CN117534748B - 一种美容养颜鱼胶原蛋白肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于肽提取技术领域，具体涉及一种美容养颜鱼胶原蛋白肽的制备方法，所述制备方法包括采用鳕鱼的鱼骨和鱼皮作为原料，进行排酸，NaOH溶液和生姜液浸泡，NaCl浸泡，混合液浸泡，采用菠萝蛋白酶、胃蛋白酶和酰基转移酶I逐级酶解，最后将获得的1kDa以下小分子肽与复配液混合，浓缩，干燥，得到鱼胶原蛋白肽。本发明采用鳕鱼的鱼骨和鱼皮作为原料，制备易于渗透吸收的小分子肽，具有良好的淡化细纹、抗皱、抑菌、美白的作用；另外，设在制备前序、中序和后序都进行祛味设计，消除了鱼胶原蛋白肽应用在化妆品中具有鱼腥味的影响，且分子肽具有良好的稳定性，保证功效。
Description
技术领域
本发明属于肽提取技术领域，具体涉及一种美容养颜鱼胶原蛋白肽的制备方法。
背景技术
目前，高端化妆品中会添加有肽类物质，源自植物或动物的酶解提取肽，或者人工合成肽。肽成分在化妆品中常起到修复受损细胞、抑菌、抗敏、抗炎、美白、抗皱等作用。目前，天然胶原蛋白肽主要从哺乳动物、鱼类中提取，提取方法主要有酸或碱降解提取法和生物酶解法，酸或碱降解提取法容易破坏氨基酸，安全性差，生物活性损失大。而生物酶解对酶的选择和酶的组合形式，酶解顺序，都难以把握准确，肽分子量偏高，不易渗透吸收；并且不同来源、不同酶，以及不同条件下酶解，所产出的肽链氨基酸序列均不相同，其作用功效也不相同，市面上各类肽产品多种多样，功效不一。
总体上，对于经皮吸收的化妆品来说，肽链越短越容易渗透吸收，但功效欠佳。另外，从鱼类中提取的肽常携带有鱼腥味，影响在化妆品中的应用。
发明内容
针对现有胶原蛋白肽酶解提取存在的肽分子量偏高，不易吸收，而小分子肽功效欠佳的问题，以及鱼胶原蛋白肽带有鱼腥味，影响在化妆品中的应用问题。本发明提供一种美容养颜鱼胶原蛋白肽的制备方法，采用鳕鱼的鱼骨和鱼皮作为原料，制备易于渗透吸收的小分子肽，且用于美容抗皱的养颜功效良好，另外，设计了去腥方法，消除了鱼胶原蛋白肽应用在化妆品中，具有鱼腥味的影响。其具体技术方案如下：
一种美容养颜鱼胶原蛋白肽的制备方法，包括如下步骤：
S1：采用鳕鱼的鱼骨和鱼皮作为原料，将鱼骨和鱼皮进行水洗，然后置于温水中浸泡，紧接着迅速降温，冷冻排酸，取出解冻，再次水洗，沥干，绞碎，得到原料A；
S2：向原料A中加入NaOH溶液和生姜液，浸泡4h～6h，然后进行水洗至pH值为中性，离心分离，收集沉淀物Ⅰ，向沉淀物中加入NaCl溶液，浸泡2h～4h，然后进行水洗至pH值为中性，离心分离，收集沉淀物Ⅱ，向沉淀物中加入混合液，在50℃～60℃下，浸泡2h～4h，然后进行水洗至pH值为中性，离心分离，收集沉淀物Ⅲ，干燥后得到粉体B；
S3：按质量比为水：粉体B=100：（3～10），将粉体B悬浮于水中，加入粉体B质量0.5%～2%的菠萝蛋白酶；在负离子的发生量为2000个e-/cm3～2500个e-/cm3的MRM分子共振环境下进行水浴50℃反应1h～1.5h，然后灭酶，冷却，离心，收集上清液，进行喷雾干燥，得到干粉C；
S4：按质量比为KCl-HCl缓冲液：干粉C=100：（2～6），将干粉C悬浮于pH1.5、50mMKCl-HCl缓冲液中，加入干粉C质量2%～4%的胃蛋白酶；进行水浴37℃反应1h～1.5h，然后灭酶，冷却，离心，收集上清液，进行喷雾干燥，得到干粉D；
S5：按质量比为Tris-HCl缓冲液：干粉D=100：（2～6），将干粉D悬浮于pH8.0、50mMTris-HCl缓冲液中，加入干粉D质量3%～6%的酰基转移酶I；水浴57℃，25kHZ超声反应1h～1.5h，然后灭酶；冷却，采用1kDa超滤膜进行离心过滤率分离，得到小于1kDa的超滤液，进行喷雾干燥，得到干粉E；
S6：按质量比为复配液：干粉E=100：（20～25），将干粉E悬浮于复配液中，混合30min～60min，浓缩，干燥，得到鱼胶原蛋白肽。
上述方法的S1中，所述温水为40℃～45℃，浸泡时间为30min～40min；所述降温至-15℃以下；所述冷冻排酸的时间为2h以上。
上述方法的S2中，所述NaOH溶液的质量浓度为1%～1.5%；NaOH溶液加入量为原料A质量的8倍～10倍。
上述方法的S2中，所述生姜液的加入量为原料A质量的0.2倍～0.5倍。
上述方法的S2中，所述NaCl溶液的质量浓度为1.5%～3%；NaCl溶液的加入量为沉淀物Ⅰ质量的8倍～10倍。
上述方法的S2中，所述混合液的成分质量比为，水：聚谷氨酸钠：尿囊素：2-羟基丙酸=100：（1～3）：（3～6）：（3～8）；混合液的加入量为沉淀物Ⅱ质量的6倍～8倍。
上述方法的S2中，所述离心分离的转速为5000r/min～8000r/min，时间为15min～25min。
上述方法的S3、S4和S5中，所述灭酶为升温至95℃～100℃保持20min～30min。
上述方法的S3、S4和S5中，所述离心的转速为8000r/min～12000r/min，时间为15min～25min。
上述方法的S6中，所述复配液的成分质量比为，水：愈创木奥磺酸钠：椰油基葡糖苷：六氢麝香草酚=100：（0.2～1）：（0.2～1）：（0.2～1）。
上述方法的S6中，混合的时间为30min～60min。
本发明的一种美容养颜鱼胶原蛋白肽的制备方法，与现有技术相比，有益效果为：
一、本发明制备方法采用鳕鱼的鱼骨和鱼皮作为原料，温水浸泡后快速冷冻排酸，能够提高蛋白质提取质量。
二、加入NaOH溶液和生姜液，浸泡4h～6h，能够去除一部分腥味，有效减轻腥味。
三、加入NaCl溶液，浸泡2h～4h，能够去除脂肪、脂肪衍生物以及非胶原蛋白，有效减少脂肪及其衍生物对后续工序的影响，保证蛋白质提取质量。
四、后续采用混合液浸泡，混合液中的聚谷氨酸钠、尿囊素、2-羟基丙酸，能够膨胀固体组织结构，促进胶原蛋白的溶出，提高提取率，并且能够进一步减轻或去除胶原蛋白的异味。
五、本发明制备方法采用菠萝蛋白酶、胃蛋白酶和酰基转移酶I进行逐级酶解，得到小于1kDa的小分子肽，且能够快速渗透皮肤，促进吸收，具有良好的淡化细纹、抗皱、抑菌、美白的作用。
六、设计添加菠萝蛋白酶在负离子的发生量为2000个e-/cm3～2500个e-/cm3的MRM分子共振环境下进行水浴50℃反应1h～1.5h，2000个e-/cm3～2500个e-/cm3的MRM分子共振环境能够促进酶解，提高酶解效率。
七、本发明方法设计肽干粉悬浮于复配液中，进行浓缩干燥，复配液包含愈创木奥磺酸钠、椰油基葡糖苷和六氢麝香草酚，三者配合能够作为小分子肽的保护剂，提高小分子肽的储存稳定性，保证有效性，另外，还能够进一步改善小分子肽的气味，以及促进功效发挥，得到适用于化妆品添加的鱼胶原蛋白肽。
具体实施方式
下面结合具体实施案例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例。
实施例1
一种美容养颜鱼胶原蛋白肽的制备方法，包括如下步骤：
S1：采用鳕鱼的鱼骨和鱼皮作为原料，将鱼骨和鱼皮进行水洗，然后置于42℃的温水中浸泡35min，紧接着迅速降温至-18℃，冷冻排酸2.5h，取出解冻，再次水洗，沥干，绞碎，得到原料A；
S2：向原料A中加入9质量的质量浓度为1.2%的NaOH溶液和0.35倍质量的生姜液，浸泡5h，然后进行水洗至pH值为中性，离心分离，收集沉淀物Ⅰ，向沉淀物中加入9倍质量的质量浓度为2.2%的NaCl溶液，浸泡3h，然后进行水洗至pH值为中性，离心分离，收集沉淀物Ⅱ，向沉淀物中加入7倍质量的混合液，在55℃下，浸泡3h，然后进行水洗至pH值为中性，6500r/min离心分离20min，收集沉淀物Ⅲ，干燥后得到粉体B；
其中，混合液的成分质量比为，水：聚谷氨酸钠：尿囊素：2-羟基丙酸=100：2：4.5：5.5；
S3：按质量比为水：粉体B=100：6.5，将粉体B悬浮于水中，加入粉体B质量1.2%的菠萝蛋白酶；在负离子的发生量为2300个e-/cm3的MRM分子共振环境下进行水浴50℃反应1.2h，然后升温至95℃灭酶25min，冷却，10000r/min离心20min，收集上清液，进行喷雾干燥，得到干粉C；
S4：按质量比为KCl-HCl缓冲液：干粉C=100：4，将干粉C悬浮于pH1.5、50mM KCl-HCl缓冲液中，加入干粉C质量3%的胃蛋白酶；进行水浴37℃反应1.2h，然后升温至98℃灭酶25min，冷却，10000r/min离心20min，收集上清液，进行喷雾干燥，得到干粉D；
S5：按质量比为Tris-HCl缓冲液：干粉D=100：4，将干粉D悬浮于pH8.0、50mM Tris-HCl缓冲液中，加入干粉D质量4.5%的酰基转移酶I；水浴57℃，25kHZ超声反应1.2h，然后升温至98℃灭酶25min；冷却，采用1kDa超滤膜进行离心过滤率分离，得到小于1kDa的超滤液，进行喷雾干燥，得到干粉E；
S6：按质量比为复配液：干粉E=100：23，将干粉E悬浮于复配液中，混合45min，浓缩，干燥，得到鱼胶原蛋白肽；
其中，复配液的成分质量比为，水：愈创木奥磺酸钠：椰油基葡糖苷：六氢麝香草酚=100：0.6：0.6：0.6。
实施例2
一种美容养颜鱼胶原蛋白肽的制备方法，包括如下步骤：
S1：采用鳕鱼的鱼骨和鱼皮作为原料，将鱼骨和鱼皮进行水洗，然后置于40℃的温水中浸泡30min，紧接着迅速降温至-16℃，冷冻排酸2h，取出解冻，再次水洗，沥干，绞碎，得到原料A；
S2：向原料A中加入8倍质量的质量浓度为1%的NaOH溶液和0.2倍质量的生姜液，浸泡4h，然后进行水洗至pH值为中性，离心分离，收集沉淀物Ⅰ，向沉淀物中加入8倍质量的质量浓度为1.5%的NaCl溶液，浸泡2h，然后进行水洗至pH值为中性，离心分离，收集沉淀物Ⅱ，向沉淀物中加入6倍质量的混合液，在50℃下，浸泡2h，然后进行水洗至pH值为中性，5000r/min离心分离25min，收集沉淀物Ⅲ，干燥后得到粉体B；
其中，混合液的成分质量比为，水：聚谷氨酸钠：尿囊素：2-羟基丙酸=100：1：3：3；
S3：按质量比为水：粉体B=100：3，将粉体B悬浮于水中，加入粉体B质量0.5%的菠萝蛋白酶；在负离子的发生量为2000个e-/cm3的MRM分子共振环境下进行水浴50℃反应1h，然后升温至95℃灭酶20min，冷却，8000r/min离心25min，收集上清液，进行喷雾干燥，得到干粉C；
S4：按质量比为KCl-HCl缓冲液：干粉C=100：2，将干粉C悬浮于pH1.5、50mM KCl-HCl缓冲液中，加入干粉C质量2%的胃蛋白酶；进行水浴37℃反应1h，然后升温至95℃灭酶20min，冷却，8000r/min离心25min，收集上清液，进行喷雾干燥，得到干粉D；
S5：按质量比为Tris-HCl缓冲液：干粉D=100：2，将干粉D悬浮于pH8.0、50mM Tris-HCl缓冲液中，加入干粉D质量3%的酰基转移酶I；水浴57℃，25kHZ超声反应1h，然后升温至95℃灭酶20min；冷却，采用1kDa超滤膜进行离心过滤率分离，得到小于1kDa的超滤液，进行喷雾干燥，得到干粉E；
S6：按质量比为复配液：干粉E=100：20，将干粉E悬浮于复配液中，混合30min，浓缩，干燥，得到鱼胶原蛋白肽；
其中，复配液的成分质量比为，水：愈创木奥磺酸钠：椰油基葡糖苷：六氢麝香草酚=100：0.2：0.2：0.2。
实施例3
一种美容养颜鱼胶原蛋白肽的制备方法，包括如下步骤：
S1：采用鳕鱼的鱼骨和鱼皮作为原料，将鱼骨和鱼皮进行水洗，然后置于45℃的温水中浸泡40min，紧接着迅速降温至-20℃，冷冻排酸4h，取出解冻，再次水洗，沥干，绞碎，得到原料A；
S2：向原料A中加入10倍质量的质量浓度为1.5%的NaOH溶液和0.5倍质量的生姜液，浸泡6h，然后进行水洗至pH值为中性，离心分离，收集沉淀物Ⅰ，向沉淀物中加入10倍质量的质量浓度为3%的NaCl溶液，浸泡4h，然后进行水洗至pH值为中性，离心分离，收集沉淀物Ⅱ，向沉淀物中加入8倍质量的混合液，在60℃下，浸泡4h，然后进行水洗至pH值为中性，8000r/min离心分离25min，收集沉淀物Ⅲ，干燥后得到粉体B；
其中，混合液的成分质量比为，水：聚谷氨酸钠：尿囊素：2-羟基丙酸=100：3：6：8；
S3：按质量比为水：粉体B=100：10，将粉体B悬浮于水中，加入粉体B质量2%的菠萝蛋白酶；在负离子的发生量为2500个e-/cm3的MRM分子共振环境下进行水浴50℃反应1.5h，然后升温至100℃灭酶30min，冷却，12000r/min离心25min，收集上清液，进行喷雾干燥，得到干粉C；
S4：按质量比为KCl-HCl缓冲液：干粉C=100：6，将干粉C悬浮于pH1.5、50mM KCl-HCl缓冲液中，加入干粉C质量4%的胃蛋白酶；进行水浴37℃反应1.5h，然后升温至100℃灭酶30min，冷却，12000r/min离心25min，收集上清液，进行喷雾干燥，得到干粉D；
S5：按质量比为Tris-HCl缓冲液：干粉D=100：6，将干粉D悬浮于pH8.0、50mM Tris-HCl缓冲液中，加入干粉D质量6%的酰基转移酶I；水浴57℃，25kHZ超声反应1.5h，然后升温至100℃灭酶30min；冷却，采用1kDa超滤膜进行离心过滤率分离，得到小于1kDa的超滤液，进行喷雾干燥，得到干粉E；
S6：按质量比为复配液：干粉E=100：25，将干粉E悬浮于复配液中，混合60min，浓缩，干燥，得到鱼胶原蛋白肽；
其中，复配液的成分质量比为，水：愈创木奥磺酸钠：椰油基葡糖苷：六氢麝香草酚=100：1：1：1。
实施例4
一种美容养颜鱼胶原蛋白肽的制备方法，包括如下步骤：
S1：采用鳕鱼的鱼骨和鱼皮作为原料，将鱼骨和鱼皮进行水洗，然后置于40℃的温水中浸泡40min，紧接着迅速降温至-17℃，冷冻排酸3h，取出解冻，再次水洗，沥干，绞碎，得到原料A；
S2：向原料A中加入8倍质量的质量浓度为1.5%的NaOH溶液和0.2倍质量的生姜液，浸泡6h，然后进行水洗至pH值为中性，离心分离，收集沉淀物Ⅰ，向沉淀物中加入8倍质量的质量浓度为3%的NaCl溶液，浸泡2h，然后进行水洗至pH值为中性，离心分离，收集沉淀物Ⅱ，向沉淀物中加入8倍质量的混合液，在50℃下，浸泡4h，然后进行水洗至pH值为中性，6000r/min离心分离25min，收集沉淀物Ⅲ，干燥后得到粉体B；
其中，混合液的成分质量比为，水：聚谷氨酸钠：尿囊素：2-羟基丙酸=100：1：6：3；
S3：按质量比为水：粉体B=100：10，将粉体B悬浮于水中，加入粉体B质量0.5%的菠萝蛋白酶；在负离子的发生量为2500个e-/cm3的MRM分子共振环境下进行水浴50℃反应1h，然后升温至95℃灭酶20min，冷却，12000r/min离心15min，收集上清液，进行喷雾干燥，得到干粉C；
S4：按质量比为KCl-HCl缓冲液：干粉C=100：6，将干粉C悬浮于pH1.5、50mM KCl-HCl缓冲液中，加入干粉C质量2%的胃蛋白酶；进行水浴37℃反应1.5h，然后升温至95℃灭酶30min，冷却，8000r/min离心25min，收集上清液，进行喷雾干燥，得到干粉D；
S5：按质量比为Tris-HCl缓冲液：干粉D=100：2，将干粉D悬浮于pH8.0、50mM Tris-HCl缓冲液中，加入干粉D质量6%的酰基转移酶I；水浴57℃，25kHZ超声反应1h，然后升温至100℃灭酶20min；冷却，采用1kDa超滤膜进行离心过滤率分离，得到小于1kDa的超滤液，进行喷雾干燥，得到干粉E；
S6：按质量比为复配液：干粉E=100：25，将干粉E悬浮于复配液中，混合30min，浓缩，干燥，得到鱼胶原蛋白肽；
其中，复配液的成分质量比为，水：愈创木奥磺酸钠：椰油基葡糖苷：六氢麝香草酚=100：1：0.2：1。
实施例5
一种美容养颜鱼胶原蛋白肽的制备方法，包括如下步骤：
S1：采用鳕鱼的鱼骨和鱼皮作为原料，将鱼骨和鱼皮进行水洗，然后置于45℃的温水中浸泡30min，紧接着迅速降温至-21℃，冷冻排酸2.5h，取出解冻，再次水洗，沥干，绞碎，得到原料A；
S2：向原料A中加入10倍质量的质量浓度为1%的NaOH溶液和0.5倍质量的生姜液，浸泡4h，然后进行水洗至pH值为中性，离心分离，收集沉淀物Ⅰ，向沉淀物中加入10倍质量的质量浓度为1.5%的NaCl溶液，浸泡4h，然后进行水洗至pH值为中性，离心分离，收集沉淀物Ⅱ，向沉淀物中加入6倍质量的混合液，在60℃下，浸泡2h，然后进行水洗至pH值为中性，8000r/min离心分离15min，收集沉淀物Ⅲ，干燥后得到粉体B；
其中，混合液的成分质量比为，水：聚谷氨酸钠：尿囊素：2-羟基丙酸=100：3：3：8；
S3：按质量比为水：粉体B=100：3，将粉体B悬浮于水中，加入粉体B质量2%的菠萝蛋白酶；在负离子的发生量为2000个e-/cm3的MRM分子共振环境下进行水浴50℃反应1.5h，然后升温至98℃灭酶30min，冷却，8000r/min离心25min，收集上清液，进行喷雾干燥，得到干粉C；
S4：按质量比为KCl-HCl缓冲液：干粉C=100：2，将干粉C悬浮于pH1.5、50mM KCl-HCl缓冲液中，加入干粉C质量4%的胃蛋白酶；进行水浴37℃反应1h，然后升温至100℃灭酶20min，冷却，12000r/min离心15min，收集上清液，进行喷雾干燥，得到干粉D；
S5：按质量比为Tris-HCl缓冲液：干粉D=100：6，将干粉D悬浮于pH8.0、50mM Tris-HCl缓冲液中，加入干粉D质量3%的酰基转移酶I；水浴57℃，25kHZ超声反应1.5h，然后升温至95℃灭酶30min；冷却，采用1kDa超滤膜进行离心过滤率分离，得到小于1kDa的超滤液，进行喷雾干燥，得到干粉E；
S6：按质量比为复配液：干粉E=100：20，将干粉E悬浮于复配液中，混合60min，浓缩，干燥，得到鱼胶原蛋白肽；
其中，复配液的成分质量比为，水：愈创木奥磺酸钠：椰油基葡糖苷：六氢麝香草酚=100：0.2：1：0.2。
实施例6
一种美容养颜鱼胶原蛋白肽的制备方法，包括如下步骤：
S1：采用鳕鱼的鱼骨和鱼皮作为原料，将鱼骨和鱼皮进行水洗，然后置于45℃的温水中浸泡40min，紧接着迅速降温至-25℃，冷冻排酸3h，取出解冻，再次水洗，沥干，绞碎，得到原料A；
S2：向原料A中加入10倍质量的质量浓度为1.5%的NaOH溶液和0.3倍质量的生姜液，浸泡6h，然后进行水洗至pH值为中性，离心分离，收集沉淀物Ⅰ，向沉淀物中加入10倍质量的质量浓度为2%的NaCl溶液，浸泡3h，然后进行水洗至pH值为中性，离心分离，收集沉淀物Ⅱ，向沉淀物中加入6倍质量的混合液，在60℃下，浸泡3h，然后进行水洗至pH值为中性，8000r/min离心分离20min，收集沉淀物Ⅲ，干燥后得到粉体B；
其中，混合液的成分质量比为，水：聚谷氨酸钠：尿囊素：2-羟基丙酸=100：2：4：5；
S3：按质量比为水：粉体B=100：6，将粉体B悬浮于水中，加入粉体B质量1.5%的菠萝蛋白酶；在负离子的发生量为2500个e-/cm3的MRM分子共振环境下进行水浴50℃反应1.5h，然后升温至95℃灭酶30min，冷却，10000r/min离心25min，收集上清液，进行喷雾干燥，得到干粉C；
S4：按质量比为KCl-HCl缓冲液：干粉C=100：5，将干粉C悬浮于pH1.5、50mM KCl-HCl缓冲液中，加入干粉C质量3%的胃蛋白酶；进行水浴37℃反应1h，然后升温至100℃灭酶20min，冷却，12000r/min离心20min，收集上清液，进行喷雾干燥，得到干粉D；
S5：按质量比为Tris-HCl缓冲液：干粉D=100：5，将干粉D悬浮于pH8.0、50mM Tris-HCl缓冲液中，加入干粉D质量5%的酰基转移酶I；水浴57℃，25kHZ超声反应1.5h，然后升温至100℃灭酶20min；冷却，采用1kDa超滤膜进行离心过滤率分离，得到小于1kDa的超滤液，进行喷雾干燥，得到干粉E；
S6：按质量比为复配液：干粉E=100：20，将干粉E悬浮于复配液中，混合35min，浓缩，干燥，得到鱼胶原蛋白肽；
其中，复配液的成分质量比为，水：愈创木奥磺酸钠：椰油基葡糖苷：六氢麝香草酚=100：0.5：0.5：0.5。
对实施例1至实施例6制备得到的干粉E进行检测，结果如表1所示：
表1 蛋白质测试结果
按照《化妆品安全技术规范》，将实施例1至实施例6的鱼胶原蛋白肽分别进行动物皮肤刺激试验、皮肤致敏试验、体外细胞毒性试验，检测结果安全无毒，没有显示对人体皮肤有潜在的不良反应。
体外抑菌实验
将实施例1至实施例6的鱼胶原蛋白肽分别进行抑菌实验，菌种分别为金黄葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌、马拉色菌。将浓度为120CFU/ml的不同菌种的菌悬液分别接入各自的培养基，然后分别加入实施例1至实施例6的鱼胶原蛋白肽；各试样于37℃培养箱培养48h，测量培养皿中抑菌圈直径，结果如下表2所示：
表2 抑菌实验结果
| 干粉E | 金黄葡萄球菌抑菌圈直径mm | 痤疮丙酸杆菌抑菌圈直径mm | 马拉色菌抑菌圈直径mm |
| 实施例1 | 15.4 | 14.2 | 12.3 |
| 实施例2 | 15.4 | 14.3 | 12.4 |
| 实施例3 | 15.3 | 14.3 | 12.5 |
| 实施例4 | 15.4 | 14.2 | 12.5 |
| 实施例5 | 15.5 | 14.3 | 12.4 |
| 实施例6 | 15.3 | 14.2 | 12.3 |
上述结果可知，鱼胶原蛋白肽对于金黄葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌、马拉色菌具有一定抑菌作用。
对实施例1至实施例6制备得到的鱼胶原蛋白肽进行人体美白去皱试用，将鱼胶原蛋白肽配置成霜膏，含质量份数为，纯化水3份、卡波姆0.2份、丁二醇1份、水溶氮酮1份和鱼胶原蛋白肽2份。制备对照样纯化水3份、卡波姆0.2份、丁二醇1份、水溶氮酮1份。选取70名受试者（20岁～45岁），分为7组；每组10人（5名男性，5名女性），面颊受试区域的皮肤明亮度ITA°平均值在20.12，7组分别对应涂覆实施例1至实施例6、对照样的霜膏，每天早晚洁面后各涂抹面部一次，按摩2min，测试环境温度：20℃～25℃，湿度：30％～60％；30天后测试及评价结果，如下表3所示：
表3 美白去皱效果评价
| 试样 | ITA°平均值 | 面部情况 |
| 实施例1 | 24.32 | 淡纹消失，细纹明显减少，暗沉减弱 |
| 实施例2 | 24.18 | 淡纹消失，细纹明显减少，暗沉减弱 |
| 实施例3 | 25.06 | 淡纹消失，细纹明显减少，暗沉减弱 |
| 实施例4 | 24.56 | 淡纹消失，细纹明显减少，暗沉减弱 |
| 实施例5 | 23.38 | 淡纹消失，细纹明显减少，暗沉减弱 |
| 实施例6 | 24.46 | 淡纹消失，细纹明显减少，暗沉减弱 |
| 对照样 | 20.10 | 未有改善 |
上述试用结果表明，实施例1至实施例6的鱼胶原蛋白肽具有良好的美白、去皱、养颜作用。并且鱼胶原蛋白肽气味良好，没有鱼腥味，具有良好的实用价值。
Claims (9)
1.一种美容养颜鱼胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：采用鳕鱼的鱼骨和鱼皮作为原料，将鱼骨和鱼皮进行水洗，然后置于温水中浸泡，紧接着迅速降温，冷冻排酸，取出解冻，再次水洗，沥干，绞碎，得到原料A；
S2：向原料A中加入NaOH溶液和生姜液，浸泡4h～6h，然后进行水洗至pH值为中性，离心分离，收集沉淀物Ⅰ，向沉淀物中加入NaCl溶液，浸泡2h～4h，然后进行水洗至pH值为中性，离心分离，收集沉淀物Ⅱ，向沉淀物中加入混合液，在50℃～60℃下，浸泡2h～4h，然后进行水洗至pH值为中性，离心分离，收集沉淀物Ⅲ，干燥后得到粉体B；
所述混合液的成分质量比为，水：聚谷氨酸钠：尿囊素：2-羟基丙酸=100：（1～3）：（3～6）：（3～8）；
S3：按质量比为水：粉体B=100：（3～10），将粉体B悬浮于水中，加入粉体B质量0.5%～2%的菠萝蛋白酶；在负离子的发生量为2000个e-/cm3～2500个e-/cm3的MRM分子共振环境下进行水浴50℃反应1h～1.5h，然后灭酶，冷却，离心，收集上清液，进行喷雾干燥，得到干粉C；
S4：按质量比为KCl-HCl缓冲液：干粉C=100：（2～6），将干粉C悬浮于pH1.5、50mM KCl-HCl缓冲液中，加入干粉C质量2%～4%的胃蛋白酶；进行水浴37℃反应1h～1.5h，然后灭酶，冷却，离心，收集上清液，进行喷雾干燥，得到干粉D；
S5：按质量比为Tris-HCl缓冲液：干粉D=100：（2～6），将干粉D悬浮于pH8.0、50mMTris-HCl缓冲液中，加入干粉D质量3%～6%的酰基转移酶I；水浴57℃，25kHZ超声反应1h～1.5h，然后灭酶；冷却，采用1kDa超滤膜进行离心过滤率分离，得到小于1kDa的超滤液，进行喷雾干燥，得到干粉E；
S6：按质量比为复配液：干粉E=100：（20～25），将干粉E悬浮于复配液中，混合30min～60min，浓缩，干燥，得到鱼胶原蛋白肽；
所述复配液的成分质量比为，水：愈创木奥磺酸钠：椰油基葡糖苷：六氢麝香草酚=100：（0.2～1）：（0.2～1）：（0.2～1）。
2.根据权利要求1所述的一种美容养颜鱼胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于，S1中，所述温水为40℃～45℃，浸泡时间为30min～40min；所述降温至-15℃以下；所述冷冻排酸的时间为2h以上；
S2中，所述NaOH溶液的质量浓度为1%～1.5%；NaOH溶液加入量为原料A质量的8倍～10倍。
3.根据权利要求1所述的一种美容养颜鱼胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于，S2中，所述生姜液的加入量为原料A质量的0.2倍～0.5倍。
4.根据权利要求1所述的一种美容养颜鱼胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于，S2中，所述NaCl溶液的质量浓度为1.5%～3%；NaCl溶液的加入量为沉淀物Ⅰ质量的8倍～10倍。
5.根据权利要求1所述的一种美容养颜鱼胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于，S2中，所述混合液的加入量为沉淀物Ⅱ质量的6倍～8倍。
6.根据权利要求1所述的一种美容养颜鱼胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于，S2中，所述离心分离的转速为5000r/min～8000r/min，时间为15min～25min。
7.根据权利要求1所述的一种美容养颜鱼胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于，S3、S4和S5中，所述灭酶为升温至95℃～100℃保持20min～30min。
8.根据权利要求1所述的一种美容养颜鱼胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于，S3、S4和S5中，所述离心的转速为8000r/min～12000r/min，时间为15min～25min。
9.根据权利要求1所述的一种美容养颜鱼胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于，S6中，混合的时间为30min～60min。
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