CN105039479B - 一种鱼胶原蛋白短肽复合物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鱼胶原蛋白短肽复合物的制备方法，对鱼皮采用柠檬酸在80～100℃高温处理获得胶原蛋白，然后使用碱性蛋白酶和菠萝蛋白酶对胶原蛋白进行水解，再用酵母对水解后的胶原蛋白肽进行发酵处理，得到鱼胶原蛋白短肽复合物。本发明方法采用酸法浸提和热水浸提相结合的提取方法，从鱼皮中获得胶原蛋白，然后对胶原蛋白进行食品工业用蛋白酶、果蔬汁蛋白酶酶解后，再经微生物发酵获得胶原蛋白肽，制得了易于消化吸收且具有较佳口感和风味的胶原蛋白短肽复合物。本方法工艺简单，易于操作，并且具有胶原蛋白提取率高的特点。
Description
技术领域
本发明属于生物提取技术领域，涉及一种鱼胶原蛋白短肽复合物的制备方法。
背景技术
科学证实，天然蛋白质经水解后所产生的多肽具有免疫调节、激素调节、降血压、降血脂、抗疲劳、抗氧化等生理调节功能，是当前医学、食品界热衷研究的课题和极具发展前景的功能因子。胶原蛋白作为动物结缔组织中的主要成分，是动物体内含量最多、分布最广的一类天然蛋白质，可以作为制备胶原蛋白肽的主要来源之一。
近些年来，伴随着口蹄疫、疯牛病等传染性疾病的爆发，陆生动物源胶原蛋白的使用受到了越来越多的质疑。随后以水产鱼类加工副产物中提取的胶原蛋白作为可食用胶原蛋白肽的原料，不仅消除了陆生动物源胶原蛋白带来的安全隐患，而且提高了鱼类加工副产物的附加值，促进了水产鱼类加工副产物的综合利用步伐。
采用生物酶法水解动植物蛋白质，是目前制备蛋白短肽的主要方法。而经过对关于胶原蛋白肽提取工艺的大量文献进行具体分析后，我们发现按照一般方法提取的鱼皮胶原蛋白肽具有一定的腥味及苦味，且胶原蛋白肽的复合提取工艺的研究还较缺乏，尤其是利用果蔬汁中植物酶酶解胶原蛋白肽，再经微生物发酵的复合处理方法尚未报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种鱼胶原蛋白短肽复合物的制备方法，用以制备易于消化吸收、具有较佳口感和风味的胶原蛋白短肽复合物。
本发明所采用的技术方案是，一种鱼胶原蛋白短肽复合物的制备方法，对鱼皮采用柠檬酸在80～100℃高温处理获得胶原蛋白，然后使用碱性蛋白酶和菠萝蛋白酶对胶原蛋白进行水解，再用酵母对水解后的胶原蛋白肽进行发酵处理，得到鱼胶原蛋白短肽复合物。
本发明特点还在于，
一种鱼胶原蛋白短肽复合物的制备方法，具体按以下步骤实施：
步骤1，鱼皮预处理：
取鱼皮去鳞并清洗干净，用0.8～1.2mol/L的HCl溶液浸泡，然后用清水冲洗酸浸泡后的鱼皮；将鱼皮剪碎，置于0.1～0.15mol/L的NaOH溶液中浸泡，并进行搅拌；
步骤2，制备胶原蛋白溶液：
将步骤1预处理的鱼皮用蒸馏水浸泡，然后用质量浓度为0.5～2％的柠檬酸溶液常温浸泡至鱼皮软化；用蒸馏水冲洗柠檬酸处理的鱼皮至pH为6～7，再加入蒸馏水，控制温度进行水浴提取；最后通过抽滤除去不溶物，获得鱼皮胶原蛋白溶液；
步骤3，碱性蛋白酶酶解：
调节步骤2中获得的胶原蛋白溶液的pH值为8～9，添加碱性蛋白酶，置于摇床中酶解；然后热处理灭酶活，并离心，收集上清液，得到单一碱性蛋白酶酶解的胶原蛋白溶液；
步骤4，菠萝汁蛋白酶酶解：
在步骤3得到的胶原蛋白溶液中加入鲜菠萝汁，混匀，调节pH为6～7，放于摇床中酶解；然后热处理灭酶活操作，并离心，收集上清液，得到碱性蛋白酶和菠萝汁蛋白酶复合水解的胶原蛋白溶液；
步骤5，酵母发酵：
5.1：将步骤4得到的胶原蛋白溶液灭菌；同时将酵母菌复水活化，得到酵母溶液；
5.2：将酵母溶液加入灭菌的胶原蛋白溶液中接种发酵，然后将发酵液离心，收集上清液并冷冻干燥，即得到白色粉末状的鱼胶原蛋白短肽复合物。
步骤1中鱼皮与HCl溶液浸泡的料液比为1：8～10g/ml，浸泡时间为20～26小时；鱼皮与NaOH溶液浸泡的料液比为1：10～20g/ml，浸泡时间为12～48小时。
步骤2中预处理的鱼皮在洗净碱液时，蒸馏水中的浸泡时间为1～2小时；鱼皮与柠檬酸溶液浸泡的料液比为1：10～15g/ml；水浴提取过程中鱼皮与蒸馏水的料液比为1：6～10g/ml，水浴提取温度为80～100℃，提取时间2～5小时。
步骤3中碱性蛋白酶加入量为步骤2中获得的胶原蛋白溶液体积的0.56％，碱性蛋白酶是由诺维信中国生物技术有限公司生产的市售商品化碱性蛋白酶。
步骤3中酶解过程参数为：酶解时间4～6小时，酶解温度为60～65℃，摇床转速为100～140r/min；热处理温度为90～100℃，灭酶活时间为10～15min；离心转速为4000～6000r/min，离心时间为10～15min。
步骤4中菠萝汁与步骤3得到胶原蛋白溶液体积比为0.5～1.5：1。
步骤4中酶解过程参数为：酶解时间2～3小时，酶解温度为60～65℃，摇床转速为100～140r/min；热处理温度为90～100℃，灭酶活时间为10～15min；离心转速为4000～6000r/min，离心时间为10～15min。
步骤5.1中胶原蛋白溶液灭菌，具体为：将装有胶原蛋白溶液的容器用牛皮纸包好后放入高压蒸汽灭菌锅中，121～125℃高温灭菌30～40分钟，冷却至35～37℃；酵母菌复水活化，具体为：按质量体积比为1：10～15g/ml将干酵母加入到含糖5～8％的糖水中，温度控制在35～38℃，搅拌溶解，15-30分钟后冷却至28-35℃，得到酵母溶液。
步骤5.2中酵母溶液用量为胶原蛋白溶液体积的0.05～0.3％，菌数达5×106cfu/g，发酵温度35～37℃，发酵时间25～35小时；离心转速为4000～5000r/min，离心时间为10～15min；冷冻干燥时间为2天。
本发明的有益效果是，本发明方法采用酸法浸提和热水浸提相结合的提取方法，从鱼皮中获得胶原蛋白，然后对胶原蛋白进行食品工业用蛋白酶、果蔬汁蛋白酶酶解后，再经微生物发酵获得胶原蛋白肽，制得了易于消化吸收且具有较佳口感和风味的胶原蛋白短肽。本方法工艺简单，易于操作，并且具有胶原蛋白提取率高的特点。
附图说明
图1是本发明实施例1制得的样品1的分子量分布图；
图2是本发明实施例1制得的样品2的分子量分布图；
图3是本发明实施例1制得的样品3的分子量分布图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明提供了一种鱼胶原蛋白短肽复合物的制备方法，采用柠檬酸和90℃高温处理从鱼皮中获得胶原蛋白，然后使用碱性蛋白酶和菠萝蛋白酶对胶原蛋白进行水解，再用高活性干酵母对水解后的胶原蛋白肽进行发酵处理，进而制备出提取率高、易于消化吸收且具有较佳口感和风味的胶原蛋白短肽。具体按以下步骤实施：
步骤1，鱼皮预处理：
取适量鱼皮去鳞并清洗干净，用0.8～1.2mol/L的HCl溶液浸泡20～26小时，控制料液比1：8～10g/ml，再用清水冲洗酸浸泡后的鱼皮，去除鱼皮表面色素。将鱼皮剪碎成1.5×1.5cm左右大小的方块状，置于0.1～0.15mol/L的NaOH溶液中浸泡12～48小时，控制料液比为1：10～20g/ml，并同时用磁力搅拌器进行搅拌，除去杂蛋白和脂肪。
步骤2，制备胶原蛋白溶液：
将预处理的鱼皮用适量蒸馏水浸泡1～2小时，以便洗净残留的碱液。然后用质量浓度为0.5～2％的柠檬酸溶液常温浸泡至鱼皮软化，使得胶质膨胀，利于提胶，控制料液比为1：10～15g/ml。用蒸馏水冲洗柠檬酸处理的鱼皮至pH为6～7，再加入蒸馏水，料液比为1：6～10g/ml，于80～100℃温度下水浴提取2～5小时后，通过抽滤除去不溶物，获得鱼皮胶原蛋白溶液(含较多明胶)。低温存储备用。
步骤3，碱性蛋白酶酶解：
用1N的NaOH溶液，将步骤2中获得的胶原蛋白溶液的pH调节到8～9，添加胶原蛋白溶液体积0.56％的碱性蛋白酶，置于摇床中酶解4～6小时，酶解温度为60～65℃，摇床转速为100～140r/min。然后90～100℃下热处理10～15min灭酶活性，并以4000～6000r/min离心10～15min，收集上清液，得到单一碱性蛋白酶酶解胶原蛋白溶液。
其中碱性蛋白酶是由诺维信中国生物技术有限公司生产的市售商品化碱性蛋白酶。
步骤4，菠萝汁蛋白酶酶解：
按体积比1：0.5～1.5在步骤3得到的胶原蛋白溶液中加入鲜菠萝汁，混匀，用3N的HCl溶液调节pH为6～7，放于摇床中酶解2～3h，酶解温度为60～65℃，摇床转速为100～140r/min。然后重复步骤3中的灭酶活操作，并以4000～6000r/min离心10～15min，收集上清液，得到碱性蛋白酶和菠萝汁蛋白酶复合水解的胶原蛋白溶液。
步骤5，酵母发酵：
5.1灭菌：
将装有胶原蛋白溶液的容器用牛皮纸包好后放入高压蒸汽灭菌锅中，121～125℃高温灭菌30～40分钟，冷却至35～37℃等待接种发酵。
5.2酵母菌复水活化：
按质量体积比为1：10～15g/ml将干酵母加入到含糖5～8％的糖水中，温度控制在35～38℃，搅拌溶解，15-30分钟后冷却至28-35℃，得到酵母溶液。
5.3接种发酵：
将酵母溶液加入灭菌的胶原蛋白溶液中接种，接种酵母溶液量为胶原蛋白溶液体积的0.05～0.3％，菌数达5×106cfu/g，用适宜浓度的HCl溶液和NaOH溶液调节pH到6～7，35～37℃下发酵培养25～35小时。然后将发酵液以4000～5000r/min离心10～15min，收集上清液冷冻干燥2天，即得到白色粉末状的鱼胶原蛋白短肽复合物。
本发明方法，将从水产鱼类加工副产物中提取出的胶原蛋白溶液进行进一步的酶解与发酵处理，从而获得提取率高、易于消化吸收且具有较佳口感和风味的食用性胶原蛋白短肽。
本发明方法中所采用的鱼皮，既可以是罗非鱼、鲫鱼、鲤鱼、草鱼等淡水鱼鱼皮，也可以是鳕鱼、军曹鱼等海水鱼鱼皮。
实施例1
步骤1，鱼皮预处理：
取适量罗非鱼皮去鳞并清洗干净，用1mol/L的HCl浸泡24小时，控制料液比1：10g/ml，再用清水冲洗酸浸泡后的鱼皮，去除鱼皮表面色素。将鱼皮剪碎成1.5×1.5cm左右大小的方块状，置于0.1mol/L的NaOH溶液中浸泡24小时，控制料液比为1：20g/ml，并同时用磁力搅拌器进行搅拌，除去杂蛋白和脂肪。
步骤2，制备胶原蛋白溶液：
将预处理的鱼皮用适量蒸馏水浸泡1小时，以便洗净残留的碱液。然后用质量浓度为1％的柠檬酸溶液常温浸泡至鱼皮软化，使得胶质膨胀，利于提胶，控制料液比为1：15g/ml。用蒸馏水冲洗柠檬酸处理的鱼皮至pH为6～7，再加入蒸馏水，料液比为1：10g/ml，于90℃温度下水浴提取2小时后，通过抽滤除去不溶物，获得鱼皮胶原蛋白溶液(含较多明胶)。低温存储备用。
步骤3，碱性蛋白酶酶解：
用1N的NaOH溶液，将步骤2中获得的胶原蛋白溶液的pH调节到8～9，添加胶原蛋白溶液体积0.56％的碱性蛋白酶，置于摇床中酶解5小时，酶解温度为60℃，摇床转速为120r/min。然后100℃下热处理10min灭酶活性，并以4000r/min离心10min，收集上清液，得到单一碱性蛋白酶酶解胶原蛋白溶液，为样品1。
步骤4，菠萝汁蛋白酶酶解：
按体积比1：1在步骤3得到的胶原蛋白溶液中加入鲜菠萝汁，混匀，用3N的HCl溶液调节pH为6～7，放于摇床中酶解2h，酶解温度为60℃，摇床转速为120r/min。然后重复步骤3中的灭酶活操作，并以4000r/min离心10min，收集上清液，得到碱性蛋白酶和菠萝汁蛋白酶复合水解的胶原蛋白溶液，为样品2。
步骤5，高活性干酵母发酵：
5.1灭菌：
将装有胶原蛋白溶液的容器用牛皮纸包好后放入高压蒸汽灭菌锅中，121～125℃高温灭菌30分钟，冷却至35℃等待接种发酵。
5.2酵母菌复水活化：
按质量体积比为1：10g/ml将干酵母加入到含糖5％的糖水中，温度控制在38℃，搅拌溶解，20分钟后冷却至35℃，得到酵母溶液。
5.3接种发酵：
将酵母溶液加入灭菌的胶原蛋白提取液中接种，接种酵母溶液量为胶原蛋白溶液体积的0.05％，菌数达5×106cfu/g，用适宜浓度的HCl溶液和NaOH溶液调节pH到6～7，35℃下发酵培养30小时。然后将发酵液以4000r/min离心10min，收集上清液，为样品3，将上清液冷冻干燥2天，即得到白色粉末状的鱼胶原蛋白短肽复合物。
实施例2
步骤1，鱼皮预处理：
取鳕鱼鱼皮去鳞并清洗干净，用0.8mol/L的HCl溶液浸泡20小时，控制料液比1：8g/ml，再用清水冲洗酸浸泡后的鱼皮，去除鱼皮表面色素。将鱼皮剪碎成1.5×1.5cm左右大小的方块状，置于0.15mol/L的NaOH溶液中浸泡48小时，控制料液比为1：10g/ml，并同时用磁力搅拌器进行搅拌，除去杂蛋白和脂肪。
步骤2，制备胶原蛋白溶液：
将预处理的鱼皮用适量蒸馏水浸泡2小时，以便洗净残留的碱液。然后用质量浓度为0.5％的柠檬酸溶液常温浸泡至鱼皮软化，使得胶质膨胀，利于提胶，控制料液比为1：10g/ml。用蒸馏水冲洗柠檬酸处理的鱼皮至pH为6～7，再加入蒸馏水，料液比为1：6g/ml，于100℃温度下水浴提取5小时后，通过抽滤除去不溶物，获得鱼皮胶原蛋白溶液(含较多明胶)。低温存储备用。
步骤3，碱性蛋白酶酶解：
用1N的NaOH溶液，将步骤2中获得的胶原蛋白溶液的pH调节到8～9，添加胶原蛋白溶液体积0.56％的碱性蛋白酶，置于摇床中酶解6小时，酶解温度为65℃，摇床转速为100r/min。然后90℃下热处理15min灭酶活性，并以6000r/min离心15min，收集上清液，得到单一碱性蛋白酶酶解胶原蛋白溶液。
步骤4，菠萝汁蛋白酶酶解：
按体积比1：1.5在步骤3得到的胶原蛋白溶液中加入鲜菠萝汁，混匀，用3N的HCl溶液调节pH为6～7，放于摇床中酶解3h，酶解温度为65℃，摇床转速为100r/min。然后重复步骤3中的灭酶活操作，并以6000r/min离心15min，收集上清液，得到碱性蛋白酶和菠萝汁蛋白酶复合水解的胶原蛋白溶液。
步骤5，高活性干酵母发酵：
5.1灭菌：
将装有胶原蛋白溶液的容器用牛皮纸包好后放入高压蒸汽灭菌锅中，121～125℃高温灭菌40分钟，冷却至37℃等待接种发酵。
5.2酵母菌复水活化：
按质量体积比为1：15g/ml将干酵母加入到含糖8％的糖水中，温度控制在35℃，搅拌溶解，15分钟后冷却至28℃，得到酵母溶液。
5.3接种发酵：
将酵母溶液加入灭菌的胶原蛋白溶液中接种，接种酵母溶液量为胶原蛋白溶液体积的0.3％，菌数达5×106cfu/g，用适宜浓度的HCl溶液和NaOH溶液调节pH到6～7，37℃下发酵培养35小时。然后将发酵液以5000r/min离心15min，收集上清液冷冻干燥2天，即得到白色粉末状的鱼胶原蛋白短肽复合物。
实施例3
步骤1，鱼皮预处理：
取草鱼鱼皮去鳞并清洗干净，用1.2mol/L的HCl溶液浸泡26小时，控制料液比1：9g/ml，再用清水冲洗酸浸泡后的鱼皮，去除鱼皮表面色素。将鱼皮剪碎成1.5×1.5cm左右大小的方块状，置于0.12mol/L的NaOH溶液中浸泡36小时，控制料液比为1：15g/ml，并同时用磁力搅拌器进行搅拌，除去杂蛋白和脂肪。
步骤2，制备胶原蛋白溶液：
将预处理的鱼皮用适量蒸馏水浸泡1.5小时，以便洗净残留的碱液。然后用质量浓度为2％的柠檬酸溶液常温浸泡至鱼皮软化，使得胶质膨胀，利于提胶，控制料液比为1：13g/ml。用蒸馏水冲洗柠檬酸处理的鱼皮至pH为6～7，再加入蒸馏水，料液比为1：8g/ml，于80℃温度下水浴提取4小时后，通过抽滤除去不溶物，获得鱼皮胶原蛋白溶液(含较多明胶)。低温存储备用。
步骤3，碱性蛋白酶酶解：
用1N的NaOH溶液，将步骤2中获得的胶原蛋白溶液的pH调节到8～9，添加胶原蛋白溶液体积0.56％的碱性蛋白酶，置于摇床中酶解4小时，酶解温度为63℃，摇床转速为140r/min。然后95℃下热处理12min灭酶活性，并以5000r/min离心13min，收集上清液，得到单一碱性蛋白酶酶解胶原蛋白溶液。
步骤4，菠萝汁蛋白酶酶解：
按体积比1：0.5在步骤3得到的胶原蛋白溶液中加入鲜菠萝汁，混匀，用3N的HCl溶液调节pH为6～7，放于摇床中酶解2.5h，酶解温度为63℃，摇床转速为140r/min。然后重复步骤3中的灭酶活操作，并以5000r/min离心13min，收集上清液，得到碱性蛋白酶和菠萝汁蛋白酶复合水解的胶原蛋白溶液。
步骤5，高活性干酵母发酵：
5.1灭菌：
将装有胶原蛋白溶液的容器用牛皮纸包好后放入高压蒸汽灭菌锅中，121～125℃高温灭菌35分钟，冷却至36℃等待接种发酵。
5.2酵母菌复水活化：
按质量体积比为1：12g/ml将干酵母加入到含糖6％的糖水中，温度控制在36℃，搅拌溶解，30分钟后冷却至30℃，得到酵母溶液。
5.3接种发酵：
将酵母溶液加入灭菌的胶原蛋白溶液中接种，接种酵母溶液量为胶原蛋白溶液体积的0.15％，菌数达5×106cfu/g，用适宜浓度的HCl溶液和NaOH溶液调节pH到6～7，36℃下发酵培养25小时。然后将发酵液以4500r/min离心12min，收集上清液冷冻干燥2天，即得到白色粉末状的鱼胶原蛋白短肽复合物。
测定实施例1制得的胶原蛋白溶液的气味滋味及分子量分布：
一、胶原蛋白短肽溶液(样品1、2、3)的感官评价：
1、气味检测
将分别装有3种样品的容器用牛皮纸包好后放入高压蒸汽灭菌锅中，121℃下灭菌20分钟，冷却至常温。
评价前首先应晃动烧杯，然后于鼻前打开烧杯盖，按气味的分析技巧进行气味检测，识别样品中的每一种气味。评价应按风味先弱后强的原则进行，以免造成评价员的“嗅觉麻痹”或“疲劳”。一旦确定之后，评价员即盖上盖子，填写评分单。
2、滋味检测
将装有3种样品的容器用牛皮纸包好后放入高压蒸汽灭菌锅中，121℃下灭菌20分钟，冷却至常温。
按滋味的品尝技术进行滋味检测，品尝后吐到废旧的纸杯中，每个样品检测前后用38℃炭过滤水漱口。
感官评价结果如表1，由表1可知：样品3色泽状态较好，无异味，风味口感较佳。
表1 感官评价结果表
二、胶原蛋白短肽的分子量分布：
利用高效液相色谱法测定分子量分布，根据GB/T 22729-2008标准，将3种样品分别称取20mg于10ml容量瓶中，加入流动相定容。超声振荡10min，混匀，0.2μm滤膜过滤，上机检测，收集谱图。
检测条件：
色谱柱：Tsk gel G2000SWXL 300mm×7.8mm；
流动相：乙腈：水：三氟乙酸为45：55：0.1(v/v/v)；
检测波长：UV220nm；
流速：0.5mL/min；
柱温：30℃；
进样体积：10μL。
标准品：
细胞色素C(cyyochrome，M，12500)；
抑酞酶(aprotinin，M，6500)；
杆菌酶(bacitracin，M，1450)；
乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(M，451)；
乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(M，189)。
通过上述方法，分别测定样品1、2、3的分子量分布，如图1、图2、图3所示。
根据高效液相测定结果可知，只经过碱性蛋白酶处理获得的胶原蛋白肽溶液，约有71％的胶原蛋白分子量大于3000Da，而仅有2％的胶原蛋白分子量小于500Da；相反，经过碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶和酵母共同处理所得的胶原蛋白水解液中，分子量大于3000Da的胶原蛋白几乎没有，而分子量小于500Da的胶原蛋白约占89％。比较碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶共同处理所得水解液和碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶、酵母共同处理所得水解液的分子量分布可知：两种样品的分子量分布差别不是很显著。
因此可得：经过碱性蛋白酶处理的水解物在菠萝蛋白酶的作用下，胶原蛋白水解效果显著；虽然碱性蛋白酶和菠萝蛋白酶分别处理所得的胶原蛋白肽分子量分布情况与碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶和酵母共同处理所得的胶原蛋白肽分子量分布相差不大，但是，再结合感官分析可知，后者处理所制备的胶原蛋白肽溶液色泽状态更好、口感风味更佳，且无异味。最终确定，两步酶法结合发酵法是制备罗非鱼皮胶原蛋白肽的最佳方法。
Claims (9)
1.一种鱼胶原蛋白短肽复合物的制备方法，其特征在于，按以下步骤实施：
步骤1，鱼皮预处理：
取鱼皮去鳞并清洗干净，用0.8～1.2mol/L的HCl溶液浸泡，然后用清水冲洗酸浸泡后的鱼皮；将鱼皮剪碎，置于0.1～0.15mol/L的NaOH溶液中浸泡，并进行搅拌；
步骤2，制备胶原蛋白溶液：
将步骤1预处理的鱼皮用蒸馏水浸泡，然后用质量浓度0.5～2％的柠檬酸溶液常温浸泡至鱼皮软化，鱼皮与柠檬酸溶液浸泡的料液比为1：10～15g/ml；用蒸馏水冲洗柠檬酸处理的鱼皮至pH为6～7，再加入蒸馏水，控制温度进行水浴提取；水浴提取过程中鱼皮与蒸馏水的料液比为1：6～10g/ml，水浴提取温度为80～100℃，提取时间2～5小时；最后通过抽滤除去不溶物，获得鱼皮胶原蛋白溶液；
步骤3，碱性蛋白酶酶解：
调节步骤2中获得的胶原蛋白溶液的pH值为8～9，添加碱性蛋白酶，置于摇床中酶解；然后热处理灭酶活，并离心，收集上清液，得到单一碱性蛋白酶酶解的胶原蛋白溶液；
步骤4，菠萝汁蛋白酶酶解：
在步骤3得到的胶原蛋白溶液中加入鲜菠萝汁，混匀，调节pH为6～7，放于摇床中酶解；然后热处理灭酶活操作，并离心，收集上清液，得到碱性蛋白酶和菠萝汁蛋白酶复合水解的胶原蛋白溶液；
步骤5，酵母发酵：
5.1：将步骤4得到的胶原蛋白溶液灭菌；同时将酵母菌复水活化，得到酵母溶液；
5.2：将酵母溶液加入灭菌的胶原蛋白溶液中接种发酵，然后将发酵液离心，收集上清液并冷冻干燥，即得到白色粉末状的鱼胶原蛋白短肽复合物。
2.根据权利要求1所述的一种鱼胶原蛋白短肽复合物的制备方法，其特征在于，步骤1中所述鱼皮与HCl溶液浸泡的料液比为1：8～10g/ml，浸泡时间为20～26小时；鱼皮与NaOH溶液浸泡的料液比为1：10～20g/ml，浸泡时间为12～48小时。
3.根据权利要求1所述的一种鱼胶原蛋白短肽复合物的制备方法，其特征在于，步骤2中所述预处理的鱼皮用蒸馏水浸泡时，蒸馏水中的浸泡时间为1～2小时。
4.根据权利要求1所述的一种鱼胶原蛋白短肽复合物的制备方法，其特征在于，步骤3中所述碱性蛋白酶加入量为步骤2中获得的胶原蛋白溶液体积的0.56％，碱性蛋白酶是由诺维信中国生物技术有限公司生产的市售商品化碱性蛋白酶。
5.根据权利要求1所述的一种鱼胶原蛋白短肽复合物的制备方法，其特征在于，步骤3中所述酶解过程参数为：酶解时间4～6小时，酶解温度为60～65℃，摇床转速为100～140r/min；热处理温度为90～100℃，灭酶活时间为10～15min；离心转速为4000～6000r/min，离心时间为10～15min。
6.根据权利要求1所述的一种鱼胶原蛋白短肽复合物的制备方法，其特征在于，所述步骤4中所述菠萝汁与步骤3得到胶原蛋白溶液体积比为0.5～1.5：1。
7.根据权利要求1所述的一种鱼胶原蛋白短肽复合物的制备方法，其特征在于，步骤4中所述酶解过程参数为：酶解时间2～3小时，酶解温度为60～65℃，摇床转速为100～140r/min；热处理温度为90～100℃，灭酶活时间为10～15min；离心转速为4000～6000r/min，离心时间为10～15min。
8.根据权利要求1所述的一种鱼胶原蛋白短肽复合物的制备方法，其特征在于，步骤5.1中所述胶原蛋白溶液灭菌为：将装有胶原蛋白溶液的容器用牛皮纸包好后放入高压蒸汽灭菌锅中，121～125℃高温灭菌30～40分钟，冷却至35～37℃；酵母菌复水活化为：按质量体积比为1：10～15g/ml将干酵母加入到含糖5～8％的糖水中，温度控制在35～38℃，搅拌溶解，15-30分钟后冷却至28-35℃，得到酵母溶液。
9.根据权利要求1所述的一种鱼胶原蛋白短肽复合物的制备方法，其特征在于，步骤5.2中所述酵母溶液用量为胶原蛋白溶液体积的0.05～0.3％，菌数达5×106cfu/g，发酵温度35～37℃，发酵时间25～35小时；离心转速为4000～5000r/min，离心时间为10～15min；冷冻干燥时间为2天。
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