KR20010085485A - Ｃ-반응성 단백질 측정방법 및 측정시약 - Google Patents

Ｃ-반응성 단백질 측정방법 및 측정시약 Download PDF

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Abstract

프로존현상을 피하고 고농도의 C-반응성 단백질을 포함하는 검체를 희석하지 않고 측정하는 방법 및 이를 사용하는 시약을 제공하는 것이다.
포스포릴콜린기와 일반식(Ⅰ)[식(Ⅰ)중 R1, R2, R3은 수소, 치환 혹은 비치환 알킬, 또는 치환 혹은 비치환 알케닐, X-은 무기성 음이온이나 유기성음이온]으로 표시되는 양이온성 기를 갖는 화합물 및 C-반응성 단백질에 대한 항체를 사용하여 C-반응성 단백질을 측정한다. 또한 포스포릴콜린기를 갖는 계면활성제, 식(Ⅱ)[Y1는 소수성기, R1, R2, R3는 수소, 치환 혹은 비치환 알킬, 또는 치환 혹은 비치환 알케닐]로 표시되는 양이온성 기를 갖는 계면활성제 및 C-반응성 단백질에 대한 항체를 사용하여 C-반응성 단백질을 측정한다. C-반응성 단백질에 대한 항체로는 폴리스티렌계 라텍스 등의 수불용성 담체에 담지되는 항체가 바람직하다.
(일반식 Ⅰ)
(일반식 Ⅱ)

Description

Ｃ-반응성 단백질 측정방법 및 측정시약{Method for measuring C-creative protein and regent thereof}
본 발명은 C-반응성 단백질 측정시약 및 측정방법, 상세하게는 포스포릴콜린기와 양이온성 기를 갖는 화합물 및 C-반응성 단백질에 대한 항체를 함유하는 C-반응성 단백질 측정시약, 및 상기 시약을 사용하여 C-반응성 단백질을 측정하는 C-반응성 단백질의 측정방법이나, 포스포릴콜린기를 갖는 계면활성제, 양이온성 기를 갖는 계면성활성제 및 C-반응성 단백질에 대한 항체를 함유하는 C-반응성 단백질 측정시약, 및 상기 시약을 사용하여 C-반응성 단백질을 측정하는 C-반응성 단백질의 측정방법에 관한 것이다.
급성 상반응물질의 하나인 C-반응성 단백질(C-reactive protein)은 각종 감염, 염증성질환 및 조직파괴를 일으키는 질환의 진단이나 경과관찰의 메카로서 임상검사의 분야에서 자주 측정되는 항목중의 하나이다. 이런 C-반응성 단백질의 측정방법으로는, C-반응성 단백질과 특이적으로 결합하는 항체, 또는 항혈청을 사용하여 모세관법, 일차원면역확산법, 면역비탁법, 라텍스면역비탁법 등의 측정방법이 알려져 있다. 이들의 측정방법은, 항원인 C-반응성 단백질과 항체가 결합하였을때 커다란 응집체가 되는 것을 이용해서 이 응집를 검출함으로써 행해지는 것이다.
예를 들어, 라텍스 면역비탁법으로는 항체를 담지시킨 입경 0.1∼1㎛ 정도의 폴리스티렌라텍스 등의 담체를 사용하여 대응하는 항원에 의해 항원항체 반응을 일으키게 하면 반응액 속의 산란광은 증가하고 투과광은 감소하므로, 이 변화를 광흡도 또는 적분구탁도로서 검출함으로써 C-반응성 단백질을 측정할 수 있다. 그러나, 이들 항원항체반응에 따른 응집을 관찰하는 방법에서는 프로존현상이라 불리는 문제가 발생하는 것으로 알려져 있다. 이런 프로존 현상은 항원량이 항체량에 비해 고농도가 되기 때문에 반대로 탁도가 감소하는 현상을 말한다. 그 결과, 측정할 시료중에 항원이 고농도로 존재함에도 불구하고, 항원이 저농도라는 잘못된 결과를 얻어지게 된다. 이 프로존현상을 회피하기 위해서에는 측정할 시료를 희석하던가, 또는 측정에 사용되는 항체를 증가시켜 재차 측정할 필요가 있으나, 조작이 번잡하게 된다.
포스포릴콜린은 칼슘이온의 존재하에 C-반응성 단백질과 특이적으로 결합하여 응집체를 형성하는 것으로 알려져 있다[J.Immunol.,124, 1396(1890)]. 또 C-반응성 단백질의 정제는 p-니트로페닐포스포릴콜린세파로오스 4B컬럼을 사용한 친화크로마토그라피에 의해 행해지는 것으로 알려져 있다[검사와 기술, 24(5),409(1996)]. 그리고, C-반응성 단백질 측정방법으로서 포스파티딜콜린, 콜레스테롤, 염화콜린, 칼슘 등을 함유하는 시약을 사용하는 방법(일본국 특개소 52-123295호 공보)이나, 포스포릴콜린기를 결합한 고분자를 함유하는 시약을 사용한 방법 및 포스포릴콜린기를 결합하는 고분자 C-반응성 단백질에 대한 특이항체를 함유하는 시약을 사용하는 방법(일본국 특개소 62-259063호 공보)이 알려져 있다. 또한 적분구탁도에 의해 검출할 라텍스시약을 사용한 C-반응성 단백질 측정방법으로는, 예를 들어 교와메딕스사의 C-반응성 단백질용 라텍스시약(엑스텔 CRP EL-1200용)을 사용하는 방법이 알려져 있다.
본 발명의 과제는 프로존현상을 회피하고 고농도의 C-반응성 단백질을 포함하는 검체를 희석시키지 않고 측정하는 방법 및 이를 사용한 시약을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구한 바, (A)포스포릴콜린기와 양이온성 기를 갖는 화합물 및 C-반응성 단백질에 대한 항체를 사용하거나, 또는 (B)포스포릴콜린기를 갖는 계면활성제, 양이온성 기를 갖는 계면활성제 및 C-반응성 단백질을 대한 항체를 사용하면 검체중의 C-반응성 단백질을 측정할 수 있다는 것과, 또 고농도의 C-반응성 단백질을 포함하는 검체이어도 희석하지 않고 프로존현상을 회피하여 검체중의 C-반응성 단백질을 측정할 수 있다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명은 포스포릴콜린기와 포스포릴콜린기를 제외한 양이온성 기를 갖는 화합물 및 C-반응성 단백질에 대한 항체를 사용하거나, 또는 포스포릴콜린기를 갖는 계면활성제, 포스포릴콜린기를 제외한 양이온성 기를 갖는 계면성활성제 및 C-반응성 단백질에 대한 항체를 사용하여 C-반응성 단백질을 측정하는 것을 특징으로 하는 C-반응성 단백질의 측정방법(청구항 1)에 관한 것이다.
또 본 발명은 포스포릴콜린기와 포스포릴콜린기를 제외한 양이온성 기를 갖는 화합물에서 양이온성 기는 일반식(Ⅰ)
(일반식 Ⅰ)
[식(Ⅰ)중, R1, R2및 R3은 동일하거나 다르며, 수소, 치환 혹은 비치환 알킬, 치환 혹은 비치환 알케닐을 나타내고, X1 -은 무기성 음이온 또는 유기성 음이온을 나타낸다.]로 표시되는 것을 특징으로 하는 청구항 1에 기재된 C-반응성 단백질의 측정방법(청구항 2); 포스포릴콜린기와 포스포릴콜린기를 제외한 양이온성 기를 갖는 화합물이 포스포릴콜린기를 갖는 단량체와 양이온성 기를 갖는 단량체를 결합시킨 공중합체인 것을 특징으로 하는 청구항 1항 또는 2항에 기재된 C-반응성 단백질의 측정방법(청구항 3); 포스포릴콜린기를 갖는 단량체와 양이온성 기를 갖는 단량체는 각각 포스포릴콜린기와 비닐기를 갖는 단량체, 양이온성 기와 비닐기를 갖는 단량체인 것을 특징으로 하는 청구항 3항에 기재된 C-반응성 단백질의 측정방법(청구항 4); 포스포릴콜린기와 비닐기를 갖는 단량체 및 양이온성 기와 비닐기를 갖는 단량체가 각각 2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린과, 2-히드록시-3-메타크릴로일옥시프로필트리메틸암모늄클로라이드인 것을 특징으로 하는 청구항 4항에 기재된 C-반응성 단백질의 측정방법(청구항 5); 포스포릴콜린기를 갖는 계면활성제가 일반식(Ⅱ)
(일반식 Ⅱ)
[식(Ⅱ)중, Y1은 소수성기를 나타낸다.]로 나타내는 화합물인 것을 특징으로 하는 청구항 1항에 기재된 C-반응성 단백질의 측정방법(청구항 6)에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 식(Ⅱ)로 나타내는 화합물이 리조포스파티딜콜린카프로일, 리조포스파티딜콜린미리스토일, 리조포스파티딜콜린파르미토일, 리조포스파티딜콜린스테아로일, 콩유래의 리조포스파티딜콜린, 포스파티딜콜린디브티로일, 포스파티딜콜린디카프로일, 포스포릴콜린올레일옥시에틸에스테르, 스핀고실포스포릴콜린으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 화합물인 것을 특징으로 하는 청구항 6항에 기재된 C-반응성 단백질의 측정방법(청구항 7); 양이온성 기를 갖는 계면활성제가 암모늄염의 계면활성제인 것을 특징으로 하는 청구항 1, 6 및 7항 중 어느 한 항에 기재된 C-반응성 단백질의 측정방법(청구항 8); 암모늄염의 계면활성제가 일반식(Ⅲ)
(일반식 Ⅲ)
[식(Ⅲ)중, Y2는 소수성기를 나타내고, R1, R2, R3는 동일하거나 다르며, 수소, 치환 혹은 비치환 알킬, 또는 치환 혹은 비치환 알케닐을 나타내며, X2 -는 무기성 음이온 또는 유기성 음이온을 나타낸다.]로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 청구항 8항에 기재된 C-반응성 단백질의 측정방법(청구항 9); 식(Ⅲ)로 표시되는 화합물이, 옥타데실트리메틸암모늄클로라이드, 헥사데실트리메틸암모늄클로라이드, 테트라데실트리메틸암모늄클로라이드, 도데실트리메틸암모늄클로라이드로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 화합물인 것을 특징으로 하는 청구항 9항에 기재된 C-반응성 단백질의 측정방법(청구항 10); C-반응성 단백질에 대한 항체가 수불용성담체에 담지된 것을 특징으로 하는 청구항 1항∼ 청구항 10항 중 어느 한 항에 기재된 C-반응성 단백질의 측정방법(청구항 11)이나, 불용성 담체가 폴리스티렌계 라텍스인 것을 특징으로 하는 청구항 11항에 기재된 C-반응성 단백질의 측정방법(청구항 12)에 관한 것이다.
그리고, 본 발명은 포스포릴콜린기와 포스포릴콜린기를 제외한 양이온성 기를 갖는 화합물 및 C-반응성 단백질에 대한 항체를 함유하거나, 또는 포스포릴콜린기를 갖는 계면활성제, 포스포릴콜린기를 제외한 양이온성 기를 갖는 계면활성제 및 C-반응성 단백질에 대한 항체를 함유하는 것을 특징으로 하는 C-반응성 단백질 측정용 시약(청구항 13); 포스포릴콜린기와 포스포릴콜린기를 제외한 양이온성 기를 갖는 화합물에서의 양이온성 기는 일반식(Ⅰ)
(일반식 Ⅰ)
[식(1)중, R1, R2및 R3은 동일하거나 다르며, 수소, 치환 혹은 비치환 알킬, 또는 치환 혹은 비치환 알케닐을 나타내고, X1 -은 무기성 음이온 또는 무기성 음이온을 나타낸다.]로 표시되는 기인 것을 특징으로 하는 청구항 13항에 기재된 C-반응성 단백질의 측정용 시약(청구항 14); 포스포릴콜린기와 포스포릴콜린기를 제외한 양이온성 기를 갖는 화합물이 포스포릴콜린기를 갖는 단량체와 양이온성 기를 갖는 단량체를 결합시킨 공중합체인 것을 특징으로 하는 청구항 13항 또는 청구항 14항에 기재된 C-반응성 단백질의 측정용 시약(청구항 15); 포스포릴콜린기를 갖는 단량체와 양이온성 기를 갖는 단량체가 각각, 포스포릴콜린기와 비닐기를 갖는 단량체와, 양이온성 기와 비닐기를 갖는 단량체인 것을 특징으로 하는 청구항 15항에 기재된 C-반응성 단백질의 측정용 시약(청구항 16); 포스포릴콜린기와 비닐기를 갖는 단량체 및 양이온성 기와 비닐기를 갖는 단량체가 각각 2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린과, 2-히드록시-3-메타크릴로일옥시프로필트리메틸암모늄클로라이드인 것을 특징으로 하는 청구항 16항에 기재된 C-반응성 단백질의 측정용 시약(청구항 17)에 관한 것이다.
또 포스포릴콜린기를 갖는 계면활성제는 일반식(Ⅱ)
(일반식 Ⅱ)
[식(Ⅱ)중, Y1은 소수성기를 나타낸다.]로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 청구항 13항에 기재된 C-반응성 단백질의 측정용 시약(청구항 18): 식(Ⅱ)로 표시되는 화합물이, 리조포스파티딜콜린카프로일, 리조포스파티딜콜린미리스토일, 리조포스파티딜콜린팔미트일, 리조포스파티딜콜린스테아로일, 콩유래의 리조포스파티딜콜린, 포스파티딜콜린디부티로일, 포스파티딜콜린디카프로일, 포스포릴콜린올레일옥시에틸에스테르, 스핀고실포스포릴콜린으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 화합물인 것을 특징으로 하는 청구항 16항에 기재된 C-반응성 단백질의 측정용 시약(청구항 19); 양이온성 기를 갖는 계면활성제가 암모늄염의 계면활성제인 것을 특징으로 하는 청구항 13, 18 및 19항 중 어느 한 항에 기재된 C-반응성 단백질의 측정용 시약(청구항 20) 암모늄염의 계면활성제가 일반식(Ⅲ)
(일반식Ⅲ)
[식(Ⅲ)중 Y2는 소수성기를 나타내고, R1, R2, R3는 동일하거나 다르며, 수소, 치환기 혹은 비치환알킬, 또는 치환 혹은 비치환 알케닐을 나타내며, X2 -는 무기성 음이온 또는 유기성 음이온을 나타낸다.]로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 청구항 20항에 기재된 C-반응성 단백질의 측정용 시약(청구항 21); 식(Ⅲ)으로 표시되는 화합물이 옥타데실트리메틸암모늄클로라이드, 헥사데실트리메틸암모늄클로라이드, 테트라데실트리메틸암모늄클로라이드, 도데실트리메틸암모늄클로라이드로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 화합물인 것을 특징으로 하는 청구항 21항에 기재된 C-반응성 단백질의 측정용 시약(청구항 22); C-반응성 단백질에 대한 항체가 수불용성 담체에 담지되는 것을 특징으로 하는 청구항 13∼22항 중 어느 한 항에 기재된 C-반응성 단백질의 측정용 시약(청구항 23); 불용성 담체가 폴리스티렌계 라텍스인 것을 특징으로 하는 청구항 23항에 기재된 C-반응성 단백질의 측정용 시약(청구항 24)에 관한 것이다.
도 1은 실시예 A-1 및 비교예 A-1∼A-3의 시약을 사용하여 0∼100mg/dL의 C-반응성 단백질을 측정한 결과를 나타낸 도면,
도 2는 실시예 A-1, 비교예 A-1 및 비교예 A-4의 시약을 사용하여 0∼100mg/dL의 C-반응성 단백질을 측정한 결과를 나타낸 도면,
도 3는 실시예 A-2 및 비교예 A-5의 시약을 사용하여 0∼100mg/dL의 C-반응성 단백질을 측정한 결과를 나타낸 도면,
도 4는 실시예 A-3 및 비교예 A-5의 시약을 사용하여 0∼100mg/dL의 C-반응성 단백질을 측정한 결과를 나타낸 도면,
도 5는 실시예 A-9 및 비교예 A-1의 시약을 사용하여 0∼100mg/dL의 C-반응성 단백질을 측정한 결과를 나타낸 도면,
도 6는 실시예 B-1 및 비교예 B-2 및 비교예 B-1∼B-4의 시약을 사용하여 0∼100mg/dL의 C-반응성 단백질을 측정한 결과를 나타낸 도면,
도 7는 실시예 B-3 및 비교예 B-5의 시약을 사용하여 0∼100mg/dL의 C-반응성 단백질을 측정한 결과를 나타낸 도면,
도 8는 실시예 B-2 및 실시예 B-4, 실시예 B-5 및 비교예 B-1의 시약을 사용하여 0∼100mg/dL의 C-반응성 단백질을 측정한 결과를 나타낸 도면.
본 발명의 C-반응성 단백질의 측정방법은 포스포릴콜린기와 포스포릴콜린기를 제외한 양이온성 기를 갖는 화합물 및 C-반응성 단백질에 대한 항체를 사용하여 C-반응성 단백질을 측정하는 것을 특징으로 하는 측정방법(이하, "본발명의 C-반응성 단백질의 측정방법(A)"이라 한다.)과; 포스포릴콜린기를 갖는 계면활성제, 양이온성 기를 갖는 계면활성제 및 C-반응성 단백질에 대한 항체를 사용한 C-반응성 단백질을 측정하는 것을 특징으로 하는 측정방법(이하, "본발명의 C-반응성 단백질의 측정방법(B)"이라 한다.)로부터 구성되며, 본 발명의 C-반응성 단백질의 측정시약은 포스포릴기와 포스포릴콜린기를 제외한 양이온성 기를 갖는 화합물 및 C-반응성 단백질에 대한 항체를 갖는 것을 특징으로 하는 시약(이하, "본발명의 C-반응성 단백질의 측정용 시약(A)"이라 한다.)과; 포스포릴콜린기를 갖는 계면성활성제, 양이온성 기를 갖는 계면활성제 및 C-반응성 단백질에 대한 항체를 함유하는 것을 특징으로 하는 시약(이하, "본 발명의 C-반응성 단백질의 측정용 시약(B)"이라 한다.)으로 구성된다.
본 발명의 C-반응성 단백질의 측정방법(A)이나 C-반응성 단백질 측정용 시약(A)에서의 포스포릴콜린기와 포스포릴콜린기를 제외한 양이온성 기를 갖는 화합물로는 적어도 한쌍의 포스포릴콜린기와 포스포릴콜린기를 제외한 양이온성 기를 동일 분자내에 갖는 화합물이면 어떤 화합물이라도 사용할 수 있지만, 포스포릴콜린기와 포스포릴콜린기를 제외한 양이온성 기를 동일 분자 내에 다수개를 갖는 화합물이 프로존현상을 충분히 피할 수 있다는 점에서 바람직하고, 예를 들어 유지, 탄수화물, 단백질, 다당류, 핵산의 천연화합물에 이들 2개의 기를 도입해서 제조한 합성화합물, 합성화합물에 이들 2개의 기를 도입하여 제조한 합성화합물, 또는 이들 기를 각각 함유하는 화합물을 합성함으로써 결합시켜 제조한 합성화합물 등을 들 수 있다. 또한 본 발명에서의 포스포릴콜린기와 포스포릴콜린기를 제외한 양이온성 기를 갖는 화합물의 분자량은 특별히 제한은 없지만, 프로존 현상을 충분히 피할 수 있다는 점에서 500∼5,000,000가 바람직하고, 1,000∼1,000,000이 보다 바람직하며, 5,000∼100,000이 특히 바람직하다.
상기 포스포릴콜린기와 포스포릴콜린기를 제외한 양이온성 기를 갖는 화합물에서의 양이온성 기로는 포스포릴콜린기를 제외한 정전하를 갖는 기라면 특별한 제한은 없지만, 일반식(Ⅰ)[식(Ⅰ)중, R1, R2및 R3은 동일하거나 다르며, 수소, 치환 혹은 비치환 알킬, 또는 치환 혹은 비치환 알케닐을 나타나고, X1 -은 무기성 음이온 또는 유기성 음이온을 나타낸다.]로 표시되는 양이온성 기가 프로존현상을 충분히 피할 수 있다는 점에서 바람직하다.
(일반식 Ⅰ)
일반식(Ⅰ)에서의 알킬로는 직쇄상 또는 분지상, 바람직하게는 탄소수 1∼24의 알킬, 보다 바람직하게는 1∼12개의 알킬, 특히 바람직한 것은 탄소수 1∼6개의 알킬을 들 수 있으며, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 펜틸, 네오펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실 등을 들 수 있고, 또한 알케닐로는 직쇄상 또는 분지상, 바람직하게는 2∼24개의 알케닐, 보다 바람직하게는 탄소수 2∼12개의 알케닐, 특히 바람직하게는 2∼6개의 알케닐을 들 수 있으며, 비닐, 알릴, 2-부테닐, 2-펜테닐, 2-헥세닐 등을 들 수 있다. 또 치환 알킬 및 치환 알케닐의 치환기로는 예를 들어, 알콕시, 알카노일, 알카노일옥시, 알케닐옥시, 알케노일, 알케노일옥시, 아로일, 치환 혹은 비치환 페닐, 치환 혹은 비치환 나프틸 등을 예시할 수 있고, 알콕시, 알카노일 및 알카노일옥시의 알킬 부분은 각각 상기의 알킬과 동일하다. 또 알케닐옥시, 알케노일 및 알케노일옥시의 알케닐 부분은 각각 상기의 알케닐과 동일하다. 아로일로는, 벤조일, 나프토일 등을 들 수 있다. 그리고, 치환 페닐, 치환 나프틸의 치환기로는 알킬, 알케닐 등을 들 수 있고, 알킬, 알케닐은 각각 상기의 알킬, 알케닐과 동일하다.
무기성 음이온으로는 플루오르, 염소, 브롬, 요오드 등의 할로겐, 질산 등의 무기산 음이온 등을 들 수 있다. 유기성 음이온으로는 포름산, 아세트산 등의 유기 카르본산이온 등을 들 수 있다.
천연화합물과 합성화합물에 포스포릴콜린기 및 양이온성 기를 도입하는 방법으로는 종래 공지의 방법, 예를 들어 천연화합물과 합성화합물의 수산기, 카르복실기, 아미노기 등을 관능기와, 포스포릴콜린기 및 양이온성 기를 갖는 화합물에 공지의 방법에 의해 도입한 관능기를 반응시키는 방법을 들 수 있다. 이러한 포스포릴콜린기 및 양이온성 기에 도입하는 관능기로는 예를 들어, 천연화합물 및 합성화합물이 갖는 상기의 관능기와 결합하는 것일 수 있고, 수산기, 아미노기, 카르복실기, 알데히드기 등을 들 수 있다.
포스포릴콜린기를 갖는 화합물과 양이온성 기를 갖는 화합물을 합성하여 결합시키는 제조방법으로는 특별한 제한은 없고, 포스포릴콜린기를 갖는 화합물 및 양이온성 기를 갖는 화합물을 단량체로서 부가중합등에 의해 고분자화시켜 제조할 수 있다. 이러한 단량체로는 포스포릴콜린기와 비닐기를 갖는 화합물 및 양이온 성기와 비닐기를 갖는 화합물; 포스포릴콜린기 혹은 양이온성 기를 갖는 디올화합물 및 양이온성 기 혹은 포스포릴콜린기를 갖는 디카르본산화합물; 포스포릴콜린기 혹은 양이온성 기를 갖는 디아민화합물 및 양이온성 기 혹은 포스포릴콜린기를 갖는 디카르본산 화합물 등을 예시할 수 있지만, 특히, 포스포릴콜린기와 비닐기를 갖는 화합물 및 양이온성 기와 비닐기를 갖는 화합물을 고분자화시켜 제조하는 방법이 분자량 또는 조성비를 억제하기 쉽다는 점에서 바람직하다.
상기 포스포릴콜린기와 비닐기를 갖는 단량체로는 공중합이 가능한 것이면 특별히 제한되는 것은 없지만, 예를 들어 2-아크릴로일옥시에틸포스포릴콜린, 2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린(이하, MPC라 약기한다), 2-(메타)아크릴로일옥시에톡시에틸포스포릴콜린, 6-(메타)아크릴옥시헥실포스포릴콜린, 10-(메타)아크릴로일옥시에톡시노닐포스포릴콜린, 알릴포스포릴콜린, 부테닐포스포릴콜린, 헥세닐포스포릴콜린, 옥테닐포스포릴콜린, 데세닐포스포릴콜린 등을 구체적으로 들 수 있다. 또한, 이들 단량체는 예를 들어, 일본국 특개소54-6325호 공보, 일본국 특개소 58-154591호 공보에 기재된 공지의 방법에 의해 제조할 수 있다.
상기 양이온성 기와 비닐기를 갖는 단량체로는 라디칼중합이 가능한 것이면 특별히 제한되는 것은 없지만, 예를 들어 [3-(메타크릴로일옥시아미노)프로필]트리메틸암모늄클로라이드, [3-(아크릴로일옥시아미노)프로필]트리메틸암모늄클라이드, [2-(타크릴오일옥시)에틸]트리메틸암모늄클로라이드, [2-(아크릴로일옥시)에틸]트리메틸암모늄클로라이드, 2-히드록시-3-메타크릴로일옥시프로필트리메틸암모늄클로라이드(이하, QA라 약기한다), 2-히드록시-3-아릴로일옥시프로필트리메틸암모늄클로라이드 등을 들 수 있다. 또한 이들 단량체는 일반 시약으로서 입수할 수 있다.
포스폴리콜린기와 비닐기를 갖는 단량체와, 양이온성 기와 비닐기를 갖는 단량체와의 조합은 특별한 제한은 없지만, 전술한 MPC와 QA와의 조합이 프로존현상을 충분히 피할 수 있다는 점에서 바람직하다. 또한 포스폴리콜린기와 비닐기를 갖는 단량체와, 양이온성 기와 비닐기를 갖는 단량체를 고분자화시킬 때에는 다른 라티칼중합 가능한 비닐기를 갖는 단량체를 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 다른 라디칼중합 가능한 비닐기를 갖는 단량체로는 예를 들어, (메타)아크릴산메틸, (메타)아크릴산에틸, (메타)아크릴산-n-부틸, (메타)아크릴산이소부틸, (메타)아크릴산펜틸, (메타)아크릴산헥실, (메타)아크릴산헵틸, (메타)아크릴산옥틸, (메타)아크릴산트리데실, 2-히드록시에틸메타클리레이트 등의 (메타)아크릴산에스테르; 스티렌, α-메틸스티렌, 메틸핵치환스티렌, 클로로치환스티렌 등의 스티렌계 단량체; 염화비닐, 염화비닐덴, 에틸렌, 프로필렌, 이소부틸렌 등의 치환 혹은 비치환 탄화수소계 단량체; 에틸비닐에테르, n-부틸비닐에테르 등의 비닐에테르계 단량체 등을 들 수 있다.
본 발명에 사용된 포스포릴콜린기와 비닐기를 갖는 단량체, 양이온성 기와 비닐기를 갖는 단량체, 및 필요에 따라 사용된 다른 라디칼중합 가능한 비닐기를 갖는 단량체를 포함하는 조성물을 중합시키는 방법으로는, 예를 들어 일본국 특개평9-3132호 공보, 일본국 특개평 8-33421호 공보, 일본국 특개평11-35605호 공보등에 기재된 공지의 중합방법 등을 들 수 있다. 구체적으로는 중합온도 30∼150℃, 중합시간 2∼72시간 조건에서 라디칼 중합시키는 방법에 의해 중합할 수 있다. 또한 라디칼 중합반응에서의 개시제로는 2,2'-아조비스(2-메틸프로피오노아미딘)이염산염, 4,4'-아조비스)4-시아노 길초산), 2,2'-아조비스[2-(5-메틸-2-이미다졸린-2-일)프로판]이염산염, 2,2'-아조비스이소부틸아미드이수화물, 2,2'-아조비스이소부티로니트릴, 과황산 암모늄, 과황산칼륨, 과산화벤조일, 디이소프로필페록시디카보네트, tert-부틸페록시-2-에틸헥사노에이트, tert-부틸페록시피바레이트, tert-부틸페록시디이소부틸레이트, 과산화라우로일, 아조비스이소부티로니트릴, 2,2'-아조비스(2,4-디메틸발레로니트릴), tert-부틸페록시네오데카노에이트, 또는 이들 혼합물 등을 들 수 있다. 또한 중합용매로는 물, 에탄올, 메탄올, 이소프로판올, tert-부탄올, 벤젠, 툴루엔, 디메틸포름아미드, 테트라히드로푸란, 클로로포름 및 이들 혼합물 등을 들 수 있다.
상기 MPC와 QA를 중합시킬 때에는 중합성 등을 고려하여, 중합개시제로서 2,2'-아조비스(2-메틸프로피오노아미진)이염산염을 사용하는 것이 바람직하고, 그 사용량은 단량체 성분 100중량부에 대해 0.01∼10중량부가 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.1∼5중량부이다. 또한 MPC와 QA의 중합용매로는 용해성이나 중합성 등을 고려하여 물, 에탄올이 특히 바람직하다. 또한 중합체의 정제는 재침전법, 투석법, 한외여과법 등 일반적인 정제방법에 의해 실시할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 중합체의 분자량은 특별한 제한은 없지만, 바람직하게는 500∼5,000,000, 보다 바람직하게는 1,000∼1,000,000, 특히 바람직한 것은 5,000∼100,000이다. 이 분자량은 겔투과크로마트그라피(GPC)로 분석하여 폴리에틸렌글리콜로 환산한 값으로 나타내고 있다. 또한 포스포릴콜린기를 갖는 단량체 및 양이온성 기를 갖는 단량체를 구성단위로서 포함하는 공중합체 중에서의 양이온성 기의 몰함량비는 포스포릴콜린기에 대해 1∼95%가 바람직하고, 5∼90%가 보다 바람직하며, 10∼30%가 특히 바람직하다.
본 발명의 C-반응성 단백질의 측정방법(A)이나 C-반응성 단백질 측정용 시약(A)을 사용한 C-반응성 단백질의 측정은 포스포릴콜린기와 양이온성 기를 갖는 화합물 및 C-반응성 단백질에 대한 항체를 반응액 중에서 C-반응성 단백질을 포함하는 피측정검체와 접촉시킴으로써 행해진다. 이러한 반응액으로는 수성매체이면 특별한 제한은 없지만, 완충액이 바람직하다. 완충액으로는 글리신완충액, 트리스완충액, 인산완충액, HEPES완충액 등을 들 수 있다. 또한 반응액에는 염화칼슘 등의 칼슘이온을 첨가하면 프로존 회피효과가 높아지고 측정범위가 확대되므로 바람직하다. 칼슘이온 농도는 예를 들어, 1∼20mmol/L이 바람직하고, 2∼10mmol/L이 보다 바람직하다. C-반응성 단백질 측정의 반응액중의 포스포릴콜린기 및 양이온성 기를 갖는 화합물 농도는 특별히 제한은 없지만, 0.0001∼1중량%가 바람직하고, 0.005∼0.5중량%가 보다 바람직하고, 0.01∼0.1중량%가 특히 바람직하다. 포스포릴콜린기 및 양이온성 기를 갖는 중합체는 상기와 같이 비교적 적은 첨가량에서도 프로존 회피 및 측정범위의 확대에 효과를 발휘한다.
본 발명의 C-반응성 단백질의 측정방법(B)이나 C-반응성 단백질 측정용 시약(B)에서의 포스포릴콜린기를 갖는 계면활성제로서는 포스포릴콜린기를 가지며, 계면활성제를 나타내는 물질이라면 어떠한 물질이라도 사용할 수 있지만, 일반식(Ⅱ)[식(Ⅱ)중, Y1은 소수성기를 나타낸다.]로 표시되는 계면활성제가 프로존현상을 충분히 회피할 수 있기 때문에 바람직하다.
(일반식 Ⅱ)
일반식(Ⅱ)로 표시되는 계면활성제에서의 소수성기로는 포스포릴콜린기의 친수성에 대해 소수성을 나타내는 기이면 특별한 제한은 없지만, 탄화수소를 기본으로하는 기를 들 수 있고, 치환 혹은 비치환 알킬, 또는 치환 혹은 비치환 알케닐을 구체적으로 예시할 수 있다. 식(Ⅱ)에서의 알킬로는 직쇄상 또는 분지상, 바람직하게는 탄소수 1∼30개의 알킬, 보다 바람직하게는 탄소수 2∼24개의 알킬, 특히 바람직하게는 탄소수 3∼20개의 알킬을 들 수 있으며, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸. 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 펜틸, 네오펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 도데실, 헵타데실, 에이코실 등을 구체적으로 예시할 수 있다. 또한, 알케닐로는 직쇄상 또는 분지상, 바람직하게 탄소수 2∼24개의 알케닐, 보다 바람직하게는 탄소수 3∼12개의 알케닐, 특히 바람직하게는 탄소수 3∼6개의 알케닐을 들 수 있고, 구체적으로 비닐, 알릴, 2-부테닐, 2-펜테닐, 2-헥세닐 등을 들 수 있다. 또한 치환 알킬 및 치환 알케닐의 치환기로는 알콕시, 알카노일, 알카노일옥시, 알케닐옥시, 알케노일, 알케노일옥시, 아로일, 히드록시, 치환 혹은 비치환 아미노, 치환 혹은 비치환 페닐, 치환 혹은 비치환 나프틸 등을 들 수 있다. 알콕시, 알카노일 및 알카노일옥시의 알킬 부분은 각각 상기의 알킬과 같으며, 알케닐옥시, 알케노일 및 알케노일옥시의 알케닐 부분은 각각 상가의 알케닐과 같다. 아로일로는벤조일, 나프토일 등을 들 수 있다. 그리고 치환 아미노의 치환기로는 알킬, 알케닐 등을 들 수 있고, 치환 페닐 및 치환 나프틸의 치환기로는 히드록시, 알킬, 알케닐 등을 들 수 있으며, 여기에서, 알킬, 알케닐은 각각 상기의 알킬, 알케닐과 동일하다.
상기 본 발명에서 일반식(Ⅱ)로 표시되는 계면활성제로는 소수성기로서 탄소수 2∼24개의 알킬 혹은 알케닐(포스포릴콜린기와 상기 알킬 혹은 알케닐 사이에 옥시메틸레닐, 옥시에틸레닐, 옥시프로피레닐을 갖는 경우도 포함한다), 아실 사슬의 탄소수가 4∼24개의 1번 위치 혹은 2번 위치의 모노글리세리드, 동일하거나 다른 아실 사슬의 탄소수가 4∼24개의 디글리세리드, 또는 스핀고신 구조를 갖는 계면활성제가 바람직하고, 리조포스파티딜콜린카프로일, 리조포스파티딜콜린미리스토일, 리조포스파티딜콜린팔미토일, 리조포스파티딜콜린스테아로일, 콩유래의 리조포스파티딜콜린 등의 리소포스파티딜콜린(리조레시틴)이나, 포스파티딜콜린디부티로일, 포스파티딜콜린디카프로일 등의 아실 사슬길이가 짧은 포스파티딜콜린, 포스포릴콜린오레일옥시에틸에스테르, 스핀고실포스포릴콜린등을 예시할 수 있다.
본 발명의 C-반응성 단백질의 측정방법(B)이나 C-반응성 단백질 측정용 시약(B)에서의 양이온성 기를 갖는 계면활성제로서는 포스포릴콜린기를 제외한 양이온성 기를 가지며, 계면활성을 나타내는 물질이면 어떠한 물질이라도 사용할 수 있지만, 암모늄염의 계면활성제가 바람직하고, 일반식(Ⅲ) [식(Ⅲ)중, Y2은 소수성기를 나타내고, R1, R2, R3은 동일하거나 다르며, 수소, 치환 혹은 비치환 알킬, 또는 치환 혹은 비치환 알케닐를 나타내고, X2 -는 무기성 음이온 또는 유기성 음이온을 나타낸다.]로 표시되는 계면활성제가 프로존현상을 충분히 회피할 수 있다는 점에서 바람직하다.
(일반식 Ⅲ)
일반식(Ⅲ)에서의 수소성기 Y2는 양이온성 기의 친수성에 대해 소수성을 나타내는 기라면 특별한 제한은 없지만, 탄화수소를 기본으로 하는 기를 들 수 있다. 치환 혹은 비치환 알킬, 또는 치환 혹은 비치환 알케닐을 구체적으로 예시할 수 있고, 상기의 알킬로는 직쇄상 또는 분지상, 바람직하게는 탄소수 1∼30개의 알킬, 보다 바람직하게는 탄소수 2∼24개의 알킬, 특히 바람직하게는 탄소수 3∼20개의 알킬을 들 수 있고, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 펜틸, 네오펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 도데실, 헵타데실, 에이코실 등을 예시할 수 있다. 또한, 알케닐로는 직쇄상 또는 분지상, 바람직하게는 탄소수 2∼24개의 알케닐, 보다 바람직하게는 탄소수 3∼12개의 알케닐, 특히 바람직하게는 탄소수 3∼6의 알케닐을 들 수 있고, 구체적으로는 비닐, 알릴, 2-부테닐, 2-펜테닐, 2-헥세닐 등을 예시할 수 있다. 또한 치환 알킬 및 치환 알케닐의 치환기로는 알콕시, 알카노일, 알카노일옥시, 알케닐옥시, 알케노일, 알케노일옥시, 아로일, 히드록시, 치환 혹은 비치환 아미노, 치환 혹은 비치환 페닐, 치환 혹은 비치환의 나프틸 등을 예시할 수 있고, 알콕시, 알카노일 및 알카노일옥시의 알킬 부분은 각각 상기의 알킬과 동일하며, 알케닐옥시, 알케노일 및 알케노일옥시의 알케닐 부분은 각각 상기의 알케닐과 동일하다. 아로일로는 벤조일, 나프트일 등을 들 수 있다. 그리고 치환 아미노의 치환기로는 알킬, 알케닐 등을 들 수 있고, 치환페닐 및 치환 나프틸의 치환기로는 히드록시, 알킬, 알케닐 등을 들 수 있다. 여기서 알킬, 알케닐은 각각 상기의 알킬, 알케닐과 동일하다.
R1, R2및 R3에서 알킬로는 직쇄상 또는 분지상, 바람직하게는 탄소수 1∼12개의 알킬, 보다 바람직하게는 탄소수 1∼6개의 알킬을 들 수 있고, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 펜틸, 네오펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실 등을 들 수 있다. 또한, R1, R2및 R3에서 알케닐로는 직쇄 또는 분지상, 바람직하게는 탄소수 1∼12개의 알케닐, 보다 바람직하게는 3∼6개의 알케닐을 들 수 있고, 구체적으로는 비닐, 알릴, 2-부테닐, 2-펜테닐, 2-헥세닐 등을 들 수 있다. 또한 R1, R2및 R3에서 치환 알킬 및 치환 알케닐의 치환기로는 알콕시, 알카노일, 알카노일옥시, 알케닐옥시, 알케노일, 알케노일옥시, 아로일, 히드록시, 치환 혹은 비치환 아미노, 치환 혹은 비치환 페닐, 치환 혹은 비치환 나프틸등을 들 수 있고, 알콕시, 알카노일 및 알카노일옥시의 알킬 부분은 각각 상기의 R1, R2및 R3의 알킬과 동일하며, 또 알케닐옥시, 알키노일 및 알케노일옥시의 알케닐 부분은 각각 상기의 R1, R2및 R3의 알케닐과 동일하다. 아로일로는 벤조일, 나프트일 등을 들 수 있다. 그리고 치환 아미노의 치환기로는 알킬, 알케닐 등을 들 수 있고, 치환 페닐 및 치환 나프틸의 치환기로는 히드록시, 알킬, 알케닐 등을 들 수 있다. 여기서 알킬, 알케닐은 각각 상기의 알킬, 알케닐과 동일하다.
무기성 음이온으로는 플루오르, 염소, 브롬, 요오드 등의 할로겐, 질산 등의 무기산의 음이온을 들 수 있다. 유기성 음이온으로는 포름산, 아세트산 등의 유기카르본산 이온 등을 들 수 있다.
또한 상기 양이온성 기를 갖는 계면활성제로는 옥타데실트리메틸암모늄클로라이드, 헥사데실트리메틸암모늄클로라이드, 테트라데실트리메틸암모늄클로라이드, 도데실트리메틸암모늄클로라이드 등의 장쇄 알킬암모늄염; 헥사데실아민 아세트산염, 옥타데실아민염산염 등의 장쇄 알킬아민염; 알킬피리디늄염 등을 들 수 있다.
포스포릴콜린기를 갖는 계면활성제와 양이온성 기를 갖는 계면활성제의 조합은 임의로 할 수 있지만, 포스포릴콜린기를 갖는 활성계면제의 소수성기와 양이온성 기를 갖는 계면활성제의 소수성기의 사슬길이가 같은 정도의 것을 사용하는 것이 프로존현상을 충분히 피할 수 있다는 점에서 바람직하다. 예를 들어, 전자에서의 아실 사슬의 탄소수가 16개인 리조포스파티딜콜린팔미트일과, 후자에서의 알킬 사슬의 탄소수가 16개인 헥사데실트리메틸암모늄클로라이드, 또는 전자에서의 아실 사슬의 탄소수가 18개인 리조포스파티딜콜린스테아로일과, 후자에서의 알킬 사슬의 탄소수가 18개인 옥타데실트리메틸암모늄클로라이드 등의 조합이 바람직하다.
포스포릴코리기를 갖는 계면활성제 및 양이온성 기를 갖는 계면활성제는 C-반응성 단백질 측정 반응액중의 농도가 각각 0.0001∼5중량%, 바람직하게는 0.001∼1중량%, 보다 바람직하게는 0.01∼0.5중량%가 되도록 하는것이 바람직하다. 또한 포스포릴콜린기를 갖는 계면활성제와 양이온성 기를 갖는 계면활성제의 몰비율은 임의로 할 수 있지만, 1:10∼5:10 정도가 바람직하다.
본 발명에서 C-반응성 단백질에 대한 항체로는 폴리클로날항체, 모노클로날항체 어느 것일 수 있으며, 이들 항체로는 시판품 또는 공지의 방법에 의해 제조한 항체를 사용할 수 있다. 또한 C-반응성 단백질에 대한 항체는 수불용성 담체에 담지된 것을 사용하는 것이 바람직하다. 수불용성 담체로는 라텍스 특히 폴리스티렌계 라텍스가 항체를 담지시키기가 용이하므로 바람직하다. 이러한 수불용성 담체의 입경으로는 0.1∼1㎛이 바람직하다. 항체의 수불용성 담체의 담지는 공지의 담지방법에 의해 행해질 수 있다. 사용하는 항체의 농도에 대해서는 특별한 제한은 없지만, 단독으로 C-반응성 단백질을 측정할 수 있는 농도가 바람직하다.
본 발명의 C-반응성 단백질의 측정방법(A)는 포스포릴콜린기와 양이온성 기를 갖는 화합물 및 C-반응성 단백질에 대한 항체를 사용하여, C-반응성 단백질을 측정하는 것을 특징으로 하는 항원항체 반응을 이용한 측정방법이며, 본 발명의 C-반응성 단백질의 측정방법(B)는 포스포릴콜린기를 갖는 계면활성제, 양이온성 기를 갖는 계면활성제 및 C-반응성 단백질에 대한 항체를 사용하여, C-반응성 단백질을 측정하는 것을 특징으로 하는 항원항체 반응을 이용한 측정방법이다. 이들 항원항체 반응을 이용한 측정방법으로는 공지의 면역비탁법, 라텍스 면역비탁법, 젤라틴응집방법, 리포좀 면역측정방법, 형광면역측정법, 효소면역 측정방법등 어떠한 측정방법도 사용할 수 있지만, 프로좀 현상을 피할 수 있다는 점에서 라텍스 면역비탁법이 바람직하다. 라텍스로는 폴리스티렌계가 바람직하며, 또 상기 라텍스의 입경은 0.1∼1㎛가 바람직하다. 이들 방법은 소정량의 항체담지 라텍스 현탁액과 소정량의 완충액 및 농도가 공지의 표준액 또는 피측정검체의 일정량을 첨가하여 충분히 교반시킨 후, 적분구식탁도계를 사용하여 탁도의 경시변화에 의한 적분구식탁도변화량(△IST값)이나, 흡광도 측정계를 사용하여 흡광도의 경시변화량(△mAbs. 값)을 측정함으로써 행해질 수 있다.
본 발명의 C-반응성 단백질 측정용 시약(A)는 포스포릴콜린기와 양이온성 기를 갖는 화합물 및 C-반응성 단백질에 대한 항체를 함유하는 것을 특징으로 하고, 본 발명의 C-반응성 단백질 측정용 시약(B)는 포스포릴콜린기를 갖는 계면활성제, 양이온성 기를 갖는 계면활성제 및 C-반응성 단백질에 대한 항체를 함유하는 것을 특징으로 하지만, 이들 화합물 및 항체 이외에, 각종 계면활성제, 무기염류, 완충액 등을 함유할 수도 있다. 계면활성제로는 예를 들어, 트리톤X-100, 트윈-20 등, 무기염으로는 예를 들어 염화칼슘 등의 칼슘 등을, 완충액으로는 글리신완충액, 트리스완충액, 인산완충액, HEPES완충액 등을 각, 예시할 수 있다. C-반응성 단백질 측정시약중 계면활성제, 무기염류 및 완충액의 함량은 반응액중의 농도가 각각 0.001∼0.1중량%, 특히 1∼7mmol/L, 0.1∼10mmol/L 및 10∼200mmol/L가 되도록 하는 것이 바람직하다.
이상과 같이, 본 발명의 C-반응성 단백질의 측정방법이나 C-반응성 단백질측정용 시약을 사용하는 C-반응성 단백질의 측정은, C-반응성 단백질에 대한 항체를 사용하여 C-반응성 단백질을 측정하는 것이지만, 이들 C-반응성 단백질의 측정방법이나 C-반응성 단백질 측정용 시약에서의 항체를 항원으로 치환, 즉 C-반응성 단백질에 대한 항체를 C-반응성 단백질 항원으로 치환함에 따라 C-반응성 단백질에 대한 항체의 측정방법이나 C-반응성 단백질에 대한 항체측정용 시약을 제공할 수 있다. 상기 C-반응성 단백질 항원으로는 C-반응성 단백질 자체 또는 C-반응성 단백질의 포스포릴콜린 결합영역과 항C-반응성 단백질의 에피톱부분을 포함하는 헵티드를 들 수 있다. 또한 이러한 C-반응성 단백질항원은 C-반응성 단백질에 대한 항체인 경우와 마찬가지로 입경이 0.1∼1㎛정도의 폴리스티렌 라텍스 등의 담체에 담지하여 사용하는 것이 바람직하다.
그리고 (a)포스포릴콜린기와 양이온성 기를 갖는 화합물 및 C-반응성 단백질 항원을 사용한 C-반응성 단백질에 대한 항체의 측정방법; 포스포릴콜린기와 양이온성 기를 갖는 화합물 및 C-반응성 단백질 항원을 함유하는 C-반응성 단백질에 대한 항체측정용 시약; 또는 (b)포스포릴콜린기를 갖는 계면활성제, 양이온성 기를 갖는 계면활성제 및 C-반응성 단백질 항원을 사용하는 C-반응성 단백질에 대한 항체의 측정방법; 포스포릴콜린기를 갖는 계면활성제, 양이온성 기를 갖는 계면활성제 및 C-반응성 단백질 항원을 함유하는 C-반응성 단백질에 대한 항체 측정용 시약에 있어서도 본 발명의 C-반응성 단백질의 측정방법이나 C-반응성 단백질 측정용 시약에서와 마찬가지로 C-반응성 단백질에 대한 항체측정에서의 프로존현상을 피하고, 측정범위를 확대할 수 있으며, 검체중의 고농도 C-반응성 단백질에 대한 항체가 포함되는 경우에도 검체를 희석하지 않고 원액 그대로 정량할 수 있다.
이하, 본 발명의 실시예, 비교예 및 참고예에 의해 보다 상세히 설명하지만, 본 발명의 기술적범위는 이러한 실시예에 의해 어떠한 제한도 받지 않는다.
(실시예 A-1)
하기의 C-반응성 단백질 측정시약을 조제하였다.
제 1시약
글리신완충액, pH8.6 (관동화학사 제조) 100mmol/L
염화칼슘(관동화학사 제조) 5mmol/L
참고예 4(후술함)에서 제조한 폴리마 20mg/L
제 2시약
항C-반응성 단백질 항체담지 라텍스(참고예 1(후술함)에서 조제) 1g/L
(비교예 A-1)
하기의 C-반응성 단백질 측정시약을 조제하였다.
제 1시약
글리신완충액, pH8.6 (관동화학사 제조) 100mmol/L
염화칼슘(관동화학사 제조) 5mmol/L
제 2시약
항C-반응성 단백질 항체담지 라텍스(참고예 1에서 조제) 1g/L
(비교예 A-2)
하기의 C-반응성 단백질 측정시약을 조제하였다.
제 1시약
글리신완충액, pH8.6 (관동화학사 제조) 100mmol/L
염화칼슘(관동화학사 제조) 5mmol/L
참고예 6(후술함)에서 제조한 폴리마 20mg/L
제 2시약
항C-반응성 단백질 항체담지 라텍스(참고예 1에서 조제) 1g/L
(비교예 A-3)
제 1시약
글리신완충액, pH8.6 (관동화학사 제조) 100mmol/L
염화칼슘(관동화학사 제조) 5mmol/L
참고예 7(후술함)에서 제조한 폴리마 20mg/L
제 2시약
항C-반응성 단백질 항체담지 라텍스(참고예 1에서 조제) 1g/L
(비교예 A-4)
하기의 C-반응성 단백질 측정시약을 조제하였다.
제 1시약
글리신완충액, pH8.6 (관동화학사 제조) 100mmol/L
염화칼슘(관동화학사 제조) 5mmol/L
참고예 4에서 제조한 폴리마 20mg/L
제 2시약
항C-반응성 단백질 항체담지 라텍스(참고예 2(후술함)에서 조제) 1g/L
(실시예 A-2)
하기의 C-반응성 단백질 측정시약을 조제하였다.
제 1시약
글리신완충액, pH8.6 (관동화학사 제조) 100mmol/L
염화칼슘(관동화학사 제조) 5mmol/L
참고예 5(후술함)에서 제조한 폴리마 30mg/L
제 2시약
항C-반응성 단백질 항체담지 라텍스(참고예 3(후술함)에서 제조) 1g/L
(비교예 A-5)
하기의 C-반응성 단백질 측정시약을 조제하였다.
제 1시약
글리신완충액, pH8.6 (관동화학사 제조) 100mmol/L
염화칼슘(관동화학사제조) 5mmol/L
제 2시약
항C-반응성 단백질 항체담지 라텍스(참고예 3에서 조제) 1g/L
(실시예 A-3)
하기의 C-반응성 단백질 측정시약을 조제하였다.
제 1시약
글리신완충액, pH8.6 (관동화학사 제조) 100mmol/L
염화칼슘(관동화학사 제조) 5mmol/L
참고예 4에서 제조한 폴리마 15mg/L
제 2시약
항C-반응성 단백질 항체감작 라텍스(참고예 3에서 조제) 1g/L
(실시예 A-4)
실시예 A-1과 비교예 A-1∼A-3에서 제조한 C-반응성 단백질 측정용 라텍스 시약을 사용하여 각 농도의 C-반응성 단백질을 포함하는 표준혈청(0∼100mg/dL)을 적분구탁도방식의 전용기 EL-1060(교와메딕스사 제조)로 측정하였다. 37℃에서 각각 실시예 1과 비교예 A-1∼A-3의 제 1시약 148㎕, 제 2시약 150㎕ 및 C-반응성 단백질 표준형청 2㎕를 혼합한 후, 72초와 612초 사이(23∼53 포인트)의 적분구탁변화량을 측정하였다. 결과를 도 1에 나타낸다. 또한 도 1에서, 가로축의 CRP는 C-반응성 단백질의 농도를 나타내고, 세로축의 △IST는 적분구식탁도의 변화량을 나타낸다.
도 1에서도 알 수 있는 바와 같이, 비교예 A-1의 시약을 사용해서 측정한 경우(-◆-플로트), 비교예 A-2의 시약을 사용하여 측정한 경우(-■-플로트) 및 비교예 A-3의 시약을 사용해서 측정한 경우(-▲-)는 C-반응성 단백질이 10mg/dL 이상의 농도에서는 프로존이 되고, 프로존 회피의 효과는 얻을 수 없었다. 이에 비해, 실시예 A-1의 시약을 사용하여 측정한 경우(-●-), 적어도 100mg/dL까지는 프로존을 피할 수 있었다. 또한 비교예 A-2의 제 1시약 중의 폴리마를 10mg/L∼1g/L의 특정농도로 한 시약, 및 비교예 A-3의 제 1시약 중의 폴리마를 10mg/L∼1g/L의 특정 농도로 한 시약을 사용한 경우에서도 프로존을 피할 수 없었다. 또 실시예 A-1의 제 1시약 중의 폴리마를 5mg/L의 농도로 한 시약도 프로존을 피할 수 있는 것을 확인하였다.
(실시예 A-5)
실시예 A-1, 비교예 A-1 및 비교예 A-4에서 제조한 C-반응성 단백질 측정용 라텍스시약을 사용하여 각 농도의 C-반응성 단백질을 포함한 표준혈청(0∼100mg/dL)을 적분구탁도방식의 전용기 EL-1060으로 측정하였다. 37℃에서 각각 실시예 A-1, 비교예 A-1 및 비교예 A-4의 제 1시약 148㎕, 제 2시약 150㎕ 및 C-반응성 단백질 표준혈청 2㎕를 혼합한 후, 72초와 216초 사이(23∼31 포인트)의 적분구탁도 변화량을 측정하였다. 결과를 도 2에 나타낸다. 또한 도 2에서, 가로축 CRP는 C-반응성 단백질의 농도를 나타내며, 세로축의 △IST는 적분구탁도의 변화량을 나타낸다.
도 2에서도 알 수 있는 바와 같이, 비교예 A-1의 시약으로 측정한 경우(-●-플로트), C-반응성 단백질 농도 10mg/dL 이상에서는 프로존이 되어 △IST 값은 감소하였다. 또한 항체를 담지하지 않은 라텍스만을 사용하는 비교예 A-4의 시약으로 측정한 경우(-■-플로트), △IST값의 증가는 확인할 수 없었다. 한편, 실시예 A-1의 시약으로 측정한 경우(-▲-플로트), 적어도 C-반응성 단백질 농도 100mg/dL까지는 프로존현상이 나타나지 않았으며, △IST값은 농도에 따라 증가하여 측정범위가 확대되었다. 이들 결과로부터, 본 발명의 측정방법에서는 포스포릴콜린기와 양이온성 기를 갖는 화합물과, C-반응성 단백질과의 반응에 따른 탁도상승 및 C-반응성단백질 항체와 C-반응성 단백질과의 반응에 따른 탁도상승의 상가효과에 의해 프로존현상이 회피된 것은 아니고, C-반응성 단백질과의 반응에서 포스포릴콜린기와 양이온성 기를 갖는 화합물 및 C-반응성 단백질 항체의 상승효과에 의해 프로존현상이 회피된 것으로 생각된다.
(실시예 A-6)
실시예 A-2 및 비교예 A-5에서 조제한 C-반응성 단백질 측정용 라텍스시약을 사용하여 각 농도의 C-반응성 단백질을 포함하는 표준혈청(0∼100mg/dL)을 적분구탁도 방식의 전용기 EL-1200(교와 메딕스사제조)로 측정하였다. 37℃에서 각각 실시예 2 및 비교예 5의 제 1시약 248㎕, 제 2시약 250㎕ 및 C-반응성 단백질 표준혈청2㎕을 혼합한 후, 108초와 270초 사이(6∼15 포인트)의 적분구탁도 변화량을 측정하였다. 결과를 도 3에 나타낸다. 또한 도 3에서, 가로축 CRP는 C-반응성 단백질의 농도를 나타내며, 세로축의 △IST는 적분구식탁도의 변화량을 나타낸다.
도 3에서도 알 수 있는 바와 같이, 비교예 A-5의 시약으로 측정한 경우(-▲-), C-반응성 단백질 농도가 20mg/dL 이상에서는 프로존 현상에의해 △IST 값은 감소하였다. 이에 비해, 실시예 A-2의 시약으로 측정한 경우(-●-), 프로존이 100mg/dL까지는 회피되어 정량성도 크게 향상되었다. 또한 실시예 A-2의 제 1시약 폴리마 농도를 10mg/dL 농도로 한 시약을 사용해서 동일한 효과가 확인되었다.
(실시예 A-7)
실시예 A-3 및 비교예 A-5로 제조한 C-반응성 단백질 측정용 라텍스시약을 사용하여 각 농도의 C-반응성 단백질을 포함하는 표준혈청(0∼100mg/dL )을 흡광도측정방식의 자동분석장치 7070(일립제작소 제조)로 측정하였다. 37℃에서, 각각 실시예 A-3 및 비교예 A-5의 제 1시약 225㎕, 제 2시약 75㎕ 및 C-반응성 단백질 표준혈청 3㎕을 혼합한 후, 19포인트와 27포인트 사이의 흡광도 변화량(파장 570nm)을 측정하였다. 결과를 도 4에 나타낸다. 또한 도 4에서, 가로축의 CRP는 C-반응성 단백질의 농도를 나타내고, 세로축의 △mAbs.는 흡광도의 변화량을 나타낸다. 도 4에서도 알 수 있는 바와 같이, 비교예 A-5의 시약으로 측정한 경우(-▲-), C-반응성 단백질이 10mg/dL 이상의 농도에서는 프로존이 되어 측정값은 감소하였다. 이에 비해, 실시예 A-3의 시약으로 측정한 경우(-●-), 프로존이 적어도 100mg/dL까지는 회피되어 정량성도 크게 향상 되었다.
(실시예 A-8)
하기의 C-반응성 단백질 측정시약을 조제하였다.
제 1시약
글리신 완충액, pH8.6 (관동화학사 제조) 100mmol/L
염화칼슘(관동화학사 제조) 5mmol/L
참고예 5에서 제조한 폴리머 20mg/L
제 2시약
항 C-반응성 단백질 항체담지 라텍스(참고예 1에서 조제) 1g/L
(실시예 A-9)
하기의 C-반응성 단백질 측정시약을 조제하였다.
제 1시약
글리신 완충액, pH8.6 (관동화학사 제조) 100mmol/L
염화칼슘(관동화학사 제조) 5mmol/L
참고예 8(후술함)에서 조제한 분자량 10,000 이하의 성분 20mg/L
제 2시약
항 C-반응성 단백질 항체담지 라텍스(참고예 1에서 조제) 1g/L
(실시예 A-10)
실시예 A-10 및 비교예 A-1에서 조제한 C-반응성 단백질 측정용 라텍스시약을 사용하여 각 농도의 C-반응성 단백질을 포함하는 표준혈청(0∼100mg/dL)을 흡광도 측정방식의 자동분석장치 7070(일립제작소 제조)로 측정하였다. 37℃에서 각각 실시예 A-9 및 비교예 A-1의 제 1시약 225㎕, 제 2시약 75㎕ 및 C-반응성 단백질 표준혈청 3㎕을 혼합한 후, 19포인트와 27포인트의 사이의 흡광도 변화량(파장 570nm)을 측정하였다. 결과를 도 5에 나타낸다. 또한 도 5에서, 가로축의 CRP는 C-반응성 단백질의 농도를 나타내고, 세로축의 △mAbs.는 흡광도 변화량을 나타낸다. 도 5에도 알 수 있는 바와 같이, 비교예A-1의 시약으로 측정한 경우(-▲-), C-반응성 단백질이 10mg/dL 이상의 농도에서는 프로존이 되어 측정값은 감소하였다. 이에 비해, 실시예 A-9의 시약으로 측정한 경우(-●-), 프로존은 적어도 100mg/dL까지는 회피되어 정량성도 크게 향상 되었다.
(실시예 B-1)
하기의 C-반응성 단백질 측정시약을 조제하였다.
제 1시약
글리신 완충액(관동화학사 제조) 100mmol/L
염화칼슘(관동화학사 제조) 5mmol/L
헥사데실트리메틸암모늄클로라이드(양이온PB-40, 일본유지사 제조) 0.5g/L
리조레시틴(시그마사 제조) 0.1g/L
제 2시약
항 C-반응성 단백질 항체담지 라텍스(참고예 1에서 조제) 1g/L
(실시예 B-2)
하기의 C-반응성 단백질 측정시약을 조제하였다.
제 1시약
글리신 완충액(관동화학사 제조) 100mmol/L
염화칼슘(관동화학사 제조) 5mmol/L
헥사데실트리메틸암모늄클로라이드(양이온PB-40, 일본유지사 제조) 0.5g/L
리조레시틴(시그마사 제조) 0.2g/L
제 2시약
항 C-반응성 단백질 항체담지 라텍스(참고예 1에서 조제) 1g/L
(비교예 B-1)
하기의 C-반응성 단백질 측정시약을 조제하였다.
제 1시약
글리신 완충액(관동화학사 제조) 100mmol/L
염화칼슘(관동화학사 제조) 5mmol/L
제 2시약
항 C-반응성 단백질 항체담지 라텍스(참고예 1에서 조제) 1g/L
(비교예 B-2)
글리신 완충액(관동화학사 제조) 100mmol/L
염화칼슘(관동화학사 제조) 5mmol/L
헥사데실트리메틸암모늄클로라이드(양이온PB-40, 일본유지사 제조) 0.5g/L
제 2시약
항 C-반응성 단백질 항체담지 라텍스(참고예 1에서 조제) 1g/L
(비교예 B-3)
제 1시약
글리신 완충액(관동화학사 제조) 100mmol/L
염화칼슘(관동화학사 제조) 5mmol/L
리조레시틴(시그마사 제조) 0.2g/L
제 2시약
항 C-반응성 단백질 항체감작 라텍스(참고예 1에서 조제) 1g/L
(비교예 B-4)
하기의 C-반응성 단백질 측정시약을 조제하였다.
제 1시약
글리신 완충액(관동화학사 제조) 100mmol/L
염화칼슘(관동화학사 제조) 5mmol/L
헥사데실트리메틸암모늄클로라이드(양이온PB-40, 일본유지사 제조) 0.5g/L
리조레시틴(시그마사 제조) 0.1g/L
제 2시약
항 C-반응성 단백질 항체담지 라텍스(참고예 2에서 조제) 1g/L
(실시예 B-3)
하기의 C-반응성 단백질 측정시약을 조제하였다.
제 1시약
글리신 완충액(관동화학사 제조) 100mmol/L
염화칼슘(관동화학사 제조) 5mmol/L
헥사데실트리메틸암모늄클로라이드(양이온PB-40, 일본유지사 제조) 0.5g/L
리조레시틴(시그마사 제조) 0.2g/L
제 2시약
항 C-반응성 단백질 항체담지 라텍스(참고예 3에서 조제) 1g/L
(비교예 B-5)
하기의 C-반응성 단백질 측정시약을 조제하였다.
제 1시약
글리신 완충액(관동화학사 제조) 100mmol/L
염화칼슘(관동화학사 제조) 5mmol/L
제 2시약
항 C-반응성 단백질 항체감작 라텍스(참고예 3로 조제) 1g/L
(실시예 B-4)
하기의 C-반응성 단백질 측정시약을 조제하였다.
제 1시약
글리신 완충액(관동화학사 제조) 100mmol/L
염화칼슘(관동화학사 제조) 5mmol/L
헥사데실트리메틸암모늄클로라이드(양이온PB-40, 일본유지사 제조) 0.5g/L
포스포릴콜린오레일옥시에틸에스테르(시그마사 제조) 0.3g/L
제 2시약
항 C-반응성 단백질 항체담지 라텍스(참고예 1에서 조제) 1g/L
(실시예 B-5)
하기의 C-반응성 단백질 측정시약을 조제하였다.
제 1시약
글리신 완충액(관동화학사 제조) 100mmol/L
염화칼슘(관동화학사 제조) 5mmol/L
헥사데실트리메틸암모늄클로라이드(양이온PB-40, 일본유지사 제조) 0.5g/L
스핀고실포스포릴콜린(시그마사 조제) 0.3g/L
제 2시약
항 C-반응성 단백질 항체담지 라텍스(참고예 1에서 조제) 1g/L
(실시예 B-6)
실시예 B-1∼B-2 및 비교예 B-1∼B-4에서 조제한 C-반응성 단백질 측정용 시약을 사용하여 각 농도의 C-반응성 단백질을 포함하는 혈청용액(C-반응성 단백질 농도: 0∼100mg/dL) 중의 C-반응성 단백질 농도를 측정하였다. 37℃에서, 제 1시약 147㎕, 제 2시약 150㎕ 및 C-반응성 단백질 표준혈청 3㎕을 혼합한 후, 적분구탁도 측정기 EL-1060(교와메딕스사 제조)로 72초와 216초 사이(23∼31포인트)의 적분구탁도 변화량을 측정하였다.
결과를 도 6에 나타낸다. 또한 도 6중, 가로축의 CRP는 C-반응성 단백질의 농도를 나타내며, 가로축의 △IST는 적분구식탁도의 변화량을 나타낸다. 비교예 B-1의 시약을 사용하여 측정한 경우(-X-), C-반응성 단백질이 10mg/dL 이상의 농도에서는 프로존이 되었다. 또한 비교예 B-2의 시약을 사용하여 측정한 경우(-■-), 프로존이 회피되는 경향을 발견할 수 있었지만, 측정범위의 개선은 확인할 수 없었다. 비교예 B-3의 시약을 사용하여 측정한 경우(-▲-), 프로존회피 효과는 얻을 없었다. 비교예 B-4의 시약을 사용하여 측정한 경우(-○-), 전혀 검출되지 않았다. 이에 비해, 실시예 B-1의 시약을 사용한 경우(-◆-), 측정범위가 크게 개선되었다. 실시예 B-2의 시약을 사용하여 측정한 경우(-●-), 적어도 프로존이 100mg/dL까지는 프로존이 회피되는 동시에 정량성이 크게 향상되었다.
(실시예 B-7)
실시예 B-3 및 비교예 B-5에서 조제한 C-반응성 단백질 측정시약을 사용하여 각 농도 C-반응성 단백질을 포함하는 혈청용액(C-반응성 단백질농도: 0∼100mg/dL) 중의 C-반응성 단백질 농도를 측정하였다. 37℃에서, 제 1시약 225㎕, 제 2시약 75㎕ 및 C-반응성 단백질 표준혈청 3㎕을 혼합한 후, 흡광도 측정방식의 자동분석장치 7070(일립자 제조)로 19포인트와 27포인트 사이의 흡광도 변화량(파장 570nm)을 측정하였다.
결과를 도 7에 나타낸다. 또한 도 7의 가로축의 CRP는 C-반응성 단백질의 농도를 나타내며, 세로축의 △mAbs.(570nm)은 570nm의 흡광도의 변화량을 나타낸다. 비교예 B-5의 시약을 사용하여 측정한 경우(-▲-), C-반응성 단백질이 5mg/dL 이상의 농도에서는 프로존이 되어 흡광도 변화량이 저하되었다. 이에 비해, 실시예 B-3의 시약을 사용하여 측정한 경우(-●-), 적어도 100mg/dL 까지는 흡광도 변화량이 저하되지 않고, 프로존이 회피되어 정량성도 크게 향상되었다.
(실시예 B-8)
실시예 B-2, 실시예 B-4, 실시예 B-5 및 비교예 B-1에서 조제한 C-반응성 단백질 측정시약을 사용하여 각 농도 C-반응성 단백질을 포함하는 혈청용액(C-반응성 단백질농도: 0∼100mg/dL) 중의 C-반응성 단백질농도를 측정하였다. 37℃에서, 제 1시약 225㎕, 제 2시약 75㎕ 및 C-반응성 단백질 표준혈청 3㎕을 혼합한 후, 흡광도 측정방식의 자동분석장치 7070(일립사 제조)로 19포인트와 27포인트 사이의 흡광도 변화량(파장 570nm)을 측정하였다.
결과를 도 8에 나타낸다. 또한 도 8의 가로축의 CRP는 C-반응성 단백질의 농도를 나타내며, 세로축의 △mAbs는 흡광도의 변화량을 나타낸다. 비교예 B-1의 시약을 사용하여 측정한 경우(-◆-), C-반응성 단백질이 10mg/dL 이상의 농도에서는 프로존이 되어 흡광도 변화량이 저하되었다. 이에 비해, 실시예 B-2 시약을 사용하여 측정한 경우(-■-), 실시예 B-4의 시약을 사용하여 측정한 경우(-▲-) 및 실시예 B-5의 시약을 사용하여 측정한 경우(-X-)에서는 적어도 100mg/dL 까지는 흡광도 변화량이 저하되지 않고, 프로존이 회피되어 적량성도 크게 향상되었다.
(참고예 1: CRP측정용 라텍스시약의 조제)
평균입경 130nm의 폴리스티렌 라텍스용액(교와메틱스사 제조, 100mg/mL) 0.8mL와 염소 항C-반응성 단백질 폴리클로날 항체용액(오리엔탈효모사 제조, 100mg/mL, 50mM 인산-NaCl 150mM pH7.2) 1mL를 혼합하여, 37℃에서 30분 동안 교반하였다. 이어서, 소혈청 알부민(BSA, 시그마사 제조)용액 1mL(20mg/dL, 50mM 인산-NaCl 150mM pH7.2)을 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 교반하여 블로킹처리를 실시하였다. 그 후, 원심분리(50,000회전, 30분간)에 의해 라텍스를 펠리트상으로 침강시켜 상청을 폐기한 후, 3mg/mL의 BSA를 포함하는 50mM 이미다졸-염산용액(pH 7.8) 10mL를 첨가하여 잘 교반한 후, 초음파 파쇄기로 분산처리를 하였다. 상기의 조작을 3회 반복해서 실시함에 따라 과잉 존재하는 항체용액을 제거하였다. 최종적으로는 라텍스농도를 1mg/dL로 조정하여 C-반응성 단백질용 라텍스시약으로 하였다. 이 시약을 4℃에서 보존하였다.
(참고예 2)
염소 항C-반응성 단백질 폴리클로날 항체를 사용하지 않는 것 외에는 참고예 1과 동일한 방법으로 항 C-반응성 단백질 항체를 포함하지 않는 대조시약을 조제하였다.
(참고예 3)
평균입경 220nm의 폴리스티렌 라텍스용액(교와 메틱스사 제조, 100mg/mL),0.8mL을 사용한 것 외에는 참고예 1과 동일한 방법으로 C-반응성 단백질 측정용 라텍스시약을 제조하였다. 최후농도도 참고예 1과 동일하게 1mg/mL로 조정하여 4℃에서 보존하였다.
(참고예 4)
37.2g의 2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린(일본유지사 제조), 12.8g의 2-히드록시3-메타크릴로일옥시프로필트리메틸암모늄클로라이드(일본유지사 제조), 0.3g의 중합개시제 2,2'-아조비스(2-메틸프로피오노아미딘)이염산염(화광순약 공업사 제조, "V-50"), 중합매로서의 물 150g을 사용하여 4시간, 70℃에서 가온함으로써 중합반응을 실시하였다. 중합반응 완료후, 반응액을 아세톤 1.5L에 천천히 적하하여 중합물을 침전시켰다. 침전물을 여과 건조한 후, 5.0중량%이 되도록 증류수에 용해시켰다. 분자량은 중합체의 인산 완충용액을 겔투과크로마토그라피(GPC)를 사용하여 분석한 결과, 폴리에틸글리콜로 환산하여 중량평균 분자량이 37,000이었다. 본 화합물은 포스포릴콜린기와 양이온성 기를 7:3의 몰비로 함유한다.
(참고예 5)
45.9g의 2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린(일본유지사 제조), 4.1g의 2-히드록시3-메타크릴로일옥시프로필트리메틸암모늄클로라이드(일본유지사 제조), 0.3g의 중합개시제 2,2'-아조비스(2-메틸프로피오노아미딘)이염산염(화광순약 공업사 제조, "V-50"), 중합매로서 물 150g을 사용하여 4시간, 70℃에서 가온함으로써 중합반응을 실시하였다. 중합반응 완료후, 반응액을 아세톤 1.5L에 천천히 적하하여 중합물을 침점시켰다. 침전물을 여별 건조한 후, 5.0중량%이 되도록 증류수에용해시켰다. 분자량은 중합체의 인산 완충용액을 겔투과크로마토그라피(GPC)를 사용하여 분석한 결과, 폴리에틸글리콜로 환산하여 중량평균 분자량이 33,000이었다. 본 화합물은 포스포릴콜린기와 양이온성 기를 9:1의 몰비로 함유한다.
(참고예 6)
50.0g의 2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린(일본유지사 제조), 0.24g의 중합개시제 아조비스이소부틸니트릴(화광순약 공업사 제조, "AIBN"), 중합매로서 에탄올 100g을 사용하여 4시간, 70℃에서 가온함으로써 중합반응을 실시하였다. 중합반응 완료후, 반응액을 아세톤 1.5L에 천천히 적하하여 중합물을 침전시켰다. 침전물을 여별 건조한 후, 5.0중량%가 되도록 증류수에 용해시켰다. 분자량은 중합체의 인산완충용액을 겔투과크로마토그라피(GPC)를 사용하여 분석한 결과, 폴리에틸글리콜로 환산하여 중량평균 분자량이 108,000이었다.
(참고예 7)
35.7g의 2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린(일본유지사 제조), 4.3g의 부틸메타크릴레이트(화광순약 공업사 제조), 0.82g의 중합개시제 아조비스이소부틸니트릴(화광순약 공업사 제조, "AIBN"), 중합매로서 에탄올 160g을 사용하여 4시간, 70℃에서 가온함으로써 중합반응을 실시하였다. 중합반응 완료후, 반응액을 아세톤 1.5L에 천천히 적하하여 중합물을 침전시켰다. 침전물을 여별 건조한 후, 5.0중량%가 되도록 증류수에 용해시켰다. 분자량은 중합체의 인산완충용액을 겔투과크로마토그라피(GPC)를 사용하여 분석한 결과, 폴리에틸글리콜로 환산하여 중량평균 분자량이 87,000이었다. 본 화합물은 포스포릴콜린기와 양이온성 기를 8:2의 몰비로 함유한다.
(참고예 8)
74.3g-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린(일본유지사 제조), 25.7g의 2-히드록시3-메타크릴로일옥시프로필트리메틸암모늄클로라이드(일본유지사 제조), 0.45g의 중합개시제 아조비스(2-메틸프로피오노이미딘)이염산염(화광순약 공업사 제조, "V-50"), 중합매로서 물 900g을 사용하여 4시간, 60℃에서 가온함으로써 중합반응을 실시하였다. 중합반응 완료후, 반응액을 아세톤 1.5L에 천천히 적하하여 중합물을 침전시켰다. 침전물을 여별 건조한 후, 5.0중량%가 되도록 증류수에 용해시켰다. 분자량은 중합체의 인산완충용액을 겔투과크로마토그라피(GPC)를 사용하여 분석한 결과, 폴리에틸글리콜로 환산하여 중량평균 분자량이 13,000이였다. 본 발명은 포스포릴콜린기와 양이온성 기를 7:3의 몰비로 함유한다. 이어서, 원심여과튜브(한외분자량 10,000, 밀리포아사 제조)를 사용하여 원심분리(3,000 x g, 30분)를 실시하여, 여액으로서 얻어진 분자량 10,000 이하의 성분을 회수하였다.
본 발명의 C-반응성 단백질용 시약을 사용하면, C-반응성 단백질 측정에서의 프로존현상이 회피되고 측정범위가 확대될 수 있다. 이에 따라, 검체 중에 고농도의 C-반응성 단백질이 포함된 경우라도 검체를 희석하지 않고 원액 그대로 정량할 수 있게 된다.

Claims (24)

  1. 포스포릴콜린기와 포스포릴콜린기를 제외한 양이온성 기를 갖는 화합물 및 C-반응성 단백질에 대한 항체를 사용하거나, 또는 포스포릴콜린기를 갖는 계면활성제, 포스포릴콜린기를 제외한 양이온성 기를 갖는 계면활성제 및 C-반응성 단백질에 대한 항체를 사용하여 C-반응성 단백질을 측정하는 것을 특징으로 하는 C-반응성 단백질의 측정방법.
  2. 제 1항에 있어서, 포스포릴콜린기와 포스포릴콜린기를 제외한 양이온성 기를 갖는 화합물에서의 양이온성 기는, 일반식(Ⅰ)
    (일반식 Ⅰ)
    [식(Ⅰ) 중, R1, R2및 R3는 동일하거나 다르며, 수소, 치환 혹은 비치환 알킬, 또는 치환 혹은 비치환 알케닐을 나타내고, X1 -는 무기성 음이온 또는 유기성 음이온을 나타낸다.]로 표시되는 기인 것을 특징으로 하는 C-반응성 단백질의 측정방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 포스포릴콜린기와 포스포릴콜린기를 제외한 양이온성 기를 갖는 화합물은 포스포릴콜린기를 갖는 단량체와 양이온성 기를 갖는 단량체를 결합시킨 공중합체인 것을 특징으로 하는 C-반응성 단백질의 측정방법.
  4. 제 3항에 있어서, 포스포릴콜린기를 갖는 단량체와 양이온성 기를 갖는 단량체는 각각 포스포릴콜린기와 비닐기를 갖는 단량체와, 양이온성기와 비닐기를 갖는 단량체인 것을 특징으로 하는 C-반응성 단백질의 측정방법.
  5. 제 4항에 있어서, 포스포릴콜린기와 비닐기를 갖는 단량체 및 양이온성 기와 비닐기를 갖는 단량체는 각각 2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린과 2-히드록시-3-메타크릴로일옥시프로필트리메틸암모늄클로라이드인 것을 특징으로 하는 C-반응성 단백질의 측정방법.
  6. 제 1항에 있어서, 포스포릴콜린기를 갖는 계면활성제는, 일반식(Ⅱ)
    (일반식 Ⅱ)
    [식(Ⅱ) 중, Y1는 소수성기를 나타낸다.]로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 C-반응성 단백질의 측정방법.
  7. 제 6항에 있어서, 식(Ⅱ)로 표시되는 화합물은 리조포스파티딜콜린카프로일, 리조포스파티딜콜린미리스토일, 리조포스파티딜콜린팔미트일, 리조포스파티딜콜린스테아로일, 콩유래의 리조포스파티딜콜린, 포스파티딜콜린디부티로일, 포스파티딜콜린디카프로일, 포스포릴콜린오레일옥시에틸에스테르, 스핀고실포스포릴콜린으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 화합물인 것을 특징으로 하는 C-반응성 단백질의 측정방법.
  8. 제 1항, 제 6항 및 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 양이온성 기를 갖는 계면활성제는 암모늄염의 계면활성제인 것을 특징으로 하는 C-반응성 단백질의 측정방법.
  9. 제 8항에 있어서, 암모늄염의 계면활성제는, 일반식(Ⅲ)
    (일반식 Ⅲ)
    [식(Ⅲ)중, Y2는 소수성기를 나타내고, R1, R2, R3는 동일하거나 다르며, 수소, 치환 혹은 비치환 알킬, 또는 치환 혹은 비치환 알케닐을 나타내며, X2 -는 무기성 음이온 또는 유기성 음이온을 나타낸다.]로 표시되는 화합물인 C-반응성 단백질의 측정방법.
  10. 제 9항에 있어서, 식(Ⅲ)으로 표시되는 화합물은 옥타데실트리메틸암모늄클로라이드, 헥사데실트리메틸암모늄클로라이드, 테트라데실트리메틸암모늄클로라이드, 도데실트리메틸암모늄클로라이드로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 화합물인 것을 특징으로 하는 C-반응성 단백질의 측정방법.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, C-반응성 단백질에 대한 항체는 수불용성 담체에 담지되어 있는 것을 특징으로 하는 C-반응성 단백질의 측정방법.
  12. 제 11항에 있어서, 불용성담체는 폴리스티렌계 라텍스인 것을 특징으로 하는 C-반응성 단백질의 측정방법.
  13. 포스포릴콜린기와 포스포릴콜린기를 제외한 양이온성 기를 갖는 화합물 및 C-반응성 단백질에 대한 항체를 함유하거나, 또는 포스포릴콜린기를 갖는 계면활성제, 포스포릴콜린기를 제외한 양이온성 기를 갖는 계면활성제 및 C-반응성 단백질에 대한 항체를 함유하는 것을 특징으로 하는 C-반응성 단백질 측정용 시약.
  14. 제 13항에 있어서, 포스포릴콜린기와 포스포릴콜린기를 제외한 양이온성기를 갖는 화합물에서의 양이온성기는, 일반식(Ⅰ)
    (일반식 Ⅰ)
    [식(Ⅰ) 중, R1, R2및 R3는 동일하거나 다르며, 수소, 치환 혹은 비치환 알킬, 또는 치환 혹은 비치환 알케닐을 나타내며, X1 -은 무기성 음이온 또는 유기성 음이온을 나타낸다.]로 표시되는 기인 것을 특징으로 하는 C-반응성 단백질 측정용 시약.
  15. 제 13항 또는 제 14항에 있어서, 포스포릴콜린기와 포스포릴콜린기를 제외한 양이온성 기를 갖는 화합물은 포스포릴콜린기를 갖는 단량체와 양이온성 기를 갖는 단량체를 결합시킨 공중합체인 것을 특징으로 하는 C-반응성 단백질 측정용 시약.
  16. 제 15항에 있어서, 포스포릴콜린기를 갖는 단량체와 양이온성 기를 갖는 단량체는 각각 포스포릴콜린기와 비닐기를 갖는 단량체와, 양이온성 기와 비닐기를갖는 단량체인 것을 특징으로 하는 C-반응성 단백질 측정용 시약.
  17. 제 16항에 있어서, 포스포릴콜린기와 비닐기를 갖는 단량체 및 양이온성 기와 비닐기를 갖는 단량체는 각각 2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린과, 2-히드록시-3-메타크릴로일옥시프로필트리메틸암모늄클로라이드인 것을 특징으로 하는 C-반응성 단백질 측정용 시약.
  18. 제 13항에 있어서, 포스포릴콜린기를 갖는 계면활성제는, 일반식(Ⅱ)
    (일반식 Ⅱ)
    [식(Ⅱ) 중, Y2는 소수성기를 나타낸다.]로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 C-반응성 단백질 측정용 시약.
  19. 제 18항에 있어서, 식(Ⅱ)로 표시되는 화합물은 리조포스파티딜콜린카프로일, 리조포스파티딜콜린미리스토일, 리조포스파티딜콜린팔미트일, 리조포스파티딜콜린스테아로일, 콩유래의 리조스파티딜콜린, 포스파티딜콜린디부티로일, 포스파티딜콜린디카프로일, 포스포릴콜린오레일옥시에틸에스테르, 스핀고실포스포릴콜린으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 화합물인 것을 특징으로 C-반응성 단백질 측정용 시약.
  20. 제 13항, 제 18항 및 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 양이온성 기를 갖는 계면활성제는 암모늄염의 계면활성제인 것을 특징으로 하는 C-반응성 단백질 측정용 시약.
  21. 제 20항에 있어서, 암모늄염의 계면활성제는, 일반식(Ⅲ)
    (일반식 Ⅲ)
    [식(Ⅲ)중 Y2는 소수성기를 나타태며, R1, R2, R3는 동일하거나 다르며, 수소 치환 혹은 비치환 알킬, 또는 치환 혹은 비치환 알케닐을 나타내며, X2 -는 무기성 음이온 또는 유기성 음이온을 나타낸다.]로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 C-반응성 단백질 측정용 시약.
  22. 제 21항에 있어서, 식(Ⅲ)으로 표시되는 화합물은 옥타데실트리메틸암모늄클로라이드, 헥사데실트리메틸암모늄클로라이드, 테트라데실트리메틸암모늄클로라이드, 도데실트리메틸암모늄클로라이드로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 화합물인 것을 특징으로 하는 C-반응성 단백질 측정용 시약.
  23. 제 13항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, C-반응성 단백질에 대한 항체는 수불용성 담체에 담지되어 있는 것을 특징으로 하는 C-반응성 단백질 측정용 시약.
  24. 제 23항에 있어서, 불용성담체는 폴리스티렌계 라텍스인 것을 특징으로 하는 C-반응성 단백질 측정용 시약.
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