adicionado com cloreto de sódio a uma concentração de 0,5 ~ 0,9 M e agitado para assim agregar o colágeno, a solução não agregada ser removida e o colágeno agregado ser dissolvido em água purificada e depois filtrado utilizando um filtro com um tamanho de poro de 2,0 ~ 0,5 pm.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dispositivo de filtração de fluxo tangencial compreende uma membrana de filtração de corte de peso molecular de 50-150 kDa, água purificada é adicionada em uma quantidade correspondente a uma quantidade da solução que é removida de modo a manter a fluidez, materiais menores do que um tamanho de poro da membrana de filtração são removidos e o colágeno é concentrado até 5 mg/mL ou menos, de modo a passar através de um filtro com um tamanho de poro de 0,22 pm.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o colágeno concentrado utilizando o dispositivo de filtração de fluxo tangencial é deixado em repouso durante 4 h ~ 24 h sob uma condição de o colagénio ser ajustado para um pH neutro (6,0 ~ 8,0) e mantido a um temperatura de 25 ~ 35 °C, pelo que o colágeno agregado é recuperado e centrifugado utilizando uma centrifuga, sendo deste modo concentrado.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o colágeno concentrado através da neutralização ser centrifugado a uma aceleração gravitacional de 4.000 ~ 6.000 g, sendo desse modo concentrado e agitado utilizando um misturador, obtendo, assim colágeno de alta concentração de 120 mg/ml.