CN114137223A - 一种快速测定igf-1的胶乳增强免疫比浊法测定试剂盒及其制备使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种快速测定IGF‑1的胶乳增强免疫比浊法测定试剂盒,包括试剂R1和试剂R2;所述试剂R1为含促凝剂的缓冲溶液,试剂R2为固定化IGF‑1抗体的胶乳微球溶液;其中,试剂R2的具体成分为:5~10mmol/LIGF‑1抗体胶乳微球,10~100mmol/LTris‑HCl缓冲液,2~5g/LBSA,0.1~1g/L防腐剂。本发明还提供上述试剂盒的制备使用方法。本发明的优点在于:(1)可直接使用全自动生化仪进行检测,不仅操方便,还省时节约;(2)还具有灵敏度高和特异性好等优点,且采用本发明试剂盒对IGF‑1进行定量检测,准确度偏差≤10%。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域,尤其涉及一种快速测定IGF-1的胶乳增强免疫比浊法测定试剂盒及其制备使用方法。
背景技术
胰岛素样生长因子(insulin-like growth factors,简称IGFs)是一类多功能细胞增殖调控因子,其在细胞的分化、增殖、个体的生长发育中具有重要的促进作用。IGF在组织或血液中均与胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)相结合,以复合物的形式存在。
IGFBP-1、IGFBP-2这两者占血清中可提取的胰岛素样生长因子总量的90%以上,并且它们在促组织细胞生长发育中起主要作用。机体多种组织器官可以合成分泌IGF-1,但最主要的器官是肝脏,约合成血液中80%的IGF-1。血液循环中,IGF-1具有促进细胞增生和分化,促进细胞生长,抑制细胞凋亡,同时具有类似胰岛素代谢活性及免疫调节作用。因此,IGF-1是反应生长激素生物功能的灵敏指标,TGF-1的检测对疾病的进程和疗效判断提供了重要的依据。
目前,检测IGF-1的方法主要有酶联免疫吸附法(ELISA)。酶联免疫吸附法(ELISA)是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面,使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术,该方法检测操作繁琐、自动化程度低、耗时长,不利于快速检测。
胶乳增强免疫比浊法是将待测物质相对应的抗体包被在胶乳颗粒上,使抗原抗体结合物的体积增大,光通过之后,透射光和散射光的强度变化更为显著,从而提高试验的敏感性。此方法操作步骤简便,几分钟就能获得测试结果,也避免了许多人为操作带来的误差和外界环境因素的干扰,能较准确真实的反映被测物质的含量。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种快速测定IGF-1的胶乳增强免疫比浊法测定试剂盒及其制备使用方法。
本发明采用以下技术方案解决上述技术问题:
一种快速测定IGF-1的胶乳增强免疫比浊法测定试剂盒,包括试剂R1和试剂R2;所述试剂R1为含10~50g/L促凝剂的缓冲溶液,试剂R2为固定化IGF-1抗体的胶乳微球溶液;其中,试剂R2的具体成分为:5~10mmol/L IGF-1抗体胶乳微球,10~100mmol/L Tris-HCl缓冲液,2~5g/LBSA,0.1~1g/L防腐剂。
作为本发明的优选方式之一,所述试剂R1的具体成分为:10~100mmol/L、pH 7.0~8.0的Tris-HCl缓冲液,9-135g/L氯化钠,10-50g/L促凝剂,0.1~1g/L防腐剂。
作为本发明的优选方式之一,所述试剂R1中,促凝剂为PEG6000,防腐剂为Proclin300和叠氮钠中的一种或两种。
作为本发明的优选方式之一,所述试剂R2中,IGF-1抗体胶乳微球的制备方法为:①取120nm的羧基微球1mL,并加入3~5mL BufferA缓冲体系混匀;②加入250-500μL的10mg/mL EDC进行活化反应,水浴震荡10~30min;③采用BufferB缓冲体系对3~5mg抗体稀释,待抗体稀释4~6倍后滴加至步骤②获得的胶乳液中,并震荡偶联反应2~3h,使微球表面的疏水位点能更好的与IGF-1抗体以共价键形式紧密结合;④加入封闭液封闭20~60min,从而封闭微球表面的多余疏水位点使反应终止,进而减少非特异性反应,把IGF-1抗体与120nm空白羧基微球偶联形IGF-1抗体胶乳微球;⑤离心分离获取胶乳微球,并采用超声的方法将偶联抗体的胶乳微球分散均匀。
此处,胶乳微球标记IGF-1抗体采用120nm空白羧基微球标记,具有放大反应信号、信号受背景干扰小、检测灵敏度高、结果重复性好的优点。
同时,本发明中IGF-1抗体胶乳微球标记物还经过多个预处理,即上述的BufferA缓冲体系处理、EDC活化以及BufferB缓冲体系处理等步骤过程。预处理过程的设计可有效提高本发明试剂盒的灵敏度。
另外,本发明在采用离心法制得沉淀后,以超声重悬方式去除游离的抗体,可使试剂R2中的抗体微球更加均一,从而提高检测结果的准确度。
作为本发明的优选方式之一,所述BufferA缓冲体系包括10~100mmol/LMES和0.04%-0.4%Tween 20,pH 5.0~6.0。BufferB缓冲体系包括10~100mmol/LMES和0.04%-0.4%Tween 20,pH 6.0~7.5。其中,Tween 20能够提高EDC活化效率,进而促进微球与抗体的偶联。
封闭液包括0.1~0.5%稳定成分、0.01~0.05%防腐成分以及一定浓度的硼酸硼砂缓冲液;其中,稳定成分为按照质量比1:2混合的BSA、Casein混合液,可以对未结合抗体的微球表面进行封闭,维持免疫胶乳的稳定,同时也具有终止微球继续发生非特异性反应的作用;防腐成分为Proclin300或叠氮钠,可有效制细菌等繁殖。
作为本发明的优选方式之一,一定浓度的硼酸硼砂缓冲液具体为含50mmol/L硼酸与10mmol/L的硼砂缓冲液,pH 8.0~9.0。
作为本发明的优选方式之一,所述试剂R2中,Tris-HCl缓冲液、BSA与防腐剂构成Buffer C;所述Buffer C中的防腐剂为Proclin300和叠氮钠中的一种或两种,Tris-HCl缓冲液的pH为7.0~8.0;Buffer C能长期保存胶乳微球,效期可达12个月。
一种上述快速测定IGF-1的胶乳增强免疫比浊法测定试剂盒的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)配制试剂R1
按照试剂R1的组分含量,将各组分于同一容器中混合;混合均匀后,经0.45μm滤膜过滤、37℃老化7天,制得试剂R1;
(2)制备IGF-1抗体胶乳微球
①取120nm的羧基微球1mL,并加入3~5mL BufferA缓冲体系混匀;②加入250-500μL的10mg/mL EDC进行活化反应,恒温37℃水浴震荡10~30min;③将3~5mg IGF-1抗体用Buffer B缓冲体系稀释稀释4~6倍后,滴加至步骤②获得的胶乳液中,并37℃恒温震荡偶联反应2~3h;④加入封闭液,于37℃恒温封闭20~60min;⑤离心分离获取胶乳微球,并采用超声的方法将偶联抗体的胶乳微球分散均匀,得目标所需的IGF-1抗体胶乳微球;
(3)配制试剂R2
按照试剂R2的组分含量,将Tris-HCl缓冲液、BSA、防腐剂以及步骤(2)制得的IGF-1抗体胶乳微球于同一容器中混合;混合均匀后,37℃老化7天,即得试剂R2。
一种上述快速测定IGF-1的胶乳增强免疫比浊法测定试剂盒的使用方法,其特征在于,包括如下具体步骤:
(1)吸取10μL样本,加入250μL试剂R1,37℃孵育5min;
(2)再加入125μL试剂R2进行混合,并使其充分反应;
(3)lmin后读取吸光值Al,3min后读取吸光值A2,计算ΔA;
(4)根据吸光度变化值ΔA计算出样本中IGF-1含量。
作为本发明的优选方式之一,所述步骤(3)中,采用全自动生化分析仪,于主波长450nm处测定吸光值;
作为本发明的优选方式之一,因为IGF-1受年龄、性别等影响较大,所述步骤(4)中,依据定标值,根据ΔA测算样本中IGF-1含量;所述定标方法为:5点定标,采用全自动生化分析仪进行检测,设置校准品浓度分别为:1200ug/L、600ug/L、300ug/L、150ug/L、0ug/L。
本发明相比现有技术的优点在于:
(1)本发明试剂盒检测血清中IGF-1含量,提高了检测灵敏度;并且,可用于全自动生化分析仪,方便且省时节约;同时,在试剂制作上也简单方便,适用于大规模生产;
(2)本发明可在全自动生化分析仪上使用,成本低廉,且自动化高,节省检测时间;在高稳定性和高精密度情况下,相比同类产品具有更高的灵敏度和特异性,提升了IGF-1检测的应用价值;
(3)本发明所提供的检测试剂盒将IGF-1通过免疫比浊法进行检测,准确度偏差≤10%,通过一次加样操作就能检测出样本中IGF-1的含量,简化了操作过程,兼具灵敏性和特异性,快速准确评估相关临床症状。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明,本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施,给出了详细的实施方式和具体的操作过程,但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例的一种快速测定IGF-1的胶乳增强免疫比浊法测定试剂盒,包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分,并且,试剂R1为含10g/L促凝剂的缓冲溶液,试剂R2为固定化IGF-1抗体的胶乳微球溶液。
具体地,试剂R1包括:10mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.0~8.0),9g/L氯化钠,10g/LPEG6000,0.1g/L Proclin300,其溶剂为纯化水。试剂R2包括:5mmol/LIGF-1抗体胶乳微球,10mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.0~8.0),2g/L BSA,0.1~1g/L Proclin300,其溶剂为纯化水。
其中,关于试剂R2中IGF-1抗体胶乳微球的制备:①取120nm的羧基微球1mL,并加入3mL BufferA缓冲体系混匀;②加入250μL的10mg/mL EDC进行活化反应,水浴震荡10min;③采用BufferB缓冲体系对3mg抗体稀释,待抗体稀释4倍后滴加至步骤②获得的胶乳液中,并震荡偶联反应2h,使微球表面的疏水位点能更好的与IGF-1抗体以共价键形式紧密结合;④加入封闭液封闭20min,从而封闭微球表面的多余疏水位点使反应终止,进而减少非特异性反应,把IGF-1抗体与120nm空白羧基微球偶联形IGF-1抗体胶乳微球;⑤离心分离获取胶乳微球,并采用超声的方法将偶联抗体的胶乳微球分散均匀。
此处,胶乳微球标记IGF-1抗体采用120nm空白羧基微球标记,具有放大反应信号、信号受背景干扰小、检测灵敏度高、结果重复性好的优点。
同时,本实施例中IGF-1抗体胶乳微球标记物经过多个预处理,即上述的BufferA缓冲体系处理、EDC活化以及BufferB缓冲体系处理等步骤过程。预处理过程的设计可有效提高本发明试剂盒的灵敏度。
另外,本发明在采用离心法制得沉淀后,以超声重悬方式去除游离的抗体,可使试剂R2中的抗体微球更加均一,从而提高检测结果的准确度。
进一步地,本实施例中,Buffer A缓冲体系包括10mmol/L MES和0.04%Tween 20,pH 5.0~6.0。Buffer B缓冲体系包括10mmol/L MES和0.04%Tween 20,pH 6.0~7.5。其中,Tween 20能够提高EDC活化效率,进而促进微球与抗体的偶联。
封闭液包括0.1%稳定成分、0.01%防腐成分以及硼酸硼砂缓冲液(含50mmol/L硼酸与10mmol/L的硼砂缓冲液,pH 8.0~9.0)。其中,稳定成分为按照质量比1:2混合的BSA、Casein混合液,可以对未结合抗体的微球表面进行封闭,维持免疫胶乳的稳定,同时也具有终止微球继续发生非特异性反应的作用;防腐成分为Proclin300或叠氮钠,可有效制细菌等繁殖。
实施例2
本实施例的一种快速测定IGF-1的胶乳增强免疫比浊法测定试剂盒,包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分,并且,试剂R1为含50g/L促凝剂的缓冲溶液,试剂R2为固定化IGF-1抗体的胶乳微球溶液。
具体地,试剂R1包括:100mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.0~8.0),135g/L氯化钠,50g/LPEG6000,1g/L叠氮钠,其溶剂为纯化水。试剂R2包括:10mmol/LIGF-1抗体胶乳微球,100mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.0~8.0),5g/L BSA,1g/L叠氮钠,其溶剂为纯化水。
其中,关于试剂R2中IGF-1抗体胶乳微球的制备:①取120nm的羧基微球1mL,并加入5mL BufferA缓冲体系混匀;②加入500μL的10mg/mL EDC进行活化反应,水浴震荡30min;③采用BufferB缓冲体系对5mg抗体稀释,待抗体稀释6倍后滴加至步骤②获得的胶乳液中,并震荡偶联反应3h,使微球表面的疏水位点能更好的与IGF-1抗体以共价键形式紧密结合;④加入封闭液封闭60min,从而封闭微球表面的多余疏水位点使反应终止,进而减少非特异性反应,把IGF-1抗体与120nm空白羧基微球偶联形IGF-1抗体胶乳微球;⑤离心分离获取胶乳微球,并采用超声的方法将偶联抗体的胶乳微球分散均匀。
此处,胶乳微球标记IGF-1抗体采用120nm空白羧基微球标记,具有放大反应信号、信号受背景干扰小、检测灵敏度高、结果重复性好的优点。
同时,本实施例中IGF-1抗体胶乳微球标记物经过多个预处理,即上述的BufferA缓冲体系处理、EDC活化以及BufferB缓冲体系处理等步骤过程。预处理过程的设计可有效提高本发明试剂盒的灵敏度。
另外,本发明在采用离心法制得沉淀后,以超声重悬方式去除游离的抗体,可使试剂R2中的抗体微球更加均一,从而提高检测结果的准确度。
进一步地,本实施例中,BufferA缓冲体系包括100mmol/L MES和0.4%Tween 20,pH 5.0~6.0。BufferB缓冲体系包括100mmol/L MES和0.4%Tween 20,pH 6.0~7.5。其中,Tween 20能够提高EDC活化效率,进而促进微球与抗体的偶联。
封闭液包括0.5%稳定成分、0.05%防腐成分以及硼酸硼砂缓冲液(含50mmol/L硼酸与10mmol/L的硼砂缓冲液,pH 8.0~9.0)。其中,稳定成分为按照质量比1:2混合的BSA、Casein混合液,可以对未结合抗体的微球表面进行封闭,维持免疫胶乳的稳定,同时也具有终止微球继续发生非特异性反应的作用;防腐成分为Proclin300或叠氮钠,可有效制细菌等繁殖。
实施例3
本实施例的一种快速测定IGF-1的胶乳增强免疫比浊法测定试剂盒,包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分,并且,试剂R1为含20g/L促凝剂的缓冲溶液,试剂R2为固定化IGF-1抗体的胶乳微球溶液。
具体地,试剂R1包括:50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.0~8.0),90g/L氯化钠,20g/L PEG6000,0.5g/L Proclin300,其溶剂为纯化水。试剂R2包括:8mmol/L IGF-1抗体胶乳微球,50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.0~8.0),4g/L BSA,0.5g/L Proclin300,其溶剂为纯化水。
其中,关于试剂R2中IGF-1抗体胶乳微球的制备:①取120nm的羧基微球1mL,并加入4mL BufferA缓冲体系混匀;②加入350μL的10mg/mL EDC进行活化反应,水浴震荡20min;③采用BufferB缓冲体系对4mg抗体稀释,待抗体稀释5倍后滴加至步骤②获得的胶乳液中,并震荡偶联反应2.5h,使微球表面的疏水位点能更好的与IGF-1抗体以共价键形式紧密结合;④加入封闭液封闭40min,从而封闭微球表面的多余疏水位点使反应终止,进而减少非特异性反应,把IGF-1抗体与120nm空白羧基微球偶联形IGF-1抗体胶乳微球;⑤离心分离获取胶乳微球,并采用超声的方法将偶联抗体的胶乳微球分散均匀。
此处,胶乳微球标记IGF-1抗体采用120nm空白羧基微球标记,具有放大反应信号、信号受背景干扰小、检测灵敏度高、结果重复性好的优点。
同时,本实施例中IGF-1抗体胶乳微球标记物经过多个预处理,即上述的BufferA缓冲体系处理、EDC活化以及BufferB缓冲体系处理等步骤过程。预处理过程的设计可有效提高本发明试剂盒的灵敏度。
另外,本发明在采用离心法制得沉淀后,以超声重悬方式去除游离的抗体,可使试剂R2中的抗体微球更加均一,从而提高检测结果的准确度。
进一步地,本实施例中,BufferA缓冲体系包括50mmol/L MES和0.2%Tween 20,pH5.0~6.0。BufferB缓冲体系包括50mmol/LMES和0.2%Tween 20,pH 6.0~7.5。其中,Tween20能够提高EDC活化效率,进而促进微球与抗体的偶联。
封闭液包括0.3%稳定成分、0.03%防腐成分以及硼酸硼砂缓冲液(含50mmol/L硼酸与10mmol/L的硼砂缓冲液,pH 8.0~9.0)。其中,稳定成分为按照质量比1:2混合的BSA、Casein混合液,可以对未结合抗体的微球表面进行封闭,维持免疫胶乳的稳定,同时也具有终止微球继续发生非特异性反应的作用;防腐成分为Proclin300或叠氮钠,可有效制细菌等繁殖。
实施例4
本实施例的一种上述实施例中快速测定IGF-1的胶乳增强免疫比浊法测定试剂盒的制备方法,包括如下步骤:
(1)配制试剂R1
按照试剂R1的组分含量,将各组分于同一容器中混合;混合均匀后,经0.45μm滤膜过滤、37℃老化7天,制得试剂R1;
(2)配制试剂R2
按照试剂R2的组分含量,将Tris-HCl缓冲液、BSA、防腐剂以及制得的IGF-1抗体胶乳微球于同一容器中混合;混合均匀后,37℃老化7天,即得试剂R2。
实施例5
本实施例的一种上述快速测定IGF-1的胶乳增强免疫比浊法测定试剂盒的使用方法。
分析方法:两点终点法;
反应方向:上升反应;
校准方式:Logit-Log(4P);
测定波长:采用全自动生化分析仪,主波长450nm;
测定温度:37℃;
样本:试剂R1:试剂R2=10:250:125(μL);
IGFBP-1校准品:
采用0.2%BSATris-HCL缓冲液作为空白样本,空白样本应不含被测物加入质量比为0.1%的叠氮钠以及3%的蔗糖,再加入IGF-1至1200ug/L。
测试步骤:
(1)吸取10μL样本,加入250μL试剂R1,37℃孵育5min;
(2)再加入125μL试剂R2进行混合,并使其充分反应;
(3)lmin后读取吸光值Al,3min后读取吸光值A2,计算ΔA;
(4)根据吸光度变化值ΔA计算出样本中IGF-1含量。
其中,依据定标值,根据ΔA测算样本中IGF-1含量;所述定标方法为:5点定标,采用全自动生化分析仪进行检测,设置校准品浓度分别为:1200ug/L、600ug/L、300ug/L、150ug/L、0ug/L。
实施例6
本实施例用以评价上述IGF-1测定试剂盒的使用效果。
1.线性相关性验证:
利用上述实施例3配方配制试剂,与国家食品药品监督管理总局认可的某上市公司的IGF-1检测试剂盒进行对照检测,检测100份临床血清样本,检测结果如下表1,获得了本发明试剂盒与上市某公司在售在售IGF-1检测试剂盒(基于ELISA法的试剂盒)的相关性曲线;通过检测结果显示,两试剂盒的线性相关系数r>0.990,说明两者具有较大的相关性。
表1本发明试剂盒(测试样品)与某上市公司在售IGF-1检测试剂盒(作为对照)线性相关性比对值
2.线性范围验证:
配制1200ug/L、600ug/L、300ug/L、150ug/L、0ug/L不同浓度IGF-1校准品,使用本发明试剂盒测定各测试品浓度,以稀释浓度为自变量,以测定结果为因变量求出线性回归方程,计算测定结果的相对偏差。测定与计算结果如表2所示,由表2可知,测定结果与稀释浓度之间的线性回归相关系数r>0.990,说明线性关系良好,线性范围可达1200ug/L。
表2本发明试剂盒线性范围验证
3.准确度验证:
取具有溯源性高值血清质控和低值血清质控各一份,使用本发明试剂盒检测6次,取均值,与质控靶值进行比对。结果如表3所示,表明检测值较靶值相对偏差较小,准确度较高。
表3本发明试剂盒的准确度验证结果统计表
4.灵敏度及特异度验证:
采用溶血法来检测筛选50份阳性血清、50份阴性血清,选择市售采用ELISA法测定IGF-1试剂盒与本发明试剂盒同步检测此100份血清样本,再按照各试剂盒判定标准,设不在参考标准内样本为阳性,在参考标准内样本为阴性,以溶血法测定样本为金标准计算各试剂盒的灵敏度和特异度,结果见表4。结果表明,较ELISA法测定IGF-1试剂盒而言,本发明试剂盒保证了灵敏度的同时有更高的特异度。本发明的突出优点是灵敏度高,且与ELISA制备的试剂盒相比,本发明试剂盒具有更高的特异度,大大地提高临床检测的准确性,满足临床检测的需求。
表4本发明试剂盒与市售试剂盒的灵敏度、特异度比较
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种快速测定IGF-1的胶乳增强免疫比浊法测定试剂盒,其特征在于,包括试剂R1和试剂R2;所述试剂R1为含10~50g/L促凝剂的缓冲溶液,试剂R2为固定化IGF-1抗体的胶乳微球溶液;其中,试剂R2的具体成分为:5~10mmol/L IGF-1抗体胶乳微球,10~100mmol/LTris-HCl缓冲液,2~5g/L BSA,0.1~1g/L防腐剂。
2.根据权利要求1所述的快速测定IGF-1的胶乳增强免疫比浊法测定试剂盒,其特征在于,所述试剂R1的具体成分为:10~100mmol/L、pH 7.0~8.0的Tris-HCl缓冲液,9-135g/L氯化钠,10-50g/L促凝剂,0.1~1g/L防腐剂。
3.根据权利要求2所述的快速测定IGF-1的胶乳增强免疫比浊法测定试剂盒,其特征在于,所述试剂R1中,促凝剂为PEG6000,防腐剂为Proclin300和叠氮钠中的一种或两种。
4.根据权利要求1所述的快速测定IGF-1的胶乳增强免疫比浊法测定试剂盒,其特征在于,所述试剂R2中,IGF-1抗体胶乳微球的制备方法为:①取120nm的羧基微球1mL,并加入3~5mL Buffer A缓冲体系混匀;②加入250-500μL的10mg/mL EDC进行活化反应,水浴震荡10~30min;③采用BufferB缓冲体系对3~5mg抗体稀释,待抗体稀释4~6倍后滴加至步骤②获得的胶乳液中,并震荡偶联反应2~3h;④加入封闭液封闭20~60min;⑤离心分离获取胶乳微球,并采用超声的方法将偶联抗体的胶乳微球分散均匀。
5.根据权利要求4所述的快速测定IGF-1的胶乳增强免疫比浊法测定试剂盒,其特征在于,所述BufferA缓冲体系包括10~100mmol/L MES和0.04%-0.4%Tween 20,pH 5.0~6.0;
Buffer B缓冲体系包括10~100mmol/L MES和0.04%-0.4%Tween 20,pH 6.0~7.5;
封闭液包括0.1~0.5%稳定成分、0.01~0.05%防腐成分以及一定浓度的硼酸硼砂缓冲液。
6.根据权利要求5所述的快速测定IGF-1的胶乳增强免疫比浊法测定试剂盒,其特征在于,所述封闭液中,稳定成分为按照质量比1:2混合的BSA、Casein混合液;防腐成分为Proclin300或叠氮钠;一定浓度的硼酸硼砂缓冲液为含50mmol/L硼酸与10mmol/L的硼砂缓冲液,pH 8.0~9.0。
7.根据权利要求1所述的快速测定IGF-1的胶乳增强免疫比浊法测定试剂盒,其特征在于,所述试剂R2中,防腐剂为Proclin300和叠氮钠中的一种或两种,Tris-HCl缓冲液的pH为7.0~8.0。
8.一种如权利要求1~7任一所述的快速测定IGF-1的胶乳增强免疫比浊法测定试剂盒的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)配制试剂R1
按照试剂R1的组分含量,将各组分于同一容器中混合;混合均匀后,经0.45μm滤膜过滤、37℃老化7天,制得试剂R1;
(2)制备IGF-1抗体胶乳微球
①取120nm的羧基微球1mL,并加入3~5mL BufferA缓冲体系混匀;②加入250-500μL的10mg/mL EDC进行活化反应,恒温37℃水浴震荡10~30min;③将3~5mg IGF-1抗体用Buffer B缓冲体系稀释稀释4~6倍后,滴加至步骤②获得的胶乳液中,并37℃恒温震荡偶联反应2~3h;④加入封闭液,于37℃恒温封闭20~60min;⑤离心分离获取胶乳微球,并采用超声的方法将偶联抗体的胶乳微球分散均匀,得目标所需的IGF-1抗体胶乳微球;
(3)配制试剂R2
按照试剂R2的组分含量,将Tris-HCl缓冲液、BSA、防腐剂以及步骤(2)制得的IGF-1抗体胶乳微球于同一容器中混合;混合均匀后,37℃老化7天,即得试剂R2。
9.一种如权利要求1~7任一所述的快速测定IGF-1的胶乳增强免疫比浊法测定试剂盒的使用方法,其特征在于,包括如下具体步骤:
(1)吸取10μL样本,加入250μL试剂R1,37℃孵育5min;
(2)再加入125μL试剂R2进行混合,并使其充分反应;
(3)lmin后读取吸光值Al,3min后读取吸光值A2,计算ΔA;
(4)根据吸光度变化值ΔA计算出样本中IGF-1含量。
10.根据权利要求9所述的快速测定IGF-1的胶乳增强免疫比浊法测定试剂盒的使用方法,其特征在于,所述步骤(3)中,采用全自动生化分析仪,于主波长450nm处测定吸光值;所述步骤(4)中,依据定标值,根据ΔA测算样本中IGF-1含量;所述定标方法为:5点定标,采用全自动生化分析仪进行检测,设置校准品浓度分别为:1200ug/L、600ug/L、300ug/L、150ug/L、0ug/L。
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