CN101680890B - 用于评估人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白c的比浊免疫测定 - Google Patents
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Abstract
存在对在生物样品、特别是人的体液临床样品中的人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的改进的比浊免疫测定法的需要。本发明提供能够通过比浊法测量人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的比浊免疫测定方法和试剂组,其导致令人惊讶地比当前现有技术更强和更快的比浊信号。所述提高的和更快的信号是通过使用新的试剂和组合物而获得,并且能够获得更短的测定时间和具有更强的信号的动力学读数,提高了整体测定速率和质量。本发明实现了针对脂质干扰的提高的稳定性和提高的线性。
Description
本发明涉及通过利用特异性的纳米颗粒(nanoparticle)-抗体偶联物评估在人体液样品中的人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的改进的比浊免疫测定;通过利用所述测定评估患者的肾小球滤过率的方法;相应的反应试剂盒;和改进的纳米颗粒-抗体偶联物对上述提及的医学目的的应用。
发明背景:
A.Grubb和H.Lovberg[Grubb AO,等:Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)1982;79]于1981年发现并且表征了抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C。抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C是在后来命名为抑半胱氨酸蛋白酶蛋白蛋白超家族中发现的第一个蛋白。抑半胱氨酸蛋白酶蛋白蛋白超家族是一组抑制半胱氨酸蛋白酶的蛋白。目前抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的其它生物学功能正在研究中。与抑半胱氨酸蛋白酶蛋白超家族的其它成员相反,抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C存在于所有的体液中,而不同的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的总组成随体液与体液而不同,并且在不同的区室中[Abrahamson M,等:J.Biol.Chem.(生物的化学杂志)1986;261:11282]。在1990年,Abrahamsson等证明抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C以稳定的速率并且由人体中全部(或接近全部)有核细胞产生,其叫作“持家”蛋白[Abrahamson M,等:Biochem.J.(生物化学杂志)1990;268:287-94]。
抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C----具有13kD的分子量----自由滤过肾脏的正常的肾小球膜,但是然后在“近端小管”中重吸收并且分解代谢,所述“近端小管”是重吸收通过肾小球膜的大部分肽和小蛋白的肾脏的区室。以这种方式,肾脏为机体保存这些蛋白质物质,并且阻止损失到尿中(JacobssonB,等:Histopathology(组织病理学)1995;26:559-64.)[Heyms SB,等:Am.J.Clin.Nutr.(美国临床营养学杂志)1983;37:478]。
肌酸酐,迄今为止关于肾小球滤过率(GFR)的主要应用的标记,是在肌肉细胞中产生的小分子量分子。因此,肌酸酐的形成和分泌的速率与机体的肌肉质量紧密联系。公知地,群体中个体的肌肉质量变化相当大。与机体质量相比,老年人通常具有低的肌肉质量,而且随着他们的疾病发展许多患者失去肌肉质量。与成年人相比,儿童通常具有不同的相对肌肉质量,并且男人比女人具有平均更高的相对肌肉质量。因此,当将血清肌酸酐浓度用作肾小球滤过率标记时,可以发现血清肌酸酐值在参照范围内,即使在已经发生50%的肾小球滤过率减少时[Shemesh O,等:Kidn.Int.(肾脏内科)1985;28:830-8]。此外日常饮食显著地影响肌酸酐的血清水平,特别是富含蛋白质的饮食[Perrone RD,等:Clin.Chem.(临床化学)1992;38:1933-53]。
血清和血浆肌酸酐测量不是测量肾小球滤过率的可靠的“黄金标准方法”。因此,使用静脉内注射放射性标记物质如Cr-51-EDTA或Tc-99m-DTPA,或者注射碘化剂如碘海醇,已经获得一些流行。这些方法是昂贵的、耗时的,并且注射是必需的----并且通常重复地采样血液。在Grubb等在Clinical Chemistry(临床化学)51:8,1420-1431中的“SimpleCystatin C-Based Prediction Equations for Glomerular Filtration RateCompared with the Modification of Diet in Renal Disease Prediction Equationfor Adults and the Scwartz and the Counahan-Barratt Prediction Equations forChildren(单纯基于抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的肾小球滤过率预测方程与用于成年人的肾病预测方程和用于儿童的Scwartz和Counahan-Barratt预测方程中的饮食改进的比较)”的出版物中,证明血液中的单纯抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C测量可以替代测量肾小球滤过率的复杂方法。
抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C测量最初使用经典的生物化学方法,但是不久转向应用比浊和浊度免疫测定。埃德-白令公司(Dade-Behring Company)开创了比浊法测量方法。还参见Coll,E等.Am.J.Kidney Disease(美国肾病杂志)2000;36,2934。比浊法是非常可靠的。比浊法的缺点在于,与基于光透射的自动分光光度计相比,仪器本身具有相当低的处理速度。由埃德-白令公司(Dade-Behring Company)生产的比浊计,典型地BNII比浊计和ProSpec比浊计,以及Beckman仪器,已经获得了大量的市场畅销度,但是广泛性比基于透射测量的仪器低得多。比浊计还具有比基于透射测量的大型自动化仪器低得多的样品通量。
H.Stone等在文献“Analytical performance of a particle-enhancednephelometric immunoassay for serum Cystatin C using rate analysis(使用速率分析的血清抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的颗粒-增强的比浊计免疫测定的分析性能)”,Clinical Chemistry(临床化学)卷8,第1482-85页,2001,描述了速率比浊方法。然而,比浊计仪器具有对于大量样品的有限的容量,并且比浊计仪器的数目是有限的。因此,存在转向吸光度分光光度计-均相的仪器的需要,原因在于这样的仪器更丰富,并且具有更高的容量。
丹麦Dako Cytomation已经开创了比浊抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C免疫测定的领域。现有技术在下列文献中描述:“Cystatin C-The marker ofchoice for renal function testing(抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C-肾功能检测选择的标记)”,C.Schmidt,European Clinical Laboratory(欧洲临床实验室),2004年2月10日;“New improved automated particle enhanced turbidimetricimmunoassay for quantitative determination of human Cystatin C in serum andplasma(定量确定血清和血浆中人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的新改进的自动化颗粒增强的比浊免疫测定)”,C.Schmidt,C.和K2005年7月从Dako Cytomation AS网址下载的介绍(通过引用结合)。
然而,比浊测量受到样品中浊度的干扰,如在文献“Turbidity inimmunoturbidimetric assays(免疫浊度法测定中的浊度)”,Dahr等,Ann.Clin.Biochem.(临床生物化学年刊)卷27,第509页,1990。在第29届临床化学北欧会议上,Malmo,瑞典,2004年4月24-27日,A.Grubb阐述了在血清和血浆样品中三酰甘油对抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C测量的结果的干扰的结果。因此,仍然存在对于改进人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的比浊免疫测定的需要。
均相免疫测定系统的备选方案是基于分离的非均相免疫测定系统。非均相免疫测定系统的优点特征在于在进行所述测定过程中进行洗涤的分离步骤。这些系统的优点在于,通过洗涤的方式,它们去除任何干扰物质。此外,它允许洗去未结合的抗体和未结合的酶或荧光或有色的或其它发出信号的部分。由于待测量的物质----下文叫作分析物----不一定与标记的类似物竞争与所述抗体的结合,所以,这些方法通常是非竞争性的。这一方面,以及洗涤步骤的应用,使得可以使用过量的固定的抗体和标记的抗体,表现出高灵敏度和通常高水平的精确性,特别是如果使用高质量的抗体时。
存在许多关于固相和其它非均相免疫测定系统的教科书。大的自动化系统可以商购。美国Abbott诊断分公司(Abbott Diagnostic Division US)出售用于ImX,AxSYM及其它自动非均相免疫测定仪器的试剂;德国的罗氏诊断(Roche Diagnostics)出售用于Elecsys和其它非均相免疫测定系统的试剂;并且存在许多非均相免疫测定系统和试剂的其它供应商。仍然非常受欢迎的非均相免疫测定系统是所谓的微量滴定免疫测定系统。这些系统是缓慢的,但是可靠而廉价的。通用的免疫测定文献给出许多关于这些系统的信息,其是本领域的技术人员公知的。
非均相免疫测定系统的缺点是缺少对于每个时间单位,即每小时运行时间的大量测定的容量。所述方法包括分离和洗涤步骤,尽管是自动化的,但是其占有仪器的运行时间。此外,由于包括固相,通常使用专门的装置或固相,其具有某些生产成本,即使在大量生产时。近年来,由于不断增长的运行的检测的数量,高通量和结果产生速率已经变得越来越重要。存在需要将来自非均相,通常是基于固相的免疫测定技术的测定转移到均相免疫测定系统。
均相免疫测定系统在构造上是简单的,并且具有更高的通量容量。将试剂混合,温育,并且在温育过程中或温育之后进行测量。使用终点信号或在不同时间点之间的信号差异或连续的动力学测量。信号可以是荧光、颜色或不透明性(浊度)测量。特别地,用于测量颜色和/或不透明性/浊度的大型自动化仪器已经非常成功了。日本的日立公司(Hitachi Company)与罗氏一起工作开创了这种大规模的自动化,而且许多其它的供应商包括奥林巴斯(Olympus)和拜尔(Bayer)供应这样的仪器和试剂。这些仪器是自动化的多孔分光光度计,其在不同波长和在不同的时间点测量光通过样品与试剂的混合物的透射。既然比浊抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C免疫测定在这样的均相高容量仪器上运行,这是为什么需要高质量的比浊抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C测定的另一个原因。
大部分均相免疫测定系统是基于将样品与试剂溶液混合,所述试剂溶液包括充分控制浓度的标记的分析物或分析物类似物,和对所述分析物具有特异性亲和力的抗体。样品中的分析物分子与标记的分析物或分析物类似物竞争,并且产生信号。大量的免疫测定文献教导使用不同的标记和类似物。这里应该注意到----迄今为止----用于产生有色信号的高分子量的分析物(分子量大于4000)的均相免疫测定方法已经存在有限的成功。(使用荧光技术,如邻近测定(proximity assays),已有成功,但是还缺乏许多可用的高通量的自动化荧光计,并且因此这些技术不作为本发明的目的)。来自Syva的EMIT技术和来自Microgenics的CDEIA技术(这两个公司都位于加利福尼亚)已经成功地在低分子量分析物的均相免疫测定中使用了有色信号。对于高分子量的分析物,颗粒增强的比浊测量已经成为用于自动化多孔分光光度计的最成功的技术,所述自动化多孔分光光度计测量光通过样品与试剂的混合物的透射。因此,比浊法优选用于更高分子量的分析物。比浊法的一般描述在许多免疫测定教科书中找到。
为什么抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的高精确度测量是必需的?从生物学观点看来,关于抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C和肌酸酐的生物学的参考文献,以及上文引用的变化分析(meta-analysis),指出使用抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C而不是肌酸酐来监测和诊断降低的肾小球滤过率的方向。然而,尽管生物学论点支持使用抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C,但是只有当所述抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C分析的准确性和精确性是良好时生物学优势才是重要的。肌酸酐测量的准确性和精确性是极好的,并且如果所述抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C免疫测定方法的准确性或精确性太低,那么容易失去分析抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C而不是分析肌酸酐的医学优点。
Newman & al,Kidney Int(肾内科).卷47(1995),第312-318页,教导一种使用与兔抗人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C免疫球蛋白级分共价偶联的77nm(包被前)颗粒的最佳测定。他们没有教导使用亲和纯化的抗体,且他们只字未提他们使用的免疫球蛋白级分中结合抗体的浓度。他们教导5-30%抗体重量/颗粒重量,最佳为5%,然而只字未提免疫球蛋白级分中对关于抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C具有亲和性的抗体级分。典型地,良好的常规抗血清包括在免疫球蛋白级分中的总抗体5-15%的活性抗体,这应该意味着0.25-0.75wt.-%的活性抗体/颗粒重量。这非常低,这可能是Newman等为什么必须一路降至340nm来获得良好的信号的原因。这也可能是他们观察到背景信号非常高的原因。Newman等在表1中指出:稀释颗粒(未说明多少)以在0,74cm光路长度提供0.7的起始吸光度,这仍然非常高(超过最经常使用的在1cm光路长度下的0.9),并且因此在测定中将导致非常高的背景。这可能是Newman等的方法未被商业化或用于临床应用的主要原因,且它教导在抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C颗粒增强的比浊免疫测定中不要使用低波长。因此市场上关于抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的比浊免疫测定的所有商业化产品都使用高于500nm的波长。
本发明要解决的一个问题是提供一种免疫-比浊抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C免疫测定,如果与相应的可商购的比浊相比,其具有提高的准确性和/或精确性和/或更少的来自检测样品中的脂质和血红蛋白的干扰。
抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的浊度测量的现有技术的另一个缺点是浊度变化的低速率,其导致长久的测定时间和/或高的不精确性。因此,本发明要解决的另一个问题是提供更快的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C比浊测量。
附图简述:
图1显示利用来自Roche Diagnostics(罗氏诊断)的日立917仪测量,在将免疫颗粒加入到反应混合物中后,浊度/吸光度对于不同波长值,在不同时间点的变化。在450nm处观察到急剧起始吸光度增加。
图2显示利用来自Roche Diagnostics(罗氏诊断)的日立917仪,对于反应开始后5分钟时测量的不同波长观察到的浊度/吸光度变化。
图3a显示关于在最后混合步骤(即反应开始)后0,1,2,3,4和5分钟时获得的测定样品在340至600nm的波长范围内的吸光度光谱。上图显示340nm处的指示线且下图是430nm处的指示线。
图3b显示在430nm处测量混合后一段320nm观察到的吸光度变化的实例。
图4显示在日立917仪中,在混合所有样品后15-70秒的一段时间内测量的不同波长值下的吸光度变化(以毫吸光度单位(mABS)表示)/分钟。
发明概述:
令人吃惊地,上述与现有技术用于测量抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的比浊免疫测定相关的问题,可以通过如在权利要求中定义的并且在说明书的随后部分中更详细阐释的比浊法而解决。本发明的所述方法特别地利用与特定测量条件组合的改进的纳米颗粒-免疫偶联物,其允许在不同的实验条件下,如特别地,在不同的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C浓度、不同的测量波长、不同的反应时间和不同的温度下,更快速和/或更灵敏和/或更可靠地测量抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C。本发明的其它优点从后附的实验中显而易见。
通过细心地调整免疫颗粒,测量条件和任选地检测试剂,可以观察到令人吃惊地更强和更快的比浊信号,并且由此可以减小干扰,并且可以提高线性,而不失去准确性。此外可以减少测定时间。
下面将描述本发明的最佳模式,但是用于制备反应混合物和用于进行所述测量的其它试剂和步骤顺序以及时间也可以用于获得这种令人吃惊的结果。
存在一些纳米颗粒的供应商,例如美国Bangs实验公司(BangsLaboratories Inc)和法国默克S.A.(Merck S.A.,France)。将抗体偶联到纳米颗粒上的偶联服务的许多供应商可以在互联网上找到。丹麦DakoCytomation AS提供偶联到抗-抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗体的纳米颗粒,并且它们由本发明人检测,而不管是否实现本发明的目的。然而,所述现有技术产品证明是不成功的。
本发明人观察到,i.a.,颗粒大小必须仔细平衡。大颗粒产生良好的信号,然而,背景高,并且结合能力低,以致必须加入大量的颗粒,产生甚至更高的背景浊度。先前的测定供应商,如Dako Cytomation AS,产品号LX002/EFG/CS/25.10.04,S2361/EFG/KGR/09.07.03和X0974/EFG/SUM/09.09.04,没有获得良好的比浊信号。
另外,意外地观察到在检测波长低于500nm且高于340nm,即不在现有技术建议的波长范围内时,可以观察到吸光度的出人意料的高净变。
通用术语的定义
当用于按照本发明的测定方法中时,“体液样品”是来源于哺乳动物、特别是人的样品,并且其含有抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C,特别是人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C。可以使用任何含有抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的液体样品。要按照本发明测定的所述样品可以是任何含有抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的生物液体或组织提取物,并且可以在测定之前预先处理。适当的样品的实例是血液,血液级分,如血清和血浆,以及预处理的血液,如EDTA-血液,或EDTA-血浆,柠檬酸盐-血浆,肝素血浆,或尿样。最初获得的样品或其级分可以通过本领域已知的方法进一步改良,例如,通过分级或稀释。可以进行分级,以去除可能干扰测定的组分。为了调整组分如分析物的浓度,可以通过将初始样品或级分与适当的样品液体,如适当的缓冲液混合而进行稀释。这样改良的样品作为“来源于”从哺乳动物的机体收集或分离的初始体液样品的实例。
按照本发明要测定的“分析物”是抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C,特别是人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C,其由健康的或患病个体的机体形成。尽管不是必需的,抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的衍生物或天然抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C和抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C衍生物的混合物也可能用作分析物。抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C衍生物的非限制性实例是携带适当的可检测标记,例如放射性、金属或发色团标记的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C化合物。
在获得分析物(本文是指样品中存在的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C)的量或浓度的绝对值的意义上,以及获得指示分析物在样品中的水平的指数、比率、百分数、视觉或其它值的意义上,“评估(Assessing)”或“评估(assessment)”意欲包括定量和定性确定。评估可以是直接的或间接的,并且实际上检测到的化学种类当然不需要是分析物本身,而是例如可以是其衍生物。
与非均相免疫测定相反,“均相免疫测定”在构造上更简单,并且具有更高的通量容量。特别地,均相测定不包括以分离步骤形式的样品的预处理步骤,例如,通过将样品应用到固体基质如层析柱,塑料滤器,管、孔中和珠上的塑料表面上,在测定过程中清洗该基质并且将分析物从初始复合物样品的初始组分的多个部分中分离出来,所述程序导致非均相免疫测定中的长测定时间和多分析仪装置的低容量。对于均相测定,将样品和试剂混合,温育,并且在温育过程中或温育之后,进行测量。使用终点信号,或在不同时间点之间的信号差异,或连续的动力学测定。
“颗粒增强的”比浊测量或免疫测定是基于与按照本发明所用的纳米颗粒或纳米颗粒-免疫偶联物相关的“光散射性质”。这样的纳米颗粒通常大约是球形的,优选地具有狭窄的大小分布。所述颗粒的大小通常通过它们的平均直径表示。按照光散射的公知定律,所述光散射性质可以受到颗粒大小、和/或所述颗粒的折射率与介质的折射率的比率的影响。弱的光散射性质可以由小的颗粒大小、和/或所述颗粒的折射率与介质的折射率的低比率导致(还参见光散射的Rayleigh’s定律)。
纳米颗粒的大小和/或折射率的比率是这样的,以致它们可以在检测凝聚的纳米颗粒-免疫偶联物所用的波长处引起光散射。通常选择所述大小以小于所述检测波长。
当按照本发明用于测量样品的浊度变化时,“检测波长”通常从约340nm以上到约500nm以下,优选地从350,360或370nm到约480,490或499nm,且特别是从约390到470nm,或从400到460nm,或从410到450nm,如例如约415,420,425,430,435,440,或445nm。
本发明的分析方法的“准确性”是与通过甚至更可靠的参考方法确定的浓度相比,本发明的分析方法准确确定样品中抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的浓度的能力。
本发明的分析方法的“精确性”,是当重复确定样品中的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的浓度时,结果的变化。
按照本发明的测定的“稳定性(robustness)”是所述方法耐受干扰物质和测定条件变化而不影响抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C浓度测定的结果值的能力。
当用于本发明的上下文中时,“惰性蛋白”是不干扰本发明的测定方法的任何来源(例如,人或非人哺乳动物、微生物)的蛋白;特别地,它应该对于待分析的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C和/或对于在本发明的测定方法中所用的抗体基本上没有或没有可检测的亲和力。
抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C“结合”抗体是识别人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的抗原决定簇并与之特异性或非特异性结合的抗体。除非另外指明,本申请中指明的抗-人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗体的比例与所述“结合”抗体有关。
发明详述:
a)本发明的方面
本发明的第一方面涉及用于评估人体液样品或来源于其的样品中的人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的颗粒增强的比浊免疫测定法,其包括以下步骤:
(1)通过将所述样品或其稀释物与包含适合于比浊测量的纳米颗粒的纳米颗粒-抗体偶联物(或纳米颗粒-免疫偶联物)接触而形成测定混合物,其中所述纳米颗粒用抗-人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗体或其抗原结合片段包被,以结合所述抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C,其中所述包被的纳米颗粒具有至少40nm范围内的中数直径,如例如至少45,50,55或58nm,优选地大于58nm,并且
(2)通过确定适当光参数,如其吸光度的变化,在340nm以上且500nm以下的范围内的一、二或三,优选一个检测波长处,通过测量所述混合物的浊度的变化而评估所述人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的含量。
“吸光度变化”可以表述为两个(初始和最终)测量值(例如,作为ABS值)之间的绝对差或表达吸光度变化/时间(例如,作为ABS/时间值)的动力学参数。
优选地,(a)通过混合时的直接记录,或更优选(b)通过混合后不久记录,与对初始增加吸光度的向后外推组合,或特别地,(c)通过在混合样品和试剂后小于1分钟内的两个或多个时间点之间的吸光度差别,通过测量吸光度的初始增加速率来确定样品的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C浓度。
在本发明的优选实施方案中,吸光度的初始变化速率,且具体地,以至少一个,如例如一、二、三或四个,但优选一个,约5-300秒的时间间隔确定,所述时间间隔从形成所述测定混合物后立即或不久后开始。
“不久后”意指将所述测试成分混合在一起后几秒,如例如1-40或2-30秒,具体地5,10,15,20或25秒。对于测量优选的时间间隔具有10-280,50-250,70-220,80-210,100-200,110-190,或125-185秒,如130,140,150,160或170秒的持续时间,并采用形成所述测定混合物后1-40或2-30秒,具体地,5,10,15,20或25秒。合适的时间间隔的实例是将所有测试成分混合在一起后10-290,15-200,200-180或25-150秒。
优选地,所述抗体包括针对人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的多克隆非人、非啮齿动物抗体;特别地,所述多克隆抗体包括针对人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的禽类抗体。所述禽类抗体可以获自禽类血清,优选地,然而,它们来源于蛋黄,即它们是蛋黄级分。
在另一个优选的实施方案中,通过使用人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的亲和纯化,获得了至少25wt.-%的所述多克隆抗体或其片段。通过亲和纯化,与人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C结合的那些抗体的比例增加。另外,可以通过亲和纯化进一步富集以比从所述混合物中去除的那些抗体更高的亲和力(或抗体亲抗原性(avidity))与人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C结合的抗体。
例如,按照本发明使用的适当的抗体可以对人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C具有亲和力或抗体亲抗原性,其与通过禽类抗体的亲和纯化获得的禽类(例如,多克隆)抗体的亲和力或抗体亲抗原性相当(或基本上相同),所述禽类抗体的亲和纯化通过将禽类抗-人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗血清与固定在固相上的人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C结合,并且优选地,例如,在用磷酸缓冲盐水洗涤后,用柠檬酸盐缓冲液洗脱结合的抗体,所述柠檬酸盐缓冲液的摩尔浓度在0.05M到0.2M,或0.08M到0.12M范围,特别是约0.1M;并且pH在约3到3.5,或3.1到3.3范围,特别是约3.2(例如在后续实验部分中更详细地解释)。
在另一个实施方案中,所述抗体包括:(a)与人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的单一表位结合的单克隆抗体,或(b)一组两个或多个种类的单克隆抗体,其中每种单克隆抗体结合人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的不同的表位,或者两种或多种以不同的结合强度(亲和力或抗体亲抗原性)结合相同的表位。
所述单克隆抗体是人或非人(例如,来源于啮齿动物、绵羊、山羊、鸟或兔)来源的。
当按照本发明使用时,所述包被的纳米颗粒优选地具有大于58nm的平均直径,特别是在59-160,60-140,70-120,75-110,80-105,或90-95nm范围内的平均直径。优选地,它们用一层抗体包被。特别地,所述层可以认为是具有约5nm的近似厚度的单层。所述层可以是“完全的”(用抗体饱和的颗粒),或者,更优选地是“不完全的”(即,使用比所述颗粒提供的结合容量(binding capacity)少的抗体)。
在另一个优选的实施方案中,所述包被的纳米颗粒用约5-35%,特别地10-30%或15-25%的结合抗体/单位总重量的纳米颗粒-抗体偶联物(纳米颗粒-抗体偶联物的总重量)不完全包被。
在另一个优选的实施方案中,所述纳米颗粒用抗体和惰性、优选亲水的蛋白的混合物包被。例如,结合到所述纳米颗粒表面上的总蛋白的20-90%,并且更优选地35-80%,并且甚至更优选地40-70%由抗-抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗体组成。这样的颗粒优选地以按照所述未包被的颗粒的结合容量低于理论上可附着到所述颗粒上的抗体的量的量携带抗体。同时,所述颗粒表面上不被抗体分子覆盖的区域用惰性的、优选亲水性的蛋白饱和。
在一个优选的实施方案中,所述初始的、未包被的纳米颗粒基本上由胶乳、聚苯乙烯、聚氯乙烯、环氧树脂、聚偏1,1-二氯乙烯、聚-α-萘基甲基丙烯酸酯、聚乙烯萘、以及它们相应的共聚物制成。其它适当的颗粒材料在本领域中是可用的,并且由本发明的教导所指导,技术熟练的读者应该能够做出适当的选择。
按照本申请方法的另一个实施方案,通过在所述测定混合物在350-499nm范围的波长,优选地并且在10-50℃范围内的温度,并且优选地确定开始反应“不久后”在如上定义的预定“时间间隔”内吸光度的初始变化,测量浊度变化。
本发明还提供用于测量在体液样品或来源于体液的样品中的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的比浊免疫测定方法,其特征在于,通过将含有所述抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的液体样品,或来源于含有抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的液体的样品,或含有抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的稀释物的样品,与纳米颗粒-结合的多克隆或单克隆抗-抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗体或抗体片段接触而形成测定混合物,以结合所述抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C,并且通过测量所述混合物浊度的变化而评估抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的含量,并且所述浊度进一步表征为所述混合物在给定波长下的吸光度变化,条件是在用特定最小大小的包被的纳米颗粒形成所述混合物后,将所述混合物在给定的温度保持给定的时间段,如上文所示和在实验部分进更详细解释。
基于本文中的特定教导,包括附图和表中公开地,技术人员应该能够计算在不同时间、温度和/或波长下按照本发明可观察到的吸光度变化的其他数值。
通过举例的方式,可以获得下述值:
26℃,时间间隔38-208秒,中数直径92nm;波长405nm:
0,44mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/升 变化率:7,2mABS单位/分钟
0,83mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/升 变化率:14,1mABS单位/分钟
1,38mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/升 变化率:25,4mABS单位/分钟
2,77mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/升 变化率:56,5mABS单位/分钟
4,46mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/升 变化率:107,3mABS单位/分钟
8,05mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/升 变化率:199,1mABS单位/分钟
26℃,时间间隔38-208秒,中数直径92nm;波长380nm:
0,44mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/升 变化率:9,7mABS单位/分钟
0,83mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/升 变化率:15,9mABS单位/分钟
1,38mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/升 变化率:29,14mABS单位/分钟
2,77mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/升 变化率:62,5mABS单位/分钟
4,46mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/升 变化率:108,7mABS单位/分钟
8,05mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/升 变化率:192mABS单位/分钟
按照本发明的另一种优选的方法其特征在于----当构建针对浊度测定法的相关性曲线时----对于通过浊度测定法获得的0mg/l抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的相对应的值,对于所述比浊法获得小于0.15mg/l,优选地小于0.1,并且甚至更优选地小于0.05mg/l的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的截取值。
按照本发明的另一种优选方法其特征在于----当构建针对非均相免疫测定方法的相关性曲线时----对于0mg/l抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的相对应的值,获得小于0.25mg/l,优选地小于0.15,并且甚至更优选地小于0.5mg/l的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的截取值。
按照本发明的另一种优选的方法其特征在于,对于在1.2mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/l水平的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的测量值,具有来自所述检测的样品中的15mmol/l三酰甘油的小于6%,优选地小于4%,或者更优选地小于2%的干涉。
按照本发明的另一种优选的方法其特征在于,在1.32-7.5mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/l的测量范围内,具有低于5%,优选地低于4%,或更优选地低于3%的线性偏差,和/或在0.75-1.32mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/l的测量范围的测量区域内,具有低于15%,优选地低于11%,并且甚至更优选地低于7%的线性偏差。
本发明的另一个方面提供用于评估哺乳动物的肾小球滤过率的方法,所述方法包括按照上文定义的方法进行人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的比浊评估。所述方法可以特别地应用在肾功能障碍(如肾功能不全或肾衰竭)或与其相关的疾病或病况的诊断或治疗过程中。
本发明的另一个方面涉及用于实施上文定义的方法的试剂盒或者多个部分的试剂盒或试剂组,其包括:(a)颗粒,其包含干燥或混悬形式的如上文定义的抗-抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C免疫颗粒,(b)干燥或溶解形式的测定缓冲液,和任选地,(c)校准混合物和对照混合物,其每种以干燥或溶解的或混悬的形式存在。
优选地,所述颗粒和测定缓冲液以干燥或以混悬形式组合提供。
按照本发明的另一个方面,在下文提供按照上文定义的纳米颗粒-抗体偶联物以及更详细的描述。
本发明涉及这样的纳米颗粒-抗体偶联物在评估人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的免疫测定中或者在评估哺乳动物的肾小球滤过率的诊断方法中的应用。
最后,本发明涉及这样的纳米颗粒-抗体偶联物在评估人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的免疫测定中或者在评估肾功能障碍如肾功能不全或衰竭的诊断方法中的应用。
b)抗-人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗体的制备
b1)多克隆抗体
多克隆抗人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗体可以通过本领域公知的方法制备,诸如例如由Chase,M.W.,1967,.在″Methods of Immunology andImmunochemistry(免疫学和免疫化学方法)″中,Williams,A.等编,M.W.,第197-209页,学院出版社(Academic Press),纽约,中所述的那些。简言之,将适当物种的动物(例如,兔、山羊、或绵羊、或者,优选地禽类物种,特别是家禽,如母鸡)用在适当的佐剂如弗氏完全或不完全佐剂中的纯化的抗原重复免疫。在免疫后,将动物放血,并且通过诸如例如硫酸铵或氯化铵沉淀、阴离子交换层析、免疫亲和层析和/或亲和层析的方法纯化多克隆抗体。
为了获得充分的比浊信号,优选高抗体亲抗原性的抗体。由于多克隆抗体包括许多不同的抗体分子,所以不能计算亲和力常数,然而,通过常规的多克隆抗体技术获得高的抗体亲抗原性和亲和力。使用通过常规方法获得的兔抗体,然而,使用绵羊抗体获得甚至更好的结果。当使用禽类抗体时,获得甚至更好的结果。禽类抗体可以按照在Larsson A,Baaloew R-M,Lindahl T,和Forsberg P-O在Poultry Science(家禽科学)72:1807-1812,1993中所述的方法。考虑在遗传上与人更不同的禽类能够产生具有比多克隆哺乳动物抗体更高的抗体亲抗原性的针对人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的抗体。
多克隆禽类抗体通常从蛋黄中获得(并且因此指定为IgYs)。然而,蛋黄含有大量的脂质,使得它们的进一步应用成问题。IgY可以通过使用分步硫酸铵(例如25-40%)和聚乙二醇(PEG)沉淀而从蛋黄中分离。对于初始纯化,还可以参考供应商的用法说明而应用也是商业的可从GallusImmunotch Inc,卡雷,美国获得的IgY纯化试剂盒,或从Pierce,罗克福德,美国获得的鸡EggcellentIgY纯化试剂盒。
此外,多克隆抗体的抗体亲抗原性可以通过使用利用抗原亲和纯化方法,如按照从www.piercenet.com(2006年4月)下载并且通过引用结合的“Affinity Purification of Proteins(蛋白质的亲和纯化)”中的教导而纯化的抗体而进一步提高。在下文进一步描述亲和纯化。
当所用的抗体中有20%是抗原亲和纯化的时,特别观察到提高的抗体亲抗原性,当所述抗体中有50%是抗原亲和纯化的时,观察到甚至有更高的提高,并且当所述抗体中有大于75%,如75-100%是通过抗原亲和纯化方法获得的时,甚至提高更多。
对于禽类多克隆抗-人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗体的亲和纯化,已经制备了适当的人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C亲和柱。通过标准方法将纯化的人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C固定在适当的固体支持物上,例如琼脂糖或亲和凝胶,其是活化的以将所述抗原共价连接到支持物上(例如,适当的活化的固体支持物可从Pierce,罗克福德,美国获得)。然后,由所述携带抗原的树脂而制备亲和柱。
抗体的成功的亲和纯化取决于所述抗原上的相关表位向所述抗体的结合位点的有效呈递。如果所述抗原是小的,并且通过多个化学键直接固定在固体支持物表面上,那么重要的表位可能被封闭或者空间位阻,而抑制有效的抗体结合。因此,最好使用独特的官能团(例如,在肽的单个末端半胱氨酸上的巯基)而固定抗原,并且最好使用其反应基团存在于几个原子长的间隔臂上的活化的支持物。对于更大的抗原,特别是具有多个固定位点的那些抗原,由于所述抗原本身作为支持基质和表位之间的有效的间隔,所以所述间隔臂长度不那么重要。
由于每种方法的核心是对于其各自的抗原的抗体的亲和力,所以在抗体的亲和纯化的典型的结合和洗脱条件之间通常存在很少的变化。由于抗体设计成在生理条件下识别并且紧密结合抗原,所以大部分的亲和纯化方法使用模拟生理pH和离子强度的结合条件。最常见的结合缓冲液是在pH7.2的磷酸缓冲盐水(PBS)和Tris缓冲盐水(TBS)以及1.5M NaCl(例如,预先混合的缓冲液包装可从Pierce,罗克福德,美国获得)。一旦所述抗体已经结合到固定的抗原上,其余的结合缓冲液用来洗涤支持物上的未结合的物质。为了将非特异性结合最小化,所述洗涤缓冲液可以包含其它的盐或去污剂,以破坏任何弱的相互作用。
特别地,通过改变缓冲液(例如,常见的洗脱缓冲液可从Pierce,罗克福德,美国获得)的pH和/或离子强度而将纯化的抗体从亲和树脂上洗脱下来。抗体通常是耐受pH 2.5-11.5范围的弹性蛋白,具有最小的抗体亲抗原性损失,并且迄今为止,这是最常见的洗脱策略。在一些情形中,抗体-抗原的相互作用没有被pH变化有效破坏或者被pH损坏,这需要应用备选策略。
下面给出亲和纯化方法的实例:
步骤1:在每次使用之前,用10个柱体积的下述顺序的缓冲液洗涤柱(~1ml树脂床),以去除残留的蛋白质:
0.2M甘氨酸,pH 2.8~10ml
0.1M NaHCO3,pH 8.5,0.5M NaCl~10ml
使用上述缓冲液重复循环两次。然后将所述柱在含有被调整到0.5M的NaCl的TTBS缓冲液(0.3M NaCl,20mM Tris/Cl,pH 7.8,0.1%(v/v)吐温-20和0.01%NaN3)中平衡。
步骤2:向10ml等分试样的粗制抗体制备物中,加入1ml 10X TTBS和0.55ml 4M NaCl。将混合物离心以去除任何沉淀。
步骤3:通过将所述亲和树脂转移到含有血清的管(15ml管)中,而分批吸附所述抗体。在冷室中温育。备选地,可以使用低流速将血清施加到柱上。获得人工收集的级分。收集流过柱的相(phase),并且使用低流速将其第二次重新施加。
步骤4:用TTBS+NaCl至0.5M充分洗涤柱,直到A280小于0.02。收集10ml洗涤的级分,并且检验所述级分的A280。
步骤5:使用含有0.02%NaN3的0.2M甘氨酸,pH 2.8洗脱抗体。使用1ml等分试样的缓冲液进行洗脱。将级分收集到含有50ml 1M Tris,pH8.5的1.5ml微量离心管中。这在蛋白洗脱下来之后立即中和酸性的洗脱缓冲液。收集至少10个级分。这通常足以去除所述抗体。使用适当的空白(即,1ml甘氨酸缓冲液加50ml 1M Tris),读取每个级分的A280。
步骤6:将适当的级分合并。获得合并物的A280,并且将抗体保存在4℃,或者考虑在存在50%甘油时以等分试样冷冻(-70℃)。
步骤7:通过用0.2M甘氨酸,pH 2.8缓冲液,而后用TTBS,充分洗涤而洗涤柱。
b2)单克隆抗体
在颗粒-增强的比浊测定中,多克隆抗体通常比单克隆抗体更优选。多克隆抗体固有地与抗原(或分析物)上的许多不同的表位反应(与单克隆抗体相反),并且因此,更容易在抗原分子自身之间,以及在抗原和固定抗体的颗粒之间产生交叉结合和网络。相反,单克隆抗体通常只结合一种类型的表位,这使得其更难以形成交叉结合和网络。然而,诊断行业通常优选使用单克隆抗体,原因在于它们更容易标准化,并且更容易对预先确定的标准物进行质量控制,特别是在许多年的产品寿命时间内。因此,存在关于将单克隆抗体用于颗粒增强的比浊免疫测定的良好的实例,特别是当存在有利于单克隆抗体的使用的抗原性特征时。Eda等,在“Developmentof a New Microparticle-Enhanced Turbidimetric Assay for C-reactive protenWith Superior features in Analytical Sensitivity and Dynamic range(在分析灵敏性和动力学范围内具有优良特征的C-反应性蛋白的新的微粒-增强的比浊测定的发展)”,J.Clin.Lab.Analysis(临床实验室分析),12:137-144(1998)中描述了使用两种不同的单克隆抗体和两种不同的微粒。由于CRP分子是相同亚基的五聚体----并且因此携带五个所有表位的重复单位(Pepys MB等,Adv.Immunol.(高级免疫学)34:141-212(1983)),这使得使用单克隆抗体容易得多,所以CRP特别有利于使用单克隆。然而,此外,与单体和更小的蛋白如抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C一起,不同的单克隆抗体的混合物可以用于本发明的特别的实施方案中。不同的单克隆抗体的混合物,特别当它们由具有针对抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的高亲和力的许多不同的单克隆抗体组成时,将导致关于抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C免疫测定的本发明的良好的实施方案。
单克隆抗人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗体还可以通过本领域公知的方法制备,例如由G.等,1975,Nature(自然)256,495,G.Galfre等,1981,Meth.Enzymol.(酶学方法)73,3-46,或R.Kennet,1980,在:″Hybridomas:a new dimension in biological analysis(杂交瘤:生物学分析的新纪元)″中,R.Kennet等编,Plenum出版社,纽约和伦敦,中所述的那些。将来自免疫小鼠或大鼠的脾细胞或外周血细胞与骨髓瘤细胞系融合,例如使用聚乙烯融合方法进行。在融合后,将细胞在适当的条件下培养,例如,在培养平板上,并且使用例如次黄嘌呤/氨喋呤/胸苷(HAT)选择方法进行正确融合的细胞的选择。产生抗体的细胞系通过如EIAs,RIAs或凝集测定方法鉴定。在鉴定产生抗体的细胞系后,将所述细胞重复亚克隆,例如通过有限稀释的方法,以保证新生长的细胞系来源于一个单一的细胞。
b3)嵌合抗体
嵌合的抗人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗体可以通过本领域公知的方法获得,诸如由G.L.Boulianne等,1984,Nature(自然)312,643-645所述的方法获得。所述方法可以概括描述如下。将来自于一种物种的单克隆抗体的抗原-结合位点的DNA或其部分转移到不同物种的另一种抗体的抗体构架的DNA。将这种新的构建体克隆到表达载体中,将其转移到相对应的表达系统中以产生所述抗体。
b4)重组抗体
重组抗人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗体可以通过本领域已知的方法不使用动物载体而获得,例如由G.Winter等,1991,Nature(自然),349,293或J.S.Huston等,1988,Proc.Ntl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报),85,5879所述的那些方法。那些方法包括下述步骤:将编码抗体或其片段的DNA(cDNA或合成的DNA)引入到宿主细胞中,例如,大肠杆菌(E.coli),真菌,酵母菌,植物或真核细胞中,选择具有需要的特异性和亲和力的抗体,并且在相应的表达系统中表达所述抗体或其片段。
b5)抗体片段
任何物种的多克隆抗体、单克隆抗体(包括嵌合抗体和/或重组抗体)的Fab-,Fab′-,和F(ab′)2-片段可以通过本领域公知的方法制备,诸如例如由A.Nissonoff等,1960,Arch Biochem Biophys(生物化学和生物物理学档案),89,230,或R.P.Porter,1959,Biochem J(生物化学杂志),73,119,或E.Harlow等,1988,在″Antibodies-A Laboratory Manual(抗体-实验室手册)″,626-631,冷泉港出版社(Cold Spring Harbour Press),纽约,美国所述的那些方法。
b6)选择与人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C具有不同反应性的抗人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗体
当使用单克隆抗体或其片段作为结合配偶体时,可以便利地进行不同的、特别是高和低反应性的抗体的选择,其通过常规包被技术,将每种单克隆抗体分别地包被到相同材料和大小的纳米颗粒上,而后以给定的比例,如1/1 v/v,以排列的方式将纳米颗粒试剂与分析物混合。在相同条件下生成纳米颗粒试剂的校准曲线之后,对于低浓度的分析物所得到的校准曲线的斜率给出所述免疫结合配偶体的反应性的第一指示。
当使用多克隆抗体作为结合配偶体时,可以按照本领域公知的方法进行高和低反应性多克隆抗体的制备,其通过将所述多克隆抗体引入到携带与凝胶基质共价结合的抗原性分析物的亲和层析柱上而进行。使用梯度洗脱缓冲液,低反应性的多克隆抗体级分将最先从柱上洗脱下来,而后是具有递增的更高的反应性的级分(参见,S.Yamamoto等,1993,″VeterinaryImmunology and Immunopathology(兽医免疫学和免疫病理学)″36,257-264,Elsevier科学出版社(Elsevier Science Publishers)B.V.,Amsterdam)。然后,可以使用BIAcore仪器或者通过将它们独立地包被到相同大小和材料的纳米颗粒上并且生成相应的校准曲线,而检验级分的反应性。
抗体的选择可以通过上文提及的将它们包被在纳米颗粒上的方法进行,而后检测极限分析或确定其功能亲和性,如上文所述。如果适当的话,关于它们对人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的亲和力/抗体亲抗原性而不同的不同的抗人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗体的混合物可以用于制备本发明的纳米颗粒-抗体偶联物。适当的混合比例可以由熟练的技术人员通过有限系列的实验而确定。
适当的抗人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗体还可以从不同的来源商购。例如,芬兰的HyTest提供一组识别所述抗原的不同表位的高亲和力抗人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗体。这些抗体以常规方法制备,其通过用从人尿纯化的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C免疫Balb/c小鼠,并且通过与杂交瘤细胞系Sp2/0融合而产生杂交瘤进行。通过选择的克隆产生的抗体通过蛋白质A亲和层析而纯化。目前可从HyTest获得下述mAbs:Cyst10,Cyst13,Cyst16,Cyst18,Cyst19,Cyst23,Cyst24,和Cyst28。其它商购单或多克隆抗人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗体的供应商为:Fusion,北爱尔兰;BioVendor,捷克共和国,AB Location,德国;高级Immunicemical(AdvancedImmunicemical),美国;Abcam,英国;Axxora,英国;生物设计(Biodesign),美国;R&D系统,美国;AbD Serotec,挪威;策略生物解决方案(StrategicBiosolutions),美国。原则上,所述来源的所有抗人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗体可以单独或组合使用,以实施本发明。
c)纳米颗粒以及它们与抗体的偶联物
用于制备本发明的纳米颗粒的物质可以是适合产生并且实施颗粒-增强的光散射测定的任何天然的或合成的、无机的、有机的、非聚合物或聚合物物质。这样的物质包括,例如,硒,碳,金;碳、硅或锗的氮化物,例如Si3N4;铁、钛或硅的氧化物,例如TiO2或SiO2;以及聚合材料,诸如例如,胶乳,聚苯乙烯,聚(氯乙烯),环氧树脂,聚偏1,1-二氯乙烯,聚(α-萘基甲基丙烯酸酯),聚(乙烯基萘(naphtalene)),或它们的共聚物,特别是苯乙烯和可共聚化的烯键式不饱和化合物的共聚物,例如苯乙烯-(甲基)丙烯酸酯共聚物。由聚合材料制成的颗粒,以及由苯乙烯聚合的内核和苯乙烯与可共聚化的烯键式不饱和的化合物共聚形成的外壳而组成的核-壳颗粒,如例如在美国专利号4,210,723中所述,也是适合的。
适合于偶联的聚合物颗粒可以购自Bangs颗粒公司(Bangs ParticlesInc.)或界面动力学公司(Interfacial Dynamics Inc),默克SA,法国或其它适当的来源。所述颗粒可以按照许多方法活化,用于结合抗体,例如,这样的偶联化学的详细的教导可以在TechNote 205,Rev.003中,例如2002年3月,“共价偶联(Covalent Coupling)”(通过引用结合)中找到,其可以从Bangs实验公司(Bangs Laboratories,Inc)的网页上下载。例如,偶联可以通过在它们表面上携带羧基-、氨基-、羟基-、酰肼-或氯甲基基团的颗粒的方式而实现。待偶联的分子可以直接与这样的基团反应,或者通过适当的接头如例如碳二亚胺、戊二醛或溴化氰的方式反应。
按照本发明的颗粒的外壳优选地必须包括对抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C具有高亲和力的抗体,其与特定大小的纳米颗粒核心组合,产生充分的比浊信号。典型地,包括蛋白物质的外壳的纳米颗粒在58和200nm之间,更优选地在65和150nm之间,并且甚至更优选地在80和135nm之间。
在本发明的一个特别的实施方案中,未包被的颗粒的平均直径为约80nm。使用这些颗粒,在包被之后,它们的直径典型地为90-100nm。作为通用的法则,单层抗体约5nm厚,以致认为这样的颗粒携带单层抗体。
当所述偶联的颗粒总干重的5-35%是由抗体组成时,这些颗粒将具有良好的性能,在所述偶联的颗粒的总干重的10-30%由抗体组成时,所述颗粒具有更好的性能,并且当所述偶联的颗粒的总干重的15-25%是由抗体组成时,具有最佳性能。
如果使用稍微更大的颗粒,这些最佳百分比值下降。通过举例的方式,如果使用95nm的裸颗粒,如果包被的话,它们的中数直径典型地终止在110nm。那么,相对应的百分比为4-32%,8-26%,并且对于最佳性能,相对应的百分比为12-22%(由抗体组成的偶联颗粒的总干重百分数)。然而,使用这些稍微更大的颗粒,在所述测定中必须使用更多的颗粒(是更重的颗粒的意思),以具有足够的结合容量来产生校准曲线,而在更高抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的浓度,没有所述曲线的平化(测定校准曲线必须具有达到超过8μg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/μl样品的良好的动力学范围),这导致高得多的吸收背景(更大的颗粒和更多的颗粒),和更低的信噪比。
在另一方面,更小的颗粒将在包被的免疫颗粒中具有更高的抗体百分数最适值。例如,如果使用70nm大小的未包被的颗粒,那么包被的颗粒的中数直径典型地为80nm,并且偶联颗粒的总干重的18-30%抗体的比例将导致最佳百分数,并且次最佳的是12-36%的比例,并且甚至更次最佳的是4-42%的抗体的比例。然而,使用这些稍微更小的颗粒,在所述测定中必须使用更少的颗粒(是更少重量的颗粒的意思),以产生在更低的浓度,即,低于1μg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/μl样品,足够陡峭的校准曲线,并且信号将更低,并且还更容易受背景噪音的影响。
基于上述阐释,在本发明的教导的指导下,技术熟练的读者应该能够提供用于不同的测定条件的最佳免疫颗粒制备物。
将抗人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗体包被到纳米颗粒上可以按照满足所用的材料的特性的本领域公知的方法而吸附性地或共价性地实施。
按照一个优选的实施方案,一种或多种亲水惰性蛋白质与抗-抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗体的混合物应该存在于所述抗体与所述纳米颗粒的偶联/结合过程中。本发明人已经意外地观察到,当将抗体与具有接近偶联pH的pI值的亲水蛋白一起与所述颗粒偶联时,获得使用具有高结合容量的亲水性颗粒的最佳结果。当在偶联过程中存在牛运铁蛋白和白蛋白时,获得最好的结果。然而,在偶联过程中,其它的惰性蛋白也可以与抗体混合。这样的亲水性、惰性蛋白的非限制性实例是虫戚形(limpet)血蓝蛋白、触珠蛋白以及其它水溶性蛋白,它们对于所述抗体和抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C没有任何亲和力。
在偶联过程中,条件为,或者应该为,或者如果必要,应该采用这样的条件,以致所述抗体比所述惰性蛋白与纳米颗粒核心材料更具反应性,以致它们将或多或少地与所述核心定量结合。所述纳米颗粒表面的残余的反应性部分将由所述惰性蛋白封闭。
本发明人观察到,作为通用法则,在第一步骤中,抗体的疏水部分似乎与所述颗粒物理性结合,并且因此整个分子接近颗粒表面上的反应性基团,例如氯甲基基团,然后其与蛋白分子的相对应的基团例如胺反应。由于这种物理学吸附,大的抗体分子令人惊讶地与更小的、惰性的亲水蛋白如白蛋白和运铁蛋白充分竞争。然而,由于使用比颗粒的结合容量更少的抗体,所述惰性蛋白,如白蛋白和运铁蛋白,与颗粒表面上留下来反应的任何基团起反应,并且然后使得本发明的颗粒同时具有良好的亲水表面和良好的抗体结合容量,并且具有可以产生良好的信号的适当比例的纳米颗粒材料。
通过本文提供的教导的指导,对于本领域的技术人员而言,采用适合每种包被方法的条件的变体是常规的。
例如,对于偶联,当使用单克隆抗体时,可以选择高于抗体的pI半个单位的pH。多克隆抗体具有非常多样的pI,并且因此对于多克隆抗体可以优选地选择使用pH 8.8。
在一个优选的实施方案中,基于偶联反应混合物的总蛋白含量,在偶联过程中存在的约3-70重量%,或者甚至更优选地5-40重量%的蛋白应该由所述抗-抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗体组成。
如上述所阐释,由于所述抗体具有比亲水惰性蛋白更高的与所述颗粒的结合率,所以,抗体蛋白与结合到颗粒表面上的总蛋白的比例将高得多,例如,结合到颗粒表面上的总蛋白的20-90%,并且更优选地35-80%,并且甚至更优选地40-70%是由所述抗体组成的。
d)所要求保护的比浊法的优选实施方案
d1)发明优点
本发明提供具有比现有技术更强的信噪比的比浊抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C免疫测定。通过选择大的核心和蛋白外壳颗粒,优选特定的最小的大小,与抗原亲和纯化的抗体组合,获得了令人吃惊地高凝聚信号。由于与测定缓冲液相比较,在颗粒的折射率和高度纯化的抗体的高亲和力(或抗体亲抗原性)之间的令人吃惊的协同作用,获得了强比浊信号。所述强比浊信号导致对干扰物质如三酰甘油的更高的稳定性,并且比现有技术的比浊抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C免疫测定具有更好的线性。
均相免疫测定的关键因素是每质量单位每体积测定混合物所产生的信号。所述测定混合物是在已经加入全部的试剂和样品时获得的混合物。例如,如果要分析3μl的样品,并且所述样品含有1mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/l,并且在混合全部的试剂和样品后终体积是300μl,那么抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C在终测定混合物中的浓度是10μg/l。如果所述分析物在样品中的浓度是低的,那么这通常可以通过使用与测定混合物的体积相比更大的样品而补偿,例如,在300μl的测定混合物体积中将样品增加到6μl。对于增加样品体积,存在一些障碍。首先,在样品中可能存在的所有干扰物质在所述测定混合物中的浓度增加。其次,为了克服临界曲线作用(critical hook effect)(即,具有负斜率的剂量/反应曲线),对抗体的需求增加,其又相对应地增加测定的抗体成本。
因此,存在这样的需要,即,在分析物的低的测定混合物浓度以及相对应低的样品体积下,获得良好的信号强度和稳定的测定。在均相免疫测定中增加样品的体积导致更多的干扰和更昂贵的测定。
本发明提供在比浊抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C免疫测定的信号强度、稳定性和线性方面的令人吃惊的增加。本发明还具有来自脂质如三酰甘油的更少的干扰。在理解现有技术的缺点后,实现了上述目的,并且提供具有比现有技术中的比浊法更好的精确性、线性和更少的干扰的方法,所述现有技术基于每质量单位的分析物的比浊信号中过低的信号强度。
d2)实施本发明的测定方法
在本发明的一个优选的实施方案中,将测定缓冲液与样品和免疫颗粒混悬液混合,并且通过光度计,特别是记录式光度计,并且更优选记录式分光光度计,监测所述混合物或得到的混悬液的浊度。优选的步骤顺序为:将样品混合在测定缓冲液中,允许所述混合物完全溶解并且稳定化,然后加入免疫颗粒混合物。本发明还可以这样实施,即,通过最先将测定缓冲液与免疫颗粒混悬液混合,然后加入和混合样品而进行。应该应用最佳混合方法(在本领域公知的方法中选择),其可以通过有限量的预实验而确定。
当使用记录式光度计时,可以确定浊度增加的初始速率,通过测量吸光度增加的初始速率而确定样品的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C浓度,或者通过在混合时直接记录;或者通过在混合不久后记录,并与对吸光度初始增加的向后外推组合;或者通过在样品和试剂混合后小于1分钟内测量在两个或多个时间点之间的吸光度差异(见上)。
这些测量或组合的测量可以相关于,或者与使用已知的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C浓度的校准物的对应结果进行比较,并且这样可以计算未知样品的浓度。这些记录吸光度值和计算结果的方法对于临床化学领域的技术人员测量的许多其它物质是众所周知的。当然,来自于本发明的非常良好的信号使得这样的测量和计算要稳定和准确得多,特别在如上文所述,在将样品和试剂混合不久后获得的良好的信号时。
存在一些可以使用的测定缓冲液混合物,其具有加入所述缓冲液中的不同种类的缓冲物质,具有不同种类的去污剂和/或不同种类的聚合物和/或盐。
可以使用TRIS缓冲液,磷酸盐缓冲液,硼酸盐缓冲液以及其它缓冲物质,如MOPS,PIPES,HEPES,并且对于本发明不是关键的,只要所述测定可以不依赖于加入的样品的pH和缓冲能力而保持最终测定混合物的充分调节的pH。典型地,以约5mM-0.2M或10mM-0.1M的终摩尔比例加入所述缓冲液。将pH调整到6-8的范围,特别是6.5-7.5。
此外,可以使用一些去污剂,只要它们能够溶解所加入的样品的任何脂质内容物,并且不太强烈地干扰抗体与所述样品引入的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的反应。由于脂质形成给出干扰信号的微滴和微团,所以,三酰甘油,胆固醇和一定范围的脂蛋白是比浊测定中干扰物质的实例。吐温20,Triton X-100和脱氧胆酸盐是适当的去污剂的实例。在含有脂质的样品中测量抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C是一个大挑战,并且需要所述脂质的良好的溶解性,但是甚至更重要地是,超过任何次要的干扰的强信号。去污剂典型地以分别为最终反应混合物重量的0.01-0.5%或0.1-0.3%的终比例加入。
最广泛应用的聚合物是不同分子大小的聚乙二醇(特别地,约6.000-8.000),但是还可以使用葡聚糖和其它聚合物。所述聚合物具有缺点,----当浓度过高时----它们产生在将检测样品与测定混合物混合时引入的其它物质的非特异性沉淀。另一方面,同时,所述聚合物提高信号。然而,它们倾向于减小免疫颗粒的总结合容量。聚合物典型地以分别为最终反应混合物重量的约0.05-0.5%或0.1-0.3%的终比例加入。
适合离子强度的适合盐是例如,碱金属卤化物,特别是氯化钠,以1-100mM,或5-50mM的浓度加入。
可以存在于测定混合物中的其它适当的成分为:
氨基酸,如甘氨酸,以约1-50mM或5-20mM的终浓度加入;
蛋白质,如白蛋白,以0.1-5g/l或0.5-2g/l的终比例加入;
抗微生物试剂,如叠氮化钠,以0.1-10或1-5g/l的终比例加入;
校准物或对照物质:这些是典型地包括溶解在缓冲物质中、典型地是磷酸盐缓冲液或TRIS缓冲液中的已知浓度的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的溶液,任选地具有一些蛋白质物质,任选地包括达到100体积%的人或动物血清(如果100体积%是血清,那么对于缓冲溶液,没有空间也没有需要)。
此外,一种或多种试剂可以以干燥的、任选地冻干的形式使用。偶联到纳米颗粒上的抗体可以以干燥的形式使用,例如,作为片状物(pellet),并且在使用之前溶解,或者可以溶解在测定缓冲液试剂中或者溶解在反应混合物中。反应缓冲液中的一种或多种成分可以在实施所述测定之前或过程中以干燥形式加入,校准物也是这样。甚至所述样品可以以干燥的或冻干的形式提供,并且以干燥形式加入到反应混合物中,或者在其使用之前溶解。
在临床化学分析中,使用用于校准目的的标准曲线是标准实践。因此,在实施本发明的方法时,可以使用已知抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C含量的样品替代临床样品,以构建待测量的反应/信号的标准曲线,并且然后,可以通过从所述标准曲线的内插法而计算未知样品的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C含量。
按照颗粒增强的光散射免疫测定领域中公知的方法,选择在混合物中纳米颗粒-免疫偶联物的总浓度,以致来源于所述纳米颗粒的吸光度值不影响准确的和精确的测量,但是微粒的浓度足够高,足以得到信号形成。所述量当然受到不同的参数的影响,所述参数如体液样品或来源于其的样品的体积,以及抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的含量。
作为测定的非限制性的典型的参数,可以提及下述:
典型的样品体积是1-20μl,例如2-10μl,或者特别是3μl。
典型的免疫颗粒体积是10-100μl或20-60μl,或者特别是40μl。
所述免疫颗粒可以提供为0.5-10或1-5,典型地约2-3,特别是2.26mg颗粒/ml缓冲溶液的混悬液。所述缓冲液可以具有在6-9范围内的pH,例如7-8.5,典型地约pH 8.4。除了缓冲物质之外,所述缓冲溶液还可以包含其它组分,例如氨基酸、盐、惰性蛋白质和乳化剂或增溶剂,如上文所定义。这样的组分和缓冲液的典型的混合物包括10mM硼酸盐缓冲液,10mM甘氨酸,15mM NaCl,0.25%吐温20和1g/l白蛋白。
典型的总测定体积是100-1000μl,或200-500μl,或250-300μl,或者特别地约280μl。
不同的仪器使用不同的总体积运行,以致这些体积的30%或60%,或者这些体积的150%或300%典型地用于其它的仪器。样品体积和免疫颗粒体积的比例可以是在1/100-2/3,更优选地2/100-1/3,并且甚至更优选地1/40-1/5之间的任意值。
d3)医学用途
本发明的测定方法可以用于诊断和监测与体液或组织的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C含量相关的或以此为表现的病理性或潜在的病理性病况。这些特别包括哺乳动物的肾小球滤过率(GFR,作为肾功能的量度)或影响所述滤过率的病理性病况。
本发明的方法可以用来确定儿童的GFR;或者患有肌肉萎缩的患者的GFR;用来指导肾功能癌症治疗的作用;用来指导肾脏移植和免疫抑制治疗;用来指导糖尿病的肾脏滤过率;用于检测并且管理惊厥;并且在药物施用与可能导致体内不理想的药物累积的GFR减少相关的情形中,用来发现正确的药物剂量。
所述测定方法还可以用于评估药物对所述滤过率的作用。
对于阅读本说明书的熟练的技术人员可以明白其它潜在的应用。
本发明还提供实施按照本发明的免疫测定的一组试剂。所述试剂组特征在于,包括抗-抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C免疫颗粒,适当的测定缓冲液,和任选地,校准溶液与对照溶液。任选地,所述颗粒混悬液和测定缓冲液作为组合的试剂递送。
在另一个方面,本发明提供分析产品,任选地以试剂盒或多部分的试剂盒形式存在,用于测定样品中的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C,所述产品包括:至少一种如上文所述的以干燥的或混悬形式存在的纳米颗粒-免疫偶联物,并且任选地,一种或多种如本文定义的其它组分,例如,适当的测定缓冲液,并且任选地,校准溶液和对照溶液。
本发明还提供用于实施按照本发明的免疫测定的一组试剂。所述试剂组特征在于,包括,抗-抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C免疫颗粒,适当的测定缓冲液,并且任选地,校准溶液和对照溶液。任选地,所述颗粒混悬液和测定缓冲液作为组合的试剂递送。
任选地,还可以存在信号评估的工具,如计算图表,允许将观察到的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C浓度与GFR参数直接关联。
下述非限制性实施例以非限制的方式举例说明本发明方法。
实验部分:
合成实施例1:制备多克隆禽类血清及其亲和纯化
a)制备禽类抗体级分
可以使用下述免疫方法来产生针对人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的多克隆IgY抗体:
每个免疫实验使用2-4只母鸡。在免疫开始之前,收集一对卵。从这些卵中纯化的IgY将作为对照IgY。将在磷酸盐缓冲液中的100μg高度纯化的人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C(从患有肾小管蛋白尿的患者的尿中纯化,商购自Scipac Ltd.,英国)用弗氏完全佐剂乳化,并且注射到母鸡的胸肌中。每4周重复注射。在注射起始后10周,收集卵。将蛋黄从卵分离,并且通过氯化铵沉淀,以按照卵抗体分离的现有技术方法的常规方式,分离来自蛋黄的IgY级分(参见,例如,Larsson A,Baaloew R-M,Lindahl T,和Forsberg P-O,在Poultry Science(家禽科学)中,72:1807-1812,1993)。
b)多克隆抗体级分的亲和纯化
按照在柱子的包装插件中的指示,将10mg高度纯化的人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C固定在来自安玛西亚法玛西亚生物技术(AmershamPharmacia Biotech)的HITRAP NHS-活性HP柱上。
将分离的IgY级分在磷酸缓冲盐水中稀释至2mg/ml。将200ml的这种IgY溶液流过柱子,然后是50ml无IgY的磷酸缓冲盐水。具有对固定的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的特异性亲和力的抗体用35ml 0.1摩尔的柠檬酸盐缓冲液pH=3.2洗脱。将洗脱的特异性抗-抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗体针对磷酸缓冲盐水透析,并且使用具有30,000道尔顿的截留分子量的Amicon Centircon离心过滤装置浓缩至3mg/ml。
合成实施例2:制备单克隆抗-人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗体
单克隆抗-人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗体的制备可按照下述实施,通过利用本领域公知的方法,例如,由Harlow等,1988,″Antibodies:aLaboratory Manual(抗体:实验室手册)″的第6节,冷泉港出版社,纽约,美国所述。按照Sensabaugh等,1990,J.Urology(泌尿学杂志)144,1523所述,从人精液血浆中分离人PSA。
在规律的时间间隔,将小鼠用在RAS(RIBI佐剂系统)中的50μg人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的4次注射进行免疫。在第一次注射后4个月,使用G.Galfre等,1981,Methods in Enzymology(酶学方法),73,3-46所述的聚乙二醇方法,将从免疫的小鼠的脾脏分离的淋巴细胞与骨髓瘤细胞系SP2/0-Ag14融合。
分泌针对抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的抗体的杂交瘤通过下述筛选ELISA鉴定:将微量滴定板用兔抗-人-抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C免疫球蛋白包被;将结合到这种固相上的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C与杂交瘤培养物的上清一起温育。使用抗-小鼠-免疫球蛋白-过氧化物酶-偶联物,检测与抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C结合的单克隆抗体。
可以分离数百种分泌针对人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的不同的表位的抗体的杂交瘤。然后,亲和纯化相对应的单克隆抗体,并且可以进行更详细地特征性描述。
实施表位结合,并且使用BIAcore生物传感器技术(法玛西亚(Pharmacia),瑞典),关于它们的表观解离常数确定抗体的相对反应性。后者是基于表面等离振子共振技术(参见,J.L.Daiss等,1994.在″Methods:A Companion to Methods in Enzymology(方法:酶学方法的指南)″中6,143-156,学院出版公司(Academic Press Inc.),纽约,美国),并且允许监测生物分子反应的动力学和化学计量。
从细胞培养物的上清开始,单克隆抗体通过多克隆兔抗-小鼠-Fc-抗体而结合到生物传感器的表面。监测抗原抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C与所述单克隆抗体的缔合和解离。数据可以使用内在的BIA评估软件,基于简单的A+B=AB平衡模型(L.G.Fagerstam等,1992,Journal of Chromatography(层析杂志),597,397-410),而进行分析。然后,得到的抗体可以关于它们各自的表观解离常数进行比较。然后,适当的抗体或它们的组合可以用于制备本发明的免疫颗粒。
合成实施例3:制备抗-抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C免疫颗粒
a)偶联方法-标准方法:
(1)缓冲液和试剂
为了具有来自聚合物颗粒的更多的信号/mg抗体,将偶联缓冲液的pH以特定方式适合待偶联的抗体的pI。另外,在偶联之前,将所述抗体用白蛋白/运铁蛋白稀释(见下文)。对于偶联,当使用单克隆抗体时,选择高于抗体的pI半个单位的pH。多克隆抗体具有非常多样的pI,并且因此多克隆抗体使用8.8的pH值。通过将上文提及的PBS和硼酸盐缓冲液混合,而获得所选择的pH。
下述标准方法概括了通过抗体与氯甲基的物理吸附而附着的两种简单的一步方法。所述方法用于以1%固体的1μm的氯甲基胶乳。这一反应可以容易地放大或缩小,以适合个别需要。例如,如果使用不同的颗粒大小,那么可以从下式计算抗体(Ab)的量:
Ab的重量=(用于1μm-颗粒的Ab的重量)/(单位为μm的颗粒直径)
(2)制备胶乳颗粒混悬液
1.移取2.5ml(40mg/ml)氯甲基胶乳微球体,并且用10mL MES缓冲液稀释。
2.将所述混合物离心,以沉淀颗粒:~3,000G持续~20分钟。
3.去除上清,并且将沉淀重新分散在10ml MES缓冲液中。
4.再次离心,并且从颗粒上去除上清。
5.将沉淀重悬在5ml MES缓冲液中,确保完全悬浮微球体颗粒。
现在,所述胶乳混悬液具有约2%固体(即,~20mg/ml)。
(3)偶联
1.向5ml在调节到适当的pH(见上文)的PBS/硼酸盐缓冲液中的1.5mg抗体、3.75mg白蛋白和7mg牛运铁蛋白的溶液中,加入5ml的胶乳。这小于抗体单层所需要的。与所述运铁蛋白(transferring)和白蛋白相比,所述抗体与胶乳更具反应性,并且或多或少地与胶乳定量结合,并且其余的胶乳表面由白蛋白和/或运铁蛋白饱和。这种混合物还保证颗粒的抗凝聚和良好的亲水性。此外,其它的惰性蛋白质可以在偶联过程中与抗体混合,如虫戚形血蓝蛋白、触珠蛋白以及其它水溶性蛋白,它们对于所述抗体和抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C没有任何亲和力。
2.在室温下轻轻搅拌,将胶乳/蛋白混合物温育过夜。
3.离心,以从未结合的蛋白质分离蛋白-标记的胶乳颗粒。
4.去除并且保留用于蛋白质确定的上清。在这一步骤,可以保留上清,并且进行蛋白确定。可以从加入的初始量中减去上清中的任何残留的蛋白。剩余的被包被在颗粒上。与胶乳微球体相容的用于蛋白确定的唯一的方法是来自Pierce的Micro BCA蛋白测定试剂盒。
5.将沉淀重悬在10ml PBS中。
6.再次离心,以沉淀所述颗粒。
7.再重复步骤5-6两次,总共进行3次洗涤。
8.将最终的胶乳重悬在10ml储存缓冲液中,产生1%固体的终浓度。在4℃保存备用。勿冷冻。
将甘氨酸用于储存缓冲液中,以填充还未被蛋白质覆盖的微球体表面上的任何反应性位点。这是减少非特异性的结合。如果需要,惰性蛋白,如牛血清白蛋白(BSA)或牛运铁蛋白,可以用于同样的目的。存在NaN3作为生物杀灭剂。如果所述胶乳保持无菌,可以省略与细胞或组织培养物不相容的NaN3。
b)制备包被的纳米颗粒
应用上述标准方法包被直径0.08μm的胶乳颗粒,以制备本发明的纳米颗粒-偶联物。按照上式,24mg的抗体和65mg的白蛋白用来包被100mg的颗粒。
通过将挪威的来自挪威抗体AS(Norwegian Antibodies AS,挪威)、按照如上合成实施例1和2中给出的由Gentian AS给出的说明书制备的抗-抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗体(所述多克隆抗人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗体对应从用来自患有慢性肾小管蛋白尿的患者的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C免疫的母鸡的卵分离的免疫球蛋白的亲和纯化的免疫球蛋白级分;亲和纯化方法使用固定的人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C而进行)偶联到氯甲基活化的胶乳颗粒(0.083μm,来自美国的界面动力学公司(IntefacialDynamics Inc.,USA),产品号C37487)上,而产生所述抗-抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C免疫颗粒。对于所述偶联,可以使用从http://www.idclatex.com/body-bgrounder-superactive-protocol-11.asp下载的方法“蛋白与IDC超净氯甲基胶乳的偶联(Coupling of Proteins to IDCUltraclean Chloromethyl Latex)”。
备选的颗粒和偶联方法可以在界面动力学公司(Intefacial Dynamics)的网页上、Invitrogen的网页和Bangs颗粒公司(Bangs Particles Inc)的网页上找到。
所获得的颗粒用作在具有0.25%吐温20和1g/l白蛋白的10mM硼酸盐缓冲液,10mM甘氨酸,15mM NaCl中2.26mg颗粒/ml的混悬液。
测定实施例1:在本发明的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C测定中,在不同波长处确定的浊度
a)试剂
按照合成实施例3制备的免疫颗粒混悬液用于下述实验:
在所述实验中,使用下述最优化的测定缓冲液pH=7.2:
聚乙二醇(西格玛(Sigma))22g/l,
吐温20(西格玛)3g/l,
MOPS(西格玛)9.4g/l,
叠氮化钠2.7g/l,
氯化钠27g/l,
具有8mg/l的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C浓度的样品用于在400-700nm波长范围内确定时间依赖性浊度变化。
b)仪器:如由Roche Diagnostics(罗氏诊断)提供的具有标准附件的日立917仪,其使用样条模式设置,处于37℃。
c)程序
将3μl样品与160μl所述测定缓冲液混合,并且允许静止3分钟,然后加入45μl免疫颗粒混悬液并且混合。在所述混合之后,以不同波长和不同时间点测量浊度。
d)结果:
观察到的结果总结在附图1和2中。
如由附图1可知,反应开始点时的背景取决于测量吸光度的波长,背景随波长缩短而增加。
然而,现在意外地发现在约340nm-低于约500nm,获得吸光度的高净变,在反应开始时具有可接受的低吸光度(见附图1)。
另外,比浊/吸光度变化的测定显示,在不同波长和固定温育间隔(测量前5分钟)下,最大浊度在约450nm处获得(见附图2)。
测定实施例2:确定吸光度变化的最佳范围
a)试剂
如测试实施例1中定义的免疫颗粒和测定缓冲液
具有8,3mg/l的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C浓度的血清样品
b)仪器:Schimadzu UV-160分光光度计;具有10mm光径的石英(quarts)管
c)程序
实验(1):在具有10mm光径的石英管中混合680μl测定缓冲液和10μl血清样品,仪器处于光谱模式设置。随后,混合180ul抗-抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C免疫颗粒,并用Schimadzu UV-160分光光度计在最终混合后0,1,2,3,4和5分钟时测量350-600nm的吸光度光谱(见附图3a)。
实验(2):在单独的平行实验中,用处于动力学模式设置的仪器连续测量430nm处的吸光度5分钟(图3b)
所有实验在室温下进行。
d)结果:
观察到的结果总结在附图3a(实验(1))和3b(实验(2))中。
附图3a证明最佳信号增加在430nm附近获得(由430nm处的指示线指示),但是在最低360nm-最高500nm也具有良好的信号增加。高于500nm,信号增加较弱。从400nm到低至350nm,信号增加较低,且在400nm以下,零信号还非常高,从而导致低的信号与背景的比率。
图3b证明在430nm处251mAbs单位的初始(混合后20-40秒时测量的,因为在混合物均匀前需要几秒,因此从时间0开始测量是不可能的)吸光度变化,其对应于753mAbs单位/分钟。凝集反应持续5分钟,且5分钟后仅观察到小的增加。
充分理解观察到的比率可以通过改变免疫颗粒量、样品体积、温度、测定缓冲液的组成、颗粒的尺寸等增大或减小。然而,该实施例说明反应的信号在低于约500nm到约400nm增大,在低于约400nm开始减小,且在低于360nm时信号甚至更低。信号与背景的比率在低于约400nm时变低,且在低于360nm时非常低。
因此,可以推断存在约370-约500nm的中间波长范围,最佳在约410-450nm,其中吸光度变化最佳。
此外,由图1,3a和3b可知——在约370-500nm的波长范围内——吸光度变化在反应开始时,特别是在最初的2-3分钟内最高,并且然后在三分钟后减小。
所述附图还证明通过在混合试剂后较早测量可以节省时间,这对于自动化分析仪系统的通量很重要。此外,不应该在混合后过早开始测量,因为在良好混合导致均匀混合物之前需要几秒。
此外,在较短时期内的许多时间点处的动力学读数可以获得比简单测量分开的两个——或几个——时间点更高的精确性。在多分析仪中,可能不可能连续追随一份样品——仪器通常操作旋转式传送带(carrousels),其中样品以几秒的间隔测量许多次——但是在反应早期重复测量可以提供比等到反应变平(和结束点测量)更好的结果和更高的结果产率(例如,更多的结果/小时)。
因此,在混合所有试剂后5-280秒之间的时间点测量吸光度是优选的,且甚至更优选的是在15-200秒,如例如25-150秒之间测量。
测定实施例3:利用强生(Johnson & Johnson)的Vitros 5.1仪确定不同波长和不同抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C浓度下的吸光度变化
将仪器设置为两点率模式(two point rate mode),其具有立方样条校准曲线设置。
a)试剂:见测定实施例1
b)程序:
混合187μl试剂缓冲液、2.4μl不同抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C浓度的样品(见下)、和60μl免疫颗粒,随后在一个实验中——在405——和在另一个实验中——380nM处——以在混合所有试剂后38秒-208秒之间的时间间隔测量。实验在37℃下进行。
c)结果:
405nm处的实验结果:
0,44mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/升 变化率:7,2mABS单位/分钟
0,83mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/升 变化率:14,1mABS单位/分钟
1,38mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/升 变化率:25,4mABS单位/分钟
2,77mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/升 变化率:56,5mABS单位/分钟
4,46mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/升 变化率:107,3mABS单位/分钟
8,05mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/升 变化率:199,1mABS单位/分钟
380nm处的实验结果:
0,44mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/升 变化率:9,7mABS单位/分钟
0,83mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/升 变化率:15,9mABS单位/分钟
1,38mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/升 变化率:29,14mABS单位/分钟
2,77mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/升 变化率:62,5mABS单位/分钟
4,46mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/升 变化率:108,7mABS单位/分钟
8,05mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/升 变化率:192,mABS单位/分钟
如所可见,包含8.05mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/l的样品的最大吸光度变化速率在380nm处低于在405nm处。这是可预料的,因为如果波长缩短到低于450nm的值最大吸光度/浊度减小(如以上附图2中可见),而背景信号(反应开始时的吸光度信号)在波长缩短到低于450nm的值时显著升高,如以上附图1和3中可见。因此,测量波长值低于370nm,且特别是波长低至340nm(如由Newman等教导)是不可取的。
测定实施例4:利用来自Roche Diagnostics(罗氏诊断)的日立917仪确定不同波长和不同抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C浓度下的吸光度变化
仪器在37℃下运行,并应用样条校准曲线和两点率。
a)试剂:见测定实施例1
b)程序:
将3μl样品(抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C浓度参见图4)与230μl测定缓冲液和40μl水混合,温育3分钟,并且然后与40μl免疫颗粒混合。在混合所有试剂后25-80秒测量吸光度变化。
c)结果:
结果显示在附图4中。在该比率实验中,其中所有测量在混合所有试剂后70秒内完成,信号在376nm的低测量波长处最佳,大约比415nm处高35%,因为仅测量反应最开始的部分。mAbs/分钟值显示在附图4中。
测定实施例5:利用Cobas 501多分析仪确定不同波长和不同抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C浓度下的吸光度变化
a)试剂:见测定实施例1
b)程序/仪器设置:
仪器设置为——在每个测定中——将170μl测定与2,4μl样品混合,随后将45μl免疫颗粒与该测定混合物相混合。Cobas 501仪以8.6秒的周期操作。将仪器设置为在34-35个周期后混合所有试剂。从周期36到周期41,以两点率设置测量450nm处的吸光度变化。
获得以下吸光度变化速率:
样品中的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C(mg/l) | 吸光度变化速率mABS/min |
0.330,631.172,854,908,05 | 1120,841,2113,3228,1445,7 |
使用该标准曲线和构建该标准曲线的仪器样条函数,将关于未知血清样品中抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的测定结果与利用ProSpec比浊法参照方法获得结果相比较。获得与参考方法优秀的相关性。
ProspecmABS/min | C501mABS/min |
0,765 | 0,77 |
1,045 | 1,0365 |
1,22 | 1,188 |
1,57 | 1,535 |
2,04 | 1,99 |
2,355 | 2,2795 |
3,19 | 3,12 |
4,97 | 4,7095 |
6,255 | 5,676 |
7,225 | 6,4595 |
1,275 | 1,2485 |
2,32 | 2,246 |
1,12 | 1,129 |
1,13 | 1,1165 |
1,345 | 1,323 |
1,11 | 1,103 |
1,395 | 1,3595 |
2,575 | 2,503 |
1,445 | 1,3995 |
0,94 | 0,9205 |
0,985 | 0,9715 |
1,27 | 1,243 |
1,165 | 1,131 |
2,605 | 2,535 |
1,775 | 1,681 |
2,52 | 2,4055 |
2,86 | 2,7795 |
2,24 | 2,136 |
1,64 | 1,579 |
3,025 | 2,971 |
3,09 | 3,0445 |
2,17 | 2,068 |
2,765 | 2,7335 |
1,57 | 1,511 |
2,39 | 2,319 |
2,055 | 1,948 |
0,88 | 0,869 |
3,465 | 3,4505 |
测定实施例6:利用Beckman Lx 20仪确定不同波长和不同抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C浓度时的吸光度变化
a)试剂:见测定实施例1
b)程序:
将仪器设置为混合230μl测定和6μl样品,随后将50μl免疫颗粒与测定化合物相混合。将仪器进一步设置为在混合试剂后12-52秒测量吸光度变化速率。
Beckman Lx20仪——作为许多其他临床分光光度计自动仪器——以主要(第一)测量波长和第二测量波长(约700nm)操作,且提供主要波长处的测量结果,关于第二波长处的读数校正。进行了两个实验,一个使用主要测量波长为410nm的仪器设置,和一个实验使用主要测量波长为470nm的仪器设置。对于这两个实验,第二波长设置为700nm。
获得以下mAbs单位/分钟变化率:
样品中的半胱氨
酸蛋白酶抑制剂C 410nm 470nm
0.42mg/l 36,2 12,0
0,62mg/l 53,9 15,7
0,85mg/ml 81,2 27,3
1,69mg/ml 203,1 61,1
3,38mg/l 529,3 168,1
8,05mg/l 1095 390,8
Claims (24)
1.包含适合于比浊测量的纳米颗粒的纳米颗粒-抗体偶联物在制备用于评估人体液样品中的人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的比浊免疫测定的试剂盒中的应用,其中所述纳米颗粒用抗-人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗体或其抗原结合片段包被,以结合所述抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C,其中用抗-人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗体或其抗原结合片段包被的纳米颗粒具有59-160nm范围内的平均直径,其中所述纳米颗粒用所述纳米颗粒-抗体偶联物总重的5-35%的结合抗体包被,其中所述纳米颗粒-抗体偶联物用于与所述样品接触而形成测定混合物,所述人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的含量通过确定在370nm以上和500nm以下的范围内的至少一个波长处的吸光度变化来测量所述混合物的浊度的变化而评估。
2.权利要求1的应用,其中确定初始吸光度变化速率。
3.权利要求2的应用,其中在形成所述测定混合物后立即或1-40秒后开始的至少一个5-300秒的时间间隔内确定所述初始吸光度变化速率。
4.权利要求1-3中任一项的应用,其中所述抗体是针对人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的多克隆非人、非啮齿动物抗体。
5.权利要求4的应用,其中所述多克隆抗体是针对人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的禽类抗体。
6.权利要求4的应用,其中至少25重量%的所述多克隆抗体或片段通过使用人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的亲和纯化而获得。
7.权利要求1-3中任一项的应用,其中所述抗体包括:(a)结合人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的单一表位的单克隆抗体,或(b)一组两种或多种种类的单克隆抗体,其中每种种类的单克隆抗体结合人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的不同的表位,或者两种或多种种类以不同的结合强度而结合相同的表位。
8.权利要求7的应用,其中所述单克隆抗体是非人来源的。
9.权利要求1的应用,其中用抗-人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗体或其抗原结合片段包被的纳米颗粒具有80-105nm范围内的平均直径。
10.权利要求1-3中任一项的应用,其中所述包被的纳米颗粒用抗-人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗体和至少一种惰性蛋白质的混合物包被。
11.权利要求1-3中任一项的应用,所述纳米颗粒由聚苯乙烯、聚氯乙烯、环氧树脂、聚偏1,1-二氯乙烯、聚-α-萘基甲基丙烯酸酯、聚乙烯萘、以及它们相应的共聚物制成。
12.权利要求1-3中任一项的应用,其中所述浊度变化通过在370-499nm范围内的至少一个波长处和在10-50℃范围内的温度下测定所述混合物的吸光度变化而测量。
13.按照权利要求1-3中任一项的应用,其特征在于—当构建针对浊度测定法的相关性曲线时—关于用浊度测定法获得的0mg/l抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的对应值,用所述比浊免疫测定获得小于0.15mg/l抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的截取值。
14.按照权利要求1-3中任一项的应用,其特征在于—当构建针对非均相免疫测定方法的相关性曲线时—对于0mg/l抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的对应值,获得小于0.25mg/l抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的截取值。
15.按照权利要求1-3中任一项的应用,其特征在于,对于在1.2mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/l的水平下,抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的测量值具有来自所述人体液样品中的15mmol/l三酰甘油的小于6%的干扰。
16.按照权利要求1-3中任一项的应用,其特征在于,在1.32-7.5mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/l的测量范围内,具有低于5%的线性偏差,并且在0.75-1.32mg抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C/l的测量范围的测量区域内,具有低于15%的线性偏差。
17.按照权利要求1-3中任一项的应用,其特征在于,(a)通过在混合时直接记录,或者(b)通过在混合后立即记录,与对初始增加吸光度的向后外推组合,或者(c)通过在所述样品和所述试剂混合后小于5分钟内测量在两个或多个时间点之间的吸光度差异,通过测量吸光度增加的初始速率而确定样品的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C浓度。
18.权利要求1-3中任一项的应用,其中所述试剂盒用于评估哺乳动物的肾小球滤过率。
19.用于评估人体液样品中的人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的比浊免疫测定的试剂盒,其包括:(a)包含纳米颗粒的纳米颗粒-抗体偶联物,其中所述纳米颗粒用抗-人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗体或其抗原结合片段包被,以结合所述抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C,其中用抗-人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗体或其抗原结合片段包被的纳米颗粒具有59-160nm范围内的平均直径,其中所述纳米颗粒用所述纳米颗粒-抗体偶联物总重的5-35%的结合抗体包被,其中所述纳米颗粒-抗体偶联物用于与所述样品接触而形成测定混合物,所述人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的含量通过确定在370nm以上和500nm以下的范围内的至少一个波长处的吸光度变化来测量所述混合物的浊度的变化而评估,(b)以干燥或溶解形式存在的测定缓冲液。
20.权利要求19的试剂盒,其中所述试剂盒还包括(c)各自以干燥或溶解形式存在的校准混合物和对照混合物。
21.权利要求19的试剂盒,其中所述颗粒和测定缓冲液以干燥或混悬的形式组合提供。
22.用于评估人体液样品中的人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的比浊免疫测定的纳米颗粒-抗体偶联物,其中所述纳米颗粒用抗-人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗体或其抗原结合片段包被,以结合所述抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C,其中用抗-人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C抗体或其抗原结合片段包被的纳米颗粒具有59-160nm范围内的平均直径,其中所述纳米颗粒用所述纳米颗粒-抗体偶联物总重的5-35%的结合抗体包被,其中所述纳米颗粒-抗体偶联物用于与所述样品接触而形成测定混合物,所述人抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的含量通过确定在370nm以上和500nm以下的范围内的至少一个波长处的吸光度变化来测量所述混合物的浊度的变化而评估。
23.权利要求22的纳米颗粒-抗体偶联物在制备用于评估哺乳动物的肾小球滤过率的诊断试剂盒中的应用。
24.权利要求22的纳米颗粒-抗体偶联物在制备用于评估肾功能障碍的诊断试剂盒中的应用。
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