JP5819417B2 - アッセイ試薬として使用するための組成物 - Google Patents

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Description

背景
本発明は、一般にアッセイにおけるシグナル生成成分として有用な組成物に関する。
生物学的成分(例えば、抗体)のような成分への結合のための官能基を提供するために、粒子状アッセイ試薬上のデキストランコーティングが利用されてきた。しかし、デキストランの化学組成には原料に依存して明らかなばらつきがある。
種々の成分を粒子に連結させるために、粒子の表面に信頼できる化学組成を有するコーティングを使用することが要望されている。
要約
本発明の1つの実施態様は、シグナル生成システム(signal producing system)(sps)のメンバー及び合成コポリマーのコーティングを含む固体支持体を含む組成物である。合成コポリマーは、反応性官能基又は誘導体化反応性官能基を含むペンダント部分を含む第1の共重合モノマー、並びに少なくとも1個の炭素原子及び少なくとも2個のヘテロ原子を含むペンダント部分を含む第2の共重合モノマーを含む。幾つかの実施態様において、反応性官能基又は誘導体化反応性官能基を含むペンダント部分は、アルデヒド又はアルデヒド誘導体を含むペンダント部分である。
本発明の別の実施態様は、試料中の分析対象の存在及び量の一方又は両方を決定する方法である。この方法は、媒体中で組合せて試料及び上記組成物を提供することを含むが、この組成物はまた、固体支持体と結び付いている特異的結合対(specific binding pair)(sbp)のメンバーを含み、この支持体で特異的結合対のメンバーは、分析対象に又は第2のsbpメンバーに結合することにより、分析対象の存在と関連している複合体を形成する。この組合せは、複合体を形成することになる組成物への分析対象の結合の条件に付される。このシグナル生成システムのメンバーが活性化され、そして複合体の量が検出される。複合体の量は、試料中の分析対象の存在及び量の一方又は両方と関連している。
本発明の別の実施態様は、試料中の分析対象の存在及び量の一方又は両方を決定する方法である。ある組合せが媒体中に提供される。この組合せは、試料、並びにspsメンバー、sbpメンバー(分析対象又は第2のsbpメンバーに結合することにより、分析対象の存在と関連している複合体を形成する)及びコポリマーのコーティングを含む粒子を含む組成物を含む。このコポリマーは、下記式:
Figure 0005819417

[式中、Dは、(i)〜(iii):
(i) −COOR10(ここで、R10は、H又は1〜6個の炭素原子のアルキルである);
(ii) 下記式:
Figure 0005819417

(式中、wは、2〜4である)で示される基;又は
(iii) −C(O)−X−(CH−(Y)−(CH−Z
(式中、
Aは、O又はNR(ここで、Rは、H又は1〜6個の炭素原子のアルキルである)であり;
nは、1〜10であり;
Gは、CHO;CH(OR(ここで、Rは、1〜6個の炭素原子のアルキルである);COOH若しくはその誘導体;NR(ここで、Rは、H又は1〜6個の炭素原子のアルキルであり、そしてnは、1〜10である);OH;又は特異的結合対のメンバーであり;
Xは、O又はNR(ここで、Rは、H又は1〜6個の炭素原子のアルキルである)であり;
Yは、−(CHO)−(ここで、mは、1〜1500である);又は>N(R)(ここで、R及びRは、独立にH又は1〜6個の炭素原子のアルキルである)であり;
pは、0〜10であるが、Yが>N(R)であるとき少なくとも1であり;
qは、0又は1であり;
rは、0〜10であるが、Yが>N(R)であるとき少なくとも1であり;そして
Zは、SO ;1〜6個の炭素原子のアルキル;−(CHOH)(CHCH(ここで、tは、1〜5であり、そしてuは、0〜10である)である)であり;
、R及びRは、独立にH又は1〜6個の炭素原子のアルキルであり;そして
x及びyは、独立に1〜1000である]を有する。
この組合せは、複合体を形成することになる、分析対象への又は第2のsbpメンバーへのsbpメンバーの結合の条件に付される。spsメンバーが活性化され、そして複合体の量が検出される。複合体の量は、試料中の分析対象の存在及び量の一方又は両方と関連している。
本発明の別の実施態様は、下記式:
Figure 0005819417

[式中、
Aは、O又はNR(ここで、Rは、H又は1〜6個の炭素原子のアルキルである)であり;
nは、1〜10であり;
G’は、CHO;CH(OR(ここで、Rは、1〜6個の炭素原子のアルキルである);特異的結合対のメンバーであり;
D’は、(i)〜(iii):
(i) −COOR10(ここで、R10は、H又は1〜6個の炭素原子のアルキルである);
(ii) 下記式:
Figure 0005819417

(式中、wは、2〜4である)で示される基;又は
(iii) −C(O)−X−(CH−(Y)−(CH−Z’
(式中、
Xは、O又はNR(ここで、Rは、H又は1〜6個の炭素原子のアルキルである)であり;
Yは、−(CHO)−(ここで、mは、1〜1500である);又は>N(R)(ここで、R及びRは、独立にH又は1〜6個の炭素原子のアルキルである)であり;
pは、0〜10であるが、Yが>N(R)であるとき少なくとも1であり;
qは、0又は1であり;
rは、0〜10であるが、Yが>N(R)であるとき少なくとも1であり;そして
Z’は、SO ;又は1〜6個の炭素原子のアルキルである)であり;
、R及びRは、独立にH又は1〜6個の炭素原子のアルキルであり;そして
x及びyは、独立に1〜約1000である]で示されるコポリマーである。
図1は、MAMDMAの合成の概略図である。 図2は、アセタール保護基の加水分解後の本組成物のコポリマーの実施態様の構造を表組みで表現したものである。図2はまた、図解したコポリマーの合成に使用した親水性モノマーの供給比を包含する。 図2は、アセタール保護基の加水分解後の本組成物のコポリマーの実施態様の構造を表組みで表現したものである。図2はまた、図解したコポリマーの合成に使用した親水性モノマーの供給比を包含する。
具体的な実施態様の詳細な説明
組成物
幾つかの実施態様において、本組成物のコポリマーは、コポリマーのモノマー単位の1つが、対象の分子(例えば、粒子及びsbpメンバーなど)への結合のための反応性官能基を含み、そしてコポリマーのモノマー単位のもう1つは、生じるコポリマーが親水性になるように官能基化されている、ランダムコポリマーである。幾つかの実施態様において、このコポリマーは、例えば、2種の異なるモノマー単位、又は3種の異なるモノマー単位、又は4種の異なるモノマー単位、又は5種の異なるモノマー単位を含む。幾つかの実施態様において、第1のモノマー単位は、反応性官能基又は反応性官能基の誘導体を含む。第2のモノマー単位は、親水性部分を含む。幾つかの実施態様において、別のモノマーの反応性官能基又は反応性官能基の誘導体とは異なる反応性官能基又は反応性官能基の誘導体を含むか、あるいは別のモノマーの親水性部分とは異なる親水性部分を含む、更なるモノマー(例えば、第3、第4及び第5のモノマー)を利用することができる。
ランダムコポリマーでは、共重合モノマーの分布は、ブロックコポリマーとは区別されるとおり、ポリマー鎖のどの点でも第1の共重合モノマー及び第2の共重合モノマーが交互に又は反復するようになっている。
幾つかの実施態様において、コポリマー中のそれぞれ異なる共重合モノマーの数は、官能基化ポリマーの調製中に、ポリマーの調製に使用されるモノマー単位のモル濃度を制御することにより制御される。即ち、共重合モノマーのそれぞれの数(後述の式中のx及びy)は、最終の官能基化コポリマーにおいて制御される。このコポリマーは、例えば、1種以上の特定の支持体に、このような支持体を含む組成物に、及びこのような組成物の使用に対して合わせることができる。
「モノマー」又は「モノマー単位」という用語は、重合を受けてポリマーを形成することができる分子を意味し;この分子は、重合性官能基を含む。モノマー単位の数は、例えば、モノマー単位中の原子の数及びモノマー単位の組成の1つ以上に依存する。
上記のとおり、アッセイ試薬を調製するのに使用するため、又はアッセイ試薬として使用するための組成物は、spsメンバー及び合成コポリマーのコーティングを含む固体支持体を含む。この合成コポリマーは、共重合してポリマーを形成する少なくとも2種のモノマーを含む。共重合モノマーの一方は、ポリマー基本骨格、及び少なくとも1つの反応性官能基又は少なくとも1つの反応性官能基の誘導体を含むペンダント部分を含む。共重合モノマーのもう一方は、少なくとも1個の炭素原子及び少なくとも2個のヘテロ原子を含む親水性部分を含む。幾つかの実施態様において、このコポリマーは、反応性官能基又は誘導体化反応性官能基を含むペンダント部分、並びに少なくとも1個の炭素原子及び少なくとも2個のヘテロ原子、又は少なくとも4個の炭素原子及び少なくとも3個のヘテロ原子、又は少なくとも4個の炭素原子及び少なくとも2個のヘテロ原子、又は少なくとも8個の炭素原子及び少なくとも7個のヘテロ原子を含むペンダント部分を含むポリエチレン性基本骨格を含む。共重合モノマーは、炭素原子の鎖を含むポリマー基本骨格を含むが、ここから1つ以上の反応性官能基含有部分又は反応性官能基の誘導体含有部分が、鎖からのペンダントであり、そして1つ以上の親水性部分が、コポリマー基本骨格の鎖からのペンダントである。
幾つかの実施態様において、親水性部分を含むもう一方の共重合モノマーは、1〜約15個の炭素原子及び1〜約10個のヘテロ原子を含む。この共重合モノマーは、炭素原子の鎖を含むポリマー基本骨格を含むが、ここから1つ以上の反応性官能基含有部分又は反応性官能基の誘導体含有部分が、鎖からのペンダントであり、そして1つ以上の親水性部分が、コポリマー基本骨格の鎖からのペンダントである。
コポリマーの基本骨格の鎖中の炭素原子の数は、例えば、モノマー単位の重合性官能基中の炭素原子の数のような、それぞれの共重合モノマー単位の数及び性質、並びに例えば、コポリマーの分子量に依存する。モノマー単位の重合性官能基中の炭素原子の数は、例えば、2〜約20、又は2〜約15、又は2〜約10、又は2〜約5、又は2〜約4、又は2〜3、又は3〜約20、又は3〜約15、又は3〜約10、又は3〜約5、又は3〜4であってよい。ペンダント反応性官能基含有部分又は反応性官能基の誘導体含有部分(本明細書では任意に第1の共重合モノマーと称される)を含むモノマー中の炭素原子の数は、少なくとも約3、又は少なくとも約4、又は少なくとも約5、又は少なくとも約6、又は少なくとも約7、又は少なくとも約8、又は少なくとも約9、又は少なくとも約10であり、そして約3〜約15、又は約3〜約10、又は約3〜約9、又は約3〜約8、又は約3〜約7、又は約3〜約6、又は約3〜約5、又は3〜4の範囲にあってもよい。コポリマー中の第1の共重合モノマーの数は、sbpメンバーへの結合のニーズ及び支持体の表面への結合のニーズの1つ以上に依存する。コポリマー中の第1の共重合モノマーの数は、例えば、1〜約1,000、又は1〜約750、又は1〜約500、又は1〜約250、又は1〜約100、又は1〜約50、又は2〜約1,000、又は2〜約750、又は2〜約500、又は2〜約250、又は2〜約100、又は2〜約50、又は5〜約1,000、又は5〜約750、又は5〜約500、又は5〜約250、又は5〜約100、又は5〜約50、又は10〜約1,000、又は10〜約750、又は10〜約500、又は10〜約250、又は10〜約100、又は10〜約50、又は100〜約1,000、又は100〜約750、又は100〜約500、又は100〜約250である。
「重合性官能基」という用語は、そのモノマーの別の分子の一部又は異なるモノマーの分子の一部と反応するモノマー単位の一部、例えば、1個以上の二重又は三重結合を含む部分などであって、例えば、アリル基、ビニル基、アクリラート基、メタクリラート基、アクリルアミド基及びメタクリルアミド基などのことをいう。
「反応性官能基」という用語は、別の分子上の対応する反応性官能基と反応して共有結合を形成することができる官能基である。このような反応性官能基は、特に限定されないが実例として、例えば、アルデヒド、カルボキシ、アミノ、イミノ、スルフヒドリル及びヒドロキシを包含する。幾つかの実施態様において、この反応性官能基はアルデヒドであり、そして第1の共重合モノマーは、アルデヒド部分を含む。
「反応性官能基の誘導体」という用語は、反応性官能基と、反応性官能基と反応性の官能基を含む別の部分との反応により形成される部分を意味するが、この反応により2個の分子を合わせて連結する共有結合を形成して誘導体が生成する。反応性官能基の誘導体は、例えば、アセタール、カルボキシエステル、アミド、エーテル又はチオエーテルを含んでもよい。幾つかの実施態様において、反応性官能基の誘導体は、反応性官能基と、特異的結合対のメンバー(sbpメンバー)の反応性官能基との反応生成物であってもよく、これによってsbpメンバーは、コポリマーに共有結合する。sbpメンバー上の官能基は、sbpメンバー上に天然に存在してもよく、また合成によりsbpメンバー中に導入してもよい。このような官能基は、例えば、アミン基、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基及びカルボキシル基を包含する。幾つかの実施態様において、反応性官能基の誘導体は、反応性官能基と、粒子の反応性官能基との反応生成物であってもよく、これによってコポリマーは、粒子に共有結合して、粒子の表面上にコポリマーのコーティングを提供する。粒子上の官能基は、粒子上に天然に存在してもよく、また合成により粒子の表面上に導入してもよい。このような官能基は、例えば、アミン基、ヒドロキシル基、アジド基及びカルボキシル基を包含する。幾つかの実施態様において、反応性官能基の誘導体は、アルデヒド誘導体である。
「アルデヒド誘導体」という用語は、アルデヒド基と、アルデヒド基と反応性の官能基を含む別の部分との反応により形成される部分を意味する。このアルデヒド誘導体は、2種のアルコール官能基とアルデヒドのカルボニル酸素との反応に由来するアセタールであってよい。このアルデヒド誘導体は、アルデヒド基と特異的結合対のメンバー(sbpメンバー)との、アルデヒドとsbpメンバーの官能基との反応を利用する反応生成物であってよい。sbpメンバー上の官能基は、sbpメンバー上に天然に存在してもよく、また合成によりsbpメンバー中に導入してもよい。このような官能基は、例えば、アミン基を包含する。アルデヒド基とsbpメンバーの間の反応は、例えば、sbpメンバーのアルキルアミン又はアリールアミンとアルデヒド基の間のシッフ塩基形成を利用するものであってよい。この反応は、アルデヒド基及びsbpメンバーのアミン基が関与する還元的アミノ化を利用するものであってよい。他の実施態様では、このアルデヒド誘導体は、例えば、アセタール及び重亜硫酸付加化合物を包含する。幾つかの実施態様において、アルデヒド官能基は、粒子の表面上の対応するアミン基と反応することができ、これによって粒子は、コポリマーに共有結合して、粒子の表面上にコポリマーのコーティングを提供する。粒子上の官能基は、粒子上に天然に存在してもよく、また合成により粒子の表面上に導入してもよい。
コポリマーのもう一方の共重合モノマー(親水性モノマー、あるいは本明細書では任意に第2の共重合モノマーと称される)は、例えば、少なくとも1個の炭素原子及び少なくとも2個のヘテロ原子、又は少なくとも1個の炭素原子及び少なくとも3個のヘテロ原子、又は少なくとも1個の炭素原子及び少なくとも4個の炭素原子、又は少なくとも2個の炭素原子及び少なくとも2個のヘテロ原子、又は少なくとも2個の炭素原子及び少なくとも3個のヘテロ原子、又は少なくとも2個の炭素原子及び少なくとも4個のヘテロ原子、又は少なくとも3個の炭素原子及び少なくとも3個のヘテロ原子、又は少なくとも3個の炭素原子及び少なくとも4個のヘテロ原子、又は少なくとも4個の炭素原子及び少なくとも3個のヘテロ原子、又は少なくとも4個の炭素原子及び少なくとも4個のヘテロ原子を含む重合性官能基を含む。上記のとおり、共重合モノマーは、炭素原子の鎖を含むポリマー基本骨格を形成するが、ここから1つ以上のペンダント部分が、この鎖から分岐している。第2のモノマー単位の重合性官能基中の炭素原子の数は、例えば、2〜約20、又は2〜約15、又は2〜約10、又は2〜約5、又は2〜約4、又は2〜3、又は3〜約20、又は3〜約15、又は3〜約10、又は3〜約5、又は3〜4であってよい。
幾つかの実施態様において、コポリマーの第2の共重合モノマーは、重合性官能基、並びに1〜約15個の炭素原子及び1〜約10個のヘテロ原子、又は1〜約10個の炭素原子及び1〜約10個のヘテロ原子、又は1〜約10個の炭素原子及び1〜約8個のヘテロ原子、又は1〜約10個の炭素原子及び1〜約6個のヘテロ原子、又は1〜約10個の炭素原子及び1〜約5個のヘテロ原子、又は1〜約8個の炭素原子及び1〜約8個のヘテロ原子、又は1〜約8個の炭素原子及び1〜約7個のヘテロ原子、又は1〜約8個の炭素原子及び1〜約6個のヘテロ原子、又は4〜約8個の炭素原子及び3〜約7個のヘテロ原子を含むペンダント部分を含む。
ペンダント親水性部分の炭素原子の数は、例えば、少なくとも1、又は少なくとも約2、又は少なくとも約3、又は少なくとも約4、又は少なくとも約5、又は少なくとも約10、又は少なくとも約20、又は少なくとも約40、又は少なくとも約60、又は少なくとも約80、又は少なくとも約100、又は少なくとも約150、又は少なくとも約200、又は少なくとも約300、又は少なくとも約400、かつ約2,500以下、又は約2,000以下、又は約1,500以下、又は約1,100以下である。幾つかの実施態様において、ペンダント部分の炭素原子の数は、例えば、1〜約2,500、又は1〜約2,000、又は1〜約1,500、又は1〜約1,200、又は1〜約1,100、又は1〜約1,000、又は1〜約750、又は1〜約500、又は1〜約400、又は1〜約300、又は1〜約200、又は1〜約100、又は1〜約80、又は1〜約60、又は1〜約40、又は1〜約20、又は1〜約10、又は2〜約2,500、又は2〜約2,000、又は2〜約1,500、又は2〜約1,200、又は2〜約1,100、又は2〜約1,000、又は2〜約750、又は2〜約500、又は2〜約400、又は2〜約300、又は2〜約200、又は2〜約100、又は2〜約80、又は2〜約60、又は2〜約40、又は2〜約20、又は2〜約10、又は3〜約2,500、又は3〜約2,000、又は3〜約1,500、又は3〜約1,200、又は3〜約1,100、又は3〜約1,000、又は3〜約750、又は3〜約500、又は3〜約400、又は3〜約300、又は3〜約200、又は3〜約100、又は3〜約80、又は3〜約60、又は3〜約40、又は3〜約20、又は3〜約10、又は4〜約2,500、又は4〜約2,000、又は4〜約1,500、又は4〜約1,200、又は4〜約1,100、又は4〜約1,000、又は4〜約750、又は4〜約500、又は4〜約400、又は4〜約300、又は4〜約200、又は4〜約100、又は4〜約80、又は4〜約60、又は4〜約40、又は4〜約20、又は4〜約10、又は5〜約2,500、又は5〜約2,000、又は5〜約1,500、又は5〜約1,200、又は5〜約1,100、又は5〜約1,000、又は5〜約750、又は5〜約500、又は5〜約400、又は5〜約300、又は5〜約200、又は5〜約100、又は5〜約80、又は5〜約60、又は5〜約40、又は5〜約20、又は5〜約10の範囲にある。
コポリマー中の第2の共重合モノマーの分子の数は、例えば、1〜約1,000、又は1〜約750、又は1〜約500、又は1〜約250、又は1〜約100、又は1〜約50、又は2〜約1,000、又は2〜約750、又は2〜約500、又は2〜約250、又は2〜約100、又は2〜約50、又は5〜約1,000、又は5〜約750、又は5〜約500、又は5〜約250、又は5〜約100、又は5〜約50、又は10〜約1,000、又は10〜約750、又は10〜約500、又は10〜約250、又は10〜約100、又は10〜約50、又は100〜約1,000、又は100〜約750、又は100〜約500、又は100〜約250である。
少なくとも1個の炭素原子及び少なくとも2個のヘテロ原子を含む第2の共重合モノマーのペンダント親水性部分のヘテロ原子の数は、そのコポリマーを親水性にするのに充分な数である。「親水性」という用語は、極性であるため、中性分子又は極性分子を好み、そして極性溶媒を好む分子の性質のことをいう。親水性分子は、疎水性部分に比較して他の親水性部分に対する親和性を有する。ヘテロ原子の数は、例えば、ペンダント部分中の炭素原子の数、支持体の性質及び存在するならアルデヒド誘導体の性質のような要因に依存する。
ペンダント親水性部分のヘテロ原子の数は、例えば、少なくとも約2、又は少なくとも約3、又は少なくとも約4、又は少なくとも約5、又は少なくとも約6、又は少なくとも約7、又は少なくとも約8、又は少なくとも約9、又は少なくとも約10、又は少なくとも約20、又は少なくとも約30、又は少なくとも約40、又は少なくとも約50、又は少なくとも約60、又は少なくとも約70、又は少なくとも約80、又は少なくとも約90、又は少なくとも約100、又は少なくとも約150、かつ約1,500以下、又は約1,200以下、又は約1,100以下、又は約1,000以下である。幾つかの実施態様において、ヘテロ原子の数は、例えば、2〜約1,500、又は2〜約1,250、又は2〜約1,000、又は2〜約750、又は2〜約500、又は2〜約250、又は2〜約100、又は2〜約80、又は2〜約60、又は2〜約40、又は2〜約20、又は2〜約10、又は3〜約1,500、又は3〜約1,250、又は3〜約1,000、又は3〜約750、又は3〜約500、又は3〜約250、又は3〜約100、又は3〜約80、又は3〜約60、又は3〜約40、又は3〜約20、又は3〜約10、又は5〜約1,500、又は5〜約1,250、又は5〜約1,000、又は5〜約750、又は5〜約500、又は5〜約250、又は5〜約100、又は5〜約80、又は5〜約60、又は5〜約40、又は5〜約20、又は5〜約10、又は7〜約1,500、又は7〜約1,250、又は7〜約1,000、又は7〜約750、又は7〜約500、又は7〜約250、又は7〜約100、又は7〜約80、又は7〜約60、又は7〜約40、又は7〜約20、又は7〜約10の範囲にある。
このコポリマーの親水性は、コポリマー中のヘテロ原子(及びこのようなヘテロ原子を含む官能基)の数により制御される。コポリマー中のヘテロ原子の数は、第2の共重合モノマーのそれぞれ中のヘテロ原子の数に、また反応性官能基又は反応性官能基の誘導体を含むペンダント部分を含む共重合モノマーの数と比較したヘテロ原子を含む共重合モノマーの数にも依存する。幾つかの実施態様において、例えば、約3個の炭素原子あたり1個のヘテロ原子、又は約6個の炭素原子あたり1個のヘテロ原子、又は約10個の炭素原子あたり1個のヘテロ原子、又は約12個の炭素原子あたり1個のヘテロ原子、又は約15個の炭素原子あたり1個のヘテロ原子、又は1個の炭素原子あたり2個のヘテロ原子、又は約2個の炭素原子あたり2個のヘテロ原子、又は約3個の炭素原子あたり2個のヘテロ原子、又は約4個の炭素原子あたり2個のヘテロ原子、又は約6個の炭素原子あたり2個のヘテロ原子、又は約10個の炭素原子あたり2個のヘテロ原子、又は約12個の炭素原子あたり2個のヘテロ原子、又は約15個の炭素原子あたり2個のヘテロ原子、又は約4個の炭素原子あたり3個のヘテロ原子、又は約6個の炭素原子あたり3個のヘテロ原子、又は約10個の炭素原子あたり3個のヘテロ原子、又は約12個の炭素原子あたり3個のヘテロ原子、又は約15個の炭素原子あたり3個のヘテロ原子、又は約4個の炭素原子あたり4個のヘテロ原子、又は約6個の炭素原子あたり4個のヘテロ原子、又は約10個の炭素原子あたり4個のヘテロ原子、又は約12個の炭素原子あたり4個のヘテロ原子、又は約15個の炭素原子あたり4個のヘテロ原子、又は約4個の炭素原子あたり5個のヘテロ原子、又は約6個の炭素原子あたり5個のヘテロ原子、又は約10個の炭素原子あたり5個のヘテロ原子、又は約12個の炭素原子あたり5個のヘテロ原子、又は約15個の炭素原子あたり5個のヘテロ原子、又は約5個の炭素原子あたり6個のヘテロ原子、又は約6個の炭素原子あたり6個のヘテロ原子、又は約10個の炭素原子あたり6個のヘテロ原子、又は約12個の炭素原子あたり6個のヘテロ原子、又は約15個の炭素原子あたり6個のヘテロ原子、又は約7個の炭素原子あたり7個のヘテロ原子、又は約8個の炭素原子あたり7個のヘテロ原子、又は約10個の炭素原子あたり7のヘテロ原子、又は約12個の炭素原子あたり7個のヘテロ原子、又は約15個の炭素原子あたり7個のヘテロ原子が存在する。
幾つかの実施態様において、第2の重合モノマー(親水性モノマー)のペンダント部分は、例えば、少なくとも1個の炭素原子及び少なくとも2個のヘテロ原子、又は少なくとも1個の炭素原子及び少なくとも3個のヘテロ原子、又は少なくとも1個の炭素原子及び少なくとも4個の炭素原子、又は少なくとも2個の炭素原子及び少なくとも2個のヘテロ原子、又は少なくとも2個の炭素原子及び少なくとも3個のヘテロ原子、又は少なくとも2個の炭素原子及び少なくとも4個のヘテロ原子、又は少なくとも3個の炭素原子及び少なくとも3個のヘテロ原子、又は少なくとも3個の炭素原子及び少なくとも4個のヘテロ原子、又は少なくとも4個の炭素原子及び少なくとも2個のヘテロ原子、又は少なくとも4個の炭素原子及び少なくとも3個のヘテロ原子、又は少なくとも4個の炭素原子及び少なくとも4個のヘテロ原子、又は少なくとも4個の炭素原子及び少なくとも5個のヘテロ原子、又は少なくとも5個の炭素原子及び少なくとも2個のヘテロ原子、又は少なくとも5個の炭素原子及び少なくとも3個のヘテロ原子、又は少なくとも5個の炭素原子及び少なくとも4個のヘテロ原子、又は少なくとも5個の炭素原子及び少なくとも5個のヘテロ原子、又は少なくとも5個の炭素原子及び少なくとも6個のヘテロ原子、又は少なくとも6個の炭素原子及び少なくとも2個のヘテロ原子、又は少なくとも6個の炭素原子及び少なくとも3個のヘテロ原子、又は少なくとも6個の炭素原子及び少なくとも4個のヘテロ原子、又は少なくとも6個の炭素原子及び少なくとも5個のヘテロ原子、又は少なくとも6個の炭素原子及び少なくとも6個のヘテロ原子、又は少なくとも6個の炭素原子及び少なくとも7個のヘテロ原子、又は少なくとも7個の炭素原子及び少なくとも2個のヘテロ原子、又は少なくとも7個の炭素原子及び少なくとも3個のヘテロ原子、又は少なくとも7個の炭素原子及び少なくとも4個のヘテロ原子、又は少なくとも7個の炭素原子及び少なくとも5個のヘテロ原子、又は少なくとも7個の炭素原子及び少なくとも6個のヘテロ原子、又は少なくとも7個の炭素原子及び少なくとも7個のヘテロ原子、又は少なくとも7個の炭素原子及び少なくとも8個のヘテロ原子、又は少なくとも8個の炭素原子及び少なくとも2個のヘテロ原子、又は少なくとも8個の炭素原子及び少なくとも3個のヘテロ原子、又は少なくとも8個の炭素原子及び少なくとも4個のヘテロ原子、又は少なくとも8個の炭素原子及び少なくとも5個のヘテロ原子、又は少なくとも8個の炭素原子及び少なくとも6個のヘテロ原子、又は少なくとも8個の炭素原子及び少なくとも7個のヘテロ原子、又は少なくとも8個の炭素原子及び少なくとも8個のヘテロ原子、又は少なくとも8個の炭素原子及び少なくとも9個のヘテロ原子を含むことができる。
反応性官能基又は反応性官能基の誘導体を含むペンダント部分を含む重合モノマーの数と比較したヘテロ原子を含む共重合モノマーの数は、重合中のモノマーの供給比により制御することができる。したがって、重合中に反応性官能基又は反応性官能基の誘導体を含むペンダント部分を含むモノマー(第1の共重合性モノマー)の供給比は、親水性モノマー(第2の共重合性モノマー)の比より増加させることができる。重合中の第1の共重合性モノマーに対する第2の共重合性モノマーの比は、例えば、1:1、又は1:1.5、又は1:2、又は1:2.5、又は1:3、又は1:3.5、又は1:4、又は1:4.5、又は1:5、又は1:5.5、又は1:6であってよい。この供給比は、以下の式中のx及びyの値を制御する。更に、第1の共重合性モノマーに対する第2の共重合性モノマーの比は、シグナル生成システム(sps)のメンバー及び合成コポリマーのコーティングを含む固体支持体から得られるシグナルの量を制御するために調整することができる。反応性官能基を含むペンダント部分を含む第1の共重合性モノマーをより多くすることにより、固体支持体上に大量の誘導体化反応性官能基を得ることができる。このように、生じる合成コポリマーで被覆された固体支持体の親水性と誘導体化反応性官能基の数とのバランスを取ることにより、多種多様なアッセイ及びシグナル生成システムに対応させることができる。
ペンダント親水性部分のヘテロ原子は、例えば、酸素、硫黄、窒素及びリン、並びに酸素、硫黄、窒素及びリンの組合せを包含する。このヘテロ原子は、相互の組合せ又は他の原子(例えば、水素及び炭素の1種以上など)との組合せで、1種以上の親水性基の形で存在してもよい。幾つかの実施態様において、酸素は、水素、炭素、硫黄、窒素及びリンの1種以上に結合した、オキソ又はオキシとして存在してもよく;窒素は、例えば、アゾ、シアノ、イソシアノ、ニトロ、ニトロソ、アミド又はアミノ基のように、水素、炭素、酸素、硫黄及びリンの1種以上に結合してもよく;硫黄は、上述の酸素と類似しており;リンは、例えば、ホスホン酸又はリン酸モノ−又はジエステル基のように、水素、炭素、硫黄、酸素及び窒素の1種以上に結合してもよい。
ペンダント親水性部分中の親水性基の数は、2〜約1,500、又は2〜約1,250、又は2〜約1,000、又は2〜約750、又は2〜約500、又は2〜約250、又は2〜約125、又は2〜約100、又は2〜約80、又は2〜約60、又は2〜約40、又は2〜約20、又は2〜約10、又は2〜約5、又は3〜約1,500、又は3〜約1,250、又は3〜約1,000、又は3〜約750、又は3〜約500、又は3〜約250、又は3〜約125、又は3〜約100、又は3〜約80、又は3〜約60、又は3〜約40、又は3〜約20、又は3〜約10、又は3〜約5、又は4〜約1,500、又は4〜約1,250、又は4〜約1,000、又は4〜約750、又は4〜約500、又は4〜約250、又は4〜約125、又は4〜約100、又は4〜約80、又は4〜約60、又は4〜約40、又は4〜約20、又は4〜約10、又は4〜5であってよく;親水性基は、独立に1個以上の後述の基であってよい。
幾つかの実施態様において、親水性基又はペンダント親水性部分の基は、特に限定されないが実例として、アミン基(第1級、第2級、第3級又は第4級アミン)、アミド基、ヒドロキシル基、エステル基、エーテル基、ポリエーテル基(例えば、ポリオキシエチレン基及びポリオキシプロピレン基)、エポキシド基、チオエーテル基、ポリチオエーテル基、硫酸基、亜硫酸基、リン酸基、亜リン酸基、ホスファチジルコリン基、ベタイン基、スルホベタイン基、ニトリル基、イソニトリル基、シアナート基、イソシアナート基、チオシアナート基、イソチオシアナート基、アジド基、チオール基、チオラート基、スルフィド基、スルフィン酸基、スルホン酸基、フェノラート基、カルボニル基、カルボン酸基、ホスフィン基、ホスフィンオキシド基、ホスホン酸基及びホスホラミド基、更にはこのような基の組合せ及び混合物から選択してもよい。幾つかの実施態様において、親水性基(単数又は複数)は、特に限定されないが実例として、アミン基(第1級、第2級、第3級又は第4級アミン)、アミド基、ヒドロキシル基、エステル基、エーテル基、ポリエーテル基、チオエーテル基、硫酸基、亜硫酸基、リン酸基、亜リン酸基、ホスファチジルコリン基、ベタイン基及びスルホベタイン基から選択してもよい。
幾つかの実施態様において、コポリマーの分子量(ダルトン)(Da)は、例えば、約300〜約10,000,000以上、又は約500〜約10,000,000、又は約1,000〜約10,000,000、又は約10,000〜約10,000,000、又は約100,000〜約10,000,000、又は300〜約5,000,000以上、又は約500〜約5,000,000、又は約1,000〜約5,000,000、又は約10,000〜約5,000,000、又は約100,000〜約5,000,000、又は300〜約1,000,000以上、又は約500〜約1,000,000、又は約1,000〜約1,000,000、又は約10,000〜約1,000,000、又は約100,000〜約1,000,000、又は約100〜約750,000、又は約500〜約750,000、又は約1,000〜約750,000、又は約10,000〜約750,000、又は約100,000〜約750,000、又は約100〜約500,000、又は約200〜約500,000、又は約1,000〜約500,000、又は約10,000〜約500,000、又は約100,000〜約500,000である。
幾つかの実施態様において、このコポリマーは、ポリエチレン性基本骨格を含むが、ここから1つ以上の反応性官能基含有部分又は反応性官能基の誘導体含有部分(例えば、1つ以上のアルデヒド含有部分又はアルデヒド誘導体含有部分)並びに少なくとも1個の炭素原子及び少なくとも2個のヘテロ原子を含む1つ以上の部分が分岐している。このポリエチレン性基本骨格は、エチレン性基、即ち、二重結合を含むモノマーから形成された−(CHR−CHR)−基(ここで、Rは、アルキル又は水素である)の直鎖を含む。他のタイプのポリマー基本骨格もまた包含され、そしてモノマーの性質に依存する。このコポリマーが形成されるモノマーは、特に限定されないが一例として、ビニルモノマー、アリル型モノマー、オレフィン類、及び少なくとも1の不飽和度を含有する任意の低分子、並びに上記モノマー(ここで、重合性官能基は、炭素−炭素二重結合又は炭素−炭素三重結合である)の2種以上の混合物を包含する。重合性官能基に加えて、モノマーはまた、反応性官能基又は反応性官能基の誘導体のいずれかの適切な置換、あるいは少なくとも1個の炭素原子及び少なくとも2個のヘテロ原子を含む。ビニルモノマーの種類は、特に限定されないが、メタクリル酸、メタクリラート、メタクリルアミド、N−及びN,N−二置換メタクリルアミド、ビニル芳香族モノマー、ハロゲン化ビニル、カルボン酸のビニルエステル(例えば、酢酸ビニル)、エチレンオキシドアクリラート、ジアクリラート、及びジメタクリラートを包含する。
メタクリラートの例は、本実施態様のペンダント部分で適切に置換されたメタクリラート(ここで、メタクリラートは、特に限定されないが実例として、例えば、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸プロピル、メタクリル酸イソプロピル、メタクリル酸n−ブチル、メタクリル酸イソ−ブチル、及びメタクリル酸tert−ブチルを包含する)を包含する。使用できるビニル芳香族モノマーの例は、特に限定されないが、例えば、適切に置換されたスチレン、スチレン−ブタジエン、p−クロロメチルスチレン及びジビニルベンゼンを包含する。使用できるハロゲン化ビニルは、特に限定されないが、適切に置換された塩化ビニル及びフッ化ビニリデンを包含する。使用できるカルボン酸のビニルエステルは、特に限定されないが、適切に置換された酢酸ビニル、酪酸ビニル、3,4−ジメトキシ安息香酸ビニル、リンゴ酸ビニル及び安息香酸ビニルを包含する。
このコポリマーは、上記の適切なモノマー単位を使用してランダムコポリマーの合成のための標準的高分子化学法により合成される。幾つかの実施態様において、1個以上の重合性官能基を含むモノマー単位は、単一重合工程で化合させることができる。上記のとおり、この後者の重合アプローチにおいて、このコポリマーの共重合モノマーのそれぞれの数は、モノマー単位のモル濃度を制御することにより制御できる。
このランダムコポリマーは、ランダムコポリマーの調製のための任意の重合手法により調製することができる。重合手法は、例えば、ラジカル重合、原子移動ラジカル重合、可逆的付加開裂連鎖移動重合、ニトロキシドを介した重合などを包含する。例えば、温度、反応媒体、pH、反応時間、及び試薬の添加の順序のような、重合の条件は、例えば、利用する重合のタイプ、利用する任意の重合性官能基を包含するモノマー試薬の性質及び利用する任意の触媒の性質の1つ以上に依存する。このような条件は、使用できる重合手法のタイプが当該分野において周知であるため、広く知られている。
上記のとおり、本実施態様の幾つかによる組成物は、spsメンバー及び合成コポリマーのコーティングを含む固体支持体を含む。この固体支持体は、透明であってもある程度透明であってもよい、有機又は無機の水不溶性材料からなっていてよい。固体支持体は、疎水性であり、そして例えば、粒状物(ビーズ及び粒子を包含する)、フィルム、膜、チューブ、ウェル、ストリップ、ロッド、及び平面(例えば、プレートなど)のような幾つかの形状のいずれであってもよい表面を有する。アッセイのタイプに応じて、固体支持体は、使用される媒体中に懸濁できるか又はできない。懸濁できる固体支持体の例は、ラテックス粒子のようなポリマー材料及び磁性粒子を包含する。他の固体支持体組成物は、例えば、ポリ(塩化ビニル)、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ(4−メチルブテン)、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ(エチレンテレフタレート)、ナイロン、及びポリ(酪酸ビニル)のようなポリマー(これらを単独で使用するか、又は他の材料と併せて使用するかのいずれか)を包含する。
幾つかの実施態様において、固体支持体は粒子である。この粒子は一般に、例えば、約0.02〜約100ミクロン、又は約0.05〜約100ミクロン、又は約0.1〜約100ミクロン、又は約0.5〜約100ミクロン、又は約0.02〜約50ミクロン、又は約0.05〜約50ミクロン、又は約0.1〜約50ミクロン、又は約0.5〜約50ミクロン、又は約0.02〜約20ミクロン、又は約0.05〜約20ミクロン、又は約0.1〜約20ミクロン、又は約0.5〜約20ミクロンの平均直径を有する。幾つかの実施態様において、この粒子は、例えば、約0.05ミクロン〜約20ミクロン、又は約0.3ミクロン〜約10ミクロン、又は約0.3ミクロン〜約5ミクロンの平均直径を有する。幾つかの実施態様において、この粒子は、ラテックス粒子又はクロム粒子である。
ラテックス粒子は、粒状の水懸濁性、水不溶性のポリマー材料である。幾つかの実施態様において、このラテックスは、ポリスチレン−ブタジエンのような置換ポリエチレン、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、アミノ基を持つポリスチレン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、アクリロニトリル−ブタジエン、スチレンコポリマー、ポリ酢酸ビニル−アクリレート、ポリビニルピリジン、塩化ビニル・アクリレートコポリマーなどである。
ポリマー粒子は、付加又は縮合ポリマーから形成することができる。この粒子は、水性媒体に容易に分散でき、そして官能基化することにより、例えば、本明細書に記載されるコポリマー、シグナル生成システム(sps)のメンバー、及び特異的結合対(sbp)のメンバーの1つ以上への結合が可能になる。この粒子はまた、天然材料、合成修飾された天然材料、及び合成材料から誘導することができる。幾つかの実施態様において、この粒子は、例えば、アミン基のような、天然に又は合成により導入された反応性官能基を有しており、そしてこれは、例えば、アルデヒド基のような、コポリマーの対応する反応性官能基と反応性である。
上記のとおり、このコポリマーは、支持体上のコーティングである。支持体をコポリマーで被覆することは、幾つかの方法で達成できる。このコポリマーは、支持体の表面に共有結合させることができる。幾つかの実施態様において、共有結合は、例えば、アルデヒド基のようなコポリマーの反応性官能基の一部と、支持体の表面上の官能基との、アルデヒド誘導体に関しての上述のやり方と同様の反応によって達成できる。上記のとおり、幾つかの実施態様において、支持体の性質に応じて、適切な官能基は、既に支持体の表面上に存在するか、又は表面上に合成により導入してもよい。例えば、アルデヒド基のような残りの反応性官能基は、例えば、適切に官能基化したsbpメンバーとの反応に利用できる。
幾つかの実施態様において、支持体上に被覆されたコポリマーの量は、例えば、支持体の性質、コポリマーの性質、spsメンバーの性質、支持体へのコポリマーの結合がアルデヒド担持部位によるかどうか、及びsbpメンバーがアルデヒド担持部位に結合しているかどうかの1つ以上に依存する。幾つかの実施態様において、支持体上に被覆されたコポリマーの量(重量パーセント)は、例えば、約0.1〜約10%、又は約0.1〜約9%、又は約0.1〜約8%、又は約0.1〜約7%、又は約0.1〜約6%、又は約0.1〜約5%、又は約0.1〜約4%、又は約0.1〜約3%、又は約0.1〜約2%、又は約0.1〜約1%、又は約0.1〜約0.5%、又は約1〜約10%、又は約1〜約9%、又は約1〜約8%、又は約1〜約7%、又は約1〜約6%、又は約1〜約5%、又は約1〜約4%、又は約1〜約3%、又は約1〜約2%、又は約0.05〜約0.5%、又は約0.06〜約0.5%、又は約0.07〜約0.5%、又は約0.08〜約0.5%、又は約0.09〜約0.5%、又は約0.1〜約0.5%、又は約0.05〜約0.4%、又は約0.06〜約0.4%、又は約0.07〜約0.4%、又は約0.08〜約0.4%、又は約0.09〜約0.4%、又は約0.1〜約0.4%、又は約0.05〜約0.3%、又は約0.06〜約0.3%、又は約0.07〜約0.3%、又は約0.08〜約0.3%、又は約0.09〜約0.3%、又は約0.1〜約0.3%、又は約0.05〜約0.2%、又は約0.06〜約0.2%、又は約0.07〜約0.2%、又は約0.08〜約0.2%、又は約0.09〜約0.2%、又は約0.1〜約0.2%である。
シグナル生成システムのメンバーを含む粒子のためのコポリマーコーティングの選択は、例えば、アッセイのタイプ、シグナル生成システムのメンバーの性質、分析対象の期待濃度範囲、抗体の物理的特性及び起源、有効な抗体コーティング密度の変動、最終反応混合物のpH、及び最終反応混合物のイオン強度のような幾つかの要因の1つ以上に依存する。このような要因に応じて、任意の特定の応用では一方のコポリマーコーティングが、もう一方のコポリマーコーティングより好ましいかもしれない。例えば、特定の抗体が特定のコポリマーコーティングに結合するとき、その有効な抗体コーティング密度は、シグナル生成システムに最適であるかもしれない。シグナルの量は、共重合中に、例えば、第1及び第2の重合性モノマーの供給比を調整することにより、制御できよう。
上記のとおり、本組成物はまた、spsメンバーを含む。spsメンバーの性質は、本組成物の実施態様が利用されるアッセイのタイプに依存する。このようなアッセイは、例えば、免疫沈降及び凝集法、並びに抗体複合体の検出のための対応する光散乱法(例えば、ネフェロメトリー法など)及び比濁法;並びに標識アッセイ(例えば、標識免疫測定法)、例えば、誘起ルミネセンス(発光酸素チャネリング)アッセイ、蛍光酸素チャネリングアッセイ、酵素標識アッセイ、蛍光偏光アッセイ、放射標識アッセイ及び阻害アッセイなどを包含する。
spsメンバーは標識であってもよく、そしてこれは、シグナル生成システムの一部である。標識の性質は、上述のような特定のアッセイ形式に依存する。シグナル生成システムは、1つ以上の成分を包含できるが、少なくとも1つの成分は検出可能な標識であって、そしてこれが、結合及び非結合標識の量(即ち、検出される分析対象に結合したか結合しない、又は検出すべき分析対象の量を反映する物質に結合したか結合しない標識の量)の一方又は両方に関連する検出可能なシグナルを生成する。この標識は、シグナルを生成するか、又は生成するように誘導することができる、任意の分子であり、そして例えば、蛍光剤、放射標識、酵素、化学発光剤又は光増感剤であってよい。よって、シグナルは、例えば、場合によって、酵素活性、ルミネセンス、吸光度又は放射活性を検出することにより、検出及び/又は測定される。
適切な標識は、特に限定されないが実例として、例えば、アルカリホスファターゼ、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ(「G6PDH」)及び西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素;リボザイム;QBレプリカーゼのようなレプリカーゼの基質;プロモーター;色素;フルオレセイン、イソチオシアナート、ローダミン化合物、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o−フタルデヒド(phthaldehyde)、及びフルオレスカミンのような蛍光剤;量子ドットとして知られている半導体ナノ結晶中に存在するCdSe及びZnSから調製されるような複合体;イソルミノールのような化学発光剤;光増感剤を包含する増感剤;補酵素;酵素基質;125I、131I、14C、H、57Co及び75Seのような放射標識;ラテックス粒子、炭素粒子、磁性粒子、例えば、二酸化クロム(CrO)粒子を包含する金属粒子などのような粒子;金属ゾル;晶子;リポソーム;ヌクレオチド及び細胞を包含するが、これらは、色素、触媒又は他の検出可能な基で更に標識してもよい。
標識は、シグナルを直接生成させることができ、そのため、追加の成分はシグナルを生成させるために必要ではない。多数の有機分子、例えば、蛍光剤は、紫外線及び可視光を吸収することができるが、ここで、光吸収が、エネルギーをこれらの分子に伝達して、これらを励起エネルギー状態に高める。この吸収エネルギーは、次に第2の波長での発光により消失する。シグナルを直接生成させる他の標識は、放射活性同位元素及び色素を包含する。
あるいは、この標識は、シグナルを生成させるのに他の成分を必要とすることもあるが、するとシグナル生成システムは、測定可能なシグナルを生成させるために必要な全ての成分を包含することになる。このような他の成分は、例えば、基質、補酵素、促進剤、追加の酵素、酵素産物と反応する物質、触媒、活性化剤、補助因子、インヒビター、スカベンジャー、金属イオン、及びシグナル生成物質の結合に必要な特異的結合物質を包含することができる。
上記のとおり、本組成物においてspsメンバーは支持体と結び付いている。固体支持体とのspsメンバーの結び付きの様式は、支持体の性質、spsメンバーの性質、支持体の表面積及び多孔性並びに利用する任意の溶媒の性質の1つ以上に依存する。この結び付きは、例えば、支持体によるspsメンバーの吸着、支持体へのspsメンバーの共有結合、固体支持体へのspsメンバーの溶解又は分散、結合対メンバー(例えば、アビジン−ビオチン及びジゴキシン−ジゴキシンに対する抗体)を用いての支持体へのspsメンバーの非共有結合によるものであってよい。このように、spsメンバーは固体支持体「と結び付いて」いる。
本明細書において使用されるとき、「と結び付いて」という句は、例えば、直接結合によるか又はスペーサー基を通しての一方の部分のもう一方の部分への共有結合、直接か又は部分に結合した特異的結合対メンバーを用いての一方の部分のもう一方の部分への非共有結合、一方の部分をもう一方の部分に溶解するか又は合成によるなどの一方の部分のもう一方の部分への取り込み、及び一方の部分をもう一方の部分上に被覆することを包含する。
増感剤又は化学発光化合物のようなspsメンバーと、ラテックス粒子との結び付きは、例えば、重合による粒子の形成中の取り込み、又は例えば、粒子中への非共有の溶解による予め形成された粒子への取り込みを伴うかもしれない。幾つかのアプローチにおいて、spsメンバーの溶液が使用される。使用できる溶媒は、例えば、アルコール類(例えば、エタノール、エトキシエタノール、メトキシエタノール、エチレングリコール及びベンジルアルコールを包含する);アミド類(例えば、ジメチルホルムアミド、ホルムアミド、アセトアミド及びテトラメチル尿素など);スルホキシド類(例えば、ジメチルスルホキシド及びスルホランなど);及びエーテル類(例えば、カルビトール、エチルカルビトール及びジメトキシエタンなど);及び水;並びに上記の2種以上の混合物を包含する。粒子が不溶性である高沸点を有する溶媒の使用は、粒子中への化合物の溶解を容易にするのに高温を使用することができ、特に適している。溶媒は、単独で又は組合せて使用してもよい。溶媒は、粒子から除去されるspsメンバーの固有の性質又は能力のために、これらのシグナル生成能力を妨げないように選択すべきである。幾つかの実施態様において、例えば、フタル酸ジブチル、ベンゾニトリル、ナフトニトリル、テレフタル酸ジオクチル、ジクロロベンゼン、ジフェニルエーテル及びジメトキシベンゼンのような、芳香族溶媒を利用することができる。
一般に、本手順において利用される温度は、spsメンバー粒子からのシグナルの量を最大化するように選択される(ただし、粒子は、選択温度で融解又は凝集してはならない)。幾つかの実施態様において、高温が利用される。本手順のための温度は、約20℃〜約200℃、又は約50℃〜約170℃の範囲であろう。室温で不溶性に近い幾つかの化合物は、例えば、エタノール及びエチレングリコールのような低分子量アルコールに高温で可溶性であることが観測されている。カルボキシル化修飾ラテックス粒子は、このような温度で低分子量アルコールに耐用性があることが証明されている。
本組成物の幾つかの実施態様において、spsメンバーは、光増感剤を包含する増感剤、及び後に更に詳述される化学発光化合物よりなる群から選択される。
化学発光化合物(化学発光剤)は、化学的に活性化できる化合物であり、そしてこのような活性化の結果として、ある波長で発光する。化学発光剤の例は、特に限定されないが実例として、例えば、一重項酸素又は過酸化物と反応することによりヒドロペルオキシド又はジオキセタンを形成できるオレフィン(これはケトン又はカルボン酸誘導体に分解することができる);光の作用により分解することができる安定なジオキセタン;一重項酸素と反応することによりジケトンを形成できるアセチレン;ルミノールのようなアゾ化合物又はアゾカルボニルを形成できるヒドラゾン又はヒドラジド;及びエンドペルオキシドを形成できる芳香族化合物を包含する。活性化反応の結果として、化学発光剤は、直接的又は間接的に発光を引き起こす。
増感剤は、化学発光化合物の活性化のための、例えば、一重項酸素のような反応性中間体の生成のための分子、通常は化合物である。本組成物の幾つかの実施態様において、増感剤は光増感剤である。化学活性化できる(例えば、酵素及び金属塩により)他の増感剤は、特に限定されないが一例として、外部光源による活性化によって、又はあまり好ましくないがこれによらずに、一重項酸素を生成できる他の物質及び組成物を包含する。例えば、ある種の化合物が、一重項酸素及び水への過酸化水素の変換を触媒することが証明されている。また光増感剤の範囲には、真の増感剤ではないが、熱、光、電離放射線、又は化学活性化により励起すると、一重項酸素の分子を放出する化合物も包含される。この種類の化合物の最もよく知られているメンバーは、1,4−ビスカルボキシエチル−1,4−ナフタレンエンドペルオキシド、9,10−ジフェニルアントラセン−9,10−エンドペルオキシド及び5,6,11,12−テトラフェニルナフタレン−5,12−エンドペルオキシドのようなエンドペルオキシド類を包含する。これらの化合物が、加熱又は直接的な光の吸収により一重項酸素を放出する。
光増感剤は、例えば、光での励起による一重項酸素の生成によっての、光活性化合物の活性化のための増感剤である。光増感剤は、光活性化可能であり、そして、例えば、色素及び芳香族化合物を包含し、そして通常は共有結合した原子からなる化合物であり、通常は複数の共役二重又は三重結合を伴う。この化合物は、200〜1,100nm、又は300〜1,000nm、又は450〜950nmの波長範囲の光を、その励起波長で500M−1cm−1を上回る、又は5,000M−1cm−1を上回る、又は50,000M−1cm−1を上回るそれの最大吸光度の吸光係数で吸収するはずである。光増感剤は、比較的光安定性であり、そして好ましくは、一重項酸素と効率よく反応しない。光増感剤の例は、特に限定されないが実例として、例えば、アセトン、ベンゾフェノン、9−チオキサントン、エオシン、9,10−ジブロモアントラセン、メチレンブルー、ヘマトポルフィリンのようなメタロ−ポルフィリン、フタロシアニン、クロロフィル、ローズベンガル、及びバックミンスターフラーレン、並びにこれらの化合物の誘導体を包含する。
本組成物の実施態様に利用できる化学発光化合物及び光増感剤の例は、米国特許第5,340,716号(Ullmanら)に明記されており、この開示の相当部分は引用例として本明細書に取り込まれる。
幾つかの実施態様において、アルデヒド又はアルデヒド誘導体を含む重合モノマー(第1の重合モノマー)のペンダント部分は、下記式:
−C(O)−A−(CH−G
[式中、
Aは、O又はNRであり、そしてここで、Rは、H、又は例えば、1〜6個、若しくは1〜5個、若しくは1〜4個、若しくは1〜3個、若しくは1〜2個、若しくは2〜6個、若しくは2〜5個、若しくは2〜4個、若しくは2〜3個、若しくは3〜6個、若しくは3〜5個、若しくは3〜4個、若しくは4〜6個、若しくは4〜5個、若しくは5〜6個の炭素原子のアルキルであり;
nは、例えば、1〜10、又は1〜9、又は1〜8、又は1〜7、又は1〜6、又は1〜5、又は1〜4、又は1〜3、又は1〜2、又は2〜10、又は2〜9、又は2〜8、又は2〜7、又は2〜6、又は2〜5、又は2〜4、又は2〜3、又は3〜10、又は3〜9、又は3〜8、又は3〜7、又は3〜6、又は3〜5、又は3〜4、又は4〜10、又は4〜9、又は4〜8、又は4〜7、又は4〜6、又は4〜5、5〜10、又は5〜9、又は5〜8、又は5〜7、又は5〜6、6〜10、又は6〜9、又は6〜8、又は6〜7、又は7〜10、又は7〜9、又は7〜8、又は8〜10、又は8〜9、又は9〜10であり;そして
Gは、CHO;CH(OR(ここで、Rは、例えば、1〜6個、又は1〜5個、又は1〜4個、又は1〜3個、又は1〜2個、又は2〜6個、又は2〜5個、又は2〜4個、又は2〜3個、又は3〜6個、又は3〜5個、又は3〜4個、又は4〜6個、又は4〜5個、又は5〜6個の炭素原子のアルキルである);COOH、又は例えば、エステル若しくはアミドのようなその誘導体;NR(ここで、Rは、H又は1〜6個の炭素原子のアルキルである);特異的結合対のメンバーである]で示される。
幾つかの実施態様において、少なくとも1個の炭素原子及び少なくとも2個のヘテロ原子を含む重合モノマーのペンダント部分は、下記式(i)〜(iii)を有する:
(i) −COOR10[ここで、R10は、H、又は例えば、1〜6個、若しくは1〜5個、若しくは1〜4個、若しくは1〜3個、若しくは1〜2個、若しくは2〜6個、若しくは2〜5個、若しくは2〜4個、若しくは2〜3個、若しくは3〜6個、若しくは3〜5個、若しくは3〜4個、若しくは4〜6個、若しくは4〜5個、若しくは5〜6個の炭素原子のアルキルである];
(ii) 下記式:
Figure 0005819417

[式中、wは、2〜4、又は2〜3、又は3〜4、又は2、又は3、又は4である];又は
(iii) −C(O)−X−(CH−(Y)−(CH−Z
[式中、
Xは、O又はNRであり、そしてここで、Rは、H、又は例えば、1〜6個、若しくは1〜5個、若しくは1〜4個、若しくは1〜3個、若しくは1〜2個、若しくは2〜6個、若しくは2〜5個、若しくは2〜4個、若しくは2〜3個、若しくは3〜6個、若しくは3〜5個、若しくは3〜4個、若しくは4〜6個、若しくは4〜5個、若しくは5〜6個の炭素原子のアルキルであり;
Yは、−(CHO)−(ここで、mは、例えば、1〜100、又は2〜100、又は3〜100、又は4〜100、又は1〜90、又は1〜80、又は1〜70、又は1〜60、又は1〜50、又は1〜40、又は1〜30、又は1〜20、又は1〜10、又は1〜5、又は5〜100、又は5〜90、又は5〜80、又は5〜70、又は5〜60、又は5〜50、又は5〜40、又は5〜30、又は5〜20、又は5〜10、又は10〜100、又は10〜90、又は10〜80、又は10〜70、又は10〜60、又は10〜50、又は10〜40、又は10〜30、又は10〜20である);又は>N(R)(ここで、R及びRは、独立にH、又は例えば、1〜6個、若しくは1〜5個、若しくは1〜4個、若しくは1〜3個、若しくは1〜2個、若しくは2〜6個、若しくは2〜5個、若しくは2〜4個、若しくは2〜3個、若しくは3〜6個、若しくは3〜5個、若しくは3〜4個、若しくは4〜6個、若しくは4〜5個、若しくは5〜6個の炭素原子のアルキルである)であり;
pは、例えば、0〜10、又は0〜9、又は0〜8、又は0〜7、又は0〜6、又は0〜5、又は0〜4、又は0〜3、又は0〜2、又は0〜1、又は1〜10、又は1〜9、又は1〜8、又は1〜7、又は1〜6、又は1〜5、又は1〜4、又は1〜3、又は1〜2、又は2〜10、又は2〜9、又は2〜8、又は2〜7、又は2〜6、又は2〜5、又は2〜4、又は2〜3、又は3〜10、又は3〜9、又は3〜8、又は3〜7、又は3〜6、又は3〜5、又は3〜4、又は4〜10、又は4〜9、又は4〜8、又は4〜7、又は4〜6、又は4〜5、又は5〜10、又は5〜9、又は5〜8、又は5〜7、又は5〜6、又は6〜10、又は6〜9、又は6〜8、又は6〜7、又は7〜10、又は7〜9、又は7〜8、又は8〜10、又は8〜9、又は9〜10であって、Yが、>N(R)であるとき、少なくとも1であり;
qは、0又は1であり;
rは、例えば、0〜10、又は0〜9、又は0〜8、又は0〜7、又は0〜6、又は0〜5、又は0〜4、又は0〜3、又は0〜2、又は0〜1、又は1〜10、又は1〜9、又は1〜8、又は1〜7、又は1〜6、又は1〜5、又は1〜4、又は1〜3、又は1〜2、又は2〜10、又は2〜9、又は2〜8、又は2〜7、又は2〜6、又は2〜5、又は2〜4、又は2〜3、又は3〜10、又は3〜9、又は3〜8、又は3〜7、又は3〜6、又は3〜5、又は3〜4、又は4〜10、又は4〜9、又は4〜8、又は4〜7、又は4〜6、又は4〜5、又は5〜10、又は5〜9、又は5〜8、又は5〜7、又は5〜6、又は6〜10、又は6〜9、又は6〜8、又は6〜7、又は7〜10、又は7〜9、又は7〜8、又は8〜10、又は8〜9、又は9〜10であって、Yが、>N(R)であるとき、少なくとも1であり;
Zは、SO ;例えば、1〜6個、若しくは1〜5個、若しくは1〜4個、若しくは1〜3個、若しくは1〜2個、若しくは2〜6個、若しくは2〜5個、若しくは2〜4個、若しくは2〜3個、若しくは3〜6個、若しくは3〜5個、若しくは3〜4個、若しくは4〜6個、若しくは4〜5個、若しくは5〜6個の炭素原子のアルキル;又は−(CHOH)(CHCH(ここで、tは、例えば、1〜5、又は1〜4、又は1〜3、又は1〜2、又は2〜5、又は2〜4、又は2〜3、又は3〜5、又は3〜4、又は4〜5であり、そしてuは、例えば、0〜10、又は0〜9、又は0〜8、又は0〜7、又は0〜6、又は0〜5、又は0〜4、又は0〜3、又は0〜2、又は0〜1、又は1〜10、又は1〜9、又は1〜8、又は1〜7、又は1〜6、又は1〜5、又は1〜4、又は1〜3、又は1〜2、又は2〜10、又は2〜9、又は2〜8、又は2〜7、又は2〜6、又は2〜5、又は2〜4、又は2〜3、又は3〜10、又は3〜9、又は3〜8、又は3〜7、又は3〜6、又は3〜5、又は3〜4、又は4〜10、又は4〜9、又は4〜8、又は4〜7、又は4〜6、又は4〜5、又は5〜10、又は5〜9、又は5〜8、又は5〜7、又は5〜6、又は6〜10、又は6〜9、又は6〜8、又は6〜7、又は7〜10、又は7〜9、又は7〜8、又は8〜10、又は8〜9、又は9〜10である)である]。
幾つかの実施態様において、ペンダント部分は、約4個の炭素原子及び約3個のヘテロ原子を含む。幾つかの実施態様において、ペンダント部分は、約8個の炭素原子及び約7個のヘテロ原子を含む。幾つかの実施態様において、ペンダント部分は、約4個の炭素原子及び約2個のヘテロ原子を含む。幾つかの実施態様において、ペンダント部分は、約1個の炭素原子及び約2個のヘテロ原子を含む。
本組成物を利用できるアッセイの一般的な説明
以下の考察は、実例として挙げられ特に限定されない。本組成物は、粒子試薬を利用する任意のアッセイにおいて利用できる。本組成物は、非被覆粒子が疎水性表面を有するポリマー被覆粒子を利用するアッセイに特に応用される。このアッセイは、アッセイ成分又は生成物の分離もなしに(均一系)又は分離を伴って(不均一系)のいずれかで実施できる。不均一系アッセイは、通常1つ以上の分離工程を伴い、競合法であっても非競合法であってもよい。
免疫測定法は、標識又は非標識試薬を含んでよい。非標識試薬を伴う免疫測定法は、通常1種以上の抗体を伴う比較的大きな複合体の形成を含む。このようなアッセイは、例えば、免疫沈降法及び凝集法、並びに抗体複合体の検出のための対応する光散乱法(例えば、ネフェロメトリーなど)及び比濁法を包含する。標識免疫測定法は、化学発光免疫測定法、酵素免疫測定法、蛍光偏光免疫測定法、放射免疫測定法、阻害アッセイ、誘起ルミネセンス、蛍光酸素チャネリングアッセイなどを包含する。
試料中の分析対象の存在及び/又は量を決定するために本組成物の実施態様を利用できる免疫測定法の1つの一般的な群は、限定濃度のアッセイ試薬の1つを用いる免疫測定法を包含する。免疫測定法の別の群は、過剰の1種以上の主要試薬の使用を伴う。免疫測定法の別の群は、標識試薬が、本組成物と試料中の分析対象との結合による標識シグナルを調節する、分離不要の均一系アッセイである。
典型的な競合不均一系アッセイにおいて、分析対象に結合するsbpメンバーを含む本組成物の実施態様は、分析対象を含有することが疑われる試料を含有する媒体と接触させ、本組成物のspsメンバーと反応性の、又はspsメンバーの活性化の産物と反応性の標識に分析対象を結合させる。本組成物のspsメンバーの活性化により、分析対象が存在すれば標識からシグナルが生成し、これを従来法により測定して、試料中の分析対象の量と関連付けられる。
典型的な非競合サンドイッチアッセイにおいて、免疫サンドイッチ複合体がアッセイ媒体中に生成する。複合体は、分析対象、本組成物のsbpメンバー(第1のsbpメンバー)及び分析対象に結合するか又は第1のsbpメンバーに結合する第2のsbpメンバーを含む。続いて、免疫サンドイッチ複合体を検出して、試料中の分析対象の量と関連付けられる。この免疫サンドイッチ複合体は、複合体中の本組成物の標識及び第2のsbpメンバーの標識の1種以上の存在のおかげで検出される。
幾つかの既知のアッセイは、第1及び第2のspsメンバーを使用するシグナル生成システムを利用する。spsメンバーは、spsの一方のメンバーの活性化が、例えば、光のような産物を生成させ、これによってspsのもう一方のメンバーの活性化が起こるという点で関連している。
サンドイッチアッセイにおける1つのアプローチにおいて、本組成物の第1のインキュベーション物を、分析対象を含有することが疑われる試料を含有する媒体と接触させる。洗浄及び分離工程後、本組成物の支持体を、第2のインキュベーション期間、酵素のような標識を含有する、例えば、分析対象に対する抗体のような第2のsbpメンバーを含有する媒体と接触させる。標識は、一方の標識の活性化が、媒体中に分析対象が存在するならば、もう一方の標識を活性化するという点で関連している。支持体は、再度洗浄して、媒体から分離し、そして媒体又は支持体のいずれかをシグナルの存在について検査する。シグナルの存在及び量は、分析対象の存在又は量と関連付けられる。
上記サンドイッチアッセイの変形態様において、適切な媒体中の分析対象を含有することが疑われる試料を、分析対象に対する標識抗体と接触させ、一定時間インキュベートする。次に、この媒体を、上記の標識抗体の標識に関連する標識を含む本組成物と接触させる。インキュベーション期間後、支持体を媒体から分離して、洗浄することにより非結合試薬を除去する。分析対象の存在又は量に関連するシグナルの存在について支持体又は媒体を検査する。上記の別の変形態様において、試料、本組成物及び標識抗体を媒体中に合わせて、単一インキュベーション工程でインキュベートする。分離、洗浄工程及びシグナルに関する検査は、上記のとおりである。
既知のアッセイの幾つかの実施態様において、spsメンバーは、例えば、光増感剤のような増感剤、及び化学発光組成物(ここで、増感剤の活性化により、化学発光組成物を活性化する生成物が生じる)を含む。第2のspsメンバーは、通常、結合及び/又は非結合spsメンバーの量、即ち、検出される分析対象に、又は検出すべき分析対象の量を反映する物質に、結合しているか又は結合してないspsメンバーの量に関連する検出可能なシグナルを生成する。本発明の実施態様において、本組成物は、増感剤試薬又は化学発光試薬のいずれか一方を含むことができる。
このようなアッセイの実施態様において、アッセイが本実施態様の組成物を使用し、組成物のspsメンバーとして増感剤又は化学発光化合物を包含する、誘起ルミネセンス免疫測定法を利用できる。誘起ルミネセンス免疫測定法は、米国特許第5,340,716号(Ullman)に参照されるが、この開示は引用例として本明細書に取り込まれる。本実施態様の1つのアプローチにおいて、アッセイは、本実施態様のコポリマーで被覆され、それと共に光増感剤及び第1のsbpメンバーが結び付いた粒子を使用する。化学発光試薬は、第2のsbpメンバーを含む。媒体中の分析対象の存在と関連して、sbpメンバーが、分析対象に結合することにより複合体を形成するか、又は第1のsbpメンバーが、第2のsbpメンバーに結合することにより複合体を形成する。分析対象が存在するならば、光増感剤及び化学発光化合物は、分析対象の存在に基づく結合のために、極めて接近する。光増感剤は、一重項酸素を生成し、2つの標識が接近すると化学発光試薬を活性化する。活性化化学発光試薬は、次に発光する。発光の量は、生成した複合体の量に関連付けられ、そして順に存在する分析対象の量に関連付けられる。
誘起ルミネセンスアッセイの幾つかの実施態様において、アビジン又はストレプトアビジンに結合した光増感剤粒子を利用する。分析対象に結合するビオチン化sbpメンバーもまた利用される。spsメンバーが化学発光試薬であり、sbpメンバーが分析対象に結合する、本組成物の実施態様は、検出系の一部として利用される。反応媒体をインキュベートすることにより、アビジンとビオチンとの間の結合のために、光増感剤粒子がビオチン化sbpメンバーに結合でき、また本組成物の一部である分析対象に対する結合パートナーが分析対象に結合できる。次に、媒体を光照射することにより、光増感剤を励起させるが、これは、その励起状態で酸素を一重項状態に活性化することができる。化学発光試薬は、分析対象の存在のために光増感剤に極めて接近しているため、一重項酸素により活性化され、発光する。次に媒体をルミネセンス又は発光の存在及び/又は量について検査するが、その存在は、分析対象の存在及び/又は量に関連している。
アッセイできる分析対象の濃度は、一般に約10−5〜約10−17M、又は約10−6〜約10−14Mを変動する。このアッセイが定性的か、半定量的か又は定量的(試料中に存在する分析対象の量に対して)か、特定の検出法及び分析対象の期待濃度のような考察が、普通は種々の試薬の濃度を決定する。
アッセイ媒体中の種々の試薬の濃度は、一般に分析対象の対象の濃度範囲、アッセイの性質などにより決定される。しかし試薬のそれぞれの最終濃度は、普通は経験的に、その範囲にわたるアッセイの感度を最適化するように決定される。即ち、重要な分析対象の濃度の変化は、正確に測定可能なシグナルの差を提供すべきである。例えば、シグナル生成システムの性質及び分析対象の性質のような考察が、種々の試薬の濃度を決定する。
上記のとおり、試料及び試薬は媒体中に組合せて提供される。媒体への添加の順序は変化してもよいが、本明細書に記載されるアッセイ様式の幾つかの実施態様にはある種の優先傾向が存在するだろう。当然添加の最も単純な順序は、全ての材料を同時に添加して、均一系アッセイ中のようにアッセイ媒体がシグナルに及ぼす効果を決定することである。あるいは、試薬のそれぞれ、又は試薬の群は、逐次合わせることができる。幾つかの実施態様において、上記のように各添加に続けて、インキュベーション工程を含めることができる。不均一系アッセイにおいて、1つ以上のインキュベーション工程の後に洗浄工程もまた利用することができる。
本組成物の実施態様を利用するアッセイ方法
上記のとおり、本発明の実施態様は、試料中の分析対象の存在及び量の1つ以上を決定する方法である。分析対象は、検出及び/又は定量すべき、対象の物質又は化合物又は組成物である。分析対象は、例えば、薬物、代謝物、殺虫剤及び汚染物質を包含する。代表的分析対象は、特に限定されないが実例として、アルカロイド、ステロイド、ラクタム、アミノアルキルベンゼン、ベンズヘテロサイクリック(benzheterocyclics)、プリン、マリファナから誘導される薬物、ホルモン、タンパク質を包含するポリペプチド、免疫抑制物質、ビタミン、プロスタグランジン、三環系抗うつ薬、抗悪性腫瘍薬、ヌクレオシド及びヌクレオチド(ポリヌクレオシド及びポリヌクレオチドを包含する)、種々の個別の薬物(メタドン、メプロバメート、セロトニン、メペリジン、リドカイン、プロカインアミド、アセチルプロカインアミド、プロプラノロール、グリセオフルビン、バルプロ酸、ブチロフェノン、抗ヒスタミン、クロラムフェニコール、抗コリン作動性薬物を包含する)、並びに上記全ての代謝物及び誘導体を包含する。また包含されるものは、病態に関連する代謝物、アミノグリコシド(ゲンタマイシン、カナマイシン、トブラマイシン、及びアミカシンなど)、及び殺虫剤(例えば、ポリハロゲン化ビフェニル、リン酸エステル、チオリン酸エステル、カルバメート及びポリハロゲン化スルフェンアミドなど)並びにこれらの代謝物及び誘導体である。分析対象という用語はまた、ポリペプチド及びタンパク質、多糖及び核酸の2種以上の組合せを包含する。このような組合せは、例えば、細菌、ウイルス、染色体、遺伝子、ミトコンドリア、核及び細胞膜の成分を包含する。タンパク質分析対象は、例えば、イムノグロブリン、サイトカイン、酵素、ホルモン、癌抗原、栄養マーカー及び組織特異的抗原を包含する。このようなタンパク質は、特に限定されないが実例として、プロタミン、ヒストン、アルブミン、グロブリン、硬タンパク質、リンタンパク質、ムコタンパク質、色素タンパク質、リポタンパク質、核タンパク質、糖タンパク質、T細胞受容体、プロテオグリカン、HLA、未分類タンパク質、例えば、ソマトトロピン、プロラクチン、インスリン、ペプシン、ヒト血漿中に見い出されたタンパク質、血液凝固因子、タンパク質ホルモン(例えば、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体刺激ホルモン、プロラクチン、絨毛性ゴナドドロピンなど)、組織ホルモン、サイトカイン、癌抗原(例えば、PSA、CEA、α−フェトプロテイン、酸ホスファターゼ、CA19.9、CA15.3及びCA125など)、組織特異的抗原(例えば、アルカリホスファターゼ、ミオグロビン、CPK−MB及びカルシトニンなど)、及びペプチドホルモンを包含する。他の対象のポリマー材料は、ムコ多糖及び多糖である。上記のとおり、分析対象という用語は、例えば、m−RNA、r−RNA、t−RNA、DNA及びDNA−RNA二本鎖のような、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチド分析対象を更に包含する。
試験すべき試料は、非生物学的又は生物学的であってよい。「非生物学的試料」は、生物学的材料に関連しないものであり、そして例えば、土壌試料、水試料及び鉱物試料を包含する。「生物学的試料」という句は、例えば、体液、組織などのような任意の生物学的材料のことをいい、そしてこれは、哺乳動物の体から得られる。体液は、例えば、全血、血漿、血清、間質液、汗、唾液、尿、精液、水疱液、炎症性滲出液、糞便、喀痰、脳脊髄液、涙、粘液、リンパ液、膣粘液などを包含する。生物学的組織は、臓器又はホストの他の身体部位から切除された組織、例えば、組織生検;毛髪及び皮膚などを包含する。
本方法は、媒体中に組合せて、試料(前処理をしてもしなくともよい)、及び本組成物の実施態様(支持体と結び付いたsbpメンバーを含む)を提供することを含む。sbpメンバーは、分析対象に又は第2のsbpメンバーに結合することにより分析対象の存在に関連する複合体を形成する。sbpメンバーは、表面上又は孔中に面積を占める2種の異なる分子の一方であり、これはもう一方の分子に特異的に結合し、そのためもう一方の分子の特定の空間及び極性の組織と相補的であると定義される。このsbpメンバーは、通常は抗原−抗体のような免疫学的対のメンバーであろうが、ビオチン−アビジン、ホルモン−ホルモン受容体、酵素−基質、核酸二本鎖、IgG−プロテインA、ポリヌクレオチド対(例えば、DNA−DNA、DNA−RNAなど)のような他の特異的結合対は、免疫学的対ではないが、sbpメンバーという句の範囲に含まれる。幾つかの実施態様において、以下に更に充分に説明されるように実施されるアッセイの性質に応じて、例えば、他のsbpメンバー及び他のspsメンバーのような他の試薬が、媒体中に包含される。
試料は、任意の便利な媒体中に調製することができる。例えば、試料は、アッセイ媒体中に調製してもよく、これは本明細書で更に充分に後述される。幾つかの場合に、試料に、例えば、血球を溶解するなどのために前処理を適用してもよい。このような前処理は、通常は、続くアッセイを妨害しない媒体中で実施される。前処理には水性媒体が好ましい。
sbpメンバーは、組成物の支持体と結び付いている。幾つかの実施態様において、sbpメンバーは、固体支持体上に被覆したコポリマーに共有結合している。幾つかの実施態様において、コポリマーは、固体支持体のコポリマーコーティングのアルデヒド担持部位に共有結合している。
幾つかの実施態様において適度なpHの水性緩衝媒体である、アッセイ媒体は、一般に最適なアッセイ感度を提供するものである。この水性媒体は、単に水であっても、又は0.1〜約40容量パーセントの共溶媒(例えば、水混和性有機溶媒、例えば、アルコール、エーテル又はアミドなど)を包含してもよい。媒体のpHは、通常、例えば、約4〜約11の範囲に、又は約5〜約10の範囲に、又は約6.5〜約9.5の範囲になるだろう。使用されるpHは、しばしば任意の特異的結合対の結合メンバーの最適結合と、アッセイの他の試薬(例えば、シグナル生成システムのメンバーなど)に最適なpHとの間の妥協の結果である。所望のpHを達成し、かつ測定中pHを維持するために、種々の緩衝液を使用することができる。緩衝液の実例は、ホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、トリス、バルビタール、PIPES、HEPES、MES、ACES、MOPS、BICINEなどを包含する。使用される特定の緩衝液は、決定的に重要なものではないが、個々のアッセイにおいてあれやこれやの緩衝液が好ましいであろう。
アッセイ方法において種々の補助材料を使用してもよい。例えば、緩衝液の他に、媒体は、媒体のための及び使用される試薬のための安定化剤を含むことができる。幾つかの実施態様において、これらの添加剤の他に、媒体は、例えば、アルブミンのようなタンパク質;例えば、ホルムアミドのような有機溶媒;第4級アンモニウム塩;例えば、硫酸デキストランのようなポリアニオン;結合増強剤、例えば、ポリアルキレングリコール;デキストランのような多糖、トレハロースなどを包含してもよい。媒体はまた、血栓の生成を防ぐための物質を含むことができる。このような物質は、当該分野において周知であり、例えば、EDTA、EGTA、クエン酸塩及びヘパリンを包含する。媒体はまた、例えば、アジ化ナトリウム、硫酸ネオマイシン、PROCLIN(登録商標)300及びストレプトマイシンのような、当該分野において知られているような1種以上の保存料を含むことができる。上記物質のいずれもが、使用されるならば、所望の効果又は機能を達成するのに充分な濃度又は量で存在する。
上記のとおり、利用されるアッセイの性質に応じて、媒体は、例えば、低分子、追加の粒子、追加のspsメンバー及び追加の結合物質(1種以上のsbpメンバー(例えば、抗体)など)のような、更に1種以上の成分(これらは、本組成物の一部であるものとは異なる)を含むことができる。更に、再び利用されるアッセイの性質に応じて、初期の組合せとして、又は後に加えて、他の試薬を包含させてもよい。
本組合せは、複合体を形成することになる、組成物への分析対象の結合のための条件に付される。このような条件は、上記のものを包含するアッセイに使用する種々の試薬(その幾つか又は全てが、初期の組合せに含まれていてもよい)の添加の間の任意の間隔を包含する1回以上の間隔を空けて媒体に適用できる、1つ以上のインキュベーション期間を包含することができる。媒体は、通常試薬の種々の成分の結合、及び相補的sbpメンバー(例えば、分析対象と相補的sbpメンバー、又は第1及び第2のsbpメンバー)の間の結合が起こるのに充分な温度及び時間でインキュベートする。測定の期間中、本方法を実行するために適度な温度、そして通常一定の温度、好ましくは、室温が普通は利用される。幾つかの実施態様において、インキュベーション温度は、例えば、約5°〜約99℃、又は約15℃〜約70℃、又は約20℃〜約45℃の範囲である。インキュベーションの時間は、例えば、約0.2秒間〜約24時間、又は約1秒間〜約6時間、又は約2秒間〜約1時間、又は約1〜約15分間である。この時間は、媒体の温度及び種々の試薬の結合の速度に依存するが、例えば、会合速度定数、濃度、結合定数及び解離速度定数の1つ以上により決定される。
上記のインキュベーション時間に続いて、もしあれば、spsメンバーが活性化し、そして分析対象とsbpメンバーとの間で、又はsbpメンバーとsbpメンバーの間で生成される複合体の量(これが、分析対象を示す)を検出する。複合体の量は、試料中の分析対象の存在及び量の一方又は両方に関連している。複合体の検出は、例えば、実行されるアッセイの性質、spsメンバーの性質、及びsbpメンバーの性質に依存する。
ある実施態様において、本発明は、試料中の分析対象の存在及び量の1つ以上を決定する方法である。媒体中の組合せが提供される。この組合せは、試料、並びにシグナル生成システムのメンバー、分析対象に又は第2のsbpメンバーに結合して分析対象の存在に関連する複合体を形成する特異的結合対のメンバーを含む粒子、及びコポリマーのコーティングを含む組成物を含む。コポリマーは、下記式:
Figure 0005819417

[式中、
Dは、(i)〜(iii):
(i) −COOR10(ここで、R10は、H、又は例えば、1〜6個、若しくは1〜5個、若しくは1〜4個、若しくは1〜3個、若しくは1〜2個、若しくは2〜6個、若しくは2〜5個、若しくは2〜4個、若しくは2〜3個、若しくは3〜6個、若しくは3〜5個、若しくは3〜4個、若しくは4〜6個、若しくは4〜5個、若しくは5〜6個の炭素原子のアルキルである);
(ii) 下記式:
Figure 0005819417

(式中、wは、上記と同義である)で示される基;又は
(iii) −C(O)−X−(CH−(Y)−(CH−Z
(式中、
A、R、n、G、R、X、R、Y、m、R、R、p、q、r、Z、t及びuは、上記と同義である)であり;
、R及びRは、独立にH、又は例えば、1〜6個、若しくは1〜5個、若しくは1〜4個、若しくは1〜3個、若しくは1〜2個、若しくは2〜6個、若しくは2〜5個、若しくは2〜4個、若しくは2〜3個、若しくは3〜6個、若しくは3〜5個、若しくは3〜4個、若しくは4〜6個、若しくは4〜5個、若しくは5〜6個の炭素原子のアルキルであり;そして
x及びyは、独立に例えば、1〜約1000、又は1〜約800、又は1〜約600、又は1〜約400、又は1〜約200、又は1〜約100、又は約5〜約1000、又は約5〜約800、又は約5〜約600、又は約5〜約400、又は約5〜約200、又は約5〜約100、又は約10〜約1000、又は約10〜約800、又は約10〜約600、又は約10〜約400、又は約10〜約200、又は約10〜約100、又は約50〜約1000、又は約50〜約800、又は約50〜約600、又は約50〜約400、又は約50〜約200、又は約50〜約100、又は約100〜約1000、又は約100〜約800、又は約100〜約600、又は約100〜約400、又は約100〜約200である]を有する。
この組合せは、複合体を形成することになる、分析対象への又は第2の特異的結合対メンバーへの特異的結合対のメンバーの結合の条件に付される。シグナル生成システムのメンバーを活性化して、複合体の量を検出する。複合体の量は、試料中の分析対象の存在及び量の1つ以上に関連している。
上記方法の幾つかの実施態様において、本組成物のシグナル生成システムのメンバーは、光増感剤であり、そしてこの組合せは更に、そこに結び付いている化学発光化合物を有しており、かつ下記式:
Figure 0005819417

[式中、
Dは、(i)〜(iii):
(i) −COOR10(ここで、R10は、上記と同義である);
(ii) 下記式:
Figure 0005819417

(式中、wは、上記と同義である)で示される基;又は
(iii) −C(O)−X−(CH−(Y)−(CH−Z’
(式中、
A、R、n、G、R、X、R、Y、m、R、R、p、q、r、t、u、R、R、R、x及びyは、上記と同義であり、そして
Z’は、SO ;又は例えば、1〜6個、若しくは1〜5個、若しくは1〜4個、若しくは1〜3個、若しくは1〜2個、若しくは2〜6個、若しくは2〜5個、若しくは2〜4個、若しくは2〜3個、若しくは3〜6個、若しくは3〜5個、若しくは3〜4個、若しくは4〜6個、若しくは4〜5個、若しくは5〜6個の炭素原子のアルキルである)である]で示されるコポリマーのコーティングを有する粒子を含む化学発光試薬を含む。
上記方法の幾つかの実施態様において、本組成物のシグナル生成システムのメンバーは、化学発光化合物であり、そしてこの組合せは更に、そこに結び付いている光増感剤を有しており、かつ下記式:
Figure 0005819417

[式中、
Dは、(i)〜(iii):
(i) −COOR10(ここで、R10は、上記と同義である);
(ii) 下記式:
Figure 0005819417

(式中、wは、上記と同義である)で示される基;又は
(iii) −C(O)−X−(CH−(Y)−(CH−Z’
(式中、
A、R、n、G、R、X、R、Y、m、R、R、p、q、r、t、u、R、R、R、x及びyは、上記と同義であり、そして
Z’は、SO ;又は例えば、1〜6個、若しくは1〜5個、若しくは1〜4個、若しくは1〜3個、若しくは1〜2個、若しくは2〜6個、若しくは2〜5個、若しくは2〜4個、若しくは2〜3個、若しくは3〜6個、若しくは3〜5個、若しくは3〜4個、若しくは4〜6個、若しくは4〜5個、若しくは5〜6個の炭素原子のアルキルである)である]で示されるコポリマーのコーティングを有する粒子を含む光増感剤試薬を含む。
検査工程
アッセイ法の次の工程において、媒体は、分析対象を含む複合体の存在について検査する。複合体の存在及び量の一方又は両方は、試料中の分析対象の存在及び量の一方又は両方を示す。
「分析対象の量を測定」という句は、分析対象の定量的、半定量的及び定性的測定のことをいう。定量的、半定量的及び定性的である方法、更には分析対象を測定する他の全ての方法が、分析対象の量を測定する方法と考えられる。例えば、分析対象を含有することが疑われる試料中の分析対象の存在又は非存在を単に検出する方法は、本組成物を利用できるアッセイの範囲に含まれると考えられる。「検出」及び「測定」という用語、更には他のよく使われる測定の同義語は、アッセイ方法の範囲内で考慮される。
多くの実施態様において、媒体の検査は、媒体からのシグナルの検出を伴う。シグナルの存在及び量の一方又は両方は、試料中の分析対象の存在及び量の一方又は両方に関連している。検出の詳細な方式は、シグナル生成システムの性質に依存する。上述のとおり、シグナル生成システムの標識が、外部手段により検出可能なシグナルを生成できる多数の方法が存在する。シグナル生成システムの活性化は、シグナル生成システムメンバーの性質に依存する。
測定中の温度は、一般には例えば、約10°〜約70℃、又は約20°〜約45℃、又は約20°〜約25℃の範囲である。1つのアプローチにおいて、既知濃度の分析対象を用いて標準曲線が形成される。較正物質及び他の対照物質もまた使用できる。
任意の標識から生成したルミネセンス又は光は、目視により、写真により、光量計により、分光光度計により又はその量を測定するための任意の他の便利な手段により測定できるが、これは、媒体中の分析対象の量に関連している。シグナルの存在及び量の一方又は両方の検査はまた、シグナルの検出を包含するが、これは、一般には単にシグナルが読まれる工程である。シグナルは普通は器具を用いて読まれるが、その性質は、シグナルの性質に依存する。器具は、例えば、分光光度計、蛍光光度計、吸光度計、照度計、又はケミルミノメーターであってよい。
アッセイを実施するための試薬を含むキット
ある分析対象の特定のアッセイを実施するための本組成物及び他の試薬の実施態様は、分析対象を測定するためのアッセイを便利に実行するのに有用なキットとして存在することができる。幾つかの実施態様において、キットは、包装された組合せ中に本実施態様の組成物(ここで、sbpメンバーは分析対象に対する抗体であり、そしてspsメンバーは光増感剤又は化学発光化合物である)を含む。幾つかの実施態様において、本組成物のspsメンバーに応じて、キットはまた、分析対象に対するsbpメンバーと結び付いている光増感剤又は化学発光化合物を包含する。このキットは更に、アッセイを実行するための他の試薬を包含するが、その性質は、特定のアッセイ方式に依存する。
試薬は、試薬の交差反応性及び安定性に応じて、それぞれ別々の容器に入れるか、又は種々の試薬を1つ以上の容器に合わせてもよい。このキットは更に、アッセイを実施するための他の別々に包装された試薬(例えば、追加のsbpメンバー、spsメンバー及び補助試薬など)を包含することができる。
キット中の種々の試薬の相対量は、本方法中に起こる必要がある反応を実質的に最適化する試薬の濃度を提供するため、そして更にアッセイの感度を実質的に最適化するために広く変動させることができる。適切な状況下で、キット中の1つ以上の試薬は、賦形剤を包含する通常は凍結乾燥したドライパウダーとして提供することができ、これは、溶解により、本組成物の実施態様を利用する方法又はアッセイを実行するのに適切な濃度を有する試薬溶液を提供する。このキットは更に、上述の方法の記載された説明を包含することができる。
コポリマーの実施態様
以下のコポリマーの実施態様は、実例として述べられ、特に限定されるものではない。
幾つかの実施態様において、コポリマーは、下記式:
Figure 0005819417

[式中、
Aは、O又はNRであり、そしてここで、Rは、H、又は例えば、1〜6個、若しくは1〜5個、若しくは1〜4個、若しくは1〜3個、若しくは1〜2個、若しくは2〜6個、若しくは2〜5個、若しくは2〜4個、若しくは2〜3個、若しくは3〜6個、若しくは3〜5個、若しくは3〜4個、若しくは4〜6個、若しくは4〜5個、若しくは5〜6個の炭素原子のアルキルであり;
nは、例えば、1〜10、又は1〜9、又は1〜8、又は1〜7、又は1〜6、又は1〜5、又は1〜4、又は1〜3、又は1〜2、又は2〜10、又は2〜9、又は2〜8、又は2〜7、又は2〜6、又は2〜5、又は2〜4、又は2〜3、又は3〜10、又は3〜9、又は3〜8、又は3〜7、又は3〜6、又は3〜5、又は3〜4、又は4〜10、又は4〜9、又は4〜8、又は4〜7、又は4〜6、又は4〜5、5〜10、又は5〜9、又は5〜8、又は5〜7、又は5〜6、又は6〜10、又は6〜9、又は6〜8、又は6〜7、又は7〜10、又は7〜9、又は7〜8、又は8〜10、又は8〜9、又は9〜10であり;そして
G’は、CHO;CH(OR(ここで、Rは、例えば、1〜6個、又は1〜5個、又は1〜4個、又は1〜3個、又は1〜2個、又は2〜6個、又は2〜5個、又は2〜4個、又は2〜3個、又は3〜6個、又は3〜5個、又は3〜4個、又は4〜6個、又は4〜5個、又は5〜6個の炭素原子のアルキルである);特異的結合対のメンバーであり;
D’は、(i)〜(iii):
(i) −COOR10(ここで、R10は、H、又は例えば、1〜6個、若しくは1〜5個、若しくは1〜4個、若しくは1〜3個、若しくは1〜2個、若しくは2〜6個、若しくは2〜5個、若しくは2〜4個、若しくは2〜3個、若しくは3〜6個、若しくは3〜5個、若しくは3〜4個、若しくは4〜6個、若しくは4〜5個、若しくは5〜6個の炭素原子のアルキルである);
(ii) 下記式:
Figure 0005819417

(式中、wは、2〜4、又は2〜3、又は3〜4、又は2、又は3、又は4である);又は
(iii) −C(O)−X−(CH−(Y)−(CH−Z’
(式中、
Xは、O又はNRであり、そしてここで、Rは、H、又は例えば、1〜6個、若しくは1〜5個、若しくは1〜4個、若しくは1〜3個、若しくは1〜2個、若しくは2〜6個、若しくは2〜5個、若しくは2〜4個、若しくは2〜3個、若しくは3〜6個、若しくは3〜5個、若しくは3〜4個、若しくは4〜6個、若しくは4〜5個、若しくは5〜6個の炭素原子のアルキルであり;
Yは、−(CHO)−(ここで、mは、例えば、1〜100、又は2〜100、又は3〜100、又は4〜100、又は1〜90、又は1〜80、又は1〜70、又は1〜60、又は1〜50、又は1〜40、又は1〜30、又は1〜20、又は1〜10、又は1〜5、又は5〜100、又は5〜90、又は5〜80、又は5〜70、又は5〜60、又は5〜50、又は5〜40、又は5〜30、又は5〜20、又は5〜10、又は10〜100、又は10〜90、又は10〜80、又は10〜70、又は10〜60、又は10〜50、又は10〜40、又は10〜30、又は10〜20である);又は>N(R)(ここで、R及びRは、独立にH、又は例えば、1〜6個、若しくは1〜5個、若しくは1〜4個、若しくは1〜3個、若しくは1〜2個、若しくは2〜6個、若しくは2〜5個、若しくは2〜4個、若しくは2〜3個、若しくは3〜6個、若しくは3〜5個、若しくは3〜4個、若しくは4〜6個、若しくは4〜5個、若しくは5〜6個の炭素原子のアルキルである)であり;
pは、例えば、0〜10、又は0〜9、又は0〜8、又は0〜7、又は0〜6、又は0〜5、又は0〜4、又は0〜3、又は0〜2、又は0〜1、又は1〜10、又は1〜9、又は1〜8、又は1〜7、又は1〜6、又は1〜5、又は1〜4、又は1〜3、又は1〜2、又は2〜10、又は2〜9、又は2〜8、又は2〜7、又は2〜6、又は2〜5、又は2〜4、又は2〜3、又は3〜10、又は3〜9、又は3〜8、又は3〜7、又は3〜6、又は3〜5、又は3〜4、又は4〜10、又は4〜9、又は4〜8、又は4〜7、又は4〜6、又は4〜5、又は5〜10、又は5〜9、又は5〜8、又は5〜7、又は5〜6、又は6〜10、又は6〜9、又は6〜8、又は6〜7、又は7〜10、又は7〜9、又は7〜8、又は8〜10、又は8〜9、又は9〜10であって、Yが、>N(R)であるとき、少なくとも1であり;
qは、0又は1であり;
rは、例えば、0〜10、又は0〜9、又は0〜8、又は0〜7、又は0〜6、又は0〜5、又は0〜4、又は0〜3、又は0〜2、又は0〜1、又は1〜10、又は1〜9、又は1〜8、又は1〜7、又は1〜6、又は1〜5、又は1〜4、又は1〜3、又は1〜2、又は2〜10、又は2〜9、又は2〜8、又は2〜7、又は2〜6、又は2〜5、又は2〜4、又は2〜3、又は3〜10、又は3〜9、又は3〜8、又は3〜7、又は3〜6、又は3〜5、又は3〜4、又は4〜10、又は4〜9、又は4〜8、又は4〜7、又は4〜6、又は4〜5、又は5〜10、又は5〜9、又は5〜8、又は5〜7、又は5〜6、又は6〜10、又は6〜9、又は6〜8、又は6〜7、又は7〜10、又は7〜9、又は7〜8、又は8〜10、又は8〜9、又は9〜10であって、Yが、>N(R)であるとき、少なくとも1であり;そして
Z’は、SO ;例えば、1〜6個、又は1〜5個、又は1〜4個、又は1〜3個、又は1〜2個、又は2〜6個、又は2〜5個、又は2〜4個、又は2〜3個、又は3〜6個、又は3〜5個、又は3〜4個、又は4〜6個、又は4〜5個、又は5〜6個の炭素原子のアルキルである)であり;
、R及びRは、独立にH、又は例えば、1〜6個、若しくは1〜5個、若しくは1〜4個、若しくは1〜3個、若しくは1〜2個、若しくは2〜6個、若しくは2〜5個、若しくは2〜4個、若しくは2〜3個、若しくは3〜6個、若しくは3〜5個、若しくは3〜4個、若しくは4〜6個、若しくは4〜5個、若しくは5〜6個の炭素原子のアルキルであり;そして
x及びyは、独立に例えば、1〜約1000、又は1〜約800、又は1〜約600、又は1〜約400、又は1〜約200、又は1〜約100、又は約5〜約1000、又は約5〜約800、又は約5〜約600、又は約5〜約400、又は約5〜約200、又は約5〜約100、又は約10〜約1000、又は約10〜約800、又は約10〜約600、又は約10〜約400、又は約10〜約200、又は約10〜約100、又は約50〜約1000、又は約50〜約800、又は約50〜約600、又は約50〜約400、又は約50〜約200、又は約50〜約100、又は約100〜約1000、又は約100〜約800、又は約100〜約600、又は約100〜約400、又は約100〜約200である]を有する。
上記コポリマーの幾つかの実施態様において:
Aは、NRであり、そしてここで、Rは、上記と同義であり;
n、G、R、R、R、R、x及びyは、上記と同義であり;
D’は、−C(O)−X−(CH−(Y)−(CH−Z’
(式中、
Xは、Oであり;
Yは、>N(R)であり、そしてここで、R及びRは、上記と同義であり;
pは、例えば、1〜10、又は1〜9、又は1〜8、又は1〜7、又は1〜6、又は1〜5、又は1〜4、又は1〜3、又は1〜2、又は2〜10、又は2〜9、又は2〜8、又は2〜7、又は2〜6、又は2〜5、又は2〜4、又は2〜3、又は3〜10、又は3〜9、又は3〜8、又は3〜7、又は3〜6、又は3〜5、又は3〜4、又は4〜10、又は4〜9、又は4〜8、又は4〜7、又は4〜6、又は4〜5、又は5〜10、又は5〜9、又は5〜8、又は5〜7、又は5〜6、又は6〜10、又は6〜9、又は6〜8、又は6〜7、又は7〜10、又は7〜9、又は7〜8、又は8〜10、又は8〜9、又は9〜10であり;
qは、1であり;
rは、例えば、1〜10、又は1〜9、又は1〜8、又は1〜7、又は1〜6、又は1〜5、又は1〜4、又は1〜3、又は1〜2、又は2〜10、又は2〜9、又は2〜8、又は2〜7、又は2〜6、又は2〜5、又は2〜4、又は2〜3、又は3〜10、又は3〜9、又は3〜8、又は3〜7、又は3〜6、又は3〜5、又は3〜4、又は4〜10、又は4〜9、又は4〜8、又は4〜7、又は4〜6、又は4〜5、又は5〜10、又は5〜9、又は5〜8、又は5〜7、又は5〜6、又は6〜10、又は6〜9、又は6〜8、又は6〜7、又は7〜10、又は7〜9、又は7〜8、又は8〜10、又は8〜9、又は9〜10であり;そして
Z’は、SO である)である。
上記コポリマーの幾つかの実施態様において:
Aは、NHであり;
nは、1であり;
Gは、CHO;CH(OR(ここで、Rは、メチルである);特異的結合対のメンバーであり;
D’は、−C(O)−X−(CH−(Y)−(CH−Z’
(式中、
Xは、Oであり;
Yは、>N(R)であり、そしてここで、R及びRは、両方ともメチルであり;
pは、2であり;
qは、1であり;
rは、3であり;
Z’は、SO である)であり;
及びRは、独立にH又はメチルであり、かつRは、Hであり;そして
x及びyは、上記と同義である。
上記コポリマーの幾つかの実施態様において:
Aは、NRであり、そしてここで、Rは、上記と同義であり;
n、G、R、R、R、R、x及びyは、上記と同義であり;
D’は、−C(O)−X−(CH−(Y)−(CH−Z’
(式中、
Xは、Oであり;
Yは、−(CHO)−であり、そしてここで、mは、上記と同義であり;
pは、0であり;
qは、1であり;
rは、0であり;そして
Z’は、メチルである)である。
上記コポリマーの幾つかの実施態様において:
Aは、NHであり;
nは、1であり;
Gは、CHO;CH(OR(ここで、Rは、メチルである);特異的結合対のメンバーであり;
D’は、−C(O)−X−(CH−(Y)−(CH−Z’
(式中、
Xは、Oであり;
Yは、−(CHO)−であり、そしてここで、mは、上記と同義であり;
pは、0であり;
qは、1であり;
rは、0であり;そして
Z’は、メチルである)であり;
及びRは、独立にH又はメチルであり、かつRは、Hであり;そして
x及びyは、上記と同義である。
上記コポリマーの幾つかの実施態様において:
Aは、NRであり、そしてここで、Rは、H又は1〜6個の炭素原子のアルキルであり;
nは、1〜10であり;
G’は、CHO;CH(OR(ここで、Rは、1〜6個の炭素原子のアルキルである);又は特異的結合対のメンバーであり;
D’は、−COOHであり;
、R及びRは、独立にH又は1〜6個の炭素原子のアルキルであり;そして
x及びyは、独立に1〜1000である。
上記コポリマーの幾つかの実施態様において:
Aは、NHであり;
nは、1であり;
G’は、CHO;CH(OR(ここで、Rは、メチルである);又は特異的結合対のメンバーであり;
D’は、下記式:
Figure 0005819417

(式中、wは、3である)で示される基であり;
及びRは、独立にH又はメチルであり、かつRは、Hであり;そして
x及びyは、独立に1〜1000である。
定義
以下の定義は、上に特に定義されない用語及び句について提供される。
「少なくとも」という句は、本明細書に使用されるとき、特定される事項の数が、挙げられた数と等しいか又はこれより大きいことを意味する。
「約」という句は、本明細書に使用されるとき、挙げられた数が、プラスマイナス10%異なってもよいことを意味する;例えば、「約5」は、4.5〜5.5の範囲を意味する。
「第1」及び「第2」という指定は、例えば、「第1のspsメンバー」及び「第2のspsメンバー」、又は「第1の重合モノマー」及び「第2の重合モノマー」のように、2つの事項の間を区別する目的で専ら使用され、例えば、一方の事項がもう一方より順番又は順序又は重要性がどうかとか、あるいは添加の何らかの順序を暗示するものではない。
以下の実施例により、本発明の特定の実施態様を、特に限定されないが実例によって更に説明するが、これは、本発明を説明するものであって、その範囲を限定するものではない。本明細書に開示される部及び百分率は、特に断りない限り容量による。
実施例
材料:
特に断りない限り、試薬はSigma-Aldrich(Milwaukee, WI)から購入して、特に断りない限り受領時のまま使用した。
略語:
cTnI 心臓トロポニンI
cTnIフレックス Siemens製の市販のcTnIアッセイのFLEX(登録商標)カートリッジ
BSA ウシ血清アルブミン
LOCI 発光酸素チャネリング免疫測定法
HEPES ヒドロキシエチルピペラジン−エタンスルホン酸
洗浄緩衝液 50mM HEPES、pH8.0
BSA洗浄緩衝液 50mM HEPES−1.0mg/mL BSA、pH8.0
HPMA N−2−ヒドロキシプロピルメタクリルアミド
DMSO ジメチルスルホキシド
AIBN アゾビス(イソブチロニトリル)
PEG ポリ(エチレングリコール)
NaCNBH シアノ水素化ホウ素ナトリウム
MAMDMA メタクリルアミドアセトアルデヒドジメチルアセタール
THF テトラヒドロフラン
HCl 塩酸
NaOH 水酸化ナトリウム
TAPS N−トリス−(ヒドロキシメチル)メチル−3−アミノプロピルスルホン酸
TAPS緩衝液 TAPSナトリウム塩緩衝液、50mM、pH9.0
MES 2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸
MES緩衝液 50mM MES緩衝液、pH5.0
STUT テトラフルオロホウ酸N,N,N’,N’−テトラメチル−O−(N−スクシンイミジル)−ウロニウム
DMF ジメチルホルムアミド
DMAP 4−N,N−ジメチルアミノ−ピリジン
MA.Actl メタクリルアミドアセトアルデヒド
NHA 4,4,5,5,6,6,6−ヘプタフルオロ−1−(ナフタレン−2−イル)ヘキサン−1,3−ジオン
DPP 4,7−ジフェニル−1,10−フェナントロリン
C−28チオキセン C−28チオキセン、置換N−フェニルオキサジン及び9,10−ビス(フェニルエチニル)アントラセン(BPEA)に結合したチオキセン[米国特許第6,406,667号(これの相当する開示は引用例として本明細書に取り込まれる)に記載されるように調製]
hrs 時間(hours)
min 分(minutes)
DI 脱イオン化
w/w 重量対重量
rpm 回転/分
mL ミリリットル
mg ミリグラム
g グラム
mM ミリモル
センシビーズ(Sensibead)
光増感剤色素(ビス−(トリヘキシル)−シリコン−t−ブチル−フタロシアニン)[米国特許第6,153,442号、7,022,529号、7,229,842号及び米国特許出願公開第20050118727A号(これらの相当する開示は引用例として本明細書に取り込まれる)に記載される方法と同様の方法を用いて調製]を含むラテックス粒子
ケミビーズ(Chemibead) 化学発光化合物(ユーロピウム、NHA、DPP及びC−28チオキセンの混合物)[米国特許第5,811,311号(これの相当する開示は引用例として本明細書に取り込まれる)に記載されるような方法で調製]を含むラテックス粒子。
試薬の調製
MAMDMAの合成(図1): メタクリル酸(9.0g、0.1mol)及びN−ヒドロキシスクシンイミド(11.5g、0.1mol)を丸底フラスコに入れて、THF 300mLに溶解した。この溶液を氷浴中で冷却した。THF 50mLに溶解したジシクロヘキシルカルボジイミド(21.0g、0.1mol)を加えた。この反応混合物を氷浴中で2時間撹拌した。アミノアセトアルデヒドジメチルアセタール(15.0g、0.1mol)及びトリエチルアミン(15.0g、0.15mol)を加えた。この添加により、反応混合物は塊の状態まで凝固し、撹拌するのが困難になった。更にTHF 300mLを加えた。反応混合物を室温まで温めて、3日間撹拌した。反応混合物を濾過することにより、沈殿した固体を除去した。清澄な溶液を減圧下で濃縮した。粘性液体としてMAMDMAを得た。収量:20.0g、90%。H NMR(CDCl):5.4 δ 1H, 5.6 δ 1H (二重結合プロトン), 3.5 δ 6H (アセタールプロトン) 3.1 δ 1H (-CH-(OCH3)2), 2.5 δ 2H (-CH 2 -CH-), 2.3 δ 1H (-NH-), 1.8 δ 3H (=C-CH 3 )。
MAMDMAと種々の親水性モノマーとの重合の手順(図2): アルゴンガス注入口及び排出口を取り付けた丸底フラスコ中で、MAMDMA(0.01M)、親水性モノマー(0.01mol)及びAIBN(0.0001mol、[モノマー]/[AIBN]=200)をDMSO 30mLに溶解した。アルゴンガスは、DMSO溶液を通して室温で30分間パージした。モノマー溶液を含有するフラスコを、80℃に予熱した油浴に浸した。重合は、アルゴンパージ下で80℃で16時間実施した。DMSO溶液をジエチルエーテル700mL中に注ぎ入れ、ポリマーを沈殿させた。ポリマーを水100mLに溶解して、分子量カットオフ5,000ダルトンの限外濾過膜を用いて10〜15mLまで濃縮した。
アルデヒド含有合成コポリマーを得るためのアセタール基の加水分解の手順: 上記のとおり合成したコポリマー2〜3gを含有する水溶液(100mL)をエルレンマイヤーフラスコにとった。ここに、1N HCl 100mLを加えた。この酸性溶液を室温で2日間撹拌した;溶液のpHは、濃NaOHの添加により5.0に調整した。コポリマー中のアルデヒド基の存在は、プルパルド(purpald)アッセイ(Dickinson, R.G.; Jacobsen, N.W., Chemical Communications, p. 1719 (1970))により定性的に確認した。このコポリマー溶液は、分子量カットオフ5,000ダルトンの限外濾過膜を用いて10mLまで濃縮した。水性ポリマー溶液(100〜150mg固体/mL)を4℃で保存した。
アルデヒド含有合成コポリマーで被覆したセンシビーズの調製方法: アルデヒド含有コポリマーの水溶液(5mL、pH5.0、100〜150mg固体/mL)をファルコンチューブにとった(Falcon tube)。溶液pHを8.5に調整した。この溶液に、ヒドラジド被覆染色センシビーズの懸濁液(25mg/mL固体、pH9.0)1mLを加えた。ヒドラジドでのケミビーズのコーティングについて後述される方法と同様に、pH9.0でSTUTの存在下でのビーズとヒドラジンとの反応により、ビーズをヒドラジドで被覆した。この反応混合物を50℃で72時間穏やかに振盪しながらインキュベートした。ポリマー被覆ビーズは、15,000rpmで15℃で30分間の遠心分離により水で2回洗浄し、次に新鮮水に再懸濁した。ポリマー被覆ビーズを0.1M酢酸緩衝液pH5.0 2mLに懸濁した。ここに、ストレプトアビジン(7.0mg)を加え、室温で30分間インキュベートした。ここに、NaCNBH(40mg)を加えて、37℃で72時間穏やかに振盪しながらインキュベートした。ストレプトアビジン被覆ビーズ(センシビーズ)は、15,000rpmで15℃で30分間の遠心分離によりBSA洗浄緩衝液で2回洗浄して、緩衝液に再懸濁した。洗浄したセンシビーズは、プローブ超音波発生装置を用いて4℃で2分間の超音波処理により懸濁した。センシビーズの固体含量を測定して、10mg/mLに調整した。粒子あたりのストレプトアビジン数は、異なる濃度の粒子を固定濃度のビオチン−フルオレセイン結合体と共にインキュベートしたときの蛍光の減少から求めた。センシビーズは、更に使用するまで4℃で10mg/mL濃度で保存した。結果は表1に明記する。
Figure 0005819417
合成コポリマーで被覆したケミビーズの調製:
工程1: ヒドラジド被覆染色ケミビーズの調製: ケミビーズ懸濁液(15mL、1.046g粒子)を丸底フラスコにとった。ここに、300mM TAPS緩衝液pH9.0 37mLを加えて、20mg/mL粒子懸濁液を作った。ヒドラジン(0.1mL)を加えて、pH電極を粒子懸濁液に浸し、室温で撹拌した。ここに、STUT(新たにDMF 1mLに溶解)100mgを加え、続いてDMAPのDMF溶液(100mg/mL)0.25mLを加えた。この反応混合物を10分間撹拌して、5N NaOHの添加によりpHを9.0に調整した。STUT及びDMAPの添加を4回繰り返し、粒子懸濁液を更に1時間撹拌した。ヒドラジド被覆染色ケミビーズは、15,000rpmで10℃で30分間の遠心分離により1mM TAPS緩衝液pH9.0で2回洗浄して、緩衝液に再懸濁した。洗浄した粒子は、1mM TAPS緩衝液pH9.0 17mLに懸濁した。固体含量は41.23mg/mLであった。
工程2: ポリ(HPMA−co−MA−Actl)(1:2)被覆染色ケミビーズの調製: 上記からのヒドラジド被覆ケミビーズ懸濁液(0.6mL、25mgビーズ)を15mLファルコンチューブにとった。ポリ(HPMA−co−MA−Actl)(1:2)(図2)(3mL、pH5.0、固体含量24.7mg/mL)を別のチューブにとり、pHを8.8に調整した。pH8.8のポリマー溶液及びpH9.0のヒドラジド被覆ビーズ懸濁液を一緒に混合して、37℃で50時間穏やかに振盪しながらインキュベートした。ポリマー被覆ビーズ(CB2)は、15,000rpmで10℃で30分間の遠心分離により50mM MES緩衝液、pH6.0で2回洗浄して、MES緩衝液に再懸濁した。洗浄したビーズは、プローブ超音波発生装置を用いて超音波処理によりMES緩衝液0.25mLに再懸濁した。
工程3: 捕捉抗体被覆ケミビーズの調製: cTnI捕捉抗体は、0.2%トゥイーン20(登録商標)を含有する10mM PO−300mM NaCl、pH7.0で緩衝液交換した。緩衝液交換した抗体の濃度は、7.7mg/mLであった。cTnI捕捉抗体溶液(1mL、7.7mg抗体)、ポリ(HPMA−co−MA−Actl)(1:2)被覆ケミビーズ(0.25mL、25mgビーズ)、酢酸(0.4μL)を4℃で一緒に混合した。この混合物はpH5.7であった。NaCNBH(12μL、25mg/mL)を加え、この懸濁液を4℃で16時間穏やかに振盪しながらインキュベートした。次にこの粒子を37℃で24時間インキュベートした。抗体被覆ケミビーズは、15,000rpmで10℃で30分間の遠心分離により洗浄緩衝液(pH8.0)で2回洗浄して、洗浄緩衝液に再懸濁した。洗浄した粒子は、プローブ超音波発生装置での超音波処理によりBSA洗浄緩衝液(pH8.0)1mLに再懸濁した。固体含量は13.37mg/mLであった。
アルデヒド含有合成コポリマーの分子量特性: ポリマーは、光散乱法と一緒になったサイズ排除クロマトグラフィーにより特性決定した。得られたデータは、表2に要約する。全ての合成ポリマーは、多分散性の高いポリマーが生成することが知られている、フリーラジカル重合の従来法により合成した。表2のデータはまた、アルデヒド含有コポリマーが多分散性であったことを示す。表2に記載されたポリマーのピークは、厳密には二峰性ではなく、光散乱検出器からソフトウェアのAstra(Wyatt Technology Corporation, Santa Barbara CA)を使用して測定するとき、むしろ各ポリマーについて存在する広いガウス型ピークからデコンボリューション(deconvoluted)されている。ポリマー試料において優勢なピークの分子量は、個々のモノマー構造及びその重合性に応じて25kDa〜3300kDaを変動した。
Figure 0005819417
アッセイ
本コポリマーの実施態様で被覆されたセンシビーズを用いるcTnIアッセイの一般的手順: 全てのアッセイは、DIMENSION(登録商標)VISTA(登録商標)装置(Siemens Healthcare Diagnostics Inc., Newark DE)(Siemens)で実行した。簡単に述べると、市販のcTnIフレックスカートリッジ(Siemens Healthcare Diagnostics catalog # K6421)のウェル#8のカバーに穴を開けた。この市販のcTnI製品は、LOCI法及び試薬を利用する。この市販品のデキストラン被覆センシビーズ懸濁液を吸引して、コポリマー被覆センシビーズ懸濁液(0.7mL、1.5mgセンシビーズ/mL BSA洗浄緩衝液)を清浄なウェルに加えた。次に製品と共に供給された製造業者の取扱説明書にしたがい、較正物質を試料として用いてcTnIアッセイを実行した。装置のパラメーター、緩衝液の配合、又は使用する試薬の濃度のいずれにも最適化は行わなかった。アッセイの結果は、以下の表3(SB1)、表4(SB2)、表5(SB3)、表6(SB4)、表7(SB5)、表8(SB6)、表9(SB7)及び表10(SB8)に要約する。
Figure 0005819417
Figure 0005819417
Figure 0005819417
Figure 0005819417
Figure 0005819417
Figure 0005819417
Figure 0005819417
Figure 0005819417
SB2及びCB2を用いるcTnIアッセイの一般的手順: 全てのアッセイは、DIMENSION(登録商標)VISTA(登録商標)装置(Siemens Healthcare Diagnostics Inc., Newark DE)(Siemens)で実行した。簡単に述べると、市販のcTnIフレックスカートリッジのウェル#8のカバーに穴を開けた。デキストラン被覆センシビーズ懸濁液を吸引して、SB2懸濁液(0.7mL、1.5mg SB2/mL BSA洗浄緩衝液)を清浄なウェルに加えた。更に、市販のcTnI製品のケミビーズをCB2(0.9mL、0.19mg CB2/mL BSA洗浄緩衝液)で置き換えた。次に製品と共に供給された製造業者の取扱説明書にしたがい、較正物質を試料として用いてcTnIアッセイを実行した。装置のパラメーター、緩衝液の配合、又は使用する試薬の濃度のいずれにも最適化は行わなかった。アッセイの結果は、以下の表11に要約する。
Figure 0005819417
本明細書に引用される全ての刊行物及び特許出願は、あたかも個々の刊行物又は特許出願が具体的にかつ個別に引用例として取り込まれるかのように、引用例として本明細書に取り込まれる。
前記発明は、理解の明確さを目的として実例及び実施例により幾分詳細に説明されているが、添付の請求の範囲の本質又は範囲を逸することなく、ここにある種の変更及び修飾を加えることができることは、本発明の教示に照らせば当業者には直ぐに明らかとなろう。更には、説明を目的とする前記説明文では、本発明の深い理解を提供するために特別な用語体系を使用した。しかし、具体的な詳細事項は、本発明を実施するために必要ではないことが当業者には明らかであろう。即ち、本発明の具体的な実施態様の前記説明は、例証及び説明を目的として提示される;これらは、本発明を網羅しようとするものではなく、また開示された正確な形態に限定するものではない。上記教示を考慮して、多くの修飾法及び変法が見込まれる。実施態様は、本発明の原理及びその実用的応用を説明するために、それによって当業者が本発明を利用できるように、選択して記載した。

Claims (11)

  1. アッセイ試薬として使用するための組成物であって、
    (i)シグナル生成システムのメンバーであって、吸着、共有結合、溶解又は分散、又は非共有結合によって固体支持体と結びついているメンバー、並びに
    (ii)合成コポリマーのコーティングであって、合成コポリマーが、
    −C(O)−A−(CH −G
    [式中、Aは、NR (ここで、R は、H、又は1〜6個の炭素原子のアルキルである)であり;そしてnは、1〜10であり;そしてGは、CHO、CH(OR (ここで、R は、1〜6個の炭素原子のアルキルである)、又は特異的結合対のメンバーである]
    であるペンダント部分を含む第1の共重合モノマー、
    及び、下記式:
    Figure 0005819417

    (式中、wは、2〜4である)
    で示されるペンダント部分を含む第2の共重合モノマーを含むコーティングを含む、
    固体支持体を含む組成物。
  2. 固体支持体が、粒子である、請求項1に記載の組成物。
  3. 粒子が、ラテックス粒子である、請求項2に記載の組成物。
  4. シグナル生成システムのメンバーが、増感剤及び化学発光化合物よりなる群から選択される、請求項1に記載の組成物。
  5. コポリマーが、ポリエチレン性基本骨格を含む、請求項1に記載の組成物。
  6. 第1の共重合モノマーのペンダント部分が、−C(O)−NH−(CHCHO又は−C(O)−NH−(CH −CH(OCH [式中、nは、1である]であり、第2の共重合モノマーのペンダント部分が、下記式:
    Figure 0005819417

    (式中、wは、3である)である、請求項1に記載の組成物。
  7. 特異的結合対のメンバーが、固体支持体と結び付いている、請求項1に記載の組成物。
  8. 試料中の分析対象の存在及び/又は量を決定する方法であって、
    (a) 媒体中で組合せて
    (i) 試料、及び
    (ii) 請求項に記載の組成物であって、特異的結合対(sbp)のメンバー、分析対象に又は第2のsbpメンバーに結合することにより、分析対象の存在と関連している複合体を形成する組成物
    を提供すること、
    (b) この組合せを、複合体を形成することになる、組成物への分析対象の結合の条件に付すこと、及び
    (c) このシグナル生成システムのメンバーを活性化し、そして複合体の量であって、試料中の分析対象の存在及び/又は量と関連している複合体の量を検出すること
    を含む方法。
  9. シグナル生成システムのメンバーが、増感剤及び化学発光化合物よりなる群から選択される、請求項に記載の方法。
  10. 固体支持体が粒子であり、シグナル生成システムのメンバーが、粒子に取り込まれている、請求項に記載の方法。
  11. シグナル生成システムのメンバーが、光増感剤であり、そしてこの組合せが、更に化学発光剤試薬を含むか、又はシグナル生成システムのメンバーが、化学発光化合物であり、そして組合せが、更に光増感剤試薬を含む、請求項に記載の方法。
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