WO2016080578A1 - 의료용 재료로 사용하기 위한 고농도 콜라겐 제조방법 - Google Patents

의료용 재료로 사용하기 위한 고농도 콜라겐 제조방법 Download PDF

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정형우
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing high-density collagen that is suitable for medical materials, and more particularly, to allow collagen to be produced in various concentrations for use as a medical material, and especially high-density collagen has excellent performance for the purpose. Compared to low concentration, there is an advantage that it is easy to store. In addition, it is a very useful invention to meet the various needs of consumers by improving the quality and reliability of the product.
  • collagen is a fibrous protein that is one of the proteins that make up the skin, bones, and tendons. They are especially distributed in connective tissues of the body, and our body contains about 20% protein, of which collagen accounts for about 30%.
  • the molecular structure of the collagen has a triple helix structure in which three polypeptide chains are wound and bonded to each other by hydrogen bonds.
  • Collagen with this structure has functions such as adhesion of cells, support of body and organs, activation of cell function, cell proliferation, hemostasis, immunity, etc. It is a protein.
  • Collagen having such characteristics is currently used as a raw material or additives in various fields, including beauty, health drinks, health foods, medicines and cosmetics, and its functional field is gradually expanding its application field.
  • collagen is generally obtained by collecting the bone and leather of cows or pigs, and then separating the collagen from the tissues by using organic solvent extraction, acid / base treatment, trypsin and hyaluronidase to obtain collagen as an insoluble substance. Because of their high molecular weight, digestion and absorption in the human body are difficult and the purity is lowered due to various impurities included in the raw material.
  • Collagen is currently known as more than 20 species, collagen type 1 is occupied most, morphologically present in the form of a fibrous solid, three-stranded polypeptide has a structure twisted by hydrogen bonds, molecular weight is about 300kDa.
  • Collagen can be dissolved in dilute acid or dilute alkali and prepared in liquid form. The higher the concentration, the higher the viscosity.
  • Collagen is suitable for living tissue and is a biodegradable material, so it is widely used as one of medical materials such as tissue repair agent, skin transplant agent, bone graft agent, and cell culture.
  • the collagen is generally subjected to conventional filtration.
  • Patent Literature 4 Patent Constitution 4
  • Patent Constitution 4 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2011-201837 discloses a method for producing collagen hydrolyzate in a porous aerial desert in which a pipe wall is formed from a brand of hydrophobic polymer and hydrophilic polymer.
  • Patent Document 5 (International Patent Document 5) A method for producing a protein having a triple helix structure, which includes a step of purifying collagen by centrifugation after concentration of collagen by a crossflow filtration method.
  • collagen is a biodegradable protein that is biodegradable with low antigenicity and extracted from tissues of various animals to obtain such collagen and medical devices and It is widely used as a raw material for cosmetics and food as well as medical materials such as pharmaceuticals.
  • low molecular weight substances such as enzymes and sodium chloride, which are widely used in collagen extraction, should be removed to a level suitable for medical use.
  • collagen powder is used to manufacture medical collagen products in a high concentration liquid form, it maintains the uniqueness and structure of collagen and cannot be sterilized in a powder state. It takes a long time.
  • Mammalian tissue is treated with 70% ethyl alcohol for 24 hours and acidic solution for 72 hours or more to inactivate the virus, and filtered through a 0.22 micrometer pore filter to remove microorganisms to ensure safety.
  • the present invention is characterized by extracting high concentration liquid collagen with high purity as a raw material of mammalian tissue for use as a medical material.
  • Enzyme treatment the first extraction process, adds tissues and proteolytic enzymes to purified water at a pH of 1.5 to 2.5, and reacts for at least 72 hours.
  • the virus inactivation effect may be lowered if the pH exceeds 2.5 or the reaction time is less than 72 hours.
  • sodium chloride is added to the solution having the enzyme treatment to a concentration of 0.5 to 0.9 M to perform a salt treatment process.
  • Each protein has a property of aggregation at a specific salt concentration, and collagen is a process using the property of flocculation and floating at the salt concentration, so that other non-aggregated impurities can be discarded to increase collagen purity.
  • the aggregated collagen is dissolved again in purified water to proceed with the filtration process.
  • the filter is first filtered using a filter having a pore size of 2.0 to 0.5 micrometers, and low molecular substances such as pepsin and sodium chloride are removed using a tangential flow filtration device (TFF).
  • THF tangential flow filtration device
  • the tangential flow filtration device preferably uses a molecular weight blocking (MWCO) filtration membrane of 50 kDa to 150 kDa, which prevents the loss of collagen of about 300 kDa by using a molecular weight blocking filtration membrane of 150 kDa or less and through a molecular weight blocking (MWCO) filtration membrane of 50 kDa or more. To remove about 35 kDa pepsin.
  • MWCO molecular weight blocking
  • the filtration process using the tangential flow filtration device is composed of a storage tank 11, a pump 12, a filtration membrane 13, a pressure gauge 15, and a valve 14.
  • the solution of the storage tank is transferred to the filtration membrane by a pump so that collagen larger than the pores of the filtration membrane is recovered without storage, and impurities smaller than the pores are removed through the pores.
  • Purified water is added as much as the capacity removed through the pores of the filtration membrane and the purity can be increased while securing the flowability of the collagen solution in the storage tank (Fig. 1, 2).
  • Purification results using a tangential flow filtration device can be confirmed by various methods, among which sodium chloride removal can be confirmed through the osmotic pressure measurement (see Example 3).
  • the concentration is higher than 10mg / mL due to the characteristics of collagen, the higher the concentration, the collagen will accumulate in the filtration membrane, and the flowability of the collagen solution will be greatly reduced, resulting in a lower yield and a long process time. do.
  • it is concentrated to a concentration of 5 mg / mL or less to ensure flowability and viscosity that can be sterilized by filtration.
  • the non-aggregated solution By coagulating the collagen through the neutralization process, the non-aggregated solution can be removed to reduce the concentration of the concentration before concentration using centrifugation, and the concentration can be performed in a short time with low centrifugal force by facilitating the separation of water and collagen. It is possible to build a facility capable of mass production at a relatively low cost.
  • the collagen aggregated through neutralization is placed in a sterilizable centrifuge container, and then concentrated using a centrifuge for 5 minutes at a gravity acceleration of 4,000 to 6,000 g.
  • the concentrated collagen is put into a mixer having a sealed structure (Fig. 4), and then mixed homogeneously to obtain a high concentration of collagen for use as a medical material.
  • the concentration of collagen may be adjusted by adding water from which microorganisms and pyrogenic substances have been removed according to the purpose of application, and high concentration collagen of 120 mg / mL may be obtained under the above conditions.
  • the acid solution such as hydrochloric acid
  • the pH titration solution in the mixing process and kept at a pH of 1.5 to 5.5
  • it can be stored in a homogeneous state for a long time stable. If the pH is too low, it is difficult to titrate the pH neutrally for the manufacture of a product for later medical use, and if the pH is higher than 5.5, the collagen will reaggregate and it will be difficult to maintain a uniform concentration.
  • the collagen obtained through the extraction, purification, concentration and mixing process may be mixed and diluted with a mixed solvent such as water, isotonic solution, platelet-rich plasma (PRP), hyaluronic acid and the like to produce a liquid product, depending on the intended use.
  • a mixed solvent such as water, isotonic solution, platelet-rich plasma (PRP), hyaluronic acid and the like to produce a liquid product, depending on the intended use.
  • Collagen can be lyophilized to produce a solid product.
  • liquid products can be produced while maintaining the safety of biological safety by removing viruses and microorganisms in a minimum clean room facility such as mixing, filling and packaging space.
  • the aggregated collagen is dissolved in water titrated to pH 1.5 ⁇ 4.0 and filtered using a filter of 2.0 ⁇ 0.5 micrometer pore size (Pore size).
  • the tangential flow filtration device preferably uses a molecular weight cutoff (MWCO) filtration membrane of 50 kDa to 150 kDa, and secures flowability by maintaining the capacity of the collagen solution in the storage tank by adding purified water as much as the capacity of the filtration membrane.
  • MWCO molecular weight cutoff
  • the neutralization tank must be sterilizable, sealed to maintain sterilization, and be equipped with a pH titration solution inlet and a pH measuring electrode.
  • collagen is prepared in a state in which microorganisms are removed, high purity, and maintain collagen properties are suitable for medical use, and it is manufactured at a high concentration of 120 mg / mL and can be applied to various products.
  • Example 1 the enzyme treatment, sodium chloride treatment, filtration using a filter of 2.0 ⁇ 0.5 micrometer pore size (pore size) and then tangential flow filtration was performed using a molecular weight blocking (MWCO) filtration membrane of 100kDa.
  • MWCO molecular weight blocking
  • the tangential flow filtration process was repeated three times, and the result of removing the low molecular weight material was verified by selecting osmotic pressure by selecting sodium chloride as a representative material.
  • the removal rate was 96.2%, 96.1%, 96.4%, respectively, and the average removal rate was 96.2%.
  • sodium chloride shows an osmotic pressure of 31 ⁇ 33mOsm lower than the plasma osmotic pressure of 285mOsm, and can be mixed with isotonic solution as needed for medical material.
  • the amount of pig skin is 5kg
  • the amount of pepsin is 1kg
  • the concentration of collagen is analyzed at each step of tangential flow filtration at a concentration of 1/2 the initial dose. It was.
  • the concentration from the enzymatic treatment to the filtration process using a filter with a 2.0 to 0.5 micrometer pore was 1.6 to 2.4 mg / mL in each case. .
  • the collagen concentration can be concentrated from 3.2 to 4.8 mg / mL to 5.6 to 6.7 mg / mL by first removing the non-aggregated water through the neutralization process. Through this, it can be concentrated to about 1.4 ⁇ 1.8 times the concentration before the neutralization process to reduce the initial capacity when concentrated using centrifugation has the advantage of industrial use to reduce the centrifuge capacity and processing time.

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Abstract

본 발명은 의료용 재료를 사용하기 위한 고농도 콜라겐을 제조하는 방법에 관한 것이다. 포유동물의 조직을 세척한 후 세척된 포유동물의 조직을 분쇄하여 에틸 알코올에 침적시키고 인산을 정제수에 넣은 후 펩신을 넣고 교반하여 반응시켜 효소를 처리하고, 효소처리된 콜라겐에 염화나트륨을 첨가하여 교반한 다음 콜라겐이 응집되도록 하고, 응집된 콜라겐을 정제수로 용해한 후 필터를 이용하여 여과하고 접선 유동 여과장치를 이용하여 용액 내 펩신, 저분자 물질, 염화나트륨을 제거하고 농축한다. 상기 농축된 콜라겐을 멸균 여과하고 중성화 반응 탱크, pH용액을 이용하여 콜라겐을 응집시키고 미응집된 용액은 제거한 다음 농축하고, 농축된 콜라겐을 원심분리기를 이용하여 농축하며, 농축된 콜라겐을 혼합기에 넣은 후 교반시켜 고농도의 콜라겐을 제조하여 의료용 재료로 사용한다.

Description

의료용 재료로 사용하기 위한 고농도 콜라겐 제조방법
본 발명은 의료용 재료에 적합하도록 한 고농도 콜라겐 제조방법에 관한 것으로 보다 상세하게는 콜라겐을 의료용 재료로 사용하기 위해 다양한 농도로 제조할 수 있도록 한 것이고, 특히 고농도 콜라겐은 해당 목적에 대해 성능이 우수하고 저농도에 비해 보관이 용이한 장점이 있다. 또한 제품의 품질과 신뢰성을 향상시킬 수 있으므로써 수요자들의 다양한 욕구를 충족시켜 매우 유용한 발명이다.
콜라겐(collagen)이란 동물의 다양한 조직에 분포하고 교원질이라고도 하며, 전체 중량의 30%정도를 차지하고 있는 단백질이다.
일반적으로 콜라겐은 섬유상태의 단백질로서 피부와 뼈, 힘줄을 구성하는 단백질 중의 하나이다. 이들은 신체의 결합 조직에 특히 많이 분포하고 있으며, 우리 몸속에는 단백질이 약 20% 포함되어 있는데, 이중 콜라겐이 약 30%를 차지하고 있다. 상기 콜라겐의 분자 구조는 3개의 폴리펩티드 사슬이 감겨 수소 결합으로 서로 결합된 삼중나선형 구조를 갖는다. 이러한 구조를 갖는 콜라겐은 세포의 접착, 몸과 장기의 지지, 세포기능 활성화, 세포증식작용, 지혈, 면역력 등의 기능을 가지고 있으며, 신체를 형성함과 동시에 유기적 기능을 부여하므로 신체에서 반드시 필요로 하는 단백질이다.
이러한 특성을 갖는 콜라겐은 현재 미용, 건강음료, 건강식품, 의약품 및 화장품 분야를 포함하여 다양한 분야에서 원료나 첨가제로 사용되고 있으며, 그 기능적 특성으로 인하여 점차 그 활용분야가 확대되고 있는 추세에 있다.
이와 같이 콜라겐은 일반적으로 소나 돼지의 뼈와 가죽을 수집한 후 콜라겐을 조직으로부터 분리하기 위하여 유기용매 추출, 산/염기 처리 후 트립신, 히알루로니다아제를 작용시켜 불용성 물질로 콜라겐을 얻을 수 있으나, 이들의 분자량이 높아 인체에서의 소화흡수가 곤란하고 원료에 포함되어 있는 다양한 불순물들로 인해 순도가 저하되므로 그 사용분야가 제한된다는 문제가 있다.
콜라겐은 현재 20여 종으로 알려져 있는데 콜라겐 1형이 대부분을 차지하고 있으며, 형태적으로는 섬유상 고체로 존재하고, 3가닥의 폴리펩타이드가 수소결합으로 꼬인 구조를 가지며 분자량은 약 300kDa이다.
콜라겐은 묽은 산이나 묽은 알카리에 용해되어 액상으로 제조할 수 있고 농도가 높아질수록 점도가 높아진다.
콜라겐은 생체조직에 적합하고 생분해 물질이어서 조직수복제, 피부이식제, 뼈이식제, 세포배양 등 의료용 재료 중 하나로 널리 이용된다.
한편 다양한 원료로부터 추출 및 액상으로 제조된 콜라겐을 이물질과 미생물을 제거하여 의료용 재료로 제조하기 위해서는 일반적으로 전통적인 여과를 실시한다.
전통적인 여과방식은 여과막과 수직방향으로 압력과 유체흐름을 형성시켜 여과막의 공극(pore) 크기보다 큰 물질은 걸러내고 작은 물질은 통과시키게 된다. 이러한 여과방법은 여과대상을 한번에 투과시키며, 통과하지 않은 물질은 여과막에 쌓여 여과양이 누적될수록 여과효율이 떨어지며 최종적으로 여과막이 막히는 현상이 발생한다. 이에 따라 전통적인 여과방식은 여과대상의 용량과 막면적에 의존적이며 여과할 수 있는 농도가 낮은 한계가 있다.
이러한 한계에 따라 고분자 단백질인 콜라겐을 여과하기 위해서는 저농도의 액상으로 제조하여야 하며, 특히 미생물을 제거하기 위한 제균여과의 경우 0.22 ~ 0.45마이크로미터의 작은 공극을 가진 여과막을 투과시키기 위하여 약 5 mg/ml 이하의 농도로 제조해야 한다
저농도로 제조된 콜라겐 용액을 고농도로 농축하는 방법에 있어서 일반적인 증발농축은 콜라겐의 열변성의 우려가 있고 장시간 제조시간이 소요되어 적용하기 어려우며, 휘발성 용매를 사용하여 농축하는 방법도 잔류용매를 별도로 제거해야 하므로 의료용 제료를 제조하는 방법으로 적합하지 않다.
[선행기술문헌]
(특허문헌 1) 일본공개특허 제2001-200000호로 해양생물 유래 콜라겐의 제조방법으로 해양생물의 피부조직을 세정하고 유기산을 이용하여 콜라겐을 추출하여 얻은 용액을 정제막을 통과시켜 불순물을 제거하고 단백질 분해효소를 이용하여 추출한 용액을 정제막을 통과하는 여과공정과 농축막을 통과시키는 농축공정, 멸균여과공정을 통하여 농축된 콜라겐을 제조하는 방법이 공개된 바 있다.
(특허문헌 2) 한국공개특허 제2014-0091435호로 접선유동여과장치를 이용하여 농축하는 단계와 상기 농축된 콜라겐을 원심분리기를 이용하여 농축하는 단계와 상기 농축된 콜라겐을 동결건조기를 이용하여 농축하는 단계의 콜라겐제조방법이 공개된 바 있다.
(특허문헌 3) 미국특허 제4894441호로 동물의 피부에서 유기산을 이용해 생물조직을 추출하는 공정과 상기 추출물에 염화나트륨을 첨가해 콜라겐을 추출하는 공정과, tangential filtration 공정을 통하여 콜라겐을 제조하는 방법이 공개된 바 있다.
(특허문헌 4) (특허분헌 4) 일본공개특허 2011-201837으로 소수성 고분자와 친수성 고분자의 브랜드물로부터 관벽이 구성되어 있는 다공질 공중사막에, 콜라겐 가수분해물의 제조방법이 공개된 바 있다.
(특허문헌 5) (국제특허문헌 5) 크로스플로우 여과방법에 의해 콜라겐을 농축한 후 원심분리하여 콜라겐을 정제하는 과정을 포함하는 삼중 나선 구조를 가지는 단백질 제조방법이 공개 된 바 있다.
본 발명은 상기와 같이 종래기술의 제반 문제점을 해소하기 위해 제안된 것으로, 콜라겐은 낮은 항원성을 갖고 생체분해되는 생체분해 적합성의 단백질로써 이러한 콜라겐을 얻기 위해 다양한 동물의 조직으로부터 추출되어 의료기기와 의약품 등 의료용 재료뿐만 아니라 화장품, 식품의 원료로써 널리 사용되어진다.
콜라겐을 의료용 재료로 사용하기 위해서는 생물학적인 안전성이 확보되어야 한다. 특히 동물의 조직(tissue)으로부터 콜라겐을 추출할 때 동물유래 바이러스가 전이되는 것을 막기 위해 바이러스를 제거하거나 불활성화 되어야 하며 미생물이 적절하게 제거되어야 한다.
일반적으로 바이러스는 온도를 높여 사멸시키거나 나노미터수준의 공극(pore size)을 갖는 필터를 이용하여 여과하여 바이러스를 제거한다. 하지만 콜라겐은 37℃ 이상의 고온에서 변성되어 삼중나선가닥을 이루는 구조가 세개의 단일 가닥으로 풀려 젤라틴화 되어 콜라겐의 기본 특성을 잃게 되며, 300나노미터에 이르는 고분자 단백질로써 바이러스 제거용 필터를 통과시키기가 매우 어렵다.
또한 콜라겐 추출과정에 있어서 널리 사용되는 효소나 염화나트륨 등 저분자 물질들이 의료용으로 적합한 수준으로 제거되어야 한다.
통상적으로 콜라겐을 의료용 재료로써 액상의 제형으로 사용할 때 콜라겐의 잔존기간을 늘리거나 부피를 유지하기 위해 30 ~ 60mg/mL의 고농도의 콜라겐이 요구되며, 동결건조를 통해 고형의 제형으로 제조할 때 또한 동결건조기의 용량과 가동시간을 줄이기위해 콜라겐의 높은 농도의 콜라겐이 요구된다. 이러한 의료용 재료로써 소비자의 요구를 충족시키기 위해 콜라겐은 60mg/mL 이상의 고농도로 제조되어질 필요가 있다.
또한 고농도의 액상 형태의 의료용 콜라겐 제품을 제조하기 위하여 콜라겐 분말을 이용한다면 콜라겐의 고유성질과 구조를 유지하며 분말상태에서 멸균이 불가능하며, 다시 액상으로 녹인 후 멸균 및 농축하는 과정에서 무균적인 설비와 장시간의 시간이 소요된다.
포유동물의 조직을 70% 에틸 알코올로 24시간, 산성용액에 72시간 이상 처리하여 바이러스를 불활성화하고, 0.22마이크로미터 공극의 필터로 여과함으로써 미생물을 제거하여 안전성을 확보한다.
펩신을 이용한 콜라겐 추출과 염화나트륨, 필터, 접선유동여과장치, pH 중성화 등을 통해 순도가 높은 콜라겐을 제조한다.
또한 접선유동여과, pH 중성화, 원심분리를 이용한 농축과정들을 통해 120mg/mL의 고농도로 농축하고 이를 균질하게 혼합하여 액상, 스폰지, 분말 형태의 다양한 제품을 제조할 수 있다.
상기와 같이 살펴본 바와 같이 포유동물의 조직을 바이러스 불활성화하고 접선유동여과를 통해 이전공정에 사용된 효소, 염화나트륨 등 저분자 물질을 제거 한 후 0.22마이크로 공극의 필터로 여과함으로써 의료용으로 적합한 무균의 액상 콜라겐을 제조할 수 있다. 또한 접선유동여과막, pH 중성화, 원심분리를 통해 120mg/mL의 고농도 액상 콜라겐으로 농축하여 액상과 무균성을 유지하면서 다양한 의료용 콜라겐 제품에 원료로 사용되어질 수 있다.
이하에서는 이러한 효과를 달성하기 위해 본 발명의 바람직한 실시 예를 첨부된 도면에 따라 상세히 설명하면 다음과 같다.
도 1은 본 발명의 접선유도여과장치(TFF)로 콜라겐을 여과하는 방법을 설명한 도식도
도 2는 본 발명의 접선유도여과막을 설명한 도식도
도 3은 본 발명의 중성화 반응탱크의 구조도
도 4는 홉합기의 구조도
<도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명>
10 ; 접선유도여과막장치 11 : 저장탱크
12 : 펌프 13 : 접선유도여과막
14 : 밸브 15 : 압력계
16 : 비투과물질회수 17 : 투과물질폐기
18 : 정제수
21 : 용액의 흐름방향 22 : 압력방향
23 : 접선유도여과막 24 : 비투과물질
25 : 투과물질 31, a : 개스킷
32, b : 조임장치 33 : PH적정용액투입구
34 : PH전극 c : 회전축 밀봉장치
d : PH전극
본 발명은 의료용 재료로 사용하기 위해 포유동물의 조직을 원료로 생물학적 안전성을 확보하고 순도가 높은 고농도의 액상 콜라겐을 추출함을 특징으로 한다.
먼저 포유동물의 조직을 깨끗한 물과 알코올 등으로 깨끗하게 세척한 후 냉동보관한다. 이때 물은 미생물과 이온 등이 제거된 정제수가 적합하고, 알코올은 소독효과를 위해 70% 에틸 알코올을 사용함이 바람직하다.
동물의 조직은 추출과정에 앞서 분쇄기를 이용하여 잘게 분쇄한 후 70% 에틸 알코올에 24시간동안 침적하여 전처리과정을 수행한다.
전처리과정을 수행한 동물의 조직을 정제수로 헹군 후 추출과정을 수행한다.
첫번째 추출과정인 효소처리는 pH 1.5 ~ 2.5로 적정된 정제수에 조직과 단백질 분해효소를 넣어 72시간 이상 교반하며 반응시킨다.
이때 pH 적정에는 인산, 염산 등 다양한 산성용액을 사용할 수 있으며, 단백질 분해효소는 콜라겐의 삼중나선 구조를 손상시키지 않고 인체에 면역반응을 일으킬 수 있는 말단부분을 제거할 수 있는 펩신을 사용함이 바람직하다.
효소처리의 pH가 1.5 미만일 경우 이후 여과공정 시 사용되는 필터의 화학적 내성에 적합하지 않을 수 있으며, pH 2.5을 초과하거나 반응시간이 72시간 미만일 경우 바이러스 불활성화 효과가 떨어질 수 있다.
상기 에틸 알코올에 72시간 이상 침적시키는 전처리과정과 pH 2.5 이하로 72시간 이상 효소처리하는 과정을 통해 동물조직으로부터 혼입될 수 있는 바이러스를 불활성화 하여 생물학적 안전성을 확보할 수 있다.
두번째 추출 및 정제과정으로써 효소처리가 완료된 용액에 염화나트륨을 0.5 ~ 0.9 M 농도가 되도록 첨가하여 반응시키는 염처리과정을 수행한다. 각 단백질은 특정 염농도에서 응집하는 성질을 가지고 있으며 콜라겐은 상기 염농도에서 응집하여 부유하는 특성을 이용한 과정으로써 기타 응집하지 않은 불순물은 폐기하여 콜라겐의 순도를 높일 수 있다.
응집된 콜라겐은 여과 공정을 진행 할 수 있도록 다시 정제수로 용해한다.
세번째 정제과정으로써 일차적으로 2.0 ~ 0.5마이크로미터 공극(Pore size)의 필터를 이용하여 여과하고, 접선유동여과장치(TFF: Tangential Flow Filtration)를 이용하여 용액내 펩신, 염화나트륨 등 저분자 물질들을 제거한다.
이때 접선유동여과장치는 50kDa ~ 150kDa의 분자량 차단(MWCO) 여과막을 이용함이 바람직하며, 이는 150kDa 이하 분자량 차단 여과막을 사용함으로써 약 300kDa의 콜라겐의 소실을 방지하고 50kDa 이상의 분자량 차단(MWCO) 여과막을 통해 약 35kDa의 펩신을 제거하기 위함이다.
접선유동여과장치를 이용한 여과과정은 저장탱크(11), 펌프(12), 여과막(13) 외 압력계(15)와 밸브(14)로 이루어진다. 저장탱크의 용액을 펌프로 여과막으로 이송하여 여과막의 공극보다 큰 콜라겐은 투과하지 않고 저장탱크로 회수되도록 하고 공극보다 작은 불순물들은 공극을 투과하여 제거되도록 한다. 여과막의 공극을 통해 제거된 용량만큼 정제수를 첨가하고 이를 반복하게 되면 저장탱크 내 콜라겐용액의 흐름성을 확보하면서 순도를 높일 수 있다(도면 1, 2). 접선유동여과장치를 이용한 정제결과는 다양한 방법으로 확인할 수 있으며, 그중 염화나트륨 제거는 삼투압 측정을 통해 확인이 가능하다(실시예 3 참조).
상기 접선유동여과장치를 이용한 과정은 정제 외에도 농축의 목적으로 사용된다. 불순물 제거가 완료된 시점에서 정제수 첨가없이 여과를 반복하게되면 공극을 통해 수분이 제거되어 저장탱크 내 콜라겐의 함량은 증가하게 된다. 이를 이용하여 콜라겐의 함량이 10mg/mL까지 농축이 가능하며, 해당 공정을 통해 얻어진 콜라겐은 화장품 원료 등 높은 농도를 요구하지 않는 분야에 사용이 가능하다.
하지만 농도가 높아질수록 점도가 높아지는 콜라겐의 특성상 10mg/mL 이상으로 농축을 할 경우 여과막에 콜라겐이 쌓이는 현상이 발생하고, 콜라겐 용액의 흐름성이 크게 저하되어 수득율이 저하되고 장기간의 공정시간이 필요하게 된다. 의료용 콜라겐을 제조하기 위해서는 5mg/mL 이하의 농도로 농축하여 멸균여과가 가능한 흐름성과 점도를 확보한다.
접선유동여과장치를 이용한 정제 및 농축이 완료된 용액은 0.22마이크로미터 공극의 필터를 통과하여 여과하여 중성화 반응탱크로 이송한다. 이때 멸균필터와 중성화 반응탱크는 멸균이 선행되어야 함은 물론이며, 특히 중성화 반응탱크는 적절한 개스킷(31), 조임장치(32) 등으로 밀봉이 가능한 구조여야 하고, pH 적정용액 투입구와 pH 측정을 위한 전극 및 용액의 온도조절을 위한 자켓 등 의 장비가 구비되어있어야 한다(도면3).
멸균여과를 통해 미생물이 제거된 콜라겐 용액은 중성화 과정을 통해 다시 한번 정제 및 농축을 실시한다. 중성화 과정은 수산화나트륨, 염산 등 pH 적정용액을 첨가하여 콜라겐용액의 pH를 6.0 ~ 8.0으로 조절하고, 용액의 온도를 25 ~ 35 ℃로 조절하여 콜라겐을 응집시킨다.
상기 중성화 과정에서 제시한 pH 범위를 벗어나거나 용액의 온도가 낮으면 콜라겐의 응집이 충분하게 이루어지지 않을 수 있으며, 용액의 온도가 높으면 열에 의한 변성이 일어나 삼중나선구조가 풀릴 수 있다.
중성화 과정을 통해 콜라겐을 응집시킴으로써 응집되지 않은 용액을 제거하여 이후 원심분리를 이용한 농축 전 농축대상 용량을 줄일 수 있으며, 수분과 콜라겐의 분리를 용이하게 하여 낮은 원심력으로 짧은 시간내에 농축을 실행할 수 있어 상대적으로 적은 비용으로 대량생산이 가능한 설비를 구축할 수 있다.
중성화를 통해 응집된 콜라겐을 멸균가능한 원심분리용기에 넣은 후 원심분리기를 이용하여 4,000 ~ 6,000g의 중력가속도로 5분간 농축을 실행한다.
상기 원심력보다 낮거나 짧은 시간을 적용 시 콜라겐의 수득량이 저하되거나 최종 농도가 낮아지는 문제가 발생할 수 있으며, 더 높은 중력가속도와 시간을 적용시 이를 위한 고성능의 고가의 원심분리기가 요구되고 제조시간이 증가될 수 있다.
농축과정을 거친 콜라겐은 밀폐구조를 갖춘 혼합기(도면 4)에 넣은 후 균질하게 혼합하면 의료용 재료로 사용하기 위한 고농도의 콜라겐을 수득할 수 있다. 이때 콜라겐의 농도는 적용하고자 하는 목적에 따라 미생물 및 발열성 물질이 제거된 물을 첨가하여 조절할 수 있으며, 상기 조건하에서 120mg/mL의 고농도 콜라겐을 수득할 수 있다.
또한 상기 혼합과정에 있어서 염산 등 산성용액을 pH 적정용액으로 첨가하여 pH 1.5 ~ 5.5로 적정하여 보관하게 되면 균질한 상태로 장기간 안정적으로 보관할 수 있다. pH가 너무 낮으면 이후 의료용으로 제품을 제조하기 위해 pH를 중성으로 적정하기 힘들고 pH가 5.5보다 높으면 콜라겐이 다시 응집하여 균일한 농도를 유지하기 힘들다.
상기 추출, 정제, 농축 및 혼합과정을 통해 얻어진 콜라겐은 사용 용도에 따라 물, 등장용액, 혈소판 풍부 혈장(PRP), 히알루론산 등의 혼합용매와 혼합 및 희석하여 액상의 제품을 생산할 수 있으며, 농축된 콜라겐을 동결건조를 통해 고형의 제품을 생산할 수 있다.
특히 액상의 제품은 혼합, 충전 및 포장 공간 등 최소한의 클린룸 설비내에서 바이러스, 미생물 등을 제거한 생물학적 안전성이 확보된 상태를 유지하며 제품을 생산할 수 있다.
[실시예 1]
돼지의 피부조직을 이용한 의료용 콜라겐 제조 및 활용
1) 돼지의 피부 조직을 정제수와 알코올 등으로 깨끗하게 세척한 후 - 20 ℃ 이하로 냉동 보관한다.
2) 돼지의 피부 조직을 잘게 간다.
3) 분쇄된 피부 조직을 70% 에틸 알코올에 24시간동안 침적시킨다.
(바이러스 불활성화 공정 1단계)
4) 조직을 정제수로 헹구되 인산을 이용하여 산성(pH 1.5 ~ 2.5)으로 적정된 정제수에 넣은 후 펩신을 넣고 72시간이상 교반하여 반응 시킨다(바이러스 불활성화 공정 2단계)
이때 펩신의 양은 피부 조직중량의 1/4 ~ 1/10이 적절하다.
5) 염화나트륨을 0.5 ~ 0.9M 농도가 되도록 첨가, 교반하여 콜라겐이 응집되도록 한 후 응집되지 않은 용액을 제거한다.
6) 응집된 콜라겐을 pH 1.5 ~ 4.0로 적정된 용수로 용해한 후 2.0 ~ 0.5마이크로미터 공극(Pore size)의 필터를 이용하여 여과한다.
7) 콜라겐이 의료용으로 사용하기 적합하도록 접선유동여과장치(TFF: Tangential Flow Filtration)를 이용하여 용액내 펩신 등 저분자 물질들과 염화나트륨을 제거한다.
이때 접선유동여과장치는 50kDa ~ 150kDa의 분자량 차단(MWCO) 여과막을 이용함이 바람직하며, 여과막의 공극으로 빠져나간 용량만큼 정제수를 첨가하여 저장탱크 내 콜라겐 용액의 용량을 유지함으로써 흐름성을 확보한다.
8) 염화나트륨, 펩신 등 저분자 물질의 제거가 완료되면 정제수의 공급을 중단하고 접선유동여과는 유지하여 농축을 진행한다. 이때 콜라겐의 농도는 0.22마이크로미터 공극의 필터에 통과할 수 있도록 콜라겐의 농도를 5mg/mL 이하로 조절한다.
9) 미생물을 제거하기 위해 0.22마이크로미터 공극의 필터로 여과한다.
10) 미생물이 제거된 용액은 멸균된 중성화 탱크로 이송되게 한다. 중성화 탱크는 멸균이 가능하고, 멸균상태를 유지할 수 있는 밀봉 구조여야 하며, pH 적정용액 투입구와 pH 측정 전극이 구비되어있어야 한다.
11) 콜라겐을 응집시키기 위하여 염산(HCl)과 수산화 나트륨용액(NaOH)을 이용하여 pH를 중성(pH 6.0∼8.0)에 가깝도록 적정하고 콜라겐용액의 온도가 25∼35℃가 되도록 조절하여 4시간∼1일간 정치한다.
12) 응집되지 않은 용액은 폐기하고 응집된 콜라겐층을 원심분리용기에 담아 원심분리기에 넣고 4,000 ~ 6,000g의 중력가속도로 원심분리하여 콜라겐을 농축한다.
13) 원심분리용기내에 물을 제거하고 수분과 분리되어 농축된 콜라겐을 혼합기에 넣은 후 교반하면 약 120mg/mL 농도의 콜라겐을 수득할 수 있다.
이때 염산 등 산성용액과 혼합하여 pH를 1.5 ~ 5.5로 조절한다면 농도가 균질한 상태로 보관할 수 있다.
14) 상기 방법에 따라 콜라겐은 미생물이 제거되고 순도가 높으며 콜라겐의 성질을 유지한 상태로 제조되어 의료용으로 사용하기 적합하며, 120mg/mL의 고농도로 제조되어 다양한 제품으로 적용될 수 있다.
일례로 상기 콜라겐을 액상을 유지하며 인체내 염분과 동일한 조성을 갖도록 첨가제를 혼합한 후 프리필드실린지에 충전하여 인체에 주입할 수 있는 형태의 제품을 만들 수 있다.
[실시예 2]
바이러스 불활성 검증
상기 [실시예 1]의 제조과정 중 바이러스 불활성화과정을 3회에 걸친 모의실험을 통해 바이러스 불활성화 과정을 검증하였다.
지표 바이러스는 유전자형, 지질외피의 유무, 저항성 정도를 고려하여 PEDV(Porcine epidemic diarrhea virus), PRV(Porcine rotavirus), PPV(Porcine parvovirus), Pseudorabies virus를 선정하였다.
선정된 4종의 바이러스를 분쇄된 돼지에 접종한 후 실제 제조방법의 전처리과정과 효소처리과정을 재현하기 위해 70% 에틸 알코올에 24시간, 인산을 이용하여 pH 2.5로 적정한 산성용액에 72시간 반응시킨다.
바이러스 불활성화 과정을 재현한 샘플을 바이러스 정량분석을 통해 처리 전과 후를 비교한다.
동일 조건하에 3회에 걸친 모의실험 결과는 동일하게 나타났다. 모든 바이러스가 검출한계 이하로 검출되었으며, 각 바이러스 불활성화 과정별 log reduction factor 값은 바이러스 불활성화에 유효하다는 일반적인 기준인 2 log reduction factor 이상으로 확인되었다. 그리고 각 과정별 PEDV, PRV, PPV, Pseudorabies virus의 log reduction factor의 합(Maximum cumulative log reduction factor)은 각각 ≥ 6.75, ≥ 9.75, ≥ 8.75, ≥ 8.75로 나타나 강력한 바이러스 불활성화 효과를 나타내는 것으로 평가된다.
표 1
제조과정 Reduction factor (Log10TCID50)
PEDV PRV PPV Psedorabies virus
전처리 과정(70% 에틸 알코올, 24시간) ≥ 4.05 ≥ 5.55 ≥ 5.05 ≥ 5.05
효소처리 과정(pH 2.5, 72시간) ≥ 2.70 ≥ 4.20 ≥ 3.70 ≥ 3.70
Maximum cumulative log reduction factor ≥ 6.75 ≥ 9.75 ≥ 8.75 ≥ 8.75
[실시예 3]
접선유동여과를 이용한 염화나트륨 제거
상기 [실시예 1]에서 효소처리, 염화나트륨 처리, 2.0 ~ 0.5마이크로미터 공극(Pore size)의 필터를 이용하여 여과 후 100kDa의 분자량 차단(MWCO) 여과막을 이용하여 접선유동여과를 실시하였다.
이때 여과막의 공극을 통해 제거된 용량만큼 정제수를 첨가하고 이를 반복하게 되면 저장탱크 내 콜라겐용액의 흐름성을 확보하면서 염화나트륨, 펩신 등 저분자 물질을 제거하고 첨가된 정제수의 총 용량은 초기 콜라겐 용액용량의 5배를 가하였다.
상기 접선유동여과과정을 3회 반복하여 저분자물질의 제거결과를 염화나트륨을 대표물질로 선정하여 삼투압을 측정하여 검증하였다.
그 결과 제거비율이 각각 96.2%, 96.1%, 96.4%로 나타났으며, 평균 제거비율은 96.2%임을 확인하였다. 이를 통해 접선유동여과를 이용한 저분자물질 제거가 효과적임을 알 수 있으며, 특히 염화나트륨은 혈장 삼투압인 285mOsm보다 낮은 31 ~ 33mOsm의 삼투압을 보여 필요에 따라 등장용액과 혼합하여 의료용 재료로써 사용할 수 있다.
표 2
사례 삼투압(mOsm) 제거비율
접선유동 여과 전 접선유동 여과 후
1 840 32 96.2 %
2 846 33 96.1 %
3 861 31 96.4 %
평균 96.2 %
[실시예 4]
단계별 농축에 따른 콜라겐 농도
상기 [실시예 1]의 제조방법에 따라 돼지피부의 양은 5kg, 펩신의 양은 1kg을 사용하고, 접선유동여과 단계에서 초기 용량대비 1/2용량으로 농축을 진행하였을 때 각 단계별 콜라겐의 농도를 분석하였다.
효소처리 과정에서부터 2.0 ~ 0.5마이크로미터 공극의 필터를 이용한 여과 과정까지의 농도는 사례별로 1.6 ~ 2.4mg/mL 이었으며, 접선유동여과 과정에서 저분자물질 제거 후 3.2 ~ 4.8mg/mL의 농도로 농축하였다.
이는 접선유동여과 후 0.22 마이크로미터 공극의 멸균여과 필터를 통과시키기 위함이며, 2mg/mL 이하의 농도로 조절할 경우 콜라겐 용액의 증대되어 중성화 반응탱크의 용량이 커지고 중성화과정 후 원심분리를 이용한 농축에 많은 시간이 소요되어 결과적으로 비용상승의 결과를 야기할 수 있다. 반대로 5mg/mL 이상의 농도로 조절될 경우 점도가 상승하여 0.22 마이크로미터 공극의 멸균필터를 통과하기 어려워 조기에 멸균필터가 막혀 콜라겐 소실과 다량의 필터를 사용해야 하는 문제가 발생한다. 이러한 이유로 멸균여과 이전의 농도를 2 ~ 5mg/mL로 조절함이 바람직하다.
중성화과정을 통해 응집되지 않은 수분을 1차적으로 제거함으로써 콜라겐 농도를 3.2 ~ 4.8mg/mL에서 5.6 ~ 6.7mg/mL로 농축할 수 있음을 확인하였다. 이를 통해 중성화 과정 전 농도대비 약 1.4 ~1.8배로 농축하여 원심분리를 이용한 농축 시 초기용량을 줄일 수 있어 원심분리기 용량과 처리시간을 줄일 수 있는 산업적 이용의 잇점이 있다.
최종적으로 중성화 과정 후 응집된 콜라겐 용액을 원심분리를 이용하여 농축 시 각 사례별로 114.6 ~ 122.3mg/mL의 고농도 콜라겐을 수득할 수 있었으며, 이는 통상적으로 30 ~ 60mg/mL 농도로 사용되는 액상의 의료용 콜라겐 제품의 원료로 사용되기 적합할 뿐 아니라 동결건조를 이용한 고형의 제형을 제조하는데 있어서 동결건조기의 용량과 가동시간을 줄일 수 있는 잇점을 확보할 수 있다.
표 3
제조과정별 콜라겐 농도 (mg/mL)
제조과정 A B C D
사례 1 1.6 3.2 5.6 114.6
사례 2 2.4 4.8 6.7 122.3
사례 3 2.1 4.1 5.9 121.1
* 주) A: 효소처리 과정 ~ 여과(2.0 ~ 0.5 마이크로미터 공극) 과정
B: 접선유동여과과정(저분자 물질 제거 후 농축 과정)
C: 중성화 처리과정 (미응집 용액 제거 후)
D: 원심분리를 이용한 농축과정
본 발명은 상기 상세한 설명에 언급되는 특별한 형태로 한정되는 것이 아닌 것으로 이해되어야 하며 청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 정신과 범위 내에 있는 모든 변형물과 균등물 및 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

Claims (6)

  1. 포유동물의 조직을 세척하는 단계;
    세척된 포유동물의 조직을 분쇄하여 에틸 알코올에 침적하는 단계;
    상기 포유동물의 조직은 인산을 정제수에 넣은 후 펩신을 넣고 교반하여 반응시켜 효소 처리하는 단계;
    상기 효소처리된 콜라겐에 염화나트륨을 첨가하여 교반한 다음 콜라겐이 응집되도록 하는 단계;
    상기 응집된 콜라겐을 정제수로 용해한 후 필터를 이용하여 여과하고 접선유동여과장치를 이용하여 용액내 펩신, 저분자물질, 염화나트륨을 제거하고 농축하는 단계;
    상기 접선유동여과장치를 이용한 농축된 콜라겐을 멸균여과하고 중성화 반응탱크, pH용액을 이용하여 콜라겐을 응집시키고 미응집 용액을 제거하여 농축하는 단계;
    상기 농축된 콜라겐을 원심분리기를 이용하여 농축하고 농축된 콜라겐을 혼합기에 넣은 후 교반하는 단계를 포함하여 이루어지는 의료용 재료로 사용하기 위한 고농도 콜라겐 제조방법
  2. 제1항에 있어서, 포유동물의 분쇄된 조직을 70% 에틸 알코올에 72시간 이상 침적시킨 후, pH 1.5 ~ 2.5로 적정된 용액에서 펩신과 72시간 이상 반응시켜 바이러스를 불활성화함과 동시에 콜라겐을 추출하는 것을 특징으로 하는 의료용 재료로 사용하기 위한 고농도 콜라겐 제조방법
  3. 제1항에 있어서, 효소처리된 콜라겐에 염화나트륨을 0.5 ~ 0.9M 농도가 되도록 첨가하고 교반하여 콜라겐을 응집시키고 응집되지 않은 용액을 제거하며 응집된 콜라겐을 정제수로 용해한 후 2.0 ~ 0.5마이크로미터 공극의 필터로 여과함을 특징으로 하는 의료용 재료로 사용하기 위한 고농도 콜라겐 제조방법
  4. 제1항에 있어서, 상기 접선유도여과장치는 50kDa ~ 150kDa의 분자량 차단 여과막을 사용하고 제거된 용액만큼 정제수를 첨가하여 흐름성을 유지하며 여과막의 공극보다 작은 물질들을 제거한 후 0.22마이크로미터 공극의 필터 통과를 위해 5 mg/mL 이하로 농축함을 특징으로 하는 의료용 재료로 사용하기 위한 고농도 콜라겐 제조방법
  5. 제1항에 있어서, 접선유도장치를 이용하여 농축된 콜라겐을 pH가 중성(6.0 ~ 8.0)에 가깝도록 하고 그 온도가 25~35℃를 유지하여 4시간 ~ 24시간 정치하여 응집된 콜라겐을 회수하여 원심분리기의 용기에 담아 원심분리하여 콜라겐을 농축하는 것을 특징으로 하는 의료용 재료로 사용하기 위한 고농도 콜라겐 제조방법
  6. 제1항에 있어서, 중성화로 농축된 콜라겐을 4,000 ~ 6,000g의 중력가속도로 원심분리하여 농축하고 혼합기에 넣어 교반하여 120mg/mL의 고농도 콜라겐을 수득하는것을 특징으로 하는 의료용 재료로 사용하기 위한 고농도 콜라겐 제조방법
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