CN107629145A - 一种林蛙皮透明质酸的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种林蛙皮透明质酸的提取方法，包括：(1)获取林蛙皮粉；(2)利用蒸馏水对林蛙皮粉进行溶解；(3)将林蛙皮粉溶解液进行超高压处理；(4)利用胰酶和碱性蛋白酶对超高压浸出液进行酶解处理；(5)向酶解液中添加乙醇以便生成沉淀，离心收集沉淀并进行干燥处理；(6)利用氯化钠对经过干燥处理后的沉淀进行溶解；(7)向沉淀的溶解液中添加过氧化氢进行脱色；(8)调节pH至4.5‑5.0，并加入氯仿和正丁醇的混合溶液，离心分离出蛋白并收集水相；(9)对水相进行透析，收集透析液；(10)对透析液进行醇沉和干燥处理，以便得到透明质酸精品。该方法工艺简单，透明质酸提取率高、纯度高且活性好。

Description

一种林蛙皮透明质酸的提取方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，本发明涉及一种林蛙皮透明质酸的提取方法。

背景技术

透明质酸(Hyaluronic acid，简称HA)是一种由β-D-N-乙酰基葡萄糖和β-D-葡萄糖醛酸为结构单元以β-1，4-糖苷键缩合而成的二糖单元，二糖单元再由β-1，3-糖苷键反复交替连接形成HA链。HA链长度最高可达25，000个二糖单元，相对分子质量在10⁴-10⁷道尔顿之间。

HA在医药、食品和化妆品等领域具有广泛的应用，具有独特的保湿性能。它可以作为伤口愈合，促进术后粘连作用，可以作为原始材料合成具有抗炎、止痛等作用的新药。由于HA分子中含有的大量羧基和羟基，可与水形成氢键而具有很强的保水能力。因此，HA被当做天然的保湿因子广泛应用到化妆品中。

目前可以通过动物组织提取和微生物发酵生产两种方式得到HA，由于目前微生物发酵生产机制尚未成熟，正处于研究阶段，而动物组织提取操作简单，方便，因此适合小规模的生产需要。HA广泛存在于动物的组织、器官中，如鸡冠、牛眼玻璃体、人的脐带以及蛙皮等中含有较多的透明质酸。

中国林蛙(Rana Chensinensis)是一种集药用、食补、美容三种兼容的经济动物。中国东北的林蛙多被制成“哈士蟆油”，其中林蛙皮即林蛙躯干表明的皮肤就作为蛤蟆油的副产品，每年数百吨林蛙皮被废弃或者作为饲料用。林蛙皮中含有大量的胶原蛋白、氨基酸以及透明质酸等活性物质，具有良好的应用价值。因此，从林蛙皮中提取透明质酸具有明显的优势，将提升我国对林蛙产业的经济效益。

目前，从林蛙皮中提取透明质酸的研究甚少，其提取工艺研究也不明确。沙坤等从林蛙皮中提取HA工艺是：通过蛋白酶初步酶解，经过氯仿除去蛋白质，再经过二次酶解，最后用季铵盐进行纯化后用超滤膜超滤进行脱色。这个方法是传统的制备HA的方法，缺点的是：步骤繁琐，造成HA提取率低；同时用了氯仿和季铵盐等多种有毒物质对人和环境不友好。张辉等通过陶瓷膜过滤法从林蛙皮中分离提取HA，只采用单一酶胃蛋白酶水解之后，选择一定孔径的陶瓷膜过滤除杂蛋白，HA提取率不高。

因此，目前对于从林蛙皮中提取透明质酸的工艺有待进一步改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种从林蛙皮中提取透明质酸的方法，该方法工艺流程简单，提取率高且提取纯度高、活性好。

根据本发明的一个方面，本发明提出了一种从林蛙皮中提取透明质酸的方法，包括：

(1)获取林蛙皮粉；

(2)利用蒸馏水对所述林蛙皮粉进行溶解，以便得到林蛙皮粉溶解液；

(3)将所述林蛙皮粉溶解液在超高压容器内进行超高压处理，以便得到超高压浸出液；

(4)利用胰酶和碱性蛋白酶对所述超高压浸出液进行酶解处理，以便得到酶解液；

(5)向所述酶解液中添加2-3倍体积的95％乙醇以便生成沉淀，离心收集沉淀并进行干燥处理；

(6)利用氯化钠对经过所述干燥处理后的沉淀进行溶解；

(7)向溶解的沉淀中添加过氧化氢进行脱色处理；

(8)调节经过所述脱色处理后的溶液的pH至4.5-5.0，并加入氯仿和正丁醇的混合溶液，搅拌4h，离心分离出蛋白并收集水相；

(9)利用磷酸盐缓冲液对所述水相进行透析，收集透析液；

(10)向所述透析液中添加2-3倍体积的95％乙醇以便生成沉淀，离心收集沉淀并进行干燥处理，以便得到透明质酸精品。

本发明的上述方法将超高压技术与酶水解相结合用于提取透明质酸，从而使蛋白质充分水解成分子量小于100kDa的小分子肽，最后可以使用100kDa的透析袋透析使小分子肽与HA分离，进而有效提高透明质酸的提取率。采用本发明上述实施例的从林蛙皮中透明质酸的方法，每千克林蛙皮可最高提取4.6克的透明质酸精品，并且所得透明质酸纯度高，活性好。

另外，根据本发明上述实施例的从林蛙皮中提取透明质酸的方法还可以具有如下附加的技术特征：

在本发明的一些实施例中，步骤(2)中，所述溶解按照下列步骤进行：

(2-1)将所述林蛙皮粉溶于蒸馏水中，磁力搅拌4-8h，于4℃冰箱放置至少12h；

(2-2)将步骤(2-1)得到的溶液在20-35KHz和100-300W条件下超声处理20-30min，以便得到林蛙皮粉溶解液。

在本发明的一些实施例中，步骤(3)中，所述超高压处理是在200-400Mpa的压力下进行2-5min完成的。

在本发明的一些实施例中，步骤(4)中，所述酶解处理按照下列步骤进行：

(4-1)调节所述超高压浸出液的pH值至8.0-8.5，添加1％的胰酶并于37℃的水浴中进行第一酶解2-4h，沸水浴灭活所述胰酶，以便得到第一酶解液；

(4-2)向所述第一酶解液中添加1％的碱性蛋白酶并于50℃的水浴中进行第二酶解3-6h，沸水浴灭活所述碱性蛋白酶，以便得到第二酶解液。

在本发明的一些实施例中，步骤(4)中，所述酶解处理按照下列步骤进行：

(4-1)调节所述超高压浸出液的pH值至8.0-8.5，添加1％的碱性蛋白酶并于50℃的水浴中进行第一酶解3-6h，沸水浴灭活所述碱性蛋白酶，以便得到第一酶解液；

(4-2)向所述第一酶解液中添加1％的胰酶并于37℃的水浴中进行第二酶解2-4h，沸水浴灭活所述胰酶，以便得到第二酶解液。

在本发明的一些实施例中，步骤(5)和步骤(11)中的干燥处理是在40-60℃的真空干燥箱中进行的。

在本发明的一些实施例中，步骤(7)中，所述脱色处理是通过向溶解的沉淀中添加0.5-1.5体积％的过氧化氢、并调节pH至7.0-7.5，于40-60℃的水浴中进行4-10h完成的。

在本发明的一些实施例中，步骤(8)中，向所述脱色处理后的溶液中加入等体积的所述混合溶液。

在本发明的一些实施例中，所述混合溶液中氯仿与正丁醇的体积比为4：1。

根据本发明的另一方面，本发明还提出了一种从林蛙皮中提取透明质酸的方法，包括：

(1)获取新鲜剥离的林蛙皮，除去皮下组织及粘连物，清洗，室温干燥，粉碎，以便获得林蛙皮粉；

(2)溶解：将所述林蛙皮粉按照1g：10ml的质量体积比溶于蒸馏水中，磁力搅拌4-8h，于4℃冰箱放置至少12h；

(3)超声波处理：将步骤(2)得到的溶液在20-35KHz和100-300W条件下超声处理20-30min，以便得到林蛙皮粉溶解液；

(4)超高压处理：将所述林蛙皮粉溶解液在200-400Mpa的压力下进行超高压处理2-5min，以便得到超高压浸出液；

(5)酶解：调节所述超高压浸出液的pH值至8.0-8.5，添加1％的胰酶并于37℃的水浴中进行第一酶解2-4h，沸水浴灭活所述胰酶，以便得到第一酶解液；向所述第一酶解液中添加1％的碱性蛋白酶并于50℃的水浴中进行第二酶解3-6h，沸水浴灭活所述碱性蛋白酶，以便得到第二酶解液，或者

调节所述超高压浸出液的pH值至8.0-8.5，添加1％的碱性蛋白酶并于50℃的水浴中进行第一酶解3-6h，沸水浴灭活所述碱性蛋白酶，以便得到第一酶解液；向所述第一酶解液中添加1％的胰酶并于37℃的水浴中进行第二酶解2-4h，沸水浴灭活所述胰酶，以便得到第二酶解液；

(6)浓缩：向所述酶解液中添加2-3倍体积的95％乙醇以便生成沉淀，离心收集沉淀，将沉淀在40-60℃的真空干燥箱中进行干燥处理；

(7)利用0.1-0.5mol/L氯化钠对经过所述干燥处理后的沉淀进行溶解；

(8)向溶解的沉淀中添加0.5-1.5体积％的过氧化氢并于40-60℃的水浴中进行脱色处理4-10h；

(9)调节经过所述脱色处理后的溶液的pH至4.5-5.0，并加入等体积的氯仿和正丁醇的混合溶液，搅拌4h，离心分离出蛋白并收集水相，所述混合溶液中氯仿与正丁醇的体积比为4：1；

(10)利用pH 7.0的50mmol/L的磷酸盐缓冲液对所述水相进行透析，收集透析液；

(11)向所述透析液中添加2-3倍体积的95％乙醇以便生成沉淀，离心收集沉淀并将沉淀在40-60℃的真空干燥箱中进行干燥处理，以便得到透明质酸精品。

本发明的上述方法将超高压技术与酶水解相结合用于提取透明质酸，从而使蛋白质充分水解成分子量小于100kDa的小分子肽，最后可以使用100kDa的透析袋透析使小分子肽与HA分离，进而有效提高透明质酸的提取率。采用本发明上述实施例的从林蛙皮中透明质酸的方法，每千克林蛙皮可提取4.6克的透明质酸精品，并且所得透明质酸纯度高，活性好。

附图说明

图1是根据本发明一个实施例的从林蛙皮中提取透明质酸的方法的流程图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

根据本发明的一个方面，本发明提出了一种从林蛙皮中提取透明质酸的方法。下面参考图1详细描述本发明具体实施例的从林蛙皮中提取透明质酸的方法。

S100：获取林蛙皮粉

根据本发明的具体实施例，林蛙皮粉可以通过购买或者按照下列步骤(1)获得。具体地，(1)获取新鲜剥离的林蛙皮，除去皮下组织及粘连物，清洗，室温干燥，粉碎，以便获得林蛙皮粉。

S200：溶解

根据本发明实施例的从林蛙皮中提取透明质酸的方法，进一步不包括：(2)利用蒸馏水对所述林蛙皮粉进行溶解，以便得到林蛙皮粉溶解液。

根据本发明的具体实施例，，上述步骤(2)中，对林蛙皮粉进行溶解可以按照下列步骤进行：(2-1)将所述林蛙皮粉溶于蒸馏水中，磁力搅拌4-8h，于4℃冰箱放置至少12h；(2-2)将步骤(2-1)得到的溶液在20-35KHz和100-300W条件下超声处理20-30min，以便得到林蛙皮粉溶解液。由此，通过采用长时间的强力搅拌与超声处理结合使得林蛙皮粉能够得到充分溶解，进而提高后续的透明质酸的提取效率和提取率。

根据本发明的具体实施例，发明人发现，通过采用上述搅拌条件和超声条件可以显著提高林蛙皮粉的溶解效率，进而提高从林蛙皮粉中提取透明质酸的效率。

S300：超高压处理

根据本发明实施例的从林蛙皮中提取透明质酸的方法，进一步包括：(3)将所述林蛙皮粉溶解液在超高压容器内进行超高压处理，以便得到超高压浸出液。

发明人发现，通过对林蛙皮粉溶解液进行超高压处理，可以破坏细胞膜，加大细胞内物质的溶出率，比如有利于多糖和蛋白质的溶出，从而使蛋白的水解效率提高，从而提高透明质酸的提取率和纯度。超高压提取技术是一种全新的天然产物有效成分提取技术，是在常温下用100～1000MPa的流体静压力作用于料液上，保压一段时间，然后迅速卸压，使细胞内外渗透压力差突然增大，破坏细胞的各种膜，达到提取的目的。运用超高压技术提取天然产物，可以显著提高产物的提取率，降低耗能，缩短提取时间。

根据本发明的具体实施例，步骤(3)中，所述超高压处理是在200-400Mpa的压力下保持2-5min，并在2s内卸除压力而完成的。由此，通过采用上述超高压处理条件可以有效地对林蛙皮粉溶解进行预处理，以便进一步提高透明质酸的提取效率。

根据本发明的具体实施例，将超声处理后的林蛙皮粉溶解液置于超高压容器内，启动高压油泵，在200-400Mpa，并在此压力下保持2-5min，然后快速打开控制高压油路的阀门，在2s内卸除压力，超高压处理后的超高压浸出液备用。

S400：酶解处理

根据本发明实施例的从林蛙皮中提取透明质酸的方法，进一步包括：(4)利用胰酶和碱性蛋白酶对所述超高压浸出液进行酶解处理，以便得到酶解液。由于单纯一种蛋白酶水解蛋白的效率低，并且蛋白酶水解具有特异性，选择不同的蛋白酶水解林蛙皮中的蛋白。并根据胰酶和碱性蛋白酶的特异性，添加顺序不同，水解效果也有差异。胰酶和碱性蛋白酶都是特异性较高的蛋白酶，且水解效果好，因此选择这两种酶作为水解蛋白酶，以使林蛙皮中蛋白水解为小肽，以利于后续的分离纯化。

根据本发明的具体实施例，在上述步骤(4)中，酶解处理可以采用分步酶解的方法，具体地可以按照下列步骤进行：((4-1)调节所述超高压浸出液的pH值至8.0-8.5，添加1％的胰酶并于37℃的水浴中进行第一酶解2-4h，沸水浴灭活所述胰酶，以便得到第一酶解液；(4-2)向所述第一酶解液中添加1％的碱性蛋白酶并于50℃的水浴中进行第二酶解3-6h，沸水浴灭活所述碱性蛋白酶，以便得到第二酶解液。

根据本发明的具体实施例，或者调换胰酶和碱性蛋白酶两种的酶的添加顺序，具体地，也可以按照下列步骤进行：(4-1)调节所述超高压浸出液的pH值至8.0-8.5，添加1％的碱性蛋白酶并于50℃的水浴中进行第一酶解3-6h，沸水浴灭活所述碱性蛋白酶，以便得到第一酶解液；(4-2)向所述第一酶解液中添加1％的胰酶并于37℃的水浴中进行第二酶解2-4h，沸水浴灭活所述胰酶，以便得到第二酶解液。

由此，采用胰酶和碱性蛋白酶两种的酶解分步进行酶解的方法，使得胰酶和碱性蛋白酶均在最优的条件下酶解，进而可以显著提高酶解效果，以便最终提高透明质酸的提取率。

S500：浓缩

根据本发明实施例的从林蛙皮中提取透明质酸的方法，进一步包括：(5)向所述酶解液中添加2-3倍体积的95％乙醇以便生成沉淀，离心收集沉淀并进行干燥处理。乙醇可以从溶液中定量回收粘多糖，进而除去部分非糖物质等杂质。同时也可以使溶液达到浓缩的目的。

根据本发明的具体实施例，上述步骤(5)中的干燥处理是在40-60℃的真空干燥箱中进行的。由此在该温度下的真空干燥箱中进行干燥，不仅可以有效地挥干乙醇、避免污染，同时低温下使水分干燥还可以避免透明质酸因高温被降解，因此选择低温减压干燥可以进一步提高透明质酸产率和质量。

S600：脱色处理

根据本发明实施例的从林蛙皮中提取透明质酸的方法，进一步包括：(6)利用氯化钠对经过所述干燥处理后的沉淀进行溶解；(7)向溶解的沉淀中添加过氧化氢进行脱色处理。由此可以有效地进行脱色处理，进而提高透明质酸的纯度和品质。

根据本发明的具体实施例，步骤(7)中，所述脱色处理是通过向溶解的沉淀中添加0.5-1.5体积％的过氧化氢、并调节pH至7.0-7.5，于40-60℃的水浴中进行4-10h完成的。发明人发现，由于过氧化氢是强氧化性物质，添加一定的量，在一定温度和pH值条件下可以氧化色素使其变为无色。但是过氧化氢添加量过高则会使透明质酸也被氧化，并且温度过高也会使透明质酸降解。因此，采用上述脱色处理条件可以显著提高脱色效果。

S700：除蛋白

根据本发明实施例的从林蛙皮中提取透明质酸的方法，进一步包括：(8)调节经过所述脱色处理后的溶液的pH至4.5-5.0，并加入氯仿和正丁醇的混合溶液，搅拌4h，离心分离出蛋白并收集水相；

根据本发明的具体实施例，上述步骤(8)中，可以向所述脱色处理后的溶液中加入等体积的混合溶液。并且混合溶液中氯仿与正丁醇的体积比为4：1。发明人发现，将氯仿与正丁醇按照4：1体积比，同时以等体积的加入量，可以显著提高蛋白变性失活后沉淀效果，并且一定量的正丁醇可以起到脱脂的效果，进而可以进一步提高后续提取透明质酸的纯度。

S800：透析纯化

根据本发明实施例的从林蛙皮中提取透明质酸的方法，进一步包括：(9)利用磷酸盐缓冲液对所述水相进行透析，收集透析液；(10)向所述透析液中添加2-3倍体积的95％乙醇以便生成沉淀，离心收集沉淀并进行干燥处理，以便得到透明质酸精品。

根据本发明的具体实施例，步骤(10)中的干燥处理是在40-60℃的真空干燥箱中进行的。

根据本发明的具体实施例，透析纯化具体可以按照下列步骤进行：配置pH7.0、50mmol/L的磷酸盐缓冲液作为透析液，将样品装于透析袋中，进行过夜透析，每24h更换透析液，更换2-3次，透析结束后，收集样品。

本发明的上述方法将超高压技术与酶水解相结合用于提取透明质酸，从而使蛋白质充分水解成分子量小于100kDa的小分子肽，最后可以使用100kDa的透析袋透析使小分子肽与HA分离，进而有效提高透明质酸的提取率。采用本发明上述实施例的从林蛙皮中透明质酸的方法，每千克林蛙皮可提取4.6克的透明质酸精品，并且所得透明质酸纯度高，活性好。

根据本发明的另一方面，本发明提出了一种从林蛙皮中提取透明质酸的方法，包括：

(1)获取新鲜剥离的林蛙皮，除去皮下组织及粘连物，清洗，室温干燥，粉碎，以便获得林蛙皮粉；

(2)溶解：将所述林蛙皮粉按照1g：10ml的质量体积比溶于蒸馏水中，磁力搅拌4-8h，于4℃冰箱放置至少12h；

(3)超声波处理：将步骤(2)得到的溶液在20-35KHz和100-300W条件下超声处理20-30min，以便得到林蛙皮粉溶解液；

(4)超高压处理：将所述林蛙皮粉溶解液在200-400Mpa的压力下保持2-5min，并在2s内卸除压力完成超高压处理，以便得到超高压浸出液；

(5)酶解：调节所述超高压浸出液的pH值至8.0-8.5，添加1％的胰酶并于37℃的水浴中进行第一酶解2-4h，沸水浴灭活所述胰酶，以便得到第一酶解液；向所述第一酶解液中添加1％的碱性蛋白酶并于50℃的水浴中进行第二酶解3-6h，沸水浴灭活所述碱性蛋白酶，以便得到第二酶解液，或者

调节所述超高压浸出液的pH值至8.0-8.5，添加1％的碱性蛋白酶并于50℃的水浴中进行第一酶解3-6h，沸水浴灭活所述碱性蛋白酶，以便得到第一酶解液；向所述第一酶解液中添加1％的胰酶并于37℃的水浴中进行第二酶解2-4h，沸水浴灭活所述胰酶，以便得到第二酶解液；

(6)浓缩：向所述酶解液中添加2-3倍体积的95％乙醇以便生成沉淀，离心收集沉淀，将沉淀在40-60℃的真空干燥箱中进行干燥处理；

(7)利用0.1-0.5mol/L氯化钠对经过所述干燥处理后的沉淀进行溶解；

(8)向溶解的沉淀中添加0.5-1.5体积％的过氧化氢并于40-60℃的水浴中进行脱色处理4-10h；

(9)调节经过所述脱色处理后的溶液的pH至4.5-5.0，并加入等体积的氯仿和正丁醇的混合溶液，搅拌4h，离心分离出蛋白并收集水相，所述混合溶液中氯仿与正丁醇的体积比为4：1；

(10)利用pH 7.0的50mmol/L的磷酸盐缓冲液对所述水相进行透析，收集透析液；

(11)向所述透析液中添加2-3倍体积的95％乙醇以便生成沉淀，离心收集沉淀并将沉淀在40-60℃的真空干燥箱中进行干燥处理，以便得到透明质酸精品。

本发明的上述方法将超高压技术与酶水解相结合用于提取透明质酸，从而使蛋白质充分水解成分子量小于100kDa的小分子肽，最后可以使用100kDa的透析袋透析使小分子肽与HA分离，进而有效提高透明质酸的提取率。采用本发明上述实施例的从林蛙皮中透明质酸的方法，每千克林蛙皮可最高提取4.6克的透明质酸精品，并且所得透明质酸纯度高，活性好。

实施例1

(1)获取新鲜剥离的林蛙皮，除去皮下组织及粘连物，清洗，室温干燥，粉碎，以便获得林蛙皮粉；

(2)溶解：称取10g林蛙皮粉溶于100ml蒸馏水中，磁力搅拌器搅拌6h之后，4℃冰箱过夜，使之充分溶解。

(3)超声波处理：将溶解后的林蛙皮配成溶液，用超声波进行处理，具体在20KHz-35KHz，100W-300W条件下超声处理20min-30min。

(4)超高压处理：将超声处理后的溶液置于超高压容器内，启动高压油泵，在200-400Mpa，并在此压力下保持2-5min，然后快速打开控制高压油路的阀门，在2s内卸除压力，超高压处理后的样品备用。

(5)酶解：采用蛋白酶分步水解的方法，样品调节pH值8.0-8.5，先添加1％碱性蛋白酶50℃水浴酶解3h，沸水浴使酶灭活，然后添加1％胰酶37℃水浴酶解3h；酶解结束后，进行沸水浴使酶灭活，10000rpm离心10mim，收集上清液，4℃冰箱备用。

(6)浓缩：酶解液添加2倍体积的95％乙醇进行过夜沉淀，离心收集沉淀，于温度为40-60℃的真空干燥箱干燥。待乙醇挥发后，将样品重新溶液0.1-0.5mol/L NaCl中，收集溶液。

(7)脱色：调节溶液pH值为7.0-7.5，添加1％的过氧化氢于40℃水浴脱色6h，样品备用。

(8)除蛋白：调溶液pH为4.5-5.0，加入等体积氯仿与正丁醇混合液(氯仿：正丁醇＝4:1)，搅拌器搅拌4h，离心收集水相。

(9)纯化：配制pH 7.0 50mmol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)作为透析液，将样品装于透析袋中，进行过夜透析，每12h更换一次透析液，更换3次，透析结束后，收集样品。

(10)二次醇沉及干燥：透析后得到的溶液添加2倍体积的95％乙醇进行过夜沉淀，离心收集沉淀，于温度为40-60℃的真空干燥箱干燥，得到粉末状HA精品。

采用上述实施例的从林蛙皮中透明质酸的方法，其提取率为每千克林蛙皮提取4.6克的透明质酸精品，并且所得透明质酸纯度高，活性好。

实施例2

(1)获取新鲜剥离的林蛙皮，除去皮下组织及粘连物，清洗，室温干燥，粉碎，以便获得林蛙皮粉；

(2)溶解：称取10g林蛙皮粉溶于150ml蒸馏水中，磁力搅拌器搅拌8h之后，4℃冰箱过夜，使之充分溶解。

(3)超声波处理：将溶解后的林蛙皮配成溶液，用超声波进行处理，具体在20KHz-35KHz，100W-300W条件下超声处理20min-30min。

(4)超高压处理：将超声处理后的溶液置于超高压容器内，启动高压油泵，在200-400Mpa，并在此压力下保持2-5min，然后快速打开控制高压油路的阀门，在2s内卸除压力，超高压处理后的样品备用。

(5)酶解：采用蛋白酶分步水解的方法，样品调节pH值8.0-8.5，先添加1％胰酶37℃水浴酶解3h，沸水浴使酶灭活，然后添加1％碱性蛋白酶继续50℃水浴酶解3h；酶解结束后，进行沸水浴使酶灭活，10000rpm离心10mim，收集上清液，4℃冰箱备用。

(6)浓缩：酶解液添加3倍体积的95％乙醇进行过夜沉淀，离心收集沉淀，于温度为40-60℃的真空干燥箱干燥。待乙醇挥发后，将样品重新溶液0.1-0.5mol/L NaCl中，收集溶液。

(7)脱色：调节溶液pH值为7.0-7.5，添加1.5％的过氧化氢于50℃水浴脱色2h，样品备用。

(8)除蛋白：调溶液pH为4.5-5.0，加入等体积氯仿与正丁醇混合液(氯仿：正丁醇＝4:1)，搅拌器搅拌4h，离心收集水相。

(9)纯化：配制pH 7.0 50mmol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)作为透析液，将样品装于透析袋中，进行过夜透析，每12h更换一次透析液，更换3次，透析结束后，收集样品。

(10)二次醇沉及干燥：透析后得到的溶液添加3倍体积的95％乙醇进行过夜沉淀，离心收集沉淀，于温度为40-60℃的真空干燥箱干燥，得到粉末状HA精品。

采用上述实施例的从林蛙皮中透明质酸的方法，其提取率为每千克林蛙皮提取4.3克的透明质酸精品，并且所得透明质酸纯度高，活性好。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种从林蛙皮中提取透明质酸的方法，其特征在于，包括：

(1)获取林蛙皮粉；

(2)利用蒸馏水对所述林蛙皮粉进行溶解，以便得到林蛙皮粉溶解液；

(3)将所述林蛙皮粉溶解液在超高压容器内进行超高压处理，以便得到超高压浸出液；

(4)利用胰酶和碱性蛋白酶对所述超高压浸出液进行酶解处理，以便得到酶解液；

(5)向所述酶解液中添加2-3倍体积的95％乙醇以便生成沉淀，离心收集沉淀并进行干燥处理；

(6)利用氯化钠对经过所述干燥处理后的沉淀进行溶解；

(7)向溶解的沉淀中添加过氧化氢进行脱色处理；

(8)调节经过所述脱色处理后的溶液的pH至4.5-5.0，并加入氯仿和正丁醇的混合溶液，搅拌4h，离心分离出蛋白并收集水相；

(9)利用磷酸盐缓冲液对所述水相进行透析，收集透析液；

(10)向所述透析液中添加2-3倍体积的95％乙醇以便生成沉淀，离心收集沉淀并进行干燥处理，以便得到透明质酸精品。

2.根据权利要求1所述的从林蛙皮中提取透明质酸的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述溶解按照下列步骤进行：

(2-1)将所述林蛙皮粉溶于蒸馏水中，磁力搅拌4-8h，于4℃冰箱放置至少12h；

(2-2)将步骤(2-1)得到的溶液在20-35KHz和100-300W条件下超声处理20-30min，以便得到林蛙皮粉溶解液。

3.根据权利要求1所述的从林蛙皮中提取透明质酸的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述超高压处理是在200-400Mpa的压力下保持2-5min，并在2s内卸除压力而完成的。

4.根据权利要求1所述的从林蛙皮中提取透明质酸的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述酶解处理按照下列步骤进行：

(4-1)调节所述超高压浸出液的pH值至8.0-8.5，添加1％的胰酶并于37℃的水浴中进行第一酶解2-4h，沸水浴灭活所述胰酶，以便得到第一酶解液；

(4-2)向所述第一酶解液中添加1％的碱性蛋白酶并于50℃的水浴中进行第二酶解3-6h，沸水浴灭活所述碱性蛋白酶，以便得到第二酶解液。

5.根据权利要求1所述的从林蛙皮中提取透明质酸的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述酶解处理按照下列步骤进行：

(4-1)调节所述超高压浸出液的pH值至8.0-8.5，添加1％的碱性蛋白酶并于50℃的水浴中进行第一酶解3-6h，沸水浴灭活所述碱性蛋白酶，以便得到第一酶解液；

(4-2)向所述第一酶解液中添加1％的胰酶并于37℃的水浴中进行第二酶解2-4h，沸水浴灭活所述胰酶，以便得到第二酶解液。

6.根据权利要求1所述的从林蛙皮中提取透明质酸的方法，其特征在于，步骤(5)和步骤(10)中的干燥处理是在40-60℃的真空干燥箱中进行的。

7.根据权利要求1所述的从林蛙皮中提取透明质酸的方法，其特征在于，步骤(7)中，所述脱色处理是通过向溶解的沉淀中添加0.5-1.5体积％的过氧化氢、并调节pH至7.0-7.5，于40-60℃的水浴中进行4-10h完成的。

8.根据权利要求1所述的从林蛙皮中提取透明质酸的方法，其特征在于，步骤(8)中，向所述脱色处理后的溶液中加入等体积的所述混合溶液。

9.根据权利要求8所述的从林蛙皮中提取透明质酸的方法，其特征在于，所述混合溶液中氯仿与正丁醇的体积比为4：1。

10.一种从林蛙皮中提取透明质酸的方法，其特征在于，包括：

(1)获取新鲜剥离的林蛙皮，除去皮下组织及粘连物，清洗，室温干燥，粉碎，以便获得林蛙皮粉；

(2)溶解：将所述林蛙皮粉按照1g：10ml的质量体积比溶于蒸馏水中，磁力搅拌4-8h，于4℃冰箱放置至少12h；

(3)超声波处理：将步骤(2)得到的溶液在20-35KHz和100-300W条件下超声处理20-30min，以便得到林蛙皮粉溶解液；

(4)超高压处理：将所述林蛙皮粉溶解液在200-400Mpa的压力下保持2-5min，并在2s内卸除压力完成超高压处理，以便得到超高压浸出液；

(5)酶解：调节所述超高压浸出液的pH值至8.0-8.5，添加1％的胰酶并于37℃的水浴中进行第一酶解2-4h，沸水浴灭活所述胰酶，以便得到第一酶解液；向所述第一酶解液中添加1％的碱性蛋白酶并于50℃的水浴中进行第二酶解3-6h，沸水浴灭活所述碱性蛋白酶，以便得到第二酶解液，或者

调节所述超高压浸出液的pH值至8.0-8.5，添加1％的碱性蛋白酶并于50℃的水浴中进行第一酶解3-6h，沸水浴灭活所述碱性蛋白酶，以便得到第一酶解液；向所述第一酶解液中添加1％的胰酶并于37℃的水浴中进行第二酶解2-4h，沸水浴灭活所述胰酶，以便得到第二酶解液；

(6)浓缩：向所述酶解液中添加2-3倍体积的95％乙醇以便生成沉淀，离心收集沉淀，将沉淀在40-60℃的真空干燥箱中进行干燥处理；

(7)利用0.1-0.5mol/L氯化钠对经过所述干燥处理后的沉淀进行溶解；

(8)向溶解的沉淀中添加0.5-1.5体积％的过氧化氢并于40-60℃的水浴中进行脱色处理4-10h；

(9)调节经过所述脱色处理后的溶液的pH至4.5-5.0，并加入等体积的氯仿和正丁醇的混合溶液，搅拌4h，离心分离出蛋白并收集水相，所述混合溶液中氯仿与正丁醇的体积比为4：1；

(10)利用pH 7.0的50mmol/L的磷酸盐缓冲液对所述水相进行透析，收集透析液；

(11)向所述透析液中添加2-3倍体积的95％乙醇以便生成沉淀，离心收集沉淀并将沉淀在40-60℃的真空干燥箱中进行干燥处理，以便得到透明质酸精品。