CN100528969C - 一种从乌骨鸡中提取黑色素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从乌骨鸡中提取黑色素的方法，包括如下步骤：乌骨鸡切碎后用1～10M的盐酸溶液清洗5～30分钟，浸入液氮0.5～5分钟，将浸入液氮后的乌骨鸡粉碎成60～100目粉末，转入索氏提取器中，用1～10M的盐酸溶液热回流1.5～3小时，浸提液冷却至0～5℃析出沉淀，分别加入与浸提液等体积的丙酮蒸馏水洗涤3～4遍，干燥即得。本发明所述的方法通过液氮冷冻后粉碎的方法，在不改变黑色素物理化学性质的前提下，能充分有效的破坏组织中黑色素细胞的结构，有利于黑色素的快速释放，减短了提取黑色素所用的时间，保持了乌骨鸡黑色素近乎完整的形态结构。
Description
技术领域
本发明涉及黑色素的提取方法，具体的说，涉及一种从乌骨鸡中提取黑色素的方法。
背景技术
乌骨鸡是我国特有的珍禽，具有特殊的滋补和药用价值。在《本草纲目》里，李时珍说“乌骨鸡，有白毛乌骨者、黑毛乌骨者、斑毛乌骨者，有骨肉皆乌者、肉白乌骨者，但观鸡舌黑者，则骨肉俱乌，入药更良”。可见古代医学在辨别乌骨鸡的药用效果时，是以其肉、骨中的黑色素多少为重要标准的。现代医学也认为乌骨鸡的药用价值在于其体内的黑色素物质。黑色素是一种复杂不规律的多聚体，广泛存在于许多生物体和组织中。动物性来源的黑色素是在黑色素体中合成的，而黑色素体是由分布在皮肤或其它组织中的黑色素细胞产生的。黑色素细胞产生两种截然不同的黑色素类型，一种是棕黑色的真黑素，一种是红褐色的棕黑素。国内外大量实验证明黑色素能通过许多种不同的方式来有效的保护生物有机体，例如黑色素对紫外线的吸收、对重金属离子的鳌合作用、清除自由基以及抗氧化功能等等。由于其特殊性质，黑色素已经被广泛地应用于医学、药理学、化妆品以及其它的领域。
根据黑色素来源的不同，获得黑色素的方法也不尽相同，例如使用化学合成的方法、酸液提取的方法、碱液提取的方法以及微生物合成的方法等等。然而到目前为止没有一个公认的提取纯化黑色素的标准方法。随着对乌骨鸡黑色素的医学以及药理学等方面研究的深入，迫切需要建立快速、廉价、保真的提取方法，从乌骨鸡中高效率地提取黑色素。
到目前为止，提取乌骨鸡中黑色素的方法主要有两种：1)刘望夷在1979年使用盐酸降解蛋白质的方法分离乌骨鸡黑色素。主要的过程是：先将乌骨鸡的样本切成碎块，用浓盐酸浸泡，重复多次，所得滤渣用6M盐酸回流加热，时间为300小时左右，收集沉淀，用蒸馏水和丙酮洗涤干燥。缺点是热盐酸回流的时间太长，容易破坏和改变黑色素的化学结构和微观形态；2)蔡华珍等人在2005年使用的酶法水解蛋白质分离乌骨鸡黑色素。主要过程是：先将乌骨鸡样本绞碎，然后用酸性蛋白酶作为水解酶，加酶量3.8％，控制pH＝2.8、酶解温度34.8℃，时间约为20小时，收集沉淀，用醚、蒸馏水反复洗涤，干燥得黑色素。优点是基本不会破坏黑色素的形态和结构，提取黑色素的损失小。缺点是成本高，酶解条件复杂，步骤繁琐，提取黑色素的时间长。
发明内容
本发明的目的在于克服已有乌骨鸡中提取黑色素技术的缺陷，从而提供一种步骤简单、快速、高保真、低成本的黑色素提取方法。
为了实现本发明的目的，本发明提供了一种从乌骨鸡中提取黑色素的方法，包括将乌骨鸡切碎后用盐酸溶液清洗，浸入液氮0.5～5分钟后提取。
乌骨鸡切碎后优选用1～10M的盐酸溶液清洗5～30分钟。
浸入液氮后的提取优选为将浸入液氮后的乌骨鸡粉碎成60～100目粉末，转入索氏提取器中，用1～10M的盐酸溶液热回流1.5～3小时，即可停止，浸提液冷却至0～5℃析出沉淀，沉淀中先加入与浸提液等体积的丙酮脱脂洗涤3～4遍，然后加入与浸提液等体积的蒸馏水洗涤3～4遍，干燥即得。
其中在进行索氏提取时，所用的盐酸溶液量没有严格规定，能满足回流条件既可。加入的丙酮和蒸馏水的量与加入的盐酸溶液量相同。
本发明所述的从乌骨鸡中提取黑色素的方法与现有的技术相比，其优点是：通过液氮冷冻后粉碎的方法，在不改变黑色素物理化学性质的前提下，能充分有效的破坏组织中黑色素细胞的结构，有利于黑色素的快速释放，减短了提取黑色素所用的时间。具体来说，相比于刘望夷的盐酸降解蛋白质法，热盐酸回流的时间从原有的300小时缩减为1.5-3小时，也减少了盐酸对黑色素结构的破坏作用，保持了乌骨鸡黑色素近乎完整的形态结构。相比于蛋白酶法，优点是降低了成本、减短了提取所需的时间、操作比较简单。
附图说明
图1液氮粉碎、匀浆组织冰冻切片比对观察黑色素颗粒释放的效果图。
图2纯化后的乌骨鸡黑色素的EPR波谱。
图3纯化后的乌骨鸡黑色素SEM/TEM图像。
图1中，A为液氮粉碎后冰冻切片；B为组织匀浆后冰冻切片。
图3中，A为100um尺度上纯化后乌骨鸡黑色素的SEM图像；B为1um尺度上纯化后乌骨鸡黑色素的SEM图像，图中的颗粒状物体就是黑色素颗粒；C为200nm尺度上观察的纯化后的乌骨鸡黑色素的TEM图像，图中的细微粒是氨基酸。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1：
从乌骨鸡中提取黑色素的方法，包括将乌骨鸡切碎后用6M盐酸溶液清洗10分钟，浸入液氮1分钟。将浸入液氮后的乌骨鸡粉碎成80目粉末，转入索氏提取器中，用6M的盐酸溶液热回流2小时即可停止，所用的盐酸溶液量满足回流条件，浸提液冷却至4℃析出沉淀，沉淀中先加入与浸提液等体积的丙酮脱脂洗涤4遍，然后加入与浸提液等体积的蒸馏水洗涤4遍，干燥即得。
实施例2
从乌骨鸡中提取黑色素的方法，包括将乌骨鸡切碎后用1M盐酸溶液清洗30分钟，浸入液氮5分钟。将浸入液氮后的乌骨鸡粉碎成100目粉末，转入索氏提取器中，用1M的盐酸溶液热回流3小时即可停止，所用的盐酸溶液量满足回流条件，浸提液冷却至5℃析出沉淀，沉淀中先加入与浸提液等体积的丙酮脱脂洗涤3遍，然后加入与浸提液等体积的蒸馏水洗涤3遍，干燥即得。
实施例3
从乌骨鸡中提取黑色素的方法，包括将乌骨鸡切碎后用10M盐酸溶液清洗5分钟，浸入液氮0.5分钟。将浸入液氮后的乌骨鸡粉碎成60目粉末，转入索氏提取器中，用10M的盐酸溶液热回流1.5小时即可停止，所用的盐酸溶液量满足回流条件，浸提液冷却至0℃析出沉淀，沉淀中先加入与浸提液等体积的丙酮脱脂洗涤3遍，然后加入与浸提液等体积的蒸馏水洗涤3遍，干燥即得。
实施例4
将乌骨鸡的组织样本分成两份，一份用匀浆机对组织进行匀浆；另一份组织样本采用液氮粉碎的方法。然后将两份样本分别进行组织冰冻切片(HE染色)比对观察黑色素颗粒释放的效果。
结果发现通过液氮预处理材料比组织匀浆处理可以更好的促进黑色素细胞的破裂和黑色素颗粒的富集(图1)，并且处理过的材料形成大小合适的碎末(60～100目)，比匀浆后的材料更易于盐酸的浸透。
实施例5
将索氏提取结束后的残留的乌骨鸡组织样本用热盐酸再次长时间(48小时)浸提，观察是否还有黑色素继续从乌骨鸡组织样中释放出来。
结果发现本方法提取乌鸡中的黑色素是一种一次性快速释放的过程，即虽然提取后残渣仍呈黑色并可能有黑色素的存在，但是在对残渣按同样条件重新提取，即使使用更长的时间，也不会再浸提出黑色素。
实施例6
将所得的纯乌骨鸡黑色素用电子顺磁共振波谱法(ElectronParamagnetic Resonance，EPR)进行分析(图2)，所用的黑色素样本重为10.3mg。
分析结果发现本法所提纯的乌骨鸡黑色素的EPR信号在黑色素的范围之内，而且呈一次微商条件下稍不对称单峰曲线，ΔH＝5.813高斯，g＝2.000047，没有零场分裂，不存在内部的超精细结构，说明了我们所提黑色素的真实性，而且谱图中无杂峰的存在，也反映了本法所提的黑色素杂质较少，纯度较高。
实施例7
将所得的乌骨鸡黑色素用扫描电镜(Scanning ElectronMicroscopy，SEM)和透射电镜(Transmission Electron Microscope，TEM)进行形态学分析(图3)。
Arnaud(1981)通过电子显微镜发现长时间高浓度酸液提取的过程会修饰和破坏黑色素体的超微结构，从而改变黑色素的微观形态。使用本方法所得的黑色素由SEM照片在10um的尺度上可以发现，是块状固体，棱角分明。如果再对其放大到1um的尺度，再结合TEM照片可以发现这些块状固体是由直径在100-200nm之间的表面粗糙的球状颗粒紧密聚集而成。高度吻合YANLIU(2002)描述在乌贼中黑色素的微观形貌，并且其还与人头发中黑色素颗粒形似，均为球状颗粒的聚集体。这些都说明了生物体黑色素的普适微观形态，也证明了本方法的高保真特点。
实施例8
Susumu在1999年曾经报道过乌骨鸡不同组织部位的黑色素的沉积分布：骨膜＞性腺＝气管≥心脏、肝脏、胃、盲肠、肌肉、皮肤，这与刘薇(2004)的报道是吻合的。我们分别选取了乌骨鸡的不同部位的皮肤组织作为实验的样本，使用水分皿测干物质的方法计算使用本方法所得的黑色素提取率(表1)。
结果发现不同部位的皮肤组织的黑色素提取率相差较大，但总的皮肤中黑色素的提取率约为0.89‰(各部位的提取率与加权系数的乘积相加所得)，与Susumu使用酶法在皮肤中的提取率0.94‰相当，但是降低了成本、减短了提取所需的时间、操作比较简单。
表1、不同部位的皮肤组织样的黑色素提取率
| 实验材料(皮肤组织) | 湿重(g) | 干重(g) | 黑色素重(mg) | 提取率(‰) |
| 躯干 | 32.42 | 11.63 | 9.6 | 0.82 |
| 鸡冠 | 6.07 | 1.84 | 1.7 | 0.92 |
| 胫和爪 | 18.88 | 5.84 | 15.2 | 2.60 |
Claims (1)
1、一种从乌骨鸡中提取黑色素的方法，其特征在于将乌骨鸡切碎后用1～10M的盐酸溶液清洗5～30分钟，浸入液氮0.5～5分钟后提取，所述浸入液氮后的提取为将浸入液氮后的乌骨鸡粉碎成60～100目粉末，转入索氏提取器中，用1～10M的盐酸溶液热回流1.5～3小时，浸提液冷却至0～5℃析出沉淀，分别加入与浸提液等体积的丙酮蒸馏水洗涤3～4遍，干燥即得。
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