CN110824039B - 一种检测骨结核标本中环丝氨酸浓度的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测骨结核标本中环丝氨酸浓度的方法。它包括如下步骤：(1)将骨结核标本用液氮冷冻，液氮挥发后，加入溶剂研磨并进行环丝氨酸提取，收集组织提取液；(2)对组织提取液和环丝氨酸标准溶液采用高效液相色谱‑质谱联用进行检测；测定时，如组织提取液色谱峰的保留时间与环丝氨酸标准溶液一致，并在扣除背景后的样品质谱中，所选择的定性离子均出现，且丰度与环丝氨酸标准溶液的离子丰度比相一致，判定环丝氨酸检出；(3)根据步骤(2)得到的高效液相色谱‑质谱联用测定的组织提取液的数据，采用内标法对骨结核标本中的环丝氨酸的含量进行定量分析，即得到骨结核标本中环丝氨酸浓度。本发明缩短了骨标本处理的时间，测定浓度准确。

Description

一种检测骨结核标本中环丝氨酸浓度的方法
技术领域
本发明涉及一种检测骨结核标本中环丝氨酸浓度的方法，属于药物检测领域。
背景技术
骨结核是由结核杆菌侵入骨或关节而引起的破坏性病变。发病部位多数在负重大、活动多、容易发生劳损的骨或关节。最好发病部位是脊柱，其次是髋、膝、足、肘、手等。
目前，各研究中从骨组织中检测药物浓度的处理方法大多为-50℃下冷冻干燥，称其质量后迅速研磨成粉，再称其所需要的重量。最后根据测得的药物浓度，依据骨匀浆稀释比、组织的干湿质量比两次换算并减去骨样本中的血污染后求得组织样本中药物的实际浓度。
由于冷冻干燥所需的时间相对较长，且两次称重会进一步加大误差。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测骨结核标本中环丝氨酸浓度的方法，本发明缩短了骨标本处理的时间，省去了组织干湿质量比的换算，测定浓度更准确。
本发明提供了一种检测骨结核标本中环丝氨酸浓度的方法，包括如下步骤：(1)将骨结核标本先用液氮冷冻，等液氮挥发后，加入溶剂研磨并进行环丝氨酸提取，收集组织提取液；
(2)对所述组织提取液和环丝氨酸标准溶液采用高效液相色谱-质谱联用进行检测；测定时，如所述组织提取液色谱峰的保留时间与所述环丝氨酸标准溶液一致，并在扣除背景后的样品质谱中，所选择的定性离子均出现，且丰度与所述环丝氨酸标准溶液的离子丰度比相一致，判定环丝氨酸检出；
(3)根据步骤(2)得到的所述高效液相色谱-质谱联用测定的所述组织提取液的数据，采用内标法对所述骨结核标本中的环丝氨酸的含量进行定量分析，即得到骨结核标本中环丝氨酸浓度。
上述的方法中，所述溶剂为水，具体可为HPLC级别纯水；
采用陶瓷珠进行所述研磨；
所述提取在匀浆条件下进行。
上述的方法中，步骤(1)中还包括对所述骨结核标本进行如下处理的步骤：用生理盐水冲去附着血液，用滤纸擦干残液和附着组织，匀浆前先将骨结核标本用液氮冷冻，等液氮挥发后，加入溶剂研磨；
所述研磨的条件：速率为6m/s，100s间歇1min，重复一次；
所述提取的过程如下：4℃放置5h，其间每1小时间断涡旋：6m/s速度涡旋20s；然后4℃离心10min，收集上清。
上述的方法中，所述高效液相色谱-质谱联用的检测条件如下：a)进样体积：2μL；
b)色谱柱：液相色谱柱：ZORBAX SB-Aq，2.1×50mm，3.5Micron，具体可为PN871700-914；
c)流动相：A相为5mM甲酸胺水溶液，B相为含体积百分比0.1％甲酸的甲醇溶液；
d)梯度程序：采用等度洗脱，流动相A相体积分数为85％、B相体积分数为15％，停止时间4min；
e)流速：0.3mL/min；
f)离子源：电喷雾离子源-正离子模式；
g)检测方式：多反应监测；
h)离子源温度：300℃；
i)毛细管电压：4kV；
j)碰撞气、气帘气、雾化气、辅助气均为高纯氮气，使用前调节各气流流量以使质谱灵敏度达到检测要求；
k)去簇电压、碰撞能量应优化至最佳灵敏度。
上述的方法中，所述环丝氨酸的检测离子对如下：m/z 103.0/75.0作为定量离子对、m/z 103.0/58.0作为定性离子对；碎裂电压为45V；碰撞能量为2eV。
上述的方法中，所述内标法采用的内标物为对乙酰氨基酚(英文名Paracetamol)；
所述定量分析步骤(3)中具体包括如下步骤：1)对于步骤(2)中配制至少6个不同浓度的所述环丝氨酸标准溶液加入相同浓度的内标物工作液，将所述标准溶液采用所述的高液相色谱-质谱联用进行检测，得到不同浓度的环丝氨酸的色谱峰面积和内标物的色谱峰面积，以所述标准溶液与所述内标物的浓度比为横坐标，以所述标准溶液与所述内标物的峰面积比为纵坐标，制作标准工作曲线并得到回归方程；
2)在步骤(2)所述组织提取液中加入步骤1)中相同浓度的所述的内标物工作液，采用所述的高液相色谱-质谱联用进行检测，得到所述组织提取液中环丝氨酸的峰面积带入所述回归方程中，计算即得到所述骨结核标本中的环丝氨酸的含量。
本发明中，所述定量分析步骤(3)-1)中，具体可配制10个不同浓度的所述环丝氨酸标准溶液。
上述的方法中，所述环丝氨酸标准溶液的浓度可为0.2～30μg/mL；
所述内标物的储存液浓度可为1mg/mL，稀释至20μg/mL。
本发明具有以下优点：
本发明技术方案采用内标法，减少了较为繁琐的前处理步骤，缩短了骨标本处理的时间，减少样本前处理中的误差；采用液氮对骨标本进行冷冻，提高了匀浆的效率有助于骨组织中药物的提取。同时，省去了组织干湿质量比的换算，进而减少了误差。而且，本方案的研磨过程均在密闭容器内完成，省去了传统方法开盖称重处理的步骤，提高了操作的生物安全性。
附图说明
图1为本发明实施例中标准曲线的测定结果。
图2为本发明实施例中质谱图定性检测的结果图。
图3为本发明实施例中骨标本1中CS检测的色谱峰。
图4为本发明实施例中骨标本2中CS检测的色谱峰。
图5为本发明实施例中骨标本3中CS检测的色谱峰。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中，色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶；
色谱柱柱箱柱温：30℃。
进样量：2μL。
匀浆机为MP Bio FASTPREP-24仪器。
实施例、
1.标本处理
骨标本：
1)取出后立即用生理盐水冲去附着血液，用滤纸擦干残液和附着组织；
2)称重后，将骨标本转移到2mL外旋式螺口管中，先用液氮冷冻，等液氮挥发后，按照1g骨标本重量加1mL HPLC级别纯水的比例加水；
4)研磨：在螺口管中加两颗瓷珠，在匀浆机上研磨：6m/s，100s间歇1min，重复一次。
5)骨匀浆在4℃放置5h以提取药物(每1小时间断涡旋：用匀浆机6m/s速度涡旋20s)；
6)离心：3500g，4℃，10min；
7)收集上清EP管分装，即得组织提取液(每管50μl分装)，待测；
*以外伤手术中取到的破碎骨组织为空白对照
2.HPLC-MS检测环丝氨酸药物浓度
(1)色谱系统Agilent HPLC 1260
1)流动相：A相为5mM甲酸胺水溶液，B相为含0.1％甲酸的甲醇溶液；
流速：0.3mL/min；
色谱柱
分离柱：ZORBAX SB-Aq，2.1×50mm，3.5Micron(PN 871700-914)；
(2)质谱系统Agilent QQQ G6420A
1)质谱部分QQQ
(3)标准曲线建立及骨结核标本中环丝氨酸检测
配制标准品工作液(所有药物储存液浓度均为1mg/mL)
1)按照样本处理方法，预设工作液浓度，以得到标准溶液浓度(简称标曲浓度)建立标准曲线；
表1预设浓度
Figure BDA0002259350000000041
2)定性检测骨结核标本中环丝氨酸
待测药物工作液配制、环丝氨酸标准溶液配制：分别标记L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9、L10，10个EP管，首先吸取300μL配制好的环丝氨酸标准储备液(1mg/mL)，加入700μL的去离子水中配制成总体积为1000μL的溶液L10(300μg/mL)；再吸取储备液240μL、去离子水760μL配置成溶液L9(240μg/mL)；再吸取储备液160μL加上840μL去离子水配置成溶液L8(160μg/mL)；从溶液L9中吸取500μL加上500μL去离子水配置成L7(120μg/mL)；从溶液L8中吸取500μL加上500μL去离子水配置成溶液L6(80μg/mL)；从溶液L6中吸取500μL加上500μL去离子水配置成溶液L5(40μg/mL)；从溶液L5中吸取500μL加上500μL去离子水配置成溶液L4(20μg/mL)；从溶液L6中吸取100μL加上900μL去离子水配置成溶液L3(8μg/mL)；从溶液L5中吸取100μL加上900μL去离子水配置成溶液L2(4μg/mL)；从溶液L4中吸取100μL加上900μL去离子水配置成溶液L1(2μg/mL)。最后得到环丝氨酸工作液的浓度范围为：2～300μg/mL。
环丝氨酸标准溶液配制：健康人血浆从-80℃冰箱取出后室温解冻。精密量取100μL加入12个洁净EP管中(标记为L1-L10，L0，Blank)，L1-L10、L0分别加10μL内标工作液，Blank加10μL去离子水；L1-L10分别加10μL相应的各梯度工作液，L0、Blank各加10μL去离子水；充分涡旋混匀，短暂离心收集；在L1-L10，L0，Blank均加入380μL纯甲醇，充分涡旋混匀30s；在12000rpm/min，4℃下离心10min；离心过程中，标记上样瓶(L1-L10，L0，Blank)，分别加入600μL去离子水，离心结束后小心吸取上清300μL加入对应的上样瓶中，使最终的标准曲线L1-L10的浓度为0.2-30μg/mL(由低到高)，旋紧盖子，充分涡旋混匀。
将上述得到的组织提取液和标准溶液通过上述高效液相色谱-质谱联用进行检测，如图2所示，组织提取液的色谱峰的保留时间与标样一致，并在扣除背景后的样品质谱中，所选择的定性离子均出现，且丰度与标样的离子丰度比相一致，则判定环丝氨酸检出。
3)定量检测骨结核标本中环丝氨酸的浓度
内标工作液配制：
内标物的储存液20μL，加溶剂980μL。
环丝氨酸标准溶液通过高效液相色谱-质谱联用进行检测，环丝氨酸标准曲线测定程序运行结束后打开定量软件，以环丝氨酸浓度与内标浓度之比为横坐标，以环丝氨酸峰面积与内标峰面积之比为纵坐标，进行线性拟合；选择10个校正浓度+零浓度+空白＝12个标样，零点不参加校正，仅用于评价干扰；10个矫正浓度至少应该包括6个；建立如图1所示的标准曲线。
由图1可知，标准曲线公式如式I所示：
y＝0.008208x-4.613742×10-4 式I；
标准曲线式I中，y代表目标化合物环丝氨酸的响应值和内标对乙酰氨基酚的响应值的比值；x代表标本中目标化合物环丝氨酸的最终浓度与内标对乙酰氨基酚的浓度的比值。
上述标准曲线需评价3次，R2≥0.990。
将上述组织提取液加入相同浓度的内标物工作液，采用上述高液相色谱条件进行检测，得到组织提取液中环丝氨酸的峰面积带入所述回归方程中，计算即得到上述骨结核标本中的环丝氨酸的含量。
选取的具体骨标本1-3通过上述方法测定，结果如图3-5所示。
由图3中可知骨标本1中目标化合物环丝氨酸的响应值为509，内标对乙酰氨基酚的响应值为12742，内标对乙酰氨基酚的浓度为2000ng/μL，代入式I，得骨标本1中目标化合物环丝氨酸的最终浓度为9855.2444ng/μL。
由图4中可知骨标本2中目标化合物环丝氨酸的响应值为256，内标对乙酰氨基酚的响应值为12486，内标对乙酰氨基酚的浓度为2000ng/μL，代入式I，得骨标本1中目标化合物环丝氨酸的最终浓度为5112.3533ng/μL。
由图5中可知骨标本3中目标化合物环丝氨酸的响应值为319，内标对乙酰氨基酚的响应值为12364，内标对乙酰氨基酚的浓度为2000ng/μL，代入式I，得骨标本1中目标化合物环丝氨酸的最终浓度为6396.0785ng/μL。

Claims (6)

1.一种检测骨结核标本中环丝氨酸浓度的方法，包括如下步骤：(1)将骨结核标本先用液氮冷冻，等液氮挥发后，加溶剂研磨并进行环丝氨酸提取，收集组织提取液；
所述溶剂为水；
所述提取在匀浆条件下进行；
(2)对所述组织提取液和环丝氨酸标准溶液采用高效液相色谱-质谱联用进行检测；测定时，如所述组织提取液色谱峰的保留时间与所述环丝氨酸标准溶液一致，并在扣除背景后的样品质谱中，所选择的定性离子均出现，且丰度与所述环丝氨酸标准溶液的离子丰度比相一致，判定环丝氨酸检出；
(3)根据步骤(2)得到的所述高效液相色谱-质谱联用测定的所述组织提取液的数据，采用内标法对所述骨结核标本中的环丝氨酸的含量进行定量分析，即得到骨结核标本中环丝氨酸浓度；
所述内标法采用的内标物为对乙酰氨基酚；
所述高效液相色谱-质谱联用的检测条件如下：a)进样体积：2μL；
b)色谱柱：液相色谱柱ZORBAX SB-Aq，2.1×50mm，3.5Micron；
c)流动相：A相为5mM甲酸铵 水溶液，B相为含体积百分比0.1％甲酸的甲醇溶液；
d)梯度程序：流动相A:85％/B:15％等度洗脱，停止时间4min；
e)流速：0.3mL/min；
f)离子源：电喷雾离子源-正离子模式；
g)检测方式：多反应监测；
h)离子源温度：300℃；
i)毛细管电压：4kV；
j)碰撞气、气帘气、雾化气、辅助气均为高纯氮气，使用前调节各气流流量以使质谱灵敏度达到检测要求；
k)去簇电压、碰撞能量应优化至最佳灵敏度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：采用陶瓷珠进行所述研磨。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(1)中还包括对所述骨结核标本进行如下处理的步骤：用生理盐水冲去附着血液，用滤纸擦干残液和附着组织，匀浆前先将骨结核标本用液氮冷冻，等液氮挥发后，加入溶剂研磨；
所述研磨的条件：速率为6m/s，100s间歇1min，重复一次；
所述提取的过程如下：4℃放置5h，其间每1小时间断涡旋：6m/s速度涡旋20s；然后4℃离心10min，收集上清。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述环丝氨酸的检测离子对如下：m/z103.0/75.0作为定量离子对、m/z 103.0/58.0作为定性离子对；碎裂电压为45V；碰撞能量为2eV。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：定量分析步骤(3)中包括如下步骤：1)对于步骤(2)中配制至少6个不同浓度的所述环丝氨酸标准溶液加入相同浓度的内标物工作液，将所述标准溶液采用所述的高效 液相色谱-质谱联用进行检测，得到不同浓度的环丝氨酸的色谱峰面积和内标物的色谱峰面积，以所述标准溶液与所述内标物的浓度比为横坐标，以所述标准溶液与所述内标物的峰面积比为纵坐标，制作标准工作曲线并得到回归方程；
2)在步骤(2)所述组织提取液中加入步骤1)中相同浓度的所述的内标物工作液，采用所述的高液相色谱-质谱联用进行检测，得到所述组织提取液中环丝氨酸的峰面积带入所述回归方程中，计算即得到所述骨结核标本中的环丝氨酸的含量。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述环丝氨酸标准溶液的浓度为0.2～30μg/mL；
所述内标物的储存液浓度为1mg/ml，稀释至20μg/mL。
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人胃粘膜中γ-氨基丁酸和谷氨酸含量的高效液相色谱法测定;谭力 等;《色谱》;20040330;第22卷(第2期);第131-133页 *
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