CN102776238B - 鱿鱼墨天然黑色素的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鱿鱼墨天然黑色素的制备方法，其特征在于步骤为：1)加热预处理；2)采用中性蛋白酶和酸性蛋白酶进行复合酶解：其中中性蛋白酶的酶解pH值为5～6，酸性蛋白酶的酶解pH值为1.5～2.5，酶解温度为50～60℃，总酶解反应时间为3～5h，总加酶量为鱿鱼墨质量的1.5～4.0％；3)灭酶离心处理，取黑色素沉淀留用；4)最后将得到的黑色素沉淀反复用水清洗，烘干即可。本发明以鱿鱼墨为原料，采用复合酶解法来制备鱿鱼墨黑色素，使得酶解时间从原来的12～24h降低至只需4h就能完成，大大缩短了制备时间，提高了生产效率，并且鱿鱼墨的水解度较高，制得的鱿鱼墨黑色素纯度高，可用于保健食品及医药制剂中。本发明原料丰富易得、制备工艺简单、生产效率高，适于工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种鱿鱼墨天然黑色素的制备方法。
背景技术
鱿鱼墨占鱿鱼体重的1.3％左右，其主要成分是真黑素与蛋白质结合的黑素蛋白、酪氨酸的聚合物、水和脂肪等。虽然近几年国内对鱿鱼加工副产物，如：鱿鱼卵、肝脏、精巢组织等提取物的生物活性进行了相关研究，但是有关鱿鱼墨的综合利用程度还远远滞后于鱿鱼加工现状。我国中医素有“逢黑必补”的养生理念，但长久以来我国对鱿鱼墨的利用价值未受重视。在国外，美国和日本已把鱿鱼墨黑色素作为一种天然黑色素应用于食品生产中。目前天然黑色素纯品国际市场售价高达30万元/吨，因此，鱿鱼墨黑色素作为食品添加剂生产黑色营养保健食品市场空间巨大。此外，研究证实鱿鱼墨天然黑色素具有抗氧化、提高免疫力、体外抑制流感病毒及艾滋病病毒的功效。所以，鱿鱼墨天然黑色素在新药开发方面前景广阔。
鱿鱼墨黑色素不溶于常见的有机溶剂，具有在碱性溶液中溶解而在酸性溶液中沉淀的特性，通常采用碱溶酸沉法，酸性溶液可以除去与黑色素结合的蛋白质、碳水化合物以及脂类物质，但需要经过多次酸碱交替处理，才能得到精制的黑色素。酸碱法提取的黑色素通常会使其天然形态和化学结构受到一定程度的损伤，1979年Giesen提出用温和的蛋白酶水解法来提取黑色素，可以不损伤黑色素原有结构。国内学者阎克路等曾采用木瓜蛋白酶水解牦牛绒黑色素，得到黑色素的形态结构和化学组成改变均小于盐酸水解法。目前也出现了采用酶解法制备鱿鱼墨黑色素，如专利号为CN200610146291.0的中国专利《一种鱿鱼墨黑色素的制备方法及其应用》，其特征在于取鱿鱼墨汁，加入蒸馏水搅拌、洗涤，用粗滤布除去杂物后，用碱液调pH至5.0～10.0；在搅拌下，加酶水解12～24h，酶解温度为35～70℃，90～100℃加热终止反应；用酸液调pH至1.0～5.0，3000～5000×g室温下离心收集沉淀；所得沉淀物经蒸馏水反复洗涤、离心，至洗涤水为中性，真空冷冻干燥。但是它是采用单一的蛋白酶来进行水解，制备时间长，生产效率低且比较麻烦。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种鱿鱼墨天然黑色素的制备方法，采用复合酶解法进行制备，具有工艺简单、酶解时间短、水解率高的特点。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种鱿鱼墨天然黑色素的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)加热预处理：将鱿鱼墨捣碎后，加入一定量水，使料液质量比为1∶9～11，在95～100℃加热3～8min，然后快速冷却至室温；
2)采用中性蛋白酶和酸性蛋白酶进行复合酶解：其中中性蛋白酶的酶解pH值为5～6，酸性蛋白酶的酶解pH值为1.5～2.5，酶解温度为50～60℃，总酶解反应时间为3～5h，总加酶量为鱿鱼墨质量的1.5～4.0％；
3)灭酶离心处理：将鱿鱼墨水解液在95～100℃下加热3～8min，然后快速冷却至室温，经6000～8000r/min下离心处理，取黑色素沉淀留用；
4)最后将得到的黑色素沉淀反复用水清洗，除去可溶性成分，然后30～40℃烘干即可。
作为改进，所述步骤2)中的中性蛋白酶、酸性蛋白酶的加入量之比为2.5～3.5∶1，所述中性蛋白酶和酸性蛋白酶的酶解时间相等。
作为优选，所述中性蛋白酶的酶解pH值为5.5，酸性蛋白酶的酶解pH值为2.0，酶解温度为55℃，总酶解反应时间为4h，总加酶量为鱿鱼墨质量的3.0％。
最后，所述步骤1)中的料液质量比优选为1∶10。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明以鱿鱼墨为原料，采用中性蛋白酶和酸性蛋白酶复合酶解法来制备鱿鱼墨黑色素，使得酶解时间从原来的12～24h降低至只需4h就能完成，大大缩短了制备时间，提高了生产效率，并且鱿鱼墨的水解度大，制得的鱿鱼墨黑色素纯度高，可用于保健食品及医药制剂中。本发明原料丰富易得、制备工艺简单、生产效率高，适于工业化生产。
附图说明
图1是本发明的鱿鱼墨黑色素制备方法的制备工艺流程图；
图2是本发明的复合酶解时间对鱿鱼墨水解度的影响；
图3是本发明的复合酶解加入总酶量对鱿鱼墨水解度的影响。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
一种鱿鱼墨天然黑色素的制备方法，步骤为：
1)加热预处理：将鱿鱼墨捣碎后，加入一定量水，使料液质量比为1∶10，在95～100℃加热5min，然后快速冷却；
2)采用中性蛋白酶和酸性蛋白酶进行复合酶解：其中中性蛋白酶的酶解pH值为5.5，酸性蛋白酶的酶解pH值为2.0，酶解温度为55℃，总酶解反应时间4h(中性蛋白酶和酸性蛋白酶各自水解2h)，总加酶量为鱿鱼墨质量的3.0％，其中中性蛋白酶和酸性蛋白酶按照3∶1比例加入相应酶量；
3)灭酶离心处理：将鱿鱼墨水解液在95～100℃下加热5min，然后快速冷却至室温，经7000r/min下离心处理，取黑色素沉淀留用；
4)最后将得到的黑色素沉淀反复用水清洗，除去可溶性成分，然后30～40℃烘干即可。
下面对本发明的制备工艺参数及制得的鱿鱼墨黑色素理化性能作进一步详细说明：
一、蛋白酶的选择
选用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶，分别在各酶最适pH值和最适温度范围下水解鱿鱼墨，比较水解度大小，确定实验用酶。水解度越大，表示与鱿鱼墨结合在一起的蛋白质残留量越低，黑色素的纯度也就越高，具体结果见表1。
表1 蛋白酶水解鱿鱼墨的水解效果比较
注：蛋白酶的加入量为1.0％(相对于鱿鱼墨加入量)，料液比为1∶10，酶解时间为30min。
由水解度大小能够看出实验所用蛋白酶对鱿鱼墨的水解效果依次为：胃蛋白酶＞酸性蛋白酶＞中性蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞胰蛋白酶。在比较水解度的同时，感官评定所得水解液的口味，其中胃蛋白酶水解液的苦味最强。考虑到水解鱿鱼墨在提取高纯度天然黑色素的同时，综合利用水解上清液。虽然胃蛋白酶水解鱿鱼墨的水解效果最好，但是所得上清液的苦味也是最重的，为后期上清液的再利用带来不便。因此，实验选用水解度较高的中性蛋白酶和酸性蛋白酶复合水解鱿鱼墨制备天然黑色素。
二、复合酶解条件研究
在料液比为1∶10条件下，单酶水解鱿鱼墨的研究中分别得到中性蛋白酶水解鱿鱼墨黑色素的最佳条件为：反应pH5.5，温度45℃，酶解时间5h，加酶量2.5％，在此最优条件下鱿鱼墨水解度为11.86％。酸性蛋白酶单酶水解鱿鱼墨的最佳条件为：反应pH2.0，酶解温度50℃，酶解时间3h，最适酶量为3.5％，水解液的水解度为13.24％。
将中性蛋白酶和酸性蛋白酶复合用于鱿鱼墨的水解反应，水解条件可能与单酶最佳水解条件不同，实验考察了复合酶解时间、总加酶量对鱿鱼墨水解度的影响。
1、复合酶解时间
在中性蛋白酶和酸性蛋白酶的酶解温度50℃，中性蛋白酶的反应pH值为5.5，酸性蛋白酶的反应pH值为2.0，固定总加酶量为2.5％(中性蛋白酶和酸性蛋白酶加入比例为1∶1)，酶解反应总时间(中性蛋白酶和酸性蛋白酶反应时间比例为1∶1)分别为2h、3h、4h和5h时，所得鱿鱼墨的水解度见图2。
图2结果显示，中性蛋白酶和酸性蛋白酶的复合酶解时间在4h时水解度最高，反应时间过短及过长均不利于水解度的提高。
2、复合酶加入总量
固定复合酶的反应温度为50℃，中性蛋白酶的反应pH值为5.5，酸性蛋白酶的反应pH值为2.0，酶解总时间为4h(中性蛋白酶和酸性蛋白酶的酶解时间比例为1∶1)条件下，总酶量(中性蛋白酶和酸性蛋白酶的比例为1∶1)分别为1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％和4.5％时，鱿鱼墨的水解度见图3。
由图3结果可知总酶加入量低于3.0％时，随着酶加入量的增加，鱿鱼墨水解度也是逐渐地增加，当总酶加入量大于3.0％后，水解度的增加比较平缓。
3、复合酶水解鱿鱼墨的条件优化
中性蛋白酶和酸性蛋白酶复合酶解鱿鱼墨时，中性蛋白酶的反应pH值为5.5，酸性蛋白酶的反应pH值为2.0，在酶解反应总时间为4h，总加酶量3.0％的条件下，通过正交实验L9(33)研究中性蛋白酶、酸性蛋白酶各自水解时间和加酶比例对鱿鱼墨水解度的影响，同时也考察复合酶水解温度对水解度的影响，正交实验安排及结果见表2。
表2 复合酶水解鱿鱼墨的L9(33)正交实验安排及实验结果
表2极差值大小反映出各因素对鱿鱼墨水解度影响顺序为B＞C＞A，在料液比为1∶10，中性蛋白酶的酶解pH值5.5，酸性蛋白酶的酶解pH值为2.0，酶解总时间4h，总加酶量3.0％的条件下，复合酶水解鱿鱼墨的最佳水解组合条件为A2B3C3，即：中性蛋白酶和酸性蛋白酶各自水解2h；中性蛋白酶和酸性蛋白酶的加酶量按照3∶1比例加入；复合酶解温度控制在55℃。在此最优条件下，鱿鱼墨的水解度为14.56％，高于表2中的任一水解度，同时也高于中性蛋白酶和酸性蛋白酶各自单酶水解鱿鱼墨时的水解度，表明正交实验优化得到的水解条件是合理的。
三、复合酶水解鱿鱼墨制备天然黑色素的理化性质
中性蛋白酶和酸性蛋白酶的复合酶水解鱿鱼墨所得天然黑色素在紫外区220nm有特征吸收，红外光谱最强峰在1617.36cm-1处，有典型的黑色素红外吸收特点。具有碱溶酸沉溶解特性，在pH大于9.0条件下色残率高。酶解法制备的鱿鱼黑色素在自然光下稳定性高，而紫外光照30min后色残率降至52.1％。不耐高温长时间加热处理，而低温65℃加热30min时稳定性较高可达对照的95.4％。
Claims (3)
1.一种鱿鱼墨天然黑色素的制备方法，其特征在于包括以下步骤；
1)加热预处理：将鱿鱼墨捣碎后，加入一定量水，使料液质量比为1∶9～11，在95～100℃加热3～8min，然后快速冷却至室温；
2)采用中性蛋白酶和酸性蛋白酶进行复合酶解：其中中性蛋白酶的酶解pH值为5～6，酸性蛋白酶的酶解pH值为1.5～2.5，酶解温度为50～60℃，总酶解反应时间为3～5h，总加酶量为鱿鱼墨质量的1.5～4％；所述中性蛋白酶、酸性蛋白酶的加入量之比为2.5～3.5∶1，所述中性蛋白酶和酸性蛋白酶的酶解时间相等；
3)灭酶离心处理：将鱿鱼墨水解液在95～100℃下加热3～8min，然后快速冷却至室温，经6000～8000r/min下离心处理，取黑色素沉淀留用；
4)最后将得到的黑色素沉淀反复用水清洗，除去可溶性成分，然后30～40℃烘干。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述中性蛋白酶的酶解pH值为5.5，酸性蛋白酶的酶解pH值为2.0，酶解温度为55℃，总酶解反应时间为4h，总加酶量为鱿鱼墨质量的3.0％。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤1)中的料液质量比为1∶10。
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