CN110898080B - 鲎血浆在促生长发育中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物工程领域，特别涉及鲎血浆在促生长发育中的应用，为解决鲎血浆利用率低，造成资源浪费的问题，本发明通过不同分子量的超滤膜将鲎血浆分离纯化成不同分子量区段的血浆冻干粉，鲎血浆全血对小鼠的急性毒性试验表明，鲎血浆全血对机体无损害；对不同分子量区段的鲎血浆冻干粉进行改善生长发育的药效试验表明，5～10KD的鲎血浆和10～30KD的鲎血浆均具有改善生长发育的功能，有望应用于制备促生长发育的制剂和制备治疗儿童身材矮小症的药物中，还可以制备成促生长发育的制剂，以改善生长发育和儿童的身材矮小症状。本发明不仅有助于鲎血浆的资源化利用，而且也为研发制备简单，且效果明显的促生长产品提供了新的方向。

Description

鲎血浆在促生长发育中的应用

技术领域

本发明涉及生物工程领域，特别涉及鲎血浆在促生长发育中的应用。

背景技术

鲎又称马蹄蟹，是一种十分珍贵的海洋生物，其重要经济价值主要体现在含铜离子的蓝色血液上，鲎血中含有丰富的活性蛋白，目前人们对鲎血的研究主要集中在占鲎血1％的血细胞和血蓝蛋白中，而对于占比99％的血浆的利用较少，导致鲎血的利用率较低，造成资源浪费。

身材矮小是指在相似生活环境下，同种族、同性别和年龄的个体身高低于正常人群平均身高2个标准差者(-2SD)，或低于第3百分位数(-1.88SD)的个体。个子矮小的儿童可能会面临心理社会问题的风险，如缺乏自尊、社交能力低下或成为欺凌的受害者等。导致儿童出现矮小身材的原因有很多，其中生长激素缺乏症(Growth Hormone Deficiency,GHD)、特发性矮小(Idiopathic Short Stature,ISS)、体质性青春发育期延迟(ConstitutionalDelay of Growth and Puberty,CDGP)、家族性矮小(Familia Sshort Stature,FSS)和先天性甲状腺功能减低症(Congenital Hypothyroidism,CH)为常见病因。目前，治疗矮小症的主要药物是重组人生长激素(recombinant human growth hormone，rhGH)。rhGH在改善身高方面有显著的疗效，其临床效果取决于开始治疗的年龄、骨龄及营养状况等多种因素，治疗越早，效果越好，应用rhGH第1年，促生长作用明显，随时间推移，作用减弱，通常可使患儿身高每年增加7～12cm。但rhGH价格昂贵，治疗成本约为9000-60000美元/cm，导致很多家庭负担不起，因此亟需一种制备简单，且效果明显的促生长产品。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供鲎血浆在促生长发育中的应用。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

本发明的第一个目的是提供鲎血浆在制备促生长发育的制剂中的应用。

优选的，所述鲎为中华鲎。

本发明的第二个目的是提供鲎血浆在制备治疗儿童身材矮小症的药物中的应用。

本发明通过改善生长发育的药效试验发现，鲎血浆全血具有改善生长发育的功能，为进一步探究发挥上述功能的鲎血浆的分子量区段，通过不同分子量的超滤膜将鲎血浆分离成不同分子量区段的鲎血浆超滤液，再制成鲎血浆冻干粉，然后对得到的鲎血浆冻干粉分别进行改善生长发育的药效试验，结果发现，10～30KD的鲎血浆和5～10KD的鲎血浆具有明显促生长发育的效果，提示鲎血浆可能具有改善儿童生长发育的功能。

因此，优选地，上述鲎血浆为5～10KD分子量区段的鲎血浆和/或10～30KD分子量区段的鲎血浆。

优选地，5～10KD分子量区段的鲎血浆和/或分子量区段10～30KD的鲎血浆通过超滤方法得到；当然，其他能够获得5～10KD分子量区段的鲎血浆和/或分子量区段10～30KD的鲎血浆的方法也可以用于本发明中。

具体的，上述超滤的方法为：分别利用30KD分子量的超滤膜、10KD分子量的超滤膜、5KD分子量的超滤膜对鲎血浆进行分离纯化，得到10～30KD的鲎血浆超滤液和5～10KD的鲎血浆超滤液。

本发明的第三个目的是提供一种促生长发育的制剂，所述制剂包括5～10KD分子量区段的鲎血浆和/或10～30KD分子量区段的鲎血浆。

本发明的第四个目的是提供促生长发育的制剂的制备方法，具体操作为：分别利用30KD分子量的超滤膜、10KD分子量的超滤膜、5KD分子量的超滤膜对鲎血浆进行分离纯化，得到10～30KD的鲎血浆超滤液和5～10KD的鲎血浆超滤液，收集鲎血浆超滤液即得。

为了提高上述鲎血浆的使用寿命，可以将上述促生长发育的制剂制成固体，例如制成冻干粉，当制成冻干粉时，促生长发育的制剂的制备方法还包括以下操作：将收集到的鲎血浆超滤液进行冷冻干燥(取10mL超滤液加入到90mm培养皿中，先置于-80℃下预冻2h，再置于-40℃、0.2mbar真空度的环境下冷冻干燥24h)，得到鲎血浆冻干粉。

当然，也可以将得到的鲎血浆冻干粉与其他辅剂配合，制成药品，或者保健品，增加产品的应用范围，和使用价值。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明采用不同分子量的超滤膜组件对新鲜鲎血浆进行分离提取，鲎血浆全血对小鼠的急性毒性试验表明，鲎血浆全血安全，对机体无损害；再通过对不同分子量区段的鲎血浆进行改善生长发育的药效试验表明，鲎血浆全血、5～10KD的鲎血浆和10～30KD的鲎血浆均具有改善生长发育的功能，结果提示鲎血浆可应用于制备促生长发育的制剂和制备治疗儿童身材矮小症的药物中，还可以制备成促生长发育的制剂，以改善生长发育和儿童的身材矮小症状。本发明不仅有助于鲎血浆的资源化利用，而且也为研发制备简单，且效果明显的促生长产品提供了新的方向。

附图说明

图1为3号鲎血浆样品(5～10KD的鲎血浆冻干粉)高剂量组(3高组)和4号鲎血浆样品(10～30KD的鲎血浆冻干粉)高剂量组(4高组)对小鼠身长尾长的影响趋势；

图2为给药2周(2W)和3周(3W)后，3号鲎血浆样品高剂量组(3高组)和4号鲎血浆样品高剂量组(4高组)对小鼠尾长的影响(与空白组比较，*p<0.05；**p<0.01.)；

图3为给药2周(2W)和3周(3W)后，3号鲎血浆样品高剂量组(3高组)和4号鲎血浆样品高剂量组(4高组)对小鼠身长的影响(与空白组比较，*p<0.05；**p<0.01.)；

图4为鲎血浆不同分子量区段的样品对小鼠股骨长度的影响(与空白组比较，*p<0.05；**p<0.01.)；

图5为鲎血浆不同分子量区段的样品对小鼠胫骨长度的影响(与空白组比较，*p<0.05；**p<0.01.)。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1一种鲎血浆的超滤纯化方法，包括以下步骤：

S1、往中华鲎血样品中加入抗凝剂(如肝素，10～20U/mL血)，经离心分层后收集得到鲎血浆；

S2、连接并清洗超滤膜组件和系统，用蒸馏水排空清洗3遍后循环清洗10min，排空后重新倒入1L蒸馏水；准备好原液罐和超滤液罐，将蠕动泵的进口管和超滤器回流管插入鲎血浆原液中，将超滤液出口管插入超滤液罐中；分配前设置好各项参数，包括泵头型号、回吸时间、分配液量等；超滤运转，用烧杯收集出口管的液体；当系统内浓缩工作至流量减小时应停止超滤，打开排空阀，将浓缩液排出；清洗滤膜时，先用0.3mol/L NaOH溶液循环清洗至没有泡沫，换蒸馏水清洗至水通量达到初始值；分别利用30KD分子量的超滤膜、10KD分子量的超滤膜、5KD分子量的超滤膜和2KD分子量的超滤膜对步骤S1中的鲎血浆进行分离纯化，得到五种不同分子量区段的鲎血浆超滤液，即大于30KD的鲎血浆超滤液、10～30KD的鲎血浆超滤液、5～10KD的鲎血浆超滤液、2～5KD的鲎血浆超滤液和小于2KD的鲎血浆超滤液；

S3、将步骤S2中得到的五种不同分子量区段的鲎血浆超滤液分别经过冷冻干燥处理后得到大于30KD的鲎血浆冻干粉、10～30KD的鲎血浆冻干粉、5～10KD的鲎血浆冻干粉、2～5KD的鲎血浆冻干粉和小于2KD的鲎血浆冻干粉。

实施例2鲎血浆全血冻干粉对小鼠的急性毒性试验

为了验证鲎血浆的安全性，以SPF级ICR小鼠为实验对象进行急性毒性试验，由于鲎血浆全血冻干粉的最大溶解度为0.1g/mL，皮下注射最大给药量为0.2mL/10g BW，因此，鲎血浆全血冻干粉的最大给药剂量为2g/kg。

选用40只3周龄的SPF级ICR小鼠，小鼠平均体重为14±2g，分为空白组与给药组，每组20只，雌雄各半。实验前饲养3～5天以适应环境，小鼠给药前禁食不禁水12h，给药组小鼠按2g/kg的剂量皮下注射鲎血浆全血冻干粉溶液，空白组则皮下注射等量的生理盐水。每天给药一次，连续给药14天，每天对小鼠体重、尾长、身长进行记录，实验结束后剖检脏器：心、肝、脾、肺、肾、脑，并计算小鼠的脏器系数(脏器系数＝脏器湿重/体重*100)，试验结果如表1所示。

试验结果显示，以鲎血浆全血冻干粉的最大给药量处理小鼠14天后，小鼠并未出现毒性反应，且脏器系数正常，表明鲎血浆没有急性毒性反应，对机体无损害，可以进行改善生长发育药效试验。

表1.鲎血浆对小鼠脏器系数的影响

组别/指标

心脏

肝脏

脾脏

肺

双肾

全脑

给药组♀

0.51±0.11

4.03±0.37

0.61±0.15

0.63±0.14

0.89±0.09

2.32±0.12

给药组♂

0.50±0.15

3.93±0.43

0.58±0.10

0.60±0.09

0.84±0.12

2.28±0.17

对照组♀

0.53±0.08

3.98±0.43

0.66±0.07

0.64±0.19

0.84±0.16

2.34±0.14

对照组♂

0.47±0.14

4.01±0.45

0.57±0.16

0.63±0.18

0.85±0.11

2.19±0.23

实施例3鲎血浆改善生长发育的药效试验

(1)试验用药：

鲎血浆全血浆冻干粉(标记为6号样品)，5个不同分子量区段的鲎血浆冻干粉：大于30KD的鲎血浆冻干粉(标记为5号样品)、10～30KD的鲎血浆冻干粉(标记为4号样品)、5～10KD的鲎血浆冻干粉组(标记为3号样品)、2～5KD的鲎血浆冻干粉(标记为2号样品)和小于2KD的鲎血浆冻干粉(标记为1号样品)，重组人生长激素(rhGH)，生理盐水。

(2)动物分组与饲养：

选168只3周龄的SPF级ICR雄性小鼠，小鼠平均体重为12±2g，将这些小鼠平均分为14组，每组12只，分别命名为空白组、阳性组、6号样品高剂量组(6高组)、6号样品低剂量组(6低组)、5号样品高剂量组(5高组)、5号样品低剂量组(5低组)、4号样品高剂量组(4高组)、4号样品低剂量组(4低组)、3号样品高剂量组(3高组)、3号样品低剂量组(3低组)、2号样品高剂量组(2高组)、2号样品低剂量组(2低组)、1号样品高剂量组(1高组)、1号样品低剂量组(1低组)。

实验前，小鼠于实验室饲养3d(及时观察小鼠的饮食、饮水、毛色及生活状态)以适应环境，小鼠分笼饲养，每笼6只，饮食、饮水不限。室温25±2℃，相对湿度60％，12h/12h明暗交替饲养。

(3)动物给药：

各实验组均采用皮下注射的方式进行给药，每天给药1次，连续给药4周(4W)。其中，阳性组为皮下注射重组人生长激素(rhGH)，给药剂量为20ug/kg/d BW，6号样品高剂量组、6号样品低剂量组、5号样品高剂量组、5号样品低剂量组、4号样品高剂量组、4号样品低剂量组、3号样品高剂量组、3号样品低剂量组、2号样品高剂量组、2号样品低剂量组、1号样品高剂量组、1号样品低剂量组分别注射给予相应剂量的鲎血浆冻干粉溶液，其中，高剂量组的给药剂量为0.1g/kg/d BW，低剂量的给药剂量为0.01g/kg/d BW，空白组皮下注射等体积的生理盐水。给药期间每周称两次体重，记录周进食量。

(4)指标测定：

身长、尾长以及股骨、胫骨长度的变化是小鼠生长发育最直观的指标，能直接反映出小鼠的生长状况。

实验开始后每周称两次体重，每周用游标卡尺对身长(鼻尖到肛门距离)和尾长(肛门到尾尖的距离)进行测量，观察体重、身长和尾长的变化情况，中华鲎血浆样品给药组ICR小鼠的身长、体重较空白组有显著性差异，则可说明实验组有改善生长发育的功能。此外，给药4周后，对各实验组小鼠的股骨长度和胫骨长度进行测量。

(5)试验结果：

如表2和图1、图2、图3的结果所示，在体重方面，给ICR小鼠皮下注射给药连续4W(28d)后，各区段的鲎血浆冻干粉对小鼠的体重变化均没有显著的影响。在身长方面，只有3号鲎血浆样品(5～10KD的鲎血浆冻干粉)高剂量组、4号鲎血浆样品(10～30KD的鲎血浆冻干粉)高剂量组和6号鲎血浆样品(鲎血浆全血浆冻干粉)高剂量组使小鼠的身长发生了显著的变化，具体表现在：与空白组相比，3号鲎血浆样品高剂量组在给ICR小鼠皮下注射给药3W和4W后分别使小鼠的身长增长4.53％和3.59％，4号鲎血浆样品高剂量组在给ICR小鼠皮下注射给药3W和4W后分别使小鼠的身长增长6.63％和5.23％，6号鲎血浆样品高剂量组在给ICR小鼠皮下注射给药4W后使小鼠的身长增长2.07％。在尾长方面，同样只有3号鲎血浆样品高剂量组、4号鲎血浆样品高剂量组和6号鲎血浆样品高剂量组能使小鼠的尾长发生了显著的变化，具体表现在：与空白组相比，3号鲎血浆样品高剂量组在给ICR小鼠皮下注射样品2W和3W后分别使小鼠的尾长增长3.09％和2.76％，4号鲎血浆样品高剂量组在给ICR小鼠皮下注射样品2W和3W后分别使小鼠的尾长增长3.52％和3.08％，6号鲎血浆样品高剂量组在给ICR小鼠皮下注射给药4W后使小鼠的身长增长1.55％。以上分析说明，3号鲎血浆样品高剂量组、4号鲎血浆样品高剂量组和6号鲎血浆样品高剂量组均具有较为显著的改善生长发育的作用，其中，3号鲎血浆样品高剂量组和4号鲎血浆样品高剂量组的作用效果更显著。

小鼠股骨、胫骨长度是反映小鼠骨生长的直观的指标，如图4和图5的结果所示，较空白组相比，4号鲎血浆样品高剂量组和6号鲎血浆样品高剂量组使小鼠的股骨长度和胫骨长度均发生了显著变化；而3号鲎血浆样品高剂量组只使小鼠的胫骨长度发生了显著变化，说明4号鲎血浆样品高剂量组在改善生长发育方面的作用较3号鲎血浆样品高剂量组更为显著。

综合实验例2和实验例3的分析结果证明，鲎血浆全血不仅安全、对机体无损害，而且具有改善生长发育的功能，对鲎血浆全血经过超滤分离成不同分子量的鲎血浆段后，其中的5～10KD的鲎血浆和10～30KD的鲎血浆均具有显著的改善生长发育的功能。说明鲎血浆中起促进生长发育作用的成分集中在5～10KD分子量的鲎血浆和10～30KD分子量的鲎血浆，说明鲎血浆全血、5～10KD的鲎血浆和10～30KD的鲎血浆有望应用于制备促生长发育的制剂和制备治疗儿童身材矮小症的药物中，比如制备成促生长发育的制剂，以改善生长发育和儿童的身材矮小症状，特别是5～10KD的鲎血浆和10～30KD的鲎血浆的治疗效果可能更为显著。

表2.不同分子量区段的鲎血浆对小鼠体重、身长和尾长的影响

注：*p<0.05；**p<0.01。

以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.鲎血浆在制备促小鼠生长发育的制剂中的应用；所述鲎血浆为5～10 KD分子量区段的鲎血浆和/或10～30 KD分子量区段的鲎血浆。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述5～10 KD 分子量区段的鲎血浆和/或分子量区段10～30 KD的鲎血浆通过超滤方法得到。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述超滤包括以下步骤：

分别利用30 KD分子量的超滤膜、10 KD分子量的超滤膜、5 KD分子量的超滤膜对鲎血浆进行分离纯化，得到10～30 KD的鲎血浆超滤液和5～10 KD的鲎血浆超滤液。

4.一种促小鼠生长发育的制剂，其特征在于，所述制剂的活性成分为5～10 KD 分子量区段的鲎血浆和/或10～30 KD分子量区段的鲎血浆。

5.权利要求4所述促小鼠生长发育的制剂的制备方法，其特征在于，具体操作为：分别利用30 KD分子量的超滤膜、10 KD分子量的超滤膜、5 KD分子量的超滤膜对鲎血浆进行分离纯化，得到10～30 KD的鲎血浆超滤液和5～10 KD的鲎血浆超滤液，收集鲎血浆超滤液即得。

6.根据权利要求5所述促小鼠生长发育的制剂的制备方法，其特征在于，还包括以下操作：将收集到的鲎血浆超滤液进行冷冻干燥，得到鲎血浆冻干粉。

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