CN113604529B - 一种鸡羽毛低聚肽及其提取方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鸡羽毛低聚肽及其提取方法与应用，涉及日用化妆品技术领域。本发明所述鸡羽毛低聚肽的制备方法包括如下步骤：(1)粉碎鸡羽毛，得到鸡羽毛粉；(2)将鸡羽毛粉、还原剂、吗啉类离子液体混合均匀，加入水，在75～85℃下搅拌1～3h；以热过滤的方式收集滤液；再加水离心，得到鸡羽毛角蛋白；(3)在鸡羽毛角蛋白中添加角蛋白酶，于37～50℃酶解8～12h，再于90～110℃灭酶25～35min；用超滤膜从酶解液中分离出分子量在3000Da以内的鸡羽毛低聚肽。由本发明所述方法制备的鸡羽毛低聚肽具有良好的激活毛囊、改善生发微环境及育发作用，可外用于头皮，相比于口服用药，没有副作用。

Description

一种鸡羽毛低聚肽及其提取方法与应用

技术领域

本发明涉及日用化妆品技术领域，尤其涉及一种鸡羽毛低聚肽及其提取方法与应用。

背景技术

近年来，对于动植物蛋白来源的生物活性肽的临床作用功效、作用机理及产业化应用已成为国内外关注和研究的热点，已有很多科学研究结果表明这些小分子低聚肽具有增强免疫、改善机体状态、调节肠道菌群、抗氧化及抗衰老等多种生物活性，备受广大消费者的喜爱，具有巨大的商业开发价值和广阔的应用前景。目前，肉鸡的生产量及消费量极大，但是，在肉鸡加工过程中产生的大量羽毛资源没有得到充分的利用，目前绝大部分鸡羽毛被当作废物处理，少部分经粗加工做成羽毛肽粉用作动物饲料，这不仅是资源浪费，而且造成了严重的环境污染等问题。

至今为止的研究证明，鸡羽毛中含有丰富的角蛋白资源，其含量高达80％左右，根据蛋白质的二级结构不同，角蛋白又可以分为α-角蛋白和β-角蛋白，鸡等禽类动物羽毛中的角蛋白多以β-角蛋白为主。鸡羽毛角蛋白中富含的8种必须氨基酸在内的多种氨基酸，是一种来源低廉，优质，且有巨大潜在开发价值的蛋白资源库，其中可能蕴藏着多种具有生物活性的氨基酸段序列。鉴于角蛋白相对稳固的化学结构，以往对角蛋白的提取分离存在一定局限性。然而，近年来随着鸡羽毛角蛋白提取与分解技术的逐渐成熟，人们已从传统的物理化学提取分离方法逐渐发展为以酶解和酵解为主的生物学方法。目前，人们在开发和掌握了对鸡羽毛角蛋白降解为小分子低聚肽的技术基础上，开始更加关注和探讨从鸡羽毛角蛋白降解物中发现具有生物活性的氨基酸序列，开发具有健康功能和具有市场应用价值的角蛋白肽产品。

脱发是全世界成年男性面临的共同挑战，而且，脱发人群的年龄也日趋低龄化，绝大部分脱发者在30岁以前就已经出现脱发症状。因此，开发新的安全有效的育发生发产品有着巨大的市场空间，且会产生很好的经济效益与社会效益。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种具有良好的缓解和改善毛发生长微环境的性能、促进毛发生长的鸡羽毛低聚肽及其制备方法与应用。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案为：一种鸡羽毛低聚肽的制备方法，包括如下步骤：

(1)粉碎鸡羽毛，得到鸡羽毛粉；

(2)将鸡羽毛粉、还原剂、吗啉类离子液体混合均匀，加入水，在75～85℃下搅拌1～3h；以热过滤的方式收集滤液；再加水离心，得到鸡羽毛角蛋白；

(3)在鸡羽毛角蛋白中添加角蛋白酶，于37～50℃酶解8～12h，再于90～110℃灭酶25～35min；用超滤膜从酶解液中分离出分子量在3000Da以内的鸡羽毛低聚肽。

本发明选用吗啉类离子液体提取角蛋白，其极性较强，可以通过与角蛋白分子形成氢键达到使角蛋白溶解的效果，同时，在提取角蛋白时加入了还原剂，避免提取过程中角蛋白被氧化而失活。由于本发明使用的角蛋白提取方式相对温和，因此可以在很大程度上能够保留鸡羽毛角蛋白分子中的活性肽段。此外，本发明在生物酶解处理后，采用超滤技术获得了分子量低于3000Da的小分子鸡羽毛低聚肽。本发明申请人通过实验证实，上述方法提取的低聚肽可以促进人毛乳头细胞的增殖，并发现所述鸡羽毛低聚肽具有一定的促进生发的作用。

优选地，所述步骤(1)中，采用超微粉碎技术将鸡羽毛粉碎至粒径小于1μm。超微粉碎技术具有速度快、时间短、粒径细、分布均匀等特点，使用超微粉碎技术的结果显示溶出度有所提升、可节省原料、降低成本。

优选地，所述吗啉类离子液体为N-乙基-N-丁基吗啉四氟硼酸盐离子液体([NEBM]BF₄)，该离子液体价格较低，容易得到，有利于减少低聚羽毛肽的生产成本，并且使用该离子液体进行处理，提取到的鸡羽毛低聚肽的量明显高于其他吗啉类离子液体，其促进生发的效果更好；所述还原剂为NaHSO₃，其水溶性较好，还原性较强，其氧化产物为硫酸盐，能够溶于水中被除去，不会影响羽毛低聚肽的性状，不会带来较大的纯化成本。

优选地，所述[NEBM]BF₄的制备方法为：将N-乙基吗啉加到丙酮中，60～80℃加热搅拌，并缓慢加入溴正丁烷反应，继续搅拌回流30～40h，减压蒸馏后真空干燥10～15h，丙酮重结晶，得浅黄色晶体；取上述浅黄色晶体加至乙腈中，再加入氟硼酸铵，搅拌反应45～50h后过滤，向滤液中加入无水硫酸镁，滤去硫酸镁，减压蒸除溶剂后45～55℃真空干燥10～15h，得到的白色固体即为[NEBM]BF₄。所述N-乙基吗啉与溴正丁烷的质量比为1:1～1.5；所述浅黄色晶体与氟硼酸铵的质量比为2～2.5:1。

优选地，所述离心的转速为4000rpm，离心时水的加入量为滤液体积的3～6倍。

优选地，所述鸡羽毛粉、还原剂和吗啉类离子液体的质量比为1:0.5～1.5:30～40。

优选地，所述角蛋白酶的用量占鸡羽毛角蛋白质量的0.5～0.8％。

同时，本发明还公开了一种由上述方法提取的鸡羽毛低聚肽。

此外，本发明还公开了上述鸡羽毛低聚肽在日用化妆品中的应用，如生发液、生发膏及头发营养液等；所述日用化妆品的剂型可为喷剂、乳膏、乳液及酊剂中的任意一种。

相比于现有技术，本发明的有益效果为：本发明所述鸡羽毛低聚肽可以缓解和改善因毛发生长微环境不良导致的脱发、雄性激素源性脱发，脂溢性脱发和斑秃等诸多因素引起的脱发现象。鸡羽毛低聚肽内含有的肽生长因子可以通过促进毛乳头细胞的增殖，激活毛囊及改善生发微环境等生物学功能发挥育发和生发作用，从而促进生发。

附图说明

图1为实施例1、对比例1～2提取的鸡羽毛低聚肽的浓度对体外人毛乳头细胞增殖活力的影响图。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

本发明使用的[NEBM]BF₄的制备方法如下：

将23.0g的N-乙基吗啉加到20mL丙酮中，70℃加热搅拌，并缓慢加入27.4g的溴正丁烷反应，继续搅拌回流36h，减压蒸馏后真空干燥12h，丙酮重结晶，得浅黄色晶体；取25.2g上述浅黄色晶体加至125mL乙腈中，再加入10.5g的氟硼酸铵，搅拌反应48h后过滤，向滤液中加入无水硫酸镁，滤去硫酸镁，减压蒸除溶剂后50℃真空干燥12h，得到的白色固体即为[NEBM]BF₄离子液体。

实施例1

本发明所述鸡羽毛低聚肽的提取方法的一种实施例，本实施例所述提取方法包括如下步骤：

(1)将鸡羽毛用水洗净并干燥，利用粉碎机研磨成粉，过800目筛；

(2)按照鸡羽毛粉：NaHSO₃：[NEBM]BF₄质量比＝1:1:35将三者混合，得到混合液，再加入占混合液总质量20～30％的去离子水，80℃水浴加热，搅拌1～3h，以热过滤方式收集滤液；然后加入相当于滤液5倍体积的去离子水，以4000rpm的转速离心10min，收集鸡羽毛角蛋白；滤液通过旋转蒸发去除水分，回收吗啉类离子液体和NaHSO₃；

(3)取上一步得到的鸡羽毛角蛋白，添加占鸡羽毛角蛋白的质量为0.8％的角蛋白酶，在42℃下酶解12h，100℃灭酶30min，将酶液过3000Da超滤膜，分离出分子量低于3000Da的小分子鸡羽毛低聚肽，将滤液进行冷冻干燥，得到鸡羽毛低聚肽粉。

对比例1

一种鸡羽毛低聚肽的制备方法，其与实施例1的区别仅在于，无步骤(2)，直接将鸡羽毛粉加入水中，然后再添加占鸡羽毛粉质量0.8％的角蛋白酶，其余提取方法完全相同。

对比例2

一种鸡羽毛低聚肽的制备方法，其与实施例1的区别仅在于，步骤(3)中，未进行超滤，仅将酶解液经快速定性滤纸进行过滤，其余提取方法完全相同。

性能测试

1)鸡羽毛低聚肽对体外人毛乳头细胞增殖活力的影响

在显微镜下分离人皮肤毛乳头，并进行毛乳头细胞的体外培养。将处于生长对数期的人毛乳头细胞，按2×10³/孔的密度接种至96孔细胞培养板，待过夜细胞贴壁后，以1、2.5、5和10μg/mL等不同浓度添加实施例1、对比例1～2提取的鸡羽毛低聚肽，继续培养48小时后通过MTT实验检测细胞生存率。MTT检测具体方法为，每孔加入10μL MTT溶液(5mg/mL)，继续培养3小时。吸除上清液，每孔加入二甲基亚砜150μL溶解甲瓒结晶，室温震荡溶解后用酶标仪于波长570nm处测定各孔吸光度值。计算细胞生存率(％)＝A₅₇₀处理组/A₅₇₀空白对照组×100％。

鸡羽毛低聚肽对毛乳头细胞增殖的影响结果见图1，从图1中可以看出，实施例1提取的鸡毛低聚肽可以剂量依赖性地促进毛乳头细胞的增殖，用量为5或10μg/mL时具有显著性差异(P<0.05)。以上数据说明，鸡羽毛低聚肽可以促进毛乳头细胞的增殖活力，有望用于激活毛囊，促进毛囊的再生，基于上述结果可以说明本发明提取的鸡羽毛低聚肽能够用于预防和改善脱发现象，促进毛发生长。另外，从图1中可以看到，未用吗啉类离子液体处理和未超滤处理提取的鸡羽毛低聚肽对人毛乳头细胞增殖活力的影响明显不如实施例1。

2)鸡羽毛低聚肽对豚鼠毛发的促生长作用

将豚鼠分为正常组、鸡羽毛低聚肽低剂量组、鸡羽毛低聚肽中剂量组、鸡羽毛低聚肽高剂量组(鸡羽毛低聚肽用20vol.％乙醇溶液溶解)，每组5只，将豚鼠后背用剃须刀剃去面积约9cm²毛发作为试验区。将鸡羽毛低聚肽溶液涂抹于豚鼠后背试验区皮肤，每日涂抹两次，每次涂抹2mL，连续涂抹21天，对照组给与等体积的20vol.％乙醇溶液。每日观察豚鼠被毛生长情况，分别于第7、14和21天取毛发测定毛发长度，测量方法如下：每只豚鼠从试验区皮肤随机取五根毛发用游标标尺测量长度，取其平均值。鸡羽毛低聚肽对豚鼠毛发长度的影响结果见表1，实验中所用的鸡羽毛低聚肽均为实施例1提取的鸡羽毛低聚肽。

表1

注：与正常组相比，^*P<0.05。

从表1中可以看出，本发明提取的鸡羽毛低聚肽可以显著提高毛发的生长速度。鸡羽毛低聚肽具有明显的生发功能，有望用于激活毛囊，改善脱发和促进生发，具有进一步开发的价值。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，但并不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (4)

1.一种鸡羽毛低聚肽的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）粉碎鸡羽毛，得到鸡羽毛粉；

（2）将鸡羽毛粉、还原剂、吗啉类离子液体以1:1:35的质量比混合均匀，得混合液，再加入占混合液总质量20-30%的水，在80℃下搅拌1~3h；以热过滤的方式收集滤液；再加相当于滤液5倍体积的水以4000rpm的转速离心10min，得到鸡羽毛角蛋白；

（3）在鸡羽毛角蛋白中添加角蛋白酶，于42℃酶解12h，再于100℃灭酶30min；用超滤膜从酶解液中分离出分子量在3000Da以内的鸡羽毛低聚肽；

所述吗啉类离子液体为N-乙基-N-丁基吗啉四氟硼酸盐离子液体；所述还原剂为NaHSO₃；

所述角蛋白酶的用量占鸡羽毛角蛋白质量的0.8%；

所述N-乙基-N-丁基吗啉四氟硼酸盐离子液体的制备方法如下：

将23.0g的N-乙基吗啉加到20mL丙酮中，70℃加热搅拌，并缓慢加入27.4g的溴正丁烷反应，继续搅拌回流36h，减压蒸馏后真空干燥12h，丙酮重结晶，得浅黄色晶体；取25.2g上述浅黄色晶体加至125mL乙腈中，再加入10.5g的氟硼酸铵，搅拌反应48h后过滤，向滤液中加入无水硫酸镁，滤去硫酸镁，减压蒸除溶剂后50℃真空干燥12h，得到的白色固体即为[NEBM]BF4离子液体。

2.一种由如权利要求1所述方法提取的鸡羽毛低聚肽。

3.一种如权利要求2所述的鸡羽毛低聚肽在日用化妆品中的应用，其特征在于，所述日用化妆品为生发液、生发膏或头发营养液。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述日用化妆品的剂型为喷剂、乳膏、乳液、酊剂中的一种。