CN101356438B

CN101356438B - 评估人半胱氨酸蛋白酶抑制剂c的浊度测定法免疫测定

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Publication number: CN101356438B
Application number: CN200680043918.8A
Authority: CN
Inventors: 卡特林·森德; 汤姆·尼尔森
Original assignee: Gentian AS
Current assignee: Gentian AS
Priority date: 2005-11-24
Filing date: 2006-11-24
Publication date: 2013-04-03
Anticipated expiration: 2026-11-24
Also published as: NO20055561D0; CN101356438A

Abstract

需要用于生物样品，特别是人的体液临床样品中的人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的改进的浊度测定法免疫测定。本发明提供能够通过浊度测定方法测量人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的浊度测定免疫测定方法和试剂组，其令人惊讶地导致比现有状态的技术更强和更快的浊度测定信号。提高的和更快的信号通过使用新的试剂和组合物而获得，并且能够获得更短的测定时间和具有更强的信号的动力学读数，提高了整体测定速率和质量。本发明实现了针对脂质干扰的提高的稳定性和提高的线性。

Description

评估人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的浊度测定法免疫测定

本发明涉及通过利用特异性的纳米颗粒(nanoparticle)-抗体缀合物评估在人体液样品中的人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的改进的浊度测定法免疫测定；通过利用所述测定评估患者的肾小球滤过率的方法；相应的反应试剂盒；改进的纳米颗粒-抗体缀合物以及它们用于上述提及的医学目的的应用。

发明背景：

A.Grubb和H.Lovberg[Grubb AO，等：Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学学报)1982；79]于1981年发现并且特征性描述半胱氨酸蛋白酶抑制剂C。半胱氨酸蛋白酶抑制剂C是在后来命名为半胱氨酸蛋白酶抑制剂蛋白超家族中发现的第一个蛋白。半胱氨酸蛋白酶抑制剂蛋白超家族是一组抑制半胱氨酸蛋白酶酶的蛋白。目前半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的其它生物功能正在研究中。与半胱氨酸蛋白酶抑制剂超家族的其它成员相反，半胱氨酸蛋白酶抑制剂C存在于所有的体液中，而不同的半胱氨酸蛋白酶抑制剂的总组成随体液与体液而不同，并且在不同的区室中[AbrahamsonM，等：J.Biol.Chem.(生物的化学杂志)1986；261：11282]。在1990年，Abrahamsson等证明半胱氨酸蛋白酶抑制剂C以稳定的速率并且由人体中全部(或接近全部)有核细胞产生，其叫作“持家”蛋白[Abrahamson M，等：Biochem.J.(生物化学杂志)1990；268：287-94]。

半胱氨酸蛋白酶抑制剂C----具有13kD的分子量----自由滤过肾脏的正常的肾小球膜，但是然后在“近端小管”中重吸收并且分解代谢，所述“近端小管”是重吸收通过肾小球膜的大部分肽和更小的蛋白的肾脏的区室。以这种方式，肾脏为机体保存这些蛋白质物质，并且妨碍尿的损失(Jacobsson B，等：Histopathology(组织病理学)1995；26：559-64.)[Heyms SB，等：Am.J.Clin.Nutr.(美国临床营养学杂志)1983；37：478]。

肌酸酐，迄今为止关于肾小球滤过率(GFR)的主要应用的标记，是在肌肉细胞中产生的小分子量分子。因此，肌酸酐的形成和分泌的速率与机体的肌肉质量紧密联系。公知地，群体中个体的肌肉质量变化相当大。与机体质量相比，老年人通常具有低的肌肉质量，而且随着他们的疾病发展许多患者失去肌肉质量。与成年人相比，儿童通常具有不同的相对肌肉质量，并且男人比女人具有平均更高的相对肌肉质量。因此，当将血清肌酸酐浓度用作肾小球滤过率标记时，可以发现血清肌酸酐值在参照范围内，甚至在已经发生50％的肾小球滤过率减少时[Shemesh O，等：Kidn.Int.(肾脏国际)1985；28：830-8]。此外日常饮食显著地影响肌酸酐的血清水平，特别是富含蛋白质的饮食[Perrone RD，等：Clin.Chem.(临床化学)1992；38：1933-53]。

血清和血浆肌酸酐测量是测量肾小球滤过率的不可靠的“黄金标准方法”。因此，使用静脉内注射放射性标记物质如Cr-51-EDTA或Tc-99m-DTPA，或者注射碘化剂如碘海醇，已经受到一些流行。这些方法是昂贵的、耗时的，并且注射是必需的----并且通常重复地血液采样。在Grubb等在Clinical Chemistry(临床化学)51：8，1420-1431中的“SimpleCystatin C-Based Prediction Equations for Glomerular Filtration RateCompared with the Modification of Diet in Renal Disease Prediction Equationfor Adults and the Scwartz and the Counahan-Barratt Prediction Equations forChildren(单纯基于半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的肾小球滤过率预测方程与用于成年人的肾病预测方程和用于儿童的Scwartz和Counahan-Barratt预测方程中的饮食改进的比较)”的公布中，证明血液中的单纯半胱氨酸蛋白酶抑制剂C测量可以替代测量肾小球滤过率的复杂方法。

半胱氨酸蛋白酶抑制剂C测量最初使用经典的生物化学方法，但是不久转向应用浊度测定和比浊法免疫测定。埃德-白令公司(Dade-BehringCompany)开创了比浊法测量方法。还参见Coll，E等.Am.J.KidneyDisease(美国肾病杂志)2000；36，2934。比浊度方法是非常可靠的。比浊计方法的缺点在于，与基于光传播的自动分光光度计相比，仪器本身具有相当低的处理速度。由埃德-白令公司(Dade-Behring Company)生产的比浊计，典型地BNII比浊计和ProSpec比浊计，以及Beckman仪器，已经获得了基本的市场渗透，但是广泛性比基于传播测量的仪器低得多。比浊计还具有比基于传播测量的大型自动化仪器低得多的样品通量。

H.Stone等在文献“Analytical performance of a particle-enhancednephelometric immunoassay for serum Cystatin C using rate analysis(使用速率分析的血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的颗粒-增强的比浊计免疫测定的分析性能)”，Clinical Chemistry(临床化学)卷8，第1482-85页，2001，描述了速率比浊计方法。然而，比浊计仪器具有大量样品的有限的容量，并且比浊度仪器的数目是有限的。因此，存在转向吸收分光光度计-均相的仪器的需要，原因在于这样的仪器更多量，并且具有更高的容量。

丹麦Dako Cytomation已经开创了浊度测定法半胱氨酸蛋白酶抑制剂C免疫测定的领域。技术状态在下列文献中描述：“Cystatin C-The markerof choice for renal function testing(半胱氨酸蛋白酶抑制剂C-肾功能检测选择的标记)”，C.Schmidt，European Clinical Laboratory(欧洲临床实验室)，2004年2月10日；“New improved automated particle enhancedturbidimetric immunoassay for quantitative determination of human Cystatin Cin serum and plasma(定量确定血清和血浆中人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的新改进的自动化颗粒增强的浊度测定法免疫测定)”，C.Schmidt，C.

和K

2005年7月从Dako Cytomation AS网址下载的介绍(通过引用结合)。

然而，浊度测定法测量受到样品中浊度的干扰，如在文献“Turbidity inimmunoturbidimetric assays(免疫浊度法测定中的浊度)”，Dahr等，Ann.Clin.Biochem.(临床生物化学年刊)卷27，第509页，1990。在第29届临床化学北欧会议上，Malmo，瑞典，2004年4月24-27日，A.Grubb阐述了在血清和血浆样品中三酰甘油对半胱氨酸蛋白酶抑制剂C测量的结果的干扰的结果。因此，仍然存在对于改进人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C浊度法免疫测定的需要。

均相免疫测定系统的备选方案是基于分离的非均相免疫测定系统。非均相免疫测定系统的优点特征在于在进行所述测定过程中进行洗涤的分离步骤。这些系统的优点在于，通过洗涤的方式，它们去除任何干扰物质。此外，它允许洗去未结合的抗体和未结合的酶或荧光或有色的或其它发出信号的部分。由于待测量的物质----下文叫作分析物----不必须与标记的类似物竞争与所述抗体的结合，所以，这些方法通常是非竞争性的。这一方面，以及洗涤步骤的应用，使得可以使用过量的固定的抗体和标记的抗体，表现出高灵敏度和通常高水平的精确性，特别是如果使用高质量的抗体时。

存在许多关于固相和其它非均相免疫测定系统的教科书。大的自动化系统可以商购。美国Abbott诊断分公司(Abbott Diagnostic Division US)出售用于ImX，AxSYM及其它自动非均相免疫测定仪器的试剂；德国的罗氏诊断(Roche Diagnostics)出售用于Elecsys和其它非均相免疫测定系统的试剂；并且存在许多非均相免疫测定系统和试剂的其它供应。仍然非常受欢迎的非均相免疫测定系统是所谓的微量滴定免疫测定系统。这些系统是缓慢的，但是可靠而廉价的。通用的免疫测定文献给出许多关于这些系统的信息，其是本领域的技术人员公知的。

非均相免疫测定系统的缺点是缺少每个时间单位，即每小时运行时间的大量测定的容量。所述方法包括分离和洗涤步骤，尽管是自动化的，但是其占有仪器的运行时间。此外，由于包括固相，通常使用专门的装置或固相，其具有某些生产成本，即使在大量生产时。近年来，由于不断增长的运行的检测的数量，高通量和结果产生的速率已经变得越来越重要。存在需要将来自非均相，通常是基于固相的免疫测定技术的测定转移到均相免疫测定系统。

均相免疫测定系统在构建上是简单的，并且具有更高的通量容量。将试剂混合，温育，并且在温育过程中或温育之后进行测量。使用终点信号或在不同时间点的信号中的差异或连续的动力学测量。信号可以是荧光、颜色或不透明性(浊度)测量。特别地，用于测量颜色和/或不透明性/浊度的大型自动化仪器已经非常成功了。日本的日立公司(Hitachi Company)与罗氏一起工作开创了这种大规模的自动化，而且许多其它的供应商包括奥林巴斯(Olympus)和拜尔(Bayer)供应这样的仪器和试剂。这些仪器是自动化的多孔分光光度计，其在不同波长和在不同的时间点测量光通过样品与试剂的混合物的传播。由于浊度测定法半胱氨酸蛋白酶抑制剂C免疫测定在这样的均相高容量仪器上运行，这是为什么需要高质量的浊度测定法半胱氨酸蛋白酶抑制剂C测定的另一个原因。

大部分均相免疫测定系统是基于将样品与试剂溶液混合，所述试剂溶液包括充分控制浓度的标记的分析物或分析物类似物，和对所述分析物具有特异性亲和力的抗体。样品中的分析物分子与标记的分析物或分析物类似物竞争，并且产生信号。大量的免疫测定文献教导使用不同的标记和类似物。这里应该注意到----迄今为止----用于产生有色信号的高分子量的分析物(分子量大于4000)的均相免疫测定方法已经存在有限的成功。(使用荧光技术，如邻近测定(proximity assays)，已经存在成功了，但是还缺乏许多可用的高通量的自动化荧光计，并且因此这些技术不作为本发明的目的)。来自Syva的EMIT技术和来自Microgenics的CDEIA技术，这两个公司都位于加利福尼亚，已经成功地在低分子量分析物的均相免疫测定中使用了有色信号。对于高分子量的分析物，颗粒增强的浊度测定法测量已经成为用于自动化多孔分光光度计的最成功的技术，所述自动化多孔分光光度计测量光通过样品与试剂的混合物的传播。因此，浊度测定方法优选用于更高分子量的分析物。浊度测定方法的综合描述在许多免疫测定教科书中找到。

为什么半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的高精确度测量是必需的？从生物学观点看来，关于半胱氨酸蛋白酶抑制剂C和肌酸酐的生物学的参考文献，以及上文引用的meta-分析(meta-analysis)，指出使用半胱氨酸蛋白酶抑制剂C而不是肌酸酐来监测和诊断减小的肾小球滤过率的方向。然而，尽管生物学论点支持使用半胱氨酸蛋白酶抑制剂C，但是生物学优点不只是所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂C分析的准确性和精确性是否良好的重要性。肌酸酐测量的准确性和精确性是极好的，并且如果所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂C免疫测定方法的准确性或精确性太低，那么容易失去分析半胱氨酸蛋白酶抑制剂C而不是分析肌酸酐的医学优点。

本发明要解决的一个问题是提供一种免疫-浊度测定半胱氨酸蛋白酶抑制剂C免疫测定，如果与相应的可商购的浊度测定相比，其具有提高的准确性和/或精确性和/或更少的来自检测样品中的脂质和血红蛋白的干扰。

半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的浊度测量的现有技术的另一个缺点是浊度变化的低速率，其导致长久的测定时间和/或高的不精确性。因此，本发明要解决的另一个问题是提供更快的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C浊度测定法测量。

附图简述：

图1显示通过线性回归获得的按照本发明测量的平均半胱氨酸蛋白酶抑制剂C值相对于不同患者血清的稀释因子的图。

图2显示通过一阶回归获得的按照本发明测量的平均半胱氨酸蛋白酶抑制剂C值相对于不同患者血清的稀释因子的图。

图3显示通过二阶回归获得的按照本发明测量的平均半胱氨酸蛋白酶抑制剂C值相对于不同患者血清的稀释因子的图。

图4显示测定实施例4的血清1的DL(％)图。

图5显示测定实施例4的血清3的DL(％)图。

图6显示通过线性回归获得的测量的平均半胱氨酸蛋白酶抑制剂C值相对于患者血清的稀释因子的图。

图7显示通过二次回归获得的图6的测量的平均半胱氨酸蛋白酶抑制剂C值相对于患者血清的稀释因子的图。

图8显示通过三次回归获得的图6的测量的平均半胱氨酸蛋白酶抑制剂C值相对于患者血清的稀释因子的图。

图9显示测定实施例5的血清A的DL(％)图。

图10显示通过线性回归获得的按照现有技术方法测量的平均半胱氨酸蛋白酶抑制剂C值相对于不同患者血清的稀释因子的图(现有技术)。

图11显示通过一阶回归获得的按照现有技术方法测量的平均半胱氨酸蛋白酶抑制剂C值相对于不同患者血清的稀释因子的图。

图12显示通过二阶回归获得的按照现有技术方法测量的平均半胱氨酸蛋白酶抑制剂C值相对于不同患者血清的稀释因子的图。

图13显示测定实施例6的血清1的DL(％)图(现有技术)。

图14显示测定实施例6的血清2的DL(％)图(现有技术)。

图15显示测定实施例6的血清3的DL(％)图(现有技术).

图16，17和18显示研究通过按照本发明的浊度测定法和通过按照现有技术的比浊法测定半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的方法之间的相关性的结果。

发明概述：

令人吃惊地，上述与现有技术用于测量半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的浊度测定法免疫测定相关的问题，可以通过如在权利要求中定义的并且在说明书的后续部分中更详细阐释的浊度测定方法而解决。本发明的所述方法特别地利用改进的纳米颗粒-免疫缀合物，其允许在不同的实验条件下，如特别地，不同的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C浓度、不同的测量波长、不同的反应时间和不同的温度，更快速和/或更灵敏和/或更可靠的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C测量。本发明的其它优点从后附的实验中显而易见。

通过认真的调整免疫颗粒和任选地检测试剂，可以观察到令人吃惊的更强和更快的浊度测定信号，并且由此可以减小干扰，并且可以提高线性，而不失去准确性。此外可以减少测定时间。

下面将描述本发明的最佳模式，以及用于制备反应混合物和用于进行所述测量的其它试剂和步骤顺序以及时间可以用于获得这种令人吃惊的结果。

存在一些纳米颗粒的供应商，例如美国Bangs实验公司(BangsLaboratories Inc)和法国默克S.A.(Merck S.A.，France)。将抗体偶联到纳米颗粒上的缀合服务的许多供应商可以在互联网上找到。丹麦DakoCytomation AS提供缀合到抗-半胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体的纳米颗粒，并且它们由本发明人检测，而不管是否实现本发明的目的。然而，所述现有技术产品证明是不成功的。

本发明人观察到，i.a.，颗粒大小必须仔细平衡。大颗粒产生良好的信号，然而，背景高，并且结合能力低，以致必须加入大量的颗粒，产生甚至更高的背景浑浊度。先前的测定供应商，如Dako Cytomation AS，产品号LX002/EFG/CS/25.10.04，S2361/EFG/KGR/09.07.03和X0974/EFG/SUM/09.09.04，没有获得良好的浊度测定信号。

通用术语的定义

当用于按照本发明的测定方法中时，“体液样品”是来源于哺乳动物特别是人的样品，并且其含有半胱氨酸蛋白酶抑制剂C，特别是人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C。可以使用任何含有半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的液体样品。要按照本发明测定的所述样品可以是任何含有半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的生物液体或组织提取物，并且可以在测定之前预先处理。适当的样品的实例是血液，血液级分，如血清和血浆，以及预处理的血液，如EDTA-血液，或EDTA-血浆，柠檬酸盐-血浆，肝素血浆，或尿样。最初获得的样品或其级分可以通过本领域已知的方法进一步改良，例如，通过分馏或稀释。分馏可以进行，以去除可能干扰测定的组分。为了调整组分如分析物的浓度，可以通过将初始样品或级分与适当的样品液体，如适当的缓冲液混合而进行稀释。这样改良的样品作为“来源于”从哺乳动物的机体收集或分离的初始体液样品的实例。

按照本发明要测定的“分析物”是半胱氨酸蛋白酶抑制剂C，特别是人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C，其由健康的或患病个体的机体形成。尽管不是必需的，半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的衍生物或天然半胱氨酸蛋白酶抑制剂C和半胱氨酸蛋白酶抑制剂C衍生物的混合物也可能地用作分析物。半胱氨酸蛋白酶抑制剂C衍生物的非限制性实例是携带适当的可检测标记，例如放射性、金属或发色团标记的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C化合物。

在获得分析物，本文是指样品中存在的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的量或浓度的绝对值的意义上，以及获得指示分析物在样品中的水平的指数、比例、百分数、视觉或其它值的意义上，“评估(Assessing)”或“”评估(assessment)意欲包括定量和定性确定。评估可以是直接的或间接的，并且实际上检测到的化学种类不需要当然是分析物本身，但是例如可以是其衍生物。

与非均相免疫测定相反，“均相免疫测定”在构建上更简单，并且具有更高的通量容量。特别地，均相测定不包括以分离步骤形式的样品的预处理步骤，例如，通过将样品应用到固体基质如层析柱上，并且将分析物从初始复合物样品的初始组分的部分分离出来。对于均相测定，将样品和试剂混合，温育，并且在温育过程中或温育之后，进行测量。使用终点信号，或在不同时间点的信号之间的差异，或连续的动力学测定。

“颗粒增强的”浊度测定法测量或免疫测定是基于与按照本发明所用的纳米颗粒或纳米颗粒-免疫缀合物相关的“光散射特性”。这样的纳米颗粒通常大约是球形的，优选地具有狭窄的大小分布。所述颗粒的大小通常通过它们的平均直径表示。按照光散射的公知规律，所述光散射特性可以受到颗粒大小、和/或所述颗粒的折射指数与介质的折射指数的比例的影响。弱的光散射特性可以由小的颗粒大小、和/或所述颗粒的折射指数与介质的折射指数的低的比例导致(还参见光散射的Rayleigh’s规律)。

纳米颗粒的大小和/或折射指数比例是这样的，以致它们可以在检测凝聚的纳米颗粒-免疫缀合物所用的波长处引起光散射。通常选择所述大小小于所述检测波长。

当按照本发明用于测量样品中的浊度变化时，“检测波长”通常从300nm到1200nm，优选地从400到700nm，特别是从500到600nm。

本发明的分析方法的“准确性”是与通过甚至更可靠的参考方法确定的浓度相比，所述方法准确确定样品中半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的浓度的能力。

本发明的分析方法的“精确性”，是当重复确定样品中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的浓度时，在结果中的变化。

按照本发明的测定的“稳定性(robustness)”是所述方法在测定条件下耐受干扰物质和变化而不影响半胱氨酸蛋白酶抑制剂C浓度确定的结果值的能力。

当用于本发明的上下文中时，“惰性蛋白”是不干扰本发明的测定方法的任何来源(例如，人或非人哺乳动物、微生物)的蛋白；特别地，它应该对于待分析的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C和/或对于在本发明的测定方法中所用的抗体基本上没有或没有可检测的亲和力。

发明详述：

a)本发明的方面

本发明的第一方面涉及用于评估人体液样品或来源于其的样品中的人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的颗粒增强的浊度测定法免疫测定，通过

(1)通过将所述样品或其稀释物与包含适用于浊度测定法测量的纳米颗粒的纳米颗粒-抗体缀合物(或纳米颗粒-免疫缀合物)接触而形成测定混合物，其中所述纳米颗粒用抗-人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体或其抗原结合片段包被，以结合所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂C，其中所述包被的纳米颗粒具有至少40nm范围的中值直径，如例如至少45，50，55或58nm，优选地大于58nm，并且

(2)通过测量所述混合物的浊度的变化而评估所述人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的含量进行。

优选地，所述抗体包括针对人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的多克隆非人、非啮齿动物抗体；特别地，所述多克隆抗体包括针对人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的禽类抗体。

在另一个优选的实施方案中，通过使用人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的亲和纯化，获得了至少25wt.-％的所述多克隆抗体或其片段。通过亲和纯化，与人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C结合的那些抗体的比例增加。另外，可以通过亲和纯化进一步富集以比从所述混合物中去除的那些抗体更高的亲和力(或抗体亲抗原性(avidity))与人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C结合的抗体。

例如，按照本发明使用的适当的抗体可以对人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C具有亲和力或抗体亲抗原性，其与通过禽类抗体的亲和纯化获得的禽类(例如，多克隆)抗体的亲和力或抗体亲抗原性相对应(或基本上相同)，所述禽类抗体的亲和纯化通过将禽类抗-人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗血清与固定在固相上的人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C结合，并且优选地，例如，在用磷酸缓冲盐洗涤后，用柠檬酸盐缓冲液洗脱结合的抗体，所述柠檬酸盐缓冲液的摩尔浓度在0.05M到0.2M，或0.08M到0.12M范围，特别是约0.1M；并且pH在约3到3.5，或3.1到3.3范围，特别是约3.2(例如在后续实验部分中更详细地解释)。

在另一个实施方案中，所述抗体包括(a)与人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的单一表位结合的单克隆抗体，或(b)一组两个或多个种类的单克隆抗体，其中所述每种单克隆抗体结合人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的不同的表位，或者两种或多种以不同的结合强度(亲和力或抗体亲抗原性)结合相同的表位。

所述单克隆抗体是人或非人(例如，来源于啮齿动物、绵羊、山羊、鸟或兔)来源的。

当按照本发明使用时，所述包被的纳米颗粒优选地具有大于58nm的平均直径，特别是在59-160，60-140，70-120，75-110，80-105，或90-95nm范围的平均直径。优选地，它们用一层抗体包被。特别地，所述层可以认为是具有约5nm的近似厚度的单层。所述层可以是“完全的”(用抗体饱和的颗粒)，或者，更优选地是“不完全的”(即，使用比所述颗粒提供的结合容量(binding capacity)少的抗体)。

在另一个优选的实施方案中，所述包被的纳米颗粒用约5-35％，特别地10-30％或15-25％的抗体/纳米颗粒-抗体缀合物的总重量不完全包被。

在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒用抗体和惰性、优选亲水的蛋白的混合物包被。例如，结合到所述纳米颗粒表面上的总蛋白的20-90％，并且更优选地35-80％，并且甚至更优选地40-70％由抗-半胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体组成。这样的颗粒优选地以按照所述未包被的颗粒的结合容量低于理论上可附着到所述颗粒上的抗体的量的量携带抗体。同时，所述颗粒表面上不被抗体分子覆盖的表面用惰性的、优选亲水性的蛋白饱和。

在一个优选的实施方案中，所述初始的、未包被的纳米颗粒基本上由胶乳、聚苯乙烯、聚氯乙烯、环氧树脂、聚偏1，1-二氯乙烯、聚-α-萘基甲基丙烯酸酯、聚乙烯萘、以及它们相对应的共聚物制成。其它适当的颗粒材料在本领域中是可用的，并且由本发明的教导所指导，熟练的读者应该能够做出适当的选择。

按照本申请方法的另一个实施方案，通过在所述测定混合物在500-600nm范围的波长，优选地并且在10-50℃范围内的温度，并且优选地在30-600秒的期间后，例如在40，120，260或600秒的反应时间后的光吸收的变化而测量浊度变化。

本发明还提供用于测量在体液样品或来源于体液的样品中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的浊度测定法免疫测定方法，其特征在于，通过将含有所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的液体样品，或来源于含有半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的液体的样品，或含有半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的稀释物的样品，与纳米颗粒-结合的多克隆或单克隆抗-半胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体或抗体片段接触而形成测定混合物，以结合所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂C，并且通过测量所述混合物浊度的变化而评估半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的含量，并且所述浊度进一步特征在于，所述混合物在给定波长的光吸收的变化，条件是在用特定最小大小的包被的纳米颗粒形成所述混合物后，将所述混合物在给定的温度保持给定的时间阶段，如在下表A中所示。

通过举例的方式，最大吸收变化率是约4倍，优选地高于上文提及的对于每种给定的检测条件所观察到的最高水平约2或3倍。

通过举例的方式，可以获得下述值：

37℃，260秒，中值直径92nm：

Cys.C浓度9.9μg/l：65mAbs单位/cm.

Cys.C浓度19.8μg/l：203mAbs单位/cm.

Cys.C浓度26.6μg/l：244mAbs单位/cm.

Cys.C浓度34.1μg/l：420mAbs单位/cm.

Cys.C浓度44μg/l：623mAbs单位/cm.

32℃，600秒，中值直径92nm：

Cys.C浓度9.9μg/l：29mAbs单位/cm.

Cys.C浓度19.8μg/l：62mAbs单位/cm.

Cys.C浓度26.6μg/l：122mAbs单位/cm.

Cys.C浓度34.1μg/l：167mAbs单位/cm.

Cys.C浓度44μg/l：388mAbs单位/cm.

按照本发明的另一种优选的方法特征在于----当构建针对比浊法的相关性曲线时----对于通过比浊法获得的0mg/l半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的相对应的值，对于浊度测定方法获得小于0.15mg/l，优选地小于0.1，并且甚至更优选地小于0.05mg/l的半胱氨酸蛋白酶抑制剂的截取值。

按照本发明的另一种优选方法特征在于----当构建针对非均相免疫测定方法的相关性曲线时----对于0mg/l半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的相对应的值，获得小于0.25mg/l，优选地小于0.15，并且甚至更优选地小于0.5mg/l的半胱氨酸蛋白酶抑制剂的截取值。

按照本发明的另一种优选的方法特征在于，在所述检测的样品中，对于在1.2mg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l水平的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的测量值，具有来自15mmol/l三酰甘油的小于6％，优选地小于4％，或者更优选地小于2％的干涉。

按照本发明的另一种优选的方法特征在于，在1.32-7.5mg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的测量范围内，具有低于5％，优选地低于4％，或更优选地低于3％的线性偏差，和/或在0.75-1.32mg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的测量范围的测量区域内，具有低于15％，优选地低于11％，并且甚至更优选地低于7％的线性偏差。

按照本发明的另一种优选的方法特征在于，通过测量吸收增加的初始速率而确定样品的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C浓度，(a)通过在混合的时刻直接记录，或(b)在混合后立即记录，与后推至初始增加吸收结合，或(c)通过在将样品和试剂混合后，测量在小于1分钟的两个或多个时间点之间的吸收差异。

本发明的另一个方面提供用于评估哺乳动物的肾小球滤过率的方法，所述方法包括按照上文定义的方法进行人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的浊度测定法评估。所述方法可以特别地应用在肾功能障碍(如肾不足或衰竭)或与其相关的疾病或病况的诊断或治疗过程中。

本发明的另一个方面涉及用于实施上文定义的方法的试剂试剂盒或者部分试剂盒或试剂组，其包括(a)颗粒，其包含干燥或混悬形式的如上文定义的抗-半胱氨酸蛋白酶抑制剂C免疫颗粒，(b)以干燥或溶解形式的测定缓冲液，和任选地，(c)校准混合物和对照混合物，每种以干燥或溶解的或混悬的形式存在。

优选地，所述颗粒和测定缓冲液以干燥或以混悬形式组合提供。

按照本发明的另一个方面，在下文提供按照上文定义的纳米颗粒-抗体缀合物以及更详细的描述。

本发明涉及这样的纳米颗粒-抗体缀合物在评估人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的免疫测定中或者在评估哺乳动物的肾小球滤过率的诊断方法中的应用。

最后，本发明涉及这样的纳米颗粒-抗体缀合物在评估人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的免疫测定中或者在评估肾功能障碍如肾不足或衰竭的诊断方法中的应用。

b)抗-人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体的制备

b1)多克隆抗体

多克隆抗人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体可以通过本领域公知的方法制备，诸如例如由Chase，M.W.，1967，在″Methods of Immunology andImmunochemistry(免疫学和免疫化学方法)″中，Williams，A.等编，M.W.，第197-209页，学院出版社(Academic Press)，纽约中所述的那些。简言之，将适当物种的动物(例如，兔、山羊、或绵羊、或者，优选地禽类物种，特别是家禽，如母鸡)用在适当的佐剂如弗氏完全或不完全佐剂中的纯化的抗原重复免疫。在免疫后，将动物采血，并且通过诸如例如硫酸铵或氯化铵沉淀、阴离子交换层析、免疫亲和层析和/或亲和层析的方法纯化多克隆抗体。

为了获得充分的浊度测定信号，优选高抗体亲抗原性的抗体。由于多克隆抗体包括许多不同的抗体分子，所以不能计算亲和力常数，然而，通过常规的多克隆抗体技术获得高的抗体亲抗原性和亲和力。使用通过常规方法获得的兔抗体，然而，使用绵羊抗体获得甚至更好的结果。当使用禽类抗体时，获得甚至更好的结果。禽类抗体可以按照在Larsson A，BaaloewR-M，Lindahl T，和Forsberg P-O在Poultry Science(家禽科学)72：1807-1812，1993中所述的方法。考虑到在遗传上与人更不同的禽类能够产生具有比多克隆哺乳动物抗体更高的抗体亲抗原性的针对人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的抗体。

多克隆禽类抗体通常从蛋黄中获得(并且因此指定为IgYs)。然而，蛋黄含有大量的脂质，使得它们的进一步应用成问题。IgY可以通过使用逐步硫酸铵(例如25-40％)和聚乙二醇(PEG)沉淀而从蛋黄中分离。对于初始纯化，还可以参考供应商的用法说明而应用也是商业的可从GallusImmunotch Inc，Cary，美国获得的IgY纯化试剂盒，或从Pierce，Rockford，美国获得的鸡EggcellentIgY纯化试剂盒。

此外，多克隆抗体的抗体亲抗原性可以通过使用利用抗原亲和纯化方法，如按照从www.piercenet.com(2006年4月)下载并且通过引用结合的“Affinity Purification ofProteins(蛋白质的亲和纯化)”中的教导，而纯化的抗体而进一步提高。在下文进一步描述亲和纯化。

当所用的抗体中有20％是抗原亲和纯化的时，特别观察到提高的抗体亲抗原性，当所述抗体中有50％是抗原亲和纯化的时，观察到甚至有更高的提高，并且当所述抗体中有大于75％，如75-100％是通过抗原亲和纯化方法获得的时，甚至提高更高。

对于禽类多克隆抗-人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体的亲和纯化，已经制备了适当的人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C亲和柱。通过标准方法将纯化的人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C固定在适当的固体支持物上，例如琼脂糖或亲和凝胶，其是活化的以将所述抗原共价连接到支持物上(例如，适当的活化的固体支持物可从Pierce，Rockford，美国获得)。然后，由所述携带抗原的树脂而制备亲和柱。

抗体的成功的亲和纯化取决于所述抗原上的相关表位向所述抗体的结合位点的有效呈递。如果所述抗原是小的，并且通过多个化学键直接固定在固体支持物表面上，那么重要的表位可能被封闭或者空间位阻，而抑制有效的抗体结合。因此，最好使用独特的官能团(例如，在肽的单个末端半胱氨酸上的巯基)而固定抗原，并且最好使用其反应基团存在于几个原子长的间隔臂上的活化的支持物。对于更大的抗原，特别是具有多个固定位点的那些抗原，由于所述抗原本身作为支持基质和表位之间的有效的间隔，所以所述间隔臂长度不那么重要。

由于每种方法的核心是对于其各自的抗原的抗体的亲和力，所以在抗体的亲和纯化的典型的结合和洗脱条件之间通常存在很少的变化。由于抗体设计成在生理条件下识别并且紧密结合抗原，所以大部分的亲和纯化方法使用模拟生理pH和离子强度的结合条件。最常见的结合缓冲液是在pH7.2的磷酸缓冲盐(PBS)和Tris缓冲盐(TBS)以及1.5M NaCl(例如，预先混合的缓冲液包装可从Pierce，Rockford，美国获得)。一旦所述抗体已经结合到固体的抗原上，其余的结合缓冲液用来洗涤支持物的未结合的物质。为了将非特异性结合最小化，所述洗涤缓冲液可以包含其它的盐或去污剂，以破坏任何弱的相互作用。

特别地，通过改变缓冲液(例如，常见的洗脱缓冲液可从Pierce，Rockford，美国获得)的pH和/或离子强度而将纯化的抗体从亲和树脂上洗脱下来。抗体通常是耐受pH 2.5-11.5范围的弹性蛋白，具有最小的抗体亲抗原性损失，并且迄今为止，这是最常见的洗脱策略。在一些情形中，抗体-抗原的相互作用没有被pH变化有效破坏或者被pH损坏，这需要应用备选策略。

下面给出亲和纯化方法的实例：

步骤1：在每次使用之前，用10个柱体积的下述顺序的缓冲液洗涤柱(～1ml树脂床)，以去除残留的蛋白质：

0.2M甘氨酸，pH 2.8～10ml

0.1M NaHCO₃，pH 8.5，0.5M NaCl～10ml

使用上述缓冲液重复循环两次。然后将所述柱在含有被调整到0.5M的NaCl的TTBS缓冲液(0.3M NaCl，20mM Tris/Cl，pH 7.8，0.1％(v/v)吐温-20和0.01％NaN₃)中平衡。

步骤2：向10ml等分试样的粗抗体制备物中，加入1ml 10X TTBS和0.55ml 4M NaCl。将混合物离心以去除任何沉淀。

步骤3：通过将所述亲和树脂转移到含有血清的管(15ml管)中，而分批吸收所述抗体。在冷室中温育。备选地，人们可以使用低流速将血清施加到柱上。获得人工收集的级分。收集流过柱的相(phase)，并且使用低流速将其第二次重新施加。

步骤4：用TTBS+NaCl至0.5M充分洗涤柱，直到A₂₈₀小于0.02。收集10ml洗涤的级分，并且检验所述级分的A₂₈₀。

步骤5：使用含有0.02％NaN₃的0.2M甘氨酸，pH 2.8洗脱抗体。使用1ml等分试样的缓冲液进行洗脱。将级分收集到含有50ml 1M Tris，pH8.5的1.5ml微量离心管中。这在蛋白洗脱下来之后立即中和酸性的洗脱缓冲液。收集至少10个级分。这通常足以去除所述抗体。使用适当的空白(即，1ml甘氨酸缓冲液加50ml 1M Tris)，读取每个级分的A₂₈₀。

步骤6：将适当的级分合并。获得合并物的A₂₈₀，并且将抗体保存在4℃，或者考虑在存在50％甘油时以等分试样冷冻(-70℃)。

步骤7：通过用0.2M甘氨酸，pH 2.8缓冲液，而后用TTBS充分洗涤而洗涤柱。

b2)单克隆抗体

在颗粒-增强的浊度测定中，多克隆抗体通常比单克隆抗体更优选。多克隆抗体固有地与抗原(或分析物)上的许多不同的表位反应(与单克隆抗体相反)，并且因此，更容易在抗原分子自身之间，以及在抗原和固定抗体的颗粒之间产生交叉结合和网络。相反，单克隆抗体通常只结合一种类型的表位，这使得其更难以形成交叉结合和网络。然而，诊断行业通常优选使用单克隆抗体，原因在于它们更容易标准化，并且更容易对预先确定的标准物进行定性控制，特别是在许多年的产品寿命时间内。因此，存在关于将单克隆抗体用于颗粒增强的浊度测定法免疫测定的良好的实例，特别是当存在有利于单克隆抗体的使用的抗原性特征时。Eda等，在“Development of a New Microparticle-Enhanced Turbidimetric Assay forC-reactive proten With Superior features in Analytical Sensitivity and Dynamicrange(在分析灵敏性和动力学范围内具有优良特征的C-反应性蛋白的新的微粒-增强的浊度测定法测定的发展)”，J.Clin.Lab.Analysis(临床实验室分析)，12：137-144(1998)中描述了使用两种不同的单克隆抗体和两种不同的微粒。由于CRP分子是相同亚基的五聚体----并且因此携带五个所有表位的重复(Pepys MB等，Adv.Immunol.(高级免疫学)34：141-212(1983))，这使得使用单克隆抗体容易得多，所以CRP特别有利于使用单克隆。然而，此外，与单体和更小的蛋白如半胱氨酸蛋白酶抑制剂C一起，不同的单克隆抗体的混合物可以用于本发明的特别的实施方案中。不同的单克隆抗体的混合物，特别当它们由具有针对半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的高亲和力的许多不同的单克隆抗体组成时，将导致关于半胱氨酸蛋白酶抑制剂C免疫测定的本发明的良好的实施方案。

单克隆抗人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体还可以通过本领域公知的方法制备，例如由G.

等，1975，Nature(自然)256，495，G.Galfre等，1981，Meth.Enzymol.(酶学方法)73，3-46，或R.Kennet，1980，在：″Hybridomas：a new dimension in biological analysis(杂交瘤：生物学分析的新纪元)″中，R.Kennet等编，Plenum出版社，纽约和伦敦中所述的那些。将来自免疫小鼠或大鼠的脾细胞或外周血细胞与骨髓瘤细胞系融合，例如使用聚乙烯融合方法进行。在融合后，将细胞在适当的条件下生长，例如，在培养平板上，并且使用例如次黄嘌呤/氨喋呤/胸苷(HAT)选择方法进行正确融合的细胞的选择。产生抗体的细胞系通过如EIAs，RIAs或凝聚测定的方法鉴定。在鉴定产生抗体的细胞系后，将所述细胞重复亚克隆，例如通过有限稀释的方法，以保证新生长的细胞系来源于一个单一的细胞。

b3)嵌合抗体

嵌合的抗人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体可以通过本领域公知的方法获得，诸如由G.L.Boulianne等，1984，Nature(自然)312，643-645所述的方法。所述方法可以概括描述如下。将来自于一种物种或其部分的单克隆抗体的抗原-结合位点的DNA转移到不同物种的另一种抗体的抗体构架的DNA。将这种新的构建体克隆到表达载体中，将其转移到相对应的表达系统中以产生所述抗体。

b4)重组抗体

重组抗人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体可以通过本领域已知的方法不使用动物载体而获得，例如由G.Winter等，1991，Nature(自然)，349，293或J.S.Huston等，1988，Proc.Ntl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，85，5879所述的那些方法。那些方法包括下述步骤：将编码抗体或其片段的DNA(cDNA或合成的DNA)引入到宿主细胞中，例如，大肠杆菌(E.coli)，真菌，酵母菌，植物或真核细胞中，选择具有需要的特异性和亲和力的抗体，并且在相应的表达系统中表达所述抗体或其片段。

b5)抗体片段

任何物种的多克隆抗体、单克隆抗体(包括嵌合抗体和/或重组抗体)的Fab-，Fab′-，和F(ab′)₂-片段可以通过本领域公知的方法制备，诸如例如由A.Nissonoff等，1960，Arch Biochem Biophys(生物化学和生物物理学档案)，89，230，或R.P.Porter，1959，Biochem J(生物化学杂志)，73，119，或E.Harlow等，1988，在″Antibodies-A Laboratory Manual(抗体—实验室手册)″，626-631，冷泉港出版社(Cold Spring Harbour Press)，纽约，美国所述的那些方法。

b6)选择与人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C不同反应性的抗人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体

当使用单克隆抗体或其片段作为结合配偶体时，可以便利地进行不同的、特别是高和低反应性的抗体的选择，其通过常规包被技术，将每种单克隆抗体独立地包被到相同材料和大小的纳米颗粒上，而后以给定的比例，如1/1 v/v，以变换的方式将纳米颗粒试剂与分析物混合。在相同条件下生成纳米颗粒试剂的校正曲线之后，对于低浓度的分析物所得到的校正曲线的斜率给出所述免疫结合配偶体的反应性的第一指示。

当使用多克隆抗体作为结合配偶体时，可以按照本领域公知的方法进行高和低反应性多克隆抗体的制备，其通过将所述多克隆抗体引入到携带与凝胶基质共价结合的抗原性分析物的亲和层析柱上而进行。使用梯度洗脱缓冲液，低反应性的多克隆抗体级分将最先从柱上洗脱下来，而后是具有增加的更高的反应性的级分(参见，S.Yamamoto等，1993，″VeterinaryImmunology and Immunopathology(兽医免疫学和免疫病理学)″36，257-264，Elsevier科学出版社(Elsevier Science Publishers)B.V.，Amsterdam)。然后，可以使用BIAcore仪器或者通过将它们独立地包被到相同大小和材料的纳米颗粒上并且生成相应的校正曲线，而检验级分的反应性。

抗体的选择可以通过上文提及的将它们包被在纳米颗粒上的方法进行，而后检测界限分析或确定其功能亲和性，如上文所述。如果适当的话，关于它们对人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的亲和力/抗体亲抗原性而不同的不同的抗人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体的混合物可以用于制备本发明的纳米颗粒-抗体缀合物。适当的混合比例可以由熟练的技术人员通过有限系列的实验而确定。

适当的抗人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体还可以从不同的来源商购。例如，芬兰的HyTest提供一组识别所述抗原的不同表位的高亲和力抗人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体。这些抗体以常规方法制备，其通过用从人尿纯化的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C免疫Balb/c小鼠，并且通过与杂交瘤细胞系Sp2/0融合而产生杂交瘤进行。通过选择的克隆产生的抗体通过蛋白质A亲和层析而纯化。目前可从HyTest获得下述mAbs：Cyst10，Cyst13，Cyst16，Cyst18，Cyst19，Cyst23，Cyst24，和Cyst28。其它商购单或多克隆抗人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体的供应商为：Fusion，北爱尔兰；BioVendor，捷克共和国，AB Location，德国；高级Immunicemical(AdvancedImmunicemical)，美国；Abcam，英国；Axxora，英国；生物设计(Biodesign)，美国；R&D系统，美国；AbD Serotec，挪威；Strategic生物溶液(StrategicBiosolutions)，美国。原则上，所述来源的所有抗人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体可以单独或组合使用，以实施本发明。

c)纳米颗粒以及它们与抗体的缀合物

用于制备本发明的纳米颗粒的物质可以是适合产生并且实施颗粒-增强的光散射测定的任何天然的或合成的、无机的、有机的、非聚合物或聚合物物质。这样的物质包括，例如，硒，碳，金；碳、硅或锗的氮化物，例如Si₃N₄；铁、钛或硅的氧化物，例如TiO₂或SiO₂；以及聚合材料，诸如例如，胶乳，聚苯乙烯，聚(氯乙烯)，环氧树脂，聚偏1，1-二氯乙烯，聚(α-萘基甲基丙烯酸酯)，聚(乙烯基萘(naphtalene))，或它们的共聚物，特别是苯乙烯和可共聚化的烯键式不饱和的化合物的共聚物，例如苯乙烯-(甲基)丙烯酸酯共聚物。由聚合材料制成的颗粒，以及由苯乙烯聚合的内核和苯乙烯与可共聚化的烯键式不饱和的化合物共聚形成的外壳而组成的核-壳颗粒，如例如在美国专利号4,210,723中所述，也是适合的。

适用于缀合的聚合物颗粒可以购自Bangs颗粒公司(Bangs ParticlesInc.)或界面动力学公司(Interfacial Dynamics Inc)，默克SA，法国或其它适当的来源。所述颗粒可以按照许多方法激活，用于结合抗体，例如，这样的偶联化学的详细的教导可以在TechNote 205，Rev.003中，例如2002年3月，“共价偶联(Covalent Coupling)”(通过引用结合)中找到，其可以从Bangs实验公司(Bangs Laboratories，Inc)的网页上下载。例如，偶联可以通过在它们表面上携带羧基-、氨基-、羟基-、酰肼-或氯甲基基团的颗粒的方式而实现。待偶联的分子可以直接与这样的基团反应，或者通过适当的接头如例如碳二亚胺、戊二醛或溴化氰的方式反应。

按照本发明的颗粒的外壳优选地必须包括对半胱氨酸蛋白酶抑制剂C具有高亲和力的抗体，其与特定大小的纳米颗粒核心组合，产生充分的浊度测定信号。典型地，包括蛋白物质的外壳的纳米颗粒在58和200nm之间，更优选地在65和150nm之间，并且甚至更优选地在80和135nm之间。

在本发明的一个特别的实施方案中，未包被的颗粒的平均直径约80nm。使用这些颗粒，在包被之后，它们的直径典型地为90-100nm。作为通用的法则，单层抗体约5nm厚，以致认为这样的颗粒携带单层抗体。

当所述缀合的颗粒总干重的5-35％是由抗体组成时，这些颗粒将具有良好的性能，在所述缀合的颗粒的总干重的10-30％由抗体组成时，所述颗粒具有更好的性能，并且当所述缀合的颗粒的总干重的15-25％是由抗体组成时，具有最佳性能。

如果使用稍微更大的颗粒，这些最佳百分比值下降。通过举例的方式，如果使用95nm的裸颗粒，如果包被的话，它们的中值直径典型地终止在110nm。那么，相对应的百分比为4-32％，8-26％，并且对于最佳性能，相对应的百分比为12-22％(由抗体组成的缀合的颗粒的总干重百分数)。然而，使用这些稍微更大的颗粒，在所述测定中必须使用更多的颗粒(是更重的颗粒的意思)，以具有足够的结合容量来产生校正曲线，而在更高半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的浓度，没有所述曲线的平化(测定校正曲线必须具有达到超过8μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/μl样品的良好的动力学范围)，这导致高得多的吸收背景(更大的颗粒和更多的颗粒)，和更低的信号比噪音比例。

在另一方面，更小的颗粒将在包被的免疫颗粒中具有更高的抗体百分数最适值。例如，如果使用大小70nm的未包被的颗粒，那么包被的颗粒的中值直径典型地为80nm，并且缀合颗粒的总干重的18-30％抗体的比例将导致最佳百分数，并且次最佳的是12-36％的比例，并且甚至更次最佳的是4-42％的抗体的比例。然而，使用这些稍微更小的颗粒，在所述测定中必须使用更少的颗粒(是更少重量的颗粒的意思)，以产生在更低的浓度，即，低于1μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/μl样品，足够陡峭的校正曲线，并且信号将更低，并且还更容易受背景噪音的影响。

基于上述阐释，在本发明的教导的指导下，熟练的读者应该能够提供用于不同的测定条件的最佳免疫颗粒制剂。

将抗人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体包被到纳米颗粒上可以按照满足所用的材料的特性的本领域公知的方法而吸附性地或共价性地实施。

按照一个优选的实施方案，一种或多种亲水惰性蛋白质与抗-半胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体的混合物应该存在于所述抗体与所述纳米颗粒的缀合/结合过程中。本发明人已经意外地观察到，当将抗体与具有接近缀合pH的pI值的亲水蛋白一起与所述颗粒缀合时，获得使用具有高结合容量的亲水性颗粒的最佳结果。当在缀合过程中存在牛运铁蛋白和白蛋白时，获得最好的结果。然而，在缀合过程中，其它的惰性蛋白也可以与抗体混合。这样的亲水性、惰性蛋白的非限制性实例是

(limpet)血蓝蛋白、触珠蛋白以及其它水溶性蛋白，它们对于所述抗体和半胱氨酸蛋白酶抑制剂C没有任何亲和力。

在偶联过程中，条件为，或者应该为，或者如果必要，应该采用这样的条件，以致所述抗体比所述惰性蛋白与纳米颗粒核心材料更具反应性，以致它们将或多或少地与所述核心定量结合。所述纳米颗粒表面的残余的反应部分将由所述惰性蛋白封闭。

本发明人观察到，作为通用法则，在第一步骤中，抗体的疏水部分似乎与所述颗粒物理性结合，并且因此整个分子接近颗粒表面上的反应基团，例如氯甲基基团，然后其与蛋白分子的相对应的基团例如胺反应。由于这种物理学吸附，大的抗体分子令人惊讶地与更小的、惰性的亲水蛋白如白蛋白和运铁蛋白充分竞争。然而，由于使用比颗粒的结合容量更少的抗体，所述惰性蛋白，如白蛋白和运铁蛋白，与颗粒表面上留下来反应的任何基团起反应，并且然后使得本发明的颗粒同时具有良好的亲水表面和良好的抗体结合容量，并且具有可以产生良好的信号的适当的纳米颗粒材料比例。

采用适合每种包被方法的条件，通过本文提供的教导的指导，对于本领域的技术人员，变化是常规的。

例如，对于偶联，当使用单克隆抗体时，可以选择高于抗体的pI半个单位的pH。多克隆抗体具有非常多变的pI，并且因此可以优选地选择使用pH 8.8的多克隆抗体。

在一个优选的实施方案中，基于偶联反应混合物的总蛋白含量，在缀合过程中存在的约3-70重量％，或者甚至更优选地5-40重量％的蛋白应该由所述抗-半胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体组成。

如上述所阐释，由于所述抗体具有比亲水惰性蛋白更高的与所述颗粒的结合率，所以，抗体蛋白与结合到颗粒表面上的总蛋白的比例将高得多，例如，20-90％，并且更优选地结合到颗粒表面上的总蛋白的35-80％，并且甚至更优选地40-70％是由所述抗体组成的。

d)所要求保护的浊度测定方法的优选实施方案

d1)发明优点

本发明提供具有比现有技术更强的信号比噪音比例的浊度测定半胱氨酸蛋白酶抑制剂C免疫测定。通过选择大的核心和蛋白外壳颗粒，优选特定的最小的大小，与抗原亲和纯化的抗体组合，获得了令人吃惊地高凝聚信号。由于与测定缓冲液相比较，在颗粒的折射指数和高度纯化的抗体的高亲和力(或抗体亲抗原性)之间的令人吃惊的协同作用，获得了强浊度测定信号。所述强浊度测定信号导致对干扰物质如三酰甘油的更高的稳定性，并且比浊度测定半胱氨酸蛋白酶抑制剂C免疫测定的现有技术具有更好的线性。

均相免疫测定的关键因素是每质量单位每体积测定混合物所产生的信号。所述测定混合物是在已经加入全部的试剂和样品时获得的混合物。例如，如果要分析3μl的样品，并且所述样品含有1mg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的，并且在混合全部的试剂和样品后终体积是300μl，那么半胱氨酸蛋白酶抑制剂C在终测定混合物中的浓度是l0μg/l。如果所述分析物在样品中的浓度是低的，那么这通常可以通过使用与测定混合物的体积相比更大的样品而补偿，例如，在300μl的测定混合物体积中将样品增加到6μl。对于增加样品体积，存在一些障碍。首先，在样品中可能存在的所有干扰物质在所述测定混合物中的浓度增加。其次，为了克服临界曲线作用(critical hook effect)(即，具有负斜率的剂量/反应曲线)，对抗体的需求增加，其又相对应地增加测定的抗体成本。

因此，存在这样的需要，即，在分析物的低的测定混合物浓度以及相对应低的样品体积下，获得良好的信号强度和稳定的测定。在均相免疫测定中增加样品的体积导致更多的干扰和更昂贵的测定。

本发明提供浊度测定半胱氨酸蛋白酶抑制剂C免疫测定的信号强度、稳定性和线性的令人吃惊的增加。本发明还具有来自脂质如三酰甘油的更少的干扰。在理解基于每质量单位的分析物的浊度测定信号中的过低的信号强度的现有技术的缺点后，实现了上述，并且提供具有比现有技术中的浊度测定方法更好的精确性、线性和更少的干扰的方法。

d2)在不同的检测条件观察到的特别的改进

按照本发明，提供用于测量体液样品中或者来自于体液的样品中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的改进的浊度测定免疫测定方法，其特征在于，

通过将含有所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的液体样品，或者来自于含有半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的液体的样品，或者含有半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的稀释物的样品，与纳米颗粒结合的多克隆抗-半胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体或抗体片段接触，形成测定混合物，以结合所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂C，并且

如果在形成所述混合物后，将所述混合物在37℃保持260秒，通过测量所述混合物的浊度的变化而评估半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的含量，并且所述浊度进一步特征在于，所述混合物在546nm波长处光吸收的改变，所述改变

在所述测定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度下，大于15mAbs单位/cm，或者

在所述测定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度下，大于30mAbs单位/cm，或者

在所述测定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度下，大于75mAbs单位/cm，

并且所述方法进一步特征在于所述纳米颗粒结合的多克隆抗-半胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体或抗体片段缀合物的中值直径大于58nm。

由于546nm的波长和37℃是许多大规模自动化临床化学分析器如日立(Hitachi)，来自罗氏(Roche)的Cobas和Modular，奥林巴斯以及许多其它的仪器的典型的操作模式，所以这是特别有益的。

本发明还提供改进的方法，其特征在于，如果在形成所述混合物后，将所述混合物在37℃保持260秒，所述混合物在具有546nm波长的光吸收的变化，所述变化

在所述测定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度下，大于25mAbs单位/cm，或者

在所述测定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度下，大于55mAbs单位/cm，或者

在所述测定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度下，大于125mAbs单位/cm，

所述方法因为同样的原因而有益。

此外，本发明提供一种方法，其特征在于，如果在形成所述混合物后，将所述混合物在37℃保持260秒，所述混合物在具有546nm波长的光吸收的变化，所述变化

在所述测定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度下，大于30mAbs单位/cm，或者

在所述测定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度下，大于85mAbs单位/cm，或者

在所述测定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度下，大于190mAbs单位/cm，

所述方法也是因为同样的原因而有益。

一些分析型分光光度计仪器在更低的波长下操作。因此，本发明还提供这样一种方法，其特征在于，如果在形成所述混合物后，将所述混合物在37℃保持260秒，所述混合物在具有505nm波长的光吸收的变化，所述变化

在所述测定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度下，大于20mAbs单位/cm，或者

在所述测定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度下，大于50mAbs单位/cm，或者

在所述测定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度下，大于90mAbs单位/cm。

特别地，本发明提供这样一种方法，其特征在于，如果在形成所述混合物后，将所述混合物在37℃保持260秒，所述混合物在具有505nm波长的光吸收的变化，所述变化

在所述测定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度下，大于75mAbs单位/cm，或者

在所述测定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度下，大于150mAbs单位/cm。

此外，本发明提供一种这样的方法，其特征在于，如果在形成所述混合物后，将所述混合物在37℃保持260秒，所述混合物在具有505nm波长的光吸收的变化，所述变化

在所述测定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度下，大于40mAbs单位/cm，或者

在所述测定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度下，大于100mAbs单位/cm，或者

在所述测定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度下，大于250mAbs单位/cm。

其它分析型分光光度计仪器可以在更高的波长操作。

因此，本发明还提供这样的方法，其特征在于，如果在形成所述混合物后，将所述混合物在37℃保持260秒，所述混合物在具有570nm波长的光吸收的变化，所述变化

在所述测定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度下，大于10mAbs单位/cm，或者

在所述测定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度下，大于80mAbs单位/cm。

特别地，本发明提供这样的方法，其特征在于，如果在形成所述混合物后，将所述混合物在37℃保持260秒，所述混合物在具有570nm波长的光吸收的变化，所述变化

在所述测定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度下，大于45mAbs单位/cm，或者

在所述测定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度下，大于100mAbs单位/cm。

另外，本发明提供这样的方法，其特征在于，如果在形成所述混合物后，将所述混合物在37℃保持260秒，所述混合物在具有570nm波长的光吸收的变化，所述变化为

在所述测定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度下，大于125mAbs单位/cm。

存在一些在比37℃更低的温度操作的临床化学仪器。因此，本发明提供这样的方法，其特征在于，如果在形成所述混合物后，将所述混合物在32℃保持600秒，所述混合物在具有546nm波长的光吸收的变化，所述变化

在所述测定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度下，大于12mAbs单位/cm，或者

在所述测定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度下，大于25mAbs单位/cm，或者

在所述测定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度下，大于70mAbs单位/cm。

为了提高临床化学自动化的能力，存在对于更快和更有效的测定方法的巨大的需求。如果测定运行得更快，那么在每个时间单位可以进行更多的测定。特别地，如果构建所述仪器以动力学模式运行，那么在测定开始后，快速而强烈的信号的增加是有益的。因此，本发明提供这样的方法，其特征在于，如果在形成所述混合物后，将所述混合物在37℃保持120秒，所述混合物在具有546nm波长的光吸收的变化，所述变化

在所述测定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度下，大于8mAbs单位/cm，或者

在所述测定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度下，大于20mAbs单位/cm，或者

在所述测定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度下，大于50mAbs单位/cm。

特别地，本发明提供这样的方法，其特征在于，如果在形成所述混合物后，将所述混合物在37℃保持120秒，所述混合物在具有546nm波长的光吸收的变化，所述变化

在所述测定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度下，大于75mAbs单位/cm。

此外，本发明提供这样的方法，其特征在于，如果在形成所述混合物后，将所述混合物在37℃保持40秒，所述混合物在具有546nm波长的光吸收的变化，所述变化为

在所述测定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度下，大于4mAbs单位/cm，或者

在所述测定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度下，大于7mAbs单位/cm，或者

在所述测定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度下，大于15mAbs单位/cm。

d3)使用现有技术浊度测定系统在相同条件下获得的结果

如上文所阐释，用于所述测定的纳米颗粒的颗粒大小必须仔细平衡。大的颗粒产生良好的信号，然而，背景高，并且结合容量低，以致必须加入大量的颗粒，这产生高的背景浊度。先前的测定供应商，如DakoCytomation AS，可能是由于这一主要原因而没有获得良好的浊度测定信号。

当按照在Dako Cytomation AS，产品号LX002/EFG/CS/25.10.04，S2361/EFG/KGR/09.07.03和X0974/EFG/SUM/09.09.04的包装插件中提供的用法说明，以及在上文所引用的Schmidt，Kjoller和

的论文中的用法说明，这导致用于半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的浊度测定免疫测定方法，其特征在于----在37℃260秒内，在波长546nm----收的变化，如下

在所述测定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度下，仅为9mAbs单位，

在所述测定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度下，仅为24mAbs单位，和

在所述测定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度下，仅为50mAbs单位。

这些结果远低于本发明观察到的结果(见上文)。

当尝试使用更短的测定时间(目的在于动力学读数)时，120秒导致下述吸收的变化

在所述测定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度下，仅为6mAbs单位，

在所述测定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度下，仅为15mAbs单位，并且

在所述测定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度下，仅为24mAbs单位，

其远低于本发明所获得的结果。

此外，当尝试使用甚至更短的测定时间(目的在于动力学读数)时，40秒导致下述吸收的变化

在所述测定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度下，仅为3mAbs单位，

在所述测定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度下，仅为6mAbs单位，并且

在所述测定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度下，仅为9mAbs单位，

其也远低于本发明所获得的结果。

上述测定时间定义为从将免疫颗粒混悬液加入到测定试剂和样品的混合物起的时间。所有的体积和顺序都按照供应商的信息。使用来自美国埃德-白令(Dade-Behring)，产品号OQNM13N胶乳半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的ProSpec比浊法参照方法，确定半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的浓度。

d4)实施本发明的测定方法

在本发明的一个优选的实施方案中，将测定缓冲液与样品和免疫颗粒混悬液混合，并且通过光度计，特别是记录式光度计，并且更优选记录式分光光度计，监测所述混合物或得到的混悬液的浊度。优选的步骤顺序为：将样品混合在测定缓冲液中，允许所述混合物完全溶解并且稳定，然后加入免疫颗粒混合物。本发明还可以这样实施，即，通过最先将测定缓冲液与免疫颗粒混悬液混合，然后加入和混合样品而进行。应该应用最佳混合方法(在本领域公知的方法中选择)，其可以通过有限量的预实验而确定。

当使用记录式光度计时，可以确定浊度增加的初始速率，其通过测量吸收增加的初始速率而确定样品的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C浓度，或者通过在混合时直接记录，或者通过在混合后立即记录，与吸收的初始增加的后推组合，或者通过在样品和试剂混合后测量在两个或多个小于1分钟的时间点之间的吸收差异。

这些测量或组合的测量可以是相关的，或者与使用已知的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C浓度的校正的对应结果进行比较，并且这样可以计算未知样品的浓度。这些记录吸收值和计算结果的方法对于临床化学领域的技术人员测量的许多其它物质是众所周知的。当然，来自于本发明的非常良好的信号使得这样的测量和计算稳定和准确得多，特别在如上文所述，在将样品和试剂混合之后立即获得的良好的信号时。

存在一些可以使用的测定缓冲液混合物，其具有加入所述缓冲液中的不同种类的缓冲物质，具有不同种类的去污剂和/或不同种类的聚合物和/或盐。

可以使用TRIS缓冲液，磷酸盐缓冲液，硼酸盐缓冲液以及其它缓冲物质，如MOPS，PIPES，HEPES，并且对于本发明不是关键的，只要所述测定可以不依赖于加入的样品的pH和缓冲能力而保持最终测定混合物的充分调节的pH。典型地，以约5mM-0.2M或10mM-0.1M的终摩尔比例加入所述缓冲液。将pH调整到6-8的范围，特别是6.5-7.5。

此外，可以使用一些去污剂，只要它们能够溶解所加入的样品的任何脂质内容物，并且不太强烈地干扰抗体与所述样品引入的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的反应。由于脂质形成给出干扰信号的微滴和微团，所以，三酰甘油，胆固醇和一定范围的脂蛋白是浊度测定法测定中干扰物质的实例。吐温20，Triton X-100和脱氧胆酸盐是适当的去污剂的实例。在含有脂质的样品中测量半胱氨酸蛋白酶抑制剂C是一个大挑战，并且需要所述脂质的良好的溶解性，但是甚至更重要地是，超过任何次要的干扰的强信号。去污剂典型地以分别为最终反应混合物重量的0.01-0.5％或0.1-0.3％的终比例加入。

最广泛应用的聚合物是不同分子大小的聚乙二醇(特别地，约6.000-8.000)，但是还可以使用葡聚糖和其它聚合物。所述聚合物具有缺点，----当浓度过高时----它们产生在将检测样品与测定混合物混合时引入的其它物质的非特异性沉淀。另一方面，同时，所述聚合物提高信号。然而，它们倾向于减小免疫颗粒的总体结合容量。聚合物典型地以分别为最终反应混合物重量的约0.05-0.5％或0.1-0.3％的终比例加入。

适合离子强度的适合盐是例如，碱金属卤化物，特别是氯化钠，以1-100mM，或5-50mM的浓度加入。

可以存在于测定混合物中的其它适当的成分为：

氨基酸，如甘氨酸，以约1-50mM或5-20mM的终浓度加入；

蛋白质，如白蛋白，以0.1-5g/l或0.5-2g/l的终比例加入；

抗微生物试剂，如叠氮钠，以0.1-10或1-5g/l的终比例加入；

校正剂或对照物质：这些是典型地包括溶解在缓冲物质中，典型地是磷酸缓冲液或TRIS缓冲液中的已知浓度的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的溶液，任选地具有一些蛋白质物质，任选地包括达到100体积％的人或动物血清(如果100体积％是血清，那么对于缓冲溶液，没有空间也没有需要)。

此外，一种或多种试剂可以以干燥的、任选地冻干的形式使用。缀合到纳米颗粒上的抗体可以以干燥的形式使用，例如，作为颗粒物(pellet)，并且在使用之前溶解，或者可以溶解在测定缓冲液试剂中或者溶解在反应混合物中。反应缓冲液中的一种或多种成分可以在实施所述测定之前或过程中以干燥形式加入，校正剂也是这样。甚至所述样品可以以干燥的或冻干的形式提供，并且以干燥形式加入到反应混合物中，或者在其使用之前溶解。

在临床化学分析中，使用用于校正目的的标准曲线是标准实践。因此，在实施本发明的方法时，可以使用已知半胱氨酸蛋白酶抑制剂C含量的样品替代临床样品，以构建待测量的反应/信号的标准曲线，并且然后，可以通过从所述标准曲线的内插法而计算未知样品的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C含量。

按照颗粒增强的光散射免疫测定领域中公知的方法，选择在混合物中纳米颗粒-免疫缀合物的总浓度，以致来源于所述纳米颗粒的吸收值不影响准确的和精确的测量，但是微粒的浓度足够高，足以得到信号发展。所述量当然受到不同的参数的影响，如体液样品或来源其的样品的体积，以及半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的含量。

作为测定的非限制性的典型的参数，可以提及下述：

典型的样品体积是1-20μl，例如2-10μl，或者特别是3μl。

典型的免疫颗粒体积是10-100μl或20-60μl，或者特别是40μl。

所述免疫颗粒可以提供为0.5-10或1-5，典型地约2-3，特别是2.26mg颗粒/ml缓冲溶液的混悬液。所述缓冲液可以具有在6-9范围内的pH，例如7-8.5，典型地约pH 8.4。除了缓冲物质之外，所述缓冲溶液可以包含其它组分，例如氨基酸、盐、惰性蛋白质和乳化剂或增溶剂，如上文所定义。这样的组分和缓冲液的典型的混合物包括10mM硼酸盐缓冲液，10mM甘氨酸，15mM NaCl，0.25％吐温20和1g/l白蛋白。

典型的总测定体积是100-1000μl，或200-500μl，或250-300μl，或者特别地约280μl。

不同的仪器使用不同的总体积运行，以致这些体积的30％或60％，或者这些体积的150％或300％典型地用于其它的仪器。样品体积和免疫颗粒体积的比例可以是在1/100-2/3，更优选地2/100-1/3，并且甚至更优选地1/40-1/5之间的任意值。

d5)医学用途

本发明的测定方法可以用于诊断和监测与体液或组织的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C含量相关的或以此为表现的病理性或潜在的病理性病况。这些特别包括哺乳动物的肾小球滤过率(GFR，作为肾功能的测量)或影响所述滤过率的病理性病况。

本发明的方法可以用来确定儿童的GFR；或者患有肌肉萎缩的患者的GFR；用来指导肾功能癌症治疗的作用；用来指导肾脏移植和免疫抑制治疗；用来指导糖尿病的肾脏滤过率；用于检测并且管理惊厥；并且在药物施用与可能导致体内不理想的药物累积的GFR减少相关的情形中，用来发现正确的药物剂量。

所述测定方法还可以用于评估药物对所述滤过率的作用。

对于本说明书的熟练的技术人员可以明白其它潜在的应用。

本发明还提供实施按照本发明的免疫测定的一组试剂。所述试剂组特征在于，包括抗-半胱氨酸蛋白酶抑制剂C免疫颗粒，适当的测定缓冲液，和任选地，校正剂溶液与对照溶液。任选地，所述颗粒混悬液和测定缓冲液作为组合的试剂递送。

在另一个方面，本发明提供分析产品，任选地以试剂盒或部分的试剂盒形式，用于测定样品中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C，所述产品包括：至少一种如上文所述的以干燥的或混悬形式存在的纳米颗粒-免疫缀合物，并且任选地，一种或多种如本文定义的其它组分，例如，适当的测定缓冲液，并且任选地，校正溶液和对照溶液。

本发明还提供用于实施按照本发明的免疫测定的一组试剂。所述试剂组特征在于，包括，抗-半胱氨酸蛋白酶抑制剂C免疫颗粒，适当的测定缓冲液，并且任选地，校正剂溶液和对照溶液。任选地，所述颗粒混悬液和测定缓冲液作为组合的试剂递送。

任选地，还可以存在信号评估的方式，如计算方案，允许将观察到的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C浓度与GFR参数直接相关。

下述非限制性实例举例说明本发明方法的非限制性方式。

实验部分：

合成实施例1：制备多克隆禽类血清及其亲和纯化

a)制备禽类血清

可以使用下述免疫方法来产生针对人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的多克隆IgY抗体：

每个免疫实验使用2-4只母鸡。在免疫开始之前，收集一对卵。从这些卵中纯化的IgY将作为对照IgY。将在磷酸缓冲液中的100μg高度纯化的人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(从患有肾小管蛋白尿的患者的尿中纯化)用弗氏完全佐剂乳化，并且注射到母鸡的胸肌中。每4周重复注射。在注射起始后10周，收集卵。将蛋黄从卵分离，并且通过氯化铵沉淀，以按照卵抗体分离的现有技术方法的常规方式，分离来自蛋黄的IgY级分(参见，例如，Larsson A，Baaloew R-M，Lindahl T，和Forsberg P-O，在PoultryScience(家禽科学)中，72：1807-1812，1993)。

b)多克隆血清的亲和纯化

按照在柱子的包装插件中的指示，将10mg高度纯化的人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C固定在来自安玛西亚法玛西亚生物技术(AmershamPharmacia Biotech)的HITRAP NHS-活性HP柱上。

将分离的IgY级分在磷酸缓冲盐中稀释至2mg/ml。将200ml的这种IgY溶液流过柱子，然后是50ml无IgY的磷酸缓冲盐。具有对固定的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的特异性亲和力的抗体用35ml 0.1摩尔的柠檬酸盐缓冲液pH＝3.2洗脱。将洗脱的特异性抗-半胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体针对磷酸缓冲盐透析，并且使用具有30,000道尔顿的截留分子量的AmiconCentircon离心过滤装置浓缩至3mg/ml。

合成实施例2：制备单克隆抗-人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体

单克隆抗-人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体的制备可按照下述实施，通过利用本领域公知的方法，例如，由Harlow等，1988，″Antibodies：aLaboratory Manual(抗体：实验室手册)″的第6节，冷泉港出版社，纽约，美国所述。按照Sensabaugh等，1990，J.Urology(泌尿学杂志)144，1523所述，从人精液血浆中分离人PSA。

在规律的时间间隔，将小鼠用在RAS(RIBI佐剂系统)中的50μg人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的4次注射进行免疫。在第一次注射后4个月，使用G.Galfre等，1981，Methods in Enzymology(酶学方法)，73，3-46所述的聚乙二醇方法，将从免疫的小鼠的脾脏分离的淋巴细胞与骨髓瘤细胞系SP2/0-Ag14融合。

分泌针对半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的抗体的杂交瘤通过下述筛选ELISA鉴定：将微量滴定板用兔抗-人-半胱氨酸蛋白酶抑制剂C免疫球蛋白包被；将结合到这种固相上的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C与杂交瘤培养物的上清一起温育。使用抗-小鼠-免疫球蛋白-过氧化物酶-缀合物，检测与半胱氨酸蛋白酶抑制剂C结合的单克隆抗体。

可以分离数百种分泌针对人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的不同的表位的抗体的杂交瘤。然后，亲和纯化相对应的单克隆抗体，并且可以进行更详细地特征性描述。

实施表位结合，并且使用BIAcore生物传感器技术(法玛西亚(Pharmacia)，瑞典)，关于它们的表观解离常数确定抗体的相关反应性。后者是基于表面等离振子共振技术(参见，J.L.Daiss等，1994.在″Methods：A Companion to Methods in Enzymology(方法：酶学方法的指南)″中6，143-156，学院出版公司(Academic Press Inc.)，纽约，美国)，并且允许监测生物分子反应的动力学和化学计量。

从细胞培养物的上清开始，单克隆抗体通过多克隆兔抗-小鼠-Fc-抗体而结合到生物传感器的表面。监测抗原半胱氨酸蛋白酶抑制剂C与所述单克隆抗体的缔合和解离。数据可以使用内在的BIA评估软件，基于简单的A+B＝AB平衡模型(L.G.Fagerstam等，1992，Journal of Chromatography(层析杂志)，597，397-410)，而进行分析。然后，得到的抗体可以关于它们各自的表观解离常数进行比较。然后，适当的抗体或它们的组合可以用于制备本发明的免疫颗粒。

合成实施例3：制备抗-半胱氨酸蛋白酶抑制剂C免疫颗粒

a)偶联方法-标准方法：

(1)缓冲液和试剂

为了具有来自聚合物颗粒的更多的信号/mg抗体，将偶联缓冲液的pH以特殊方式适合待偶联的抗体的pI。另外，在偶联之前，将所述抗体用白蛋白/运铁蛋白稀释(见下文)。对于偶联，当使用单克隆抗体时，选择高于抗体的pI半个单位的pH。多克隆抗体具有非常多变的pI，并且因此使用pH 8.8的多克隆抗体。通过将上文提及的PBS和硼酸盐缓冲液混合，而获得所选择的pH。

下述标准方法概括了通过抗体与氯甲基的物理吸附而附着的两种简单的一步方法。所述方法用于以1％固体的1μm的氯甲基胶乳。这一反应可以容易地放大或缩小，以适合个别需要。例如，如果使用不同的颗粒大小，那么可以从下式计算抗体(Ab)的量：

Ab的重量＝(用于1μm-颗粒的Ab的重量)/(单位为μm的颗粒直径)

(2)制备胶乳颗粒混悬液

1.移取2.5ml(40mg/ml)氯甲基胶乳微球体，并且用10mL MES缓冲液稀释。

2.将所述混合物离心，以沉淀颗粒：～3,000G持续～20分钟。

3.去除上清，并且将沉淀重新分散在10ml MES缓冲液中。

4.再次离心，并且从颗粒上去除上清。

5.将沉淀重悬在5ml MES缓冲液中，确保完全悬浮微球体颗粒。

现在，所述胶乳混悬液约2％固体(即，～20mg/ml)。

(3)偶联

1.向5ml在调节到适当的pH(见上文)的PBS/硼酸盐缓冲液中的1.5mg抗体、3.75mg白蛋白和7mg牛运铁蛋白的溶液中，加入5ml的胶乳。这小于需要的抗体单层。所述抗体与所述运铁蛋白(transferring)和白蛋白相比，与胶乳更具反应性，并且或多或少地与胶乳定量结合，并且其余的胶乳表面由白蛋白和/或运铁蛋白饱和。这种混合物还保证颗粒的抗凝聚和良好的亲水性。此外，其它的惰性蛋白质可以在缀合过程中与抗体混合，如

血蓝蛋白、触珠蛋白以及其它水溶性蛋白，它们对于所述抗体和半胱氨酸蛋白酶抑制剂C没有任何亲和力。

2.在室温下轻轻搅拌，将胶乳/蛋白混合物温育过夜。

3.离心，以从未结合的蛋白质分离蛋白-标记的胶乳颗粒。

4.去除并且保留用于蛋白质确定的上清。在这一步骤，可以保留上清，并且进行蛋白确定。可以从加入的初始量中减去上清中的任何残留的蛋白。将剩余的包被在颗粒上。与胶乳微球体相容的用于蛋白确定的唯一的方法是来自Pierce的Micro BCA蛋白测定试剂盒。

5.将沉淀重悬在10ml PBS中。

6.再次离心，以沉淀所述颗粒。

7.再重复步骤5-6两次，总共进行3次洗涤。

8.将最终的胶乳重悬在10ml储存缓冲液中，产生1％固体的终浓度。在4℃保存备用。勿冷冻。

将甘氨酸用于储存缓冲液中，以填充已经被蛋白质覆盖的微球体表面上的任何反应位点。这是减少非特异性的结合。如果需要，惰性蛋白，如牛血清白蛋白(BSA)或牛运铁蛋白，可以用于同样的目的。存在NaN₃作为生物杀灭剂。如果所述胶乳保持无菌，可以省略与细胞或组织培养物不相容的NaN₃。

b)制备包被的纳米颗粒

应用上述标准方法包被直径0.08μm的胶乳颗粒，以制备本发明的纳米颗粒-缀合物。按照上式，24mg的抗体和65mg的白蛋白用来包被100mg的颗粒。

通过将来自挪威的挪威抗体AS(Norwegian Antibodies AS，Norway)的产品号A167 Cys-C-AF的抗-半胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体(所述多克隆抗人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体对应从用来自患有慢性肾小管蛋白尿的患者的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C免疫的母鸡的卵分离的免疫球蛋白的亲和纯化的免疫球蛋白级分；亲和纯化方法使用固定的人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C而进行)，偶联到氯甲基活化的胶乳颗粒(0.08μm，来自美国的界面动力学公司(Intefacial Dynamics Inc.，USA)，产品号C37487)上，而产生所述抗-半胱氨酸蛋白酶抑制剂C免疫颗粒。对于所述偶联，可以使用从http://www.idclatex.com/body-bgrounder-superactive-protocol-11.asp下载的方法“蛋白与IDC超净氯甲基胶乳的偶联(Coupling of Proteins toIDC Ultraclean Chloromethyl Latex)”。

备选的颗粒和偶联方法可以在界面动力学公司(Intefacial Dynamics)的网页上、Invitrogen的网页和Bangs颗粒公司(Bangs Particles Inc)的网页上找到。

所获得的颗粒用作在具有0.25％吐温20和1g/l白蛋白的10mM硼酸盐缓冲液，10mM甘氨酸，15mM NaCl中2.26mg颗粒/ml的混悬液。

测定实施例1：在不同测定条件下，基于本发明的免疫颗粒的浊度测定半胱氨酸蛋白酶抑制剂C测定

按照合成实施例3制备的免疫颗粒混悬液用于下述实验：

在所述实验中，使用下述最优化的测定缓冲液pH＝7.2：

聚乙二醇(西格玛(Sigma))22g/l，

吐温20(西格玛)3g/l，

MOPS(西格玛)9.4g/l，

叠氮钠2.7g/l，

氯化钠27g/l，

将3μl样品与250μl所述测定缓冲液混合，并且允许静止300秒，然后加入40μl颗粒混悬液并且混合。在所述混合之后，在Schimadzu UV 1601分光光度计中测量光吸收/cm。

取决于浓度、温度、加入免疫颗粒混悬液并且混合后的时间、以及在分光光度计中所用光的波长，获得下述结果(mAbs单位/cm＝毫吸收单位/厘米光径)：

a)在波长546nm在37℃260秒测定时间内：

在所述测定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度下，33mAbs单位的吸收变化，并且在所述测定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度下，88mAbs单位的吸收变化，并且在所述测定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度下，194mAbs单位的吸收变化。

b)在波长505nm在37℃260秒测定时间内：

在所述测定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度下，43mAbs单位的吸收变化，并且在所述测定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度下，128mAbs单位的吸收变化，并且在所述测定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度下，282mAbs单位的吸收变化。

c)在波长570nm在37℃260秒测定时间内：

在所述测定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度下，24mAbs单位的吸收变化，并且在所述测定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度下，65mAbs单位的吸收变化，并且在所述测定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度下，148mAbs单位的吸收变化。

d)在波长546nm在37℃120秒测定时间内：

在所述测定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度下，11mAbs单位的吸收变化，并且在所述测定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度下，31mAbs单位的吸收变化，并且在所述测定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度下，72mAbs单位的吸收变化。

e)在波长546nm在37℃40秒测定时间内：

在所述测定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度下，4mAbs单位的吸收变化，并且在所述测定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度下，11mAbs单位的吸收变化，并且在所述测定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度下，23mAbs单位的吸收变化。

所述“测定时间”定义为从将免疫颗粒与测定缓冲液和样品的混合物混合直到读取吸收的秒数。使用来自美国埃德-白令(Dade-Behring)的产品号为OQNM13N胶乳半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的ProSpec比浊法参照方法，确定半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的浓度。

然后，将这些结果，与更快和更强的浊度测定信号一起，用来研究来自三酰甘油的干扰的作用，三酰甘油是浊度测定免疫测定中常见的干扰物质，并且与最好的现有技术方法相比较，研究本发明方法的线性。这些实验描述如下。

测定实施例2：研究三酰甘油对本发明方法的浊度测量的干扰

本研究的目的是确定本发明的方法是否在检测样品中经历来自三酰甘油(TG)的干扰。不管是否发现干扰低于预先确定的TG浓度，实施剂量反应研究，以证明干扰与可能干扰的物质的浓度之间的关系。这种方法是基于NCCLS指南“Interference testing in clinical chemistry；approvedguideline(临床化学的干扰检测；核准的指南)”，NCCLS第6.1.2部分。

a)装置：

仪器：带有标准附件的日立(Hitachi)917仪器，由罗氏诊断(RocheDiagnostics)提供。

日立917仪器的设置：

·测定缓冲液体积：230μl

·样品体积： 3μl

·免疫颗粒体积： 40μl

·水体积： 20μl

·一级波长 546nm

·二级波长 700nm

·校正稀释0.055，0.125，0.250，0.432，0.667，1.000

·Logit Log(4P)

b)试剂：

测定缓冲液：聚乙二醇(西格玛)22g/l，吐温20(西格玛)3g/l，MOPS(西格玛)9.4g/l，叠氮钠2.7g/l，氯化钠27g/l，pH＝7.2。

校正剂：包含7.70mg/l人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的血清，使用关于ProSpec比浊计的Dade-Behring’s比浊法由参照实验室确定。

免疫颗粒：按照上述合成实施例2制备的抗-半胱氨酸蛋白酶抑制剂C免疫颗粒。颗粒用作在10mM硼酸盐缓冲液，10mM甘氨酸，15mM NaCl，0.25％吐温20和1g/l白蛋白中的混悬液(2.26mg颗粒/ml混悬液)。

c)样品：

血清1：具有高于20mmol/l的三酰甘油浓度的人血清的合并液。

血清2：具有低于10mmol/l的三酰甘油浓度的人血清的合并液。

这两种血清样品用来制备需要的三酰甘油浓度的样品。

d)确定在要用的两种血清合并液中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C浓度：

以10次重复，测量在要用的两种血清合并液中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C浓度。

测量号	血清1(mg/l)	血清2(mg/l)
			1	0.87	3.12
2	0.86	3.10
			3	0.85	3.20
4	0.87	3.22
			5	0.87	3.18
6	0.87	3.18
			7	0.85	3.16
8	0.84	3.21
			9	0.85	3.18
10	0.86	3.25
			平均值(mg/l)	0.86	3.18
SD(mg/l)	0.011	0.045
			CV(％)	1.3	1.4

平均值指定所述血清合并液的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C值。

选择在高于1mg/l的值的+/-5％干扰和在低于1mg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的值的+/-7.5％的界限作为允许来自三酰甘油的最大的干扰。这种不同叫作d_max。

按照NCCLS指南，实施具有95％置信水平(α＝0.05)和95％幂(β＝0.05)----双边检测(two-sided test)的这一实验需要的重复的数目(n)：

n = 2 {[\frac{(1,960 + 1,645) s}{d_{\max}}]}^{2}

其中s是在所述血清合并液的运行精确度内(以mg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l)。

按照NCCLS指导计算最少重复：

低样品：

n = 2 {[\frac{(1,960 + 1,645) s}{d_{\max}}]}^{2} = 0.76

高样品：

n = 2 {[\frac{(1,960 + 1,645) s}{d_{\max}}]}^{2} = 2.08

结果表明3次重复是充分的。

e)制备三酰甘油添加的血清(triglyceride spiked serum)：

制备具有约20mmol/l三酰甘油的血清(血清合并液A)。由独立的服务实验室确定三酰甘油的含量。将这部分血清的一半添加来自英国Scipac有限公司的纯化的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C，得到高于3mg/l的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C值(血清合并液B)。

将一半的血清合并液A和B通过在Beckman TL-100超高速离心机中以50,000rpm超高速离心30分钟进行处理。样品的澄清部分用作对照合并液，并且对于去除的脂质的体积校正体积。(分别命名为血清合并液C和D)。

f)分析运行：

制备基本合并液混合物和对照合并液混合物A，B，C和D每一种的三份等分试样。

按照用法说明校正仪器，并且以交替的顺序进行基本合并液混合物和对照合并液混合物(合并液A，B，C和D)的分析。

如果观察到干扰，制备来自0％和100％的合并液的50％的中等合并液。从中等合并液和0％的合并液，制备25％的合并液。从中等合并液和100％的合并液，通过将等量的每种合并液混合而制备75％的合并液。在具有新的校正的一次运行中随机测量全部的n次重复。

对于0％的合并液，计算平均浓度，并且从所有其它的结果中减去。

g)数据分析的净结果：

g1)高半胱氨酸蛋白酶抑制剂C值样品

g2)低半胱氨酸蛋白酶抑制剂C值样品

观察到，按照指定的检测条件，在低于18mmol/l浓度的TG不干扰本发明的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C免疫测定。

因此，可以推论，本发明提供用于半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的浊度测定免疫测定方法，其特征在于，在检测样品中的15mmol/l的三酰甘油对在3.2和0.83mg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l水平的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的测量值具有等于或小于5％的干扰。

测定实施例3：确定TG对现有技术测定的干扰

使用日立(Hitachi)917仪器和现有技术试剂(Dako Cytomation)进行相应的研究。

a)试剂：

免疫颗粒： LX002/EFG/CS/25.10.04

校正剂： X0974/EFG/SUM/09.09.04

对照组： X0973/EFG/SUM/09.09.04

反应缓冲液9：S2361/EFG/KGR/09.07.03

b)结果：

b1)高半胱氨酸蛋白酶抑制剂C值样品，现有技术试剂

b2)低半胱氨酸蛋白酶抑制剂C值样品，现有技术试剂

从上述表格，我们可以推论，本发明的方法更稳定地抵抗来自三酰甘油的干扰。

测定实施例4：使用本发明的方法进行线性研究：

本研究按照NCCLS方法EP6-A，卷23，No 16进行。

在本实验中，研究了本发明的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C免疫测定的线性。这通过将3份不同的添加高血清的样品用低浓度的血清样品稀释，从0-100％而进行。通过绘制稀释系列的结果并且通过一阶、二阶和三阶回归分析研究所述图，我们推论，按照给定的标准，本发明的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C免疫测定方法是线性的。所述标准是通过斯氏t-检验而检验并且比较图的参数，以查看测量点(针对稀释因子绘图)是否能够比一阶多项式更好地拟合二阶或三阶多项式。如果t-检验失败了，我们接受在一阶多项式和具有最低chi平方值的高阶多项式之间6％的差异，其与每个水平的测量的平均值相关(除了在终点之外，在那里，由于人们很少或从不测量具有在这一区域的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C浓度的样品的事实，所以，可以接受达到25％的差异)。按照这些标准，本发明的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C免疫测定方法在日立(Hitachi)911测量系统上是线性的。

a)仪器：

使用日立(Hitachi)911仪器。

b)试剂：

使用上述测定缓冲液和半胱氨酸蛋白酶抑制剂C校正剂以及抗-半胱氨酸蛋白酶抑制剂C免疫颗粒。

c)样品：

3份不同患者血清样品，A，B和C，其中所有的样品具有高于6mg/l的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C值。

一份具有低半胱氨酸蛋白酶抑制剂C浓度，低于0.8mg/l的患者血清样品用作高血清的稀释剂。

血浆样品A，B和C的稀释系列如在表1中关于样品A所述。

使用低样品D，将每份样品A，B和C稀释10次，制备从初始浓度的100％-0％，其中100％是纯的高浓度血清(A₁₀₀，B₁₀₀，C₁₀₀)，并且0％是纯的低浓度血清(D₁₀₀)。

表1.关于血清样品A的稀释表

样品ID	稀释因子	体积100％溶液，A₁₀₀(ul)	体积0％溶液，D₁₀₀(ul)
				A1	1	1000	0
A2	0.9	900	100
				A3	0.8	800	200
A4	0.7	700	300
				A5	0.6	600	400
A6	0.5	500	500

A7	0.4	400	600
				A8	0.3	300	700
A9	0.2	200	800
				A10	0.1	100	900
A11	0	0	1000

进行如表1所述的样品B和样品C的相同的稀释系列。

使用下述测定参数，进行关于日立(Hitachi)911的校正，以建立标准曲线：

○测定体积： 230μl

○样品体积： 3μl

○免疫颗粒体积：40μl

○水体积： 10μl

每一份稀释的样品以3次重复测量，并且记录每份样品A，B和C的结果。

d)结果：

d1)回归分析

稀释	0	0.1	0.2	0.3	0.4	0.5	0.6	0.7	0.8	0.9	1
												测量1(mg/l)	0.81	1.5	2.19	3.01	3.97	4.73	5.5	6.56	7.25	7.94	8.44
测量2(mg/l)	0.77	1.5	2.16	2.95	3.67	4.75	5.62	6.23	7.23	7.88	8.45
												测量3(mg/l)	0.76	1.53	2.17	2.85	3.82	4.63	5.48	6.09	6.98	7.73	8.2
平均值(mg/l)	0.78	1.51	2.17	2.94	3.82	4.7	5.53	6.29	7.15	7.85	8.36
												SD(mg/l)	0.015	0.017	0.015	0.081	0.15	0.064	0.076	0.24	0.15	0.11	0.14
CV(％)	1.9	1.13	0.7	2.8	3.9	1.4	1.4	3.8	2.1	1.4	1.7
												对照低(mg/l)	1.40
对照高(mg/l)	3.62

表1：原始数据血清1

稀释	0	0.1	0.2	0.3	0.4	0.5	0.6	0.7	0.8	0.9	1
												测量1(mg/l)	0.6	1.34	1.8	2.41	3.1	3.59	4.21	4.76	5.28	5.82	6.35
测量2(mg/l)	0.64	1.3	1.76	2.36	2.93	3.54	4.01	4.77	5.24	5.96	6.37
												测量3(mg/l)	0.57	1.29	1.84	2.3	2.85	3.51	3.87	4.79	5.26	5.84	6.32
平均值(mg/l)	0.6	1.31	1.8	2.36	2.96	3.55	4.03	4.77	5.26	5.87	6.35
												SD(mg/l)	0.035	0.026	0.04	0.055	0.13	0.04	0.17	0.015	0.02	0.076	0.025
CV(％)	5.8	2	2.2	2.3	4.4	1.1	4.2	0.3	0.4	1.3	0.4
												对照低(mg/l)	1.47
对照高(mg/l)	3.74

表2：原始数据血清2

稀释	0	0.1	0.2	0.3	0.4	0.5	0.6	0.7	0.8	0.9	1
												测量1(mg/l)	0.78	1.43	2.06	2.65	3.46	4	4.82	5.65	6.16	7.05	7.56
测量2(mg/l)	0.67	1.41	2.07	2.75	3.31	3.99	4.92	5.63	6.29	6.89	7.47
												测量3(mg/l)	0.73	1.4	2.01	2.66	3.21	4.14	4.75	5.46	6.14	6.74	7.51
平均值(mg/l)	0.73	1.41	2.05	2.69	3.33	4.04	4.83	5.58	6.2	6.89	7.51
												SD(mg/l)	0.055	0.015	0.032	0.055	0.13	0.084	0.085	0.1	0.081	0.16	0.045
CV(％)	7.5	1.1	1.6	2.04	3.9	2.08	1.8	1.8	1.3	2.3	0.6
												对照低(mg/l)	1.46
对照高(mg/l)	3.60

表3：原始数据血清3

对于所有三种血清，使用回归分析，测量的平均值相对于稀释因子的图显示在图1，2和3中。

d2)斯氏t-检验

进行斯氏t-检验，以检验高阶回归参数是否拟合所述数据。结果显示在表4中：

表4：斯氏t-检验值

血清1

从表4中，由于计算的t-值小于列表显示的t-值，所以，我们推论，来自血清1的数据不拟合二阶多项式。

从表4中，我们推论，所述数据可以拟合更高阶的多项式，并且我们需要检验在一阶多项式和具有最低的chi平方值的更高阶多项式之间的差异是否大于6％。三阶多项式具有最低的chi平方值。

DL＝P(x)-L(x)，

其中P(x)是多项式方程，并且L(x)是线性方程。

测量的平均值(mg/l)	来自方程的三阶计算值：P3(x)＝0.811+5.821x+5.872x²-4.116x³	来自方程的一阶计算值：L(x)＝0.709+7.874x	绝对差异DL＝P3(x)-L(x)	DL％差异＝DL/(测量的平均值)*100
					0.7801.512.172.943.824.705.536.297.157.858.36	0.8111.452.182.973.824.685.536.357.127.818.39	0.7091.502.283.073.864.655.436.227.017.808.58	0.102-0.0487-0.107-0.0966-0.04310.02900.09510.1300.1100.0101-0.195	13.1-3.22-4.91-3.28-1.130.6171.722.071.540.128-2.33

表5：DL(％)计算血清1

关于血清1的DL(％)图显示在图4中。

血清2

从表4中，由于计算的t-值小于列表显示的t-值，所以，我们推论，来自血清2的数据不拟合二阶多项式。

由于计算的t-值小于列表显示的t-值，所以，从中我们推论，来自血清2的数据不拟合三阶多项式，并且认为稀释系列是线性的。

血清3

从表4中，由于计算的t-值小于列表显示的t-值，所以，我们推论，来自血清3的数据不拟合二阶多项式。

从表4中，我们推论，所述数据可以拟合更高阶的多项式，并且我们需要检验在一阶多项式和具有最低的chi平方值的更高阶多项式之间的差异是否大于5％(DL)。三阶多项式具有最低的chi平方值。

DL＝P(x)-L(x)，

其中P(x)是多项式方程，并且L(x)是线性方程。

测量的平均值(mg/l)	来自方程的三阶计算值(mg/l)：P3(x)＝0.768+5.755x+2.601x²-1.603x³	来自方程的一阶计算值：L(x)＝0.680+6.868x	绝对差异(mg/l)DL＝P3(x)-L(x)	DL％差异＝DL/(测量的平均值)*100
					0.7301.412.052.693.334.044.835.586.206.897.51	0.7681.372.012.693.384.104.815.526.226.897.52	0.6801.372.052.743.434.114.805.496.176.867.55	0.08800.00111-0.0434-0.0551-0.0436-0.01860.01030.03360.04150.0245-0.0270	12.10.0785-2.12-2.05-1.31-0.4610.2140.6010.6690.356-0.360

表6：DL(％)计算血清3

关于血清3的DL(％)图显示在图5中。

从上述计算和对线性的规格设置，我们发现，本发明的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C免疫测定在约0.6-8.5mg/l的检测范围内是线性的。

由于参考区间包含在这一范围内，并且已测量高于8mg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的浓度，所以，记录的线性范围对于本方法的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C免疫测定的全部临床目的是充分的。

从本研究可以推论，按照本发明用于半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的浊度测定免疫测定方法特征在于，在1.32-7.5mg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的测量范围内，具有小于4％的线性偏差，并且在0.75-7.5mg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的测量范围内，小于15％的线性偏差。

测定实施例5：关于按照本发明的方法的线性研究：

本研究按照NCCLS方法EP6-A，卷23，No 16进行。

在本实验中，研究了本发明的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C免疫测定的线性。这通过将添加的高血清样品用低浓度的血清样品稀释，从0-100％而进行。通过绘制稀释系列的结果并且通过一阶、二阶和三阶回归分析研究所述图，我们推论，按照给定的标准，本发明的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C免疫测定方法是线性的。所述标准是通过斯氏t-检验而检验并且比较图的参数，以查看测量点(针对稀释因子绘图)是否能够比一阶多项式更好地拟合二阶或三阶多项式。如果t-检验失败了，我们接受在一阶多项式和具有最低的chi平方值的更高阶多项式之间6％的差异，其与在每一水平的测量平均值相关(除了在终点之外，在那里，由于人们很少或从不测量具有在这一区域的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C浓度的样品的事实，所以，可以接受达到25％的差异)。按照这些标准，本发明的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C免疫测定方法在Architect ci8200测量系统上是线性的。

a)仪器

使用Architect ci8200仪器。

b)试剂

c)样品

一份患者血清样品，A，其具有高于6mg/l的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C值。

一份患者血清样品，D，其具有低于0.8mg/l的低半胱氨酸蛋白酶抑制剂C浓度，用作高血清的稀释剂。

血浆样品A的稀释系列，如在表1中所述。使用低样品D，将样品稀释10倍，从初始浓度的100％-0％，其中100％是纯的高浓度血清(A₁₀₀)，并且0％是纯的低浓度血清(D₁₀₀)。

样品ID	稀释因子	体积100％溶液，A₁₀₀(ul)	体积0％溶液，D₁₀₀(ul)
				A1	1	1000	0
A2	0.9	900	100
				A3	0.8	800	200
A4	0.7	700	300
				A5	0.6	600	400
A6	0.5	500	500
				A7	0.4	400	600
A8	0.3	300	700
				A9	0.2	200	800
A10	0.1	100	900
				A11	0	0	1000

表7.血清样品A的稀释表

○测定体积： 220μl

○样品体积： 3μl

○免疫颗粒体积：45μl

每一份稀释的样品以3次重复测量，并且记录样品A的结果。

d)结果：

d1)回归分析

稀释	0	0.1	0.2	0.3	0.4	0.5	0.6	0.7	0.8	0.9	1
												测量1(mg/L)	0.63	1.58	2.45	3.36	4.25	5.31	6.36	7.38	8.12	8.77	太高
测量2(mg/L)	0.64	1.59	2.47	3.37	4.35	5.36	6.31	7.33	8.15	8.71	太高

测量3(mg/L)	0.62	1.59	2.48	3.33	4.27	5.38	6.32	7.35	8.16	8.83	太高
												平均值(mg/L)	063	1.59	2.47	3.35	4.29	5.35	6.33	7.35	8.14	8.77	太高
SD(mg/L)	0.01	0.006	0.015	0.021	0.053	0.036	0.026	0.025	0.021	0.060	NA
												CV(％)	1.59	0.36	0.62	0.62	1.23	0.67	0.42	0.34	0.26	0.68
对照低(mg/L)	0.88
												对照高(mg/L)	3.63

表8：原始数据血清A

使用回归分析，对于血清A测量的平均值相对于稀释因子的图显示在图6，7和8中。

d2)斯氏t-检验

表9：斯氏t-检验值

血清A

从表9中，由于计算的t-值小于列表显示的t-值，所以，我们推论，来自血清A的数据不拟合二阶多项式。

从表9中，我们推论，所述数据可以拟合更高阶的多项式，并且我们需要检验在一阶多项式和具有最低的chi平方值的更高阶多项式之间的差异是否大于6％。三阶多项式具有最低的chi平方值。

DL＝P(x)-L(x)，

其中P(x)是多项式方程，并且L(x)是线性方程。

测量的平均值(mg/L)	来自方程的三阶计算值：P3(x)＝0.695+7.53x+6.15x²-4.996x³	来自方程的一阶计算值：L(x)＝0.64+9.30x	绝对差异DL＝P3(x)-L(x)	DL％差异＝DL/(测量的平均值)*100
					0.6301.592.473.354.295.356.337.358.148.77	0.6951.502.413.374.375.376.357.278.108.82	0.6401.572.503.434.365.296.227.158.089.01	0.05500.06570.09320.05760.01110.08300.1280.1160.01800.197	-8.734.133.771.72-0.259-1.55-2.02-1.58-0.2212.25

表10：DL(％)计算

从上述计算和对线性的规格设置，我们发现，本发明的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C免疫测定在约0.6-8.8mg/l的检测范围内是线性的。

由于参考区间包含在这一范围内，并且已测量高于8mg/l的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C浓度，所以，记录的线性范围对于本方法的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C免疫测定的全部临床目的是充分的。

从本研究可以推论，按照本发明用于半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的浊度免疫测定方法特征在于，在1.32-7.5mg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的测量范围内，具有小于4％的线性偏差，并且在0.75-7.5mg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的测量范围内，小于15％的线性偏差。

测定实施例6：关于现有技术浊度测定的线性研究：

a)分析

使用现有技术方法和设置，按照Camilla Schmidt在journal EuropeanClinical Laboratory(欧洲临床实验室杂志)，2004年2月10日，“CystatinC-The marker of choice for renal function testing(半胱氨酸蛋白酶抑制剂C-肾功能检测的选择标记”，以及在所述文献中提及的Dako产品的包装插件，进行与测定实施例4相对应的研究，获得下述结果：

b)结果

b1)回归分析

对于所有三份血清A，B和C，使用回归分析，测定的平均值相对于稀释因子的图显示在图10，11和12中。

b2)斯氏t-检验

进行斯氏t-检验，以检验更高阶回归参数是否拟合所述数据。对应的值总结在表11中：

对于具有df＝30和α＝0.05/2的二阶多项式(双边检验)的列表显示的t-值	2.042	2.042	2.042
				对于具有df＝29和α＝0.05/2的二阶多项式(双边检验)的列表显示的t-值	2.045	2.045	2.045

表11：斯氏t-检验值

血清1

数据可能拟合更高阶多项式，并且我们需要检验在一阶多项式和具有最低的chi平方值的更高阶多项式之间的差异是否大于6％(DL)。所述三阶多项式具有最低chi平方值。差异(DL)为：

测量的平均值(mg/l)	来自方程的三阶计算值：P3(x)＝0.659+5.051x+3.796x²-1.521x³	来自方程的一阶计算值：L(x)＝0.377+7.436x	绝对差异DL＝P3(x)-L(x)	％差异＝DL/测量的平均值*100
					0.6331.241.822.453.203.934.705.576.327.227.96	0.6591.201.812.473.193.944.735.536.357.177.99	0.3771.121.862.613.354.094.845.586.337.077.81	0.2820.0799-0.0553-0.133-0.162-0.152-0.111-0.04920.02470.1010.172	44.56.45-3.04-5.43-5.06-3.86-2.36-0.8830.3911.412.16

表12：DL(％)计算

关于血清1的DL(％)图显示在图13中。

血清2

数据可能拟合更高阶多项式，并且我们需要检验在一阶多项式和具有最低的chi平方值的更高阶多项式之间的差异是否大于6％(DL)。所述三阶多项式具有最低chi平方值。

差异(DL)为：

测量的平均值(mg/l)	来自方程的三阶计算值(mg/l)：P3(x)＝0.516+4.703x-0.246x²+0.381x³	来自方程的一阶计算值(mg/l)：L(x)＝0.480+4.81x	绝对差异(mg/l)DL＝P3(x)-L(x)	％差异＝DL/测量的平均值*100
					0.4801.041.451.912.372.863.283.834.334.875.32	0.5160.9841.451.922.382.853.333.824.324.835.35	0.4800.9611.441.922.402.883.373.854.334.815.29	0.03600.02320.00781-0.00795-0.0218-0.0314-0.0345-0.0288-0.01200.01820.0640	7.502.230.538-0.416-0.919-1.10-1.05-0.751-0.2760.3731.20

表13：DL(％)计算

关于血清2的DL(％)图显示在图14中。

血清3

这意味着，数据可能拟合更高阶多项式，并且我们需要检验在一阶多项式和具有最低的chi平方值的更高阶多项式之间的差异是否大于6％(DL)。所述三阶多项式具有最低chi平方值。

差异(DL)为：

测量的平均值(mg/l)	来自方程的三阶计算值(mg/l)：P3(x)＝0.623+5.032x+2.100x²-0.287x³	来自方程的一阶计算值(mg/l)：L(x)＝0.363+6.866x	绝对差异(mg/l)DL＝P3(x)-L(x)	％差异＝DL/测量的平均值*100
					0.6101.151.742.322.953.614.295.125.836.697.44	0.6231.151.712.312.953.634.345.085.856.647.47	0.3631.051.742.423.113.804.485.175.866.547.23	0.2600.0973-0.0251-0.109-0.156-0.168-0.146-0.0932-0.01010.1010.239	42.68.46-1.44-4.70-5.29-4.65-3.41-1.82-0.1741.513.21

表14：DL(％)计算

关于血清3的DL(％)图显示在图15中。

我们推论，在参照范围的下限部分，通过Dako半胱氨酸蛋白酶抑制剂C免疫测定示例的浊度测定法免疫测定的现有技术不是令人满意的线性的。

测定实施例7：本发明的浊度测定与比浊度参照方法的相关性：

参考2005年春季C.Schmidt，C.

和K

的公布“Newimproved automated particle-enhanced turbidimetric immunoassay forquantitative determination of human Cystatin C in serum and plasma(用于定量确定血清和血浆中的人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的新改进的自动化颗粒-增强的浊度免疫测定)”，其可从Dako Cytomation网页下载。在使用来自埃德-白令(Dade-Behring)的比浊法参照方法的相关性研究中，他们发现+0.214的截取，以及在相关性曲线中0.6954的增量/斜率。这是与所述参照方法的大的差异。

由于上述原因，通过本发明，提供比所述参照方法具有好得多的相关性的方法。

a)测定条件：

在本实验中，在瑞典乌普萨拉的Akademiska大学医院(AkademiskaUniversity Hospital)，将本发明的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C免疫测定，其使用如上文所述的日立917仪器的设置，与在BN ProSpec上的埃德-白令(Dade-Behring)半胱氨酸蛋白酶抑制剂C方法进行比较，其通过用两种方法一式两份测量相同的51份血清样品(在同一种校正剂和同一天)，并且将它们使用偏性分析(bias analysis)和线性回归分析进行比较。另外，确定与埃德-白令(Dade-Behring)置信上限的差异，也叫作医学决定点(Medical Decision point)。实验设计和数据分析按照NCCLS方法EP-2，卷22，No.19的推荐。

b)结果

下述附图16，17和18表示所述结果。所述附图16，17和18表明，本发明的方法令人吃惊地提供具有非常好的准确性的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C测量，其使得结果没有显著不同于比浊法参照方法。在50份检测样品的所述研究中，在两种方法之间没有显著的偏性。总共存在0.023的偏性，具有-0.023到+0.0658的95％置信区间；本质上，没有显著不同于0的偏性。

埃德-白令(Dade-Behring)半胱氨酸蛋白酶抑制剂C免疫测定具有0.95mg/l的医学决定点。使用线性回归分析，我们发现，用Dade Behring方法测量为0.95mg/l的样品，使用按照本发明的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C免疫测定方法，将测量在0.83-0.89mg/l之间。血浆方法比较分析导致0.968的相关性曲线斜率，具有0.103mg/l的截取。这意味着，所述血浆分析的斜率和截取落在血清分析的斜率和截取的置信区间内。

这证明，与浊度测定方法技术先前的最好状态相比，本发明的方法导致与比浊法参照方法好得多的相关性。

上文提及的公布“New improved automated particle-enhancedturbidimetric immunoassay for quantitative determination of human Cystatin Cin serum and plasma(用于定量确定在血清和血浆中的人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的新改进的自动化颗粒-增强的浊度测定法免疫测定)”证明，浊度测定半胱氨酸蛋白酶抑制剂C测量可以用来估计肾小球滤过率。这也由Grubb等在Clinical Chemistry(临床化学)51：8，1420-1431中的公布“SimpleCystatin C-Based Prediction Equations for Glomerular Filtration RateCompared with the Modification of Diet in Renal Disease Prediction Equationfor Adults and the Schwartz and the Counahan-Barratt Prediction Equations forChildren(单纯基于半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的肾小球滤过率预测方程与用于成年人的肾病预测方程和用于儿童的Scwartz和Counahan-Barratt预测方程中的饮食改进的比较)”证明。使用比浊法参照方法的类似公布是A.Larsson等，在Scand.J.Lab.Invest.(斯堪的纳维亚实验室研究杂志)2004；64，25-30中的“Calculation of glomerular filtration rate expressed in ml/minfrom plasma Cystatin C values in mg/l(来自以mg/l的血浆半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的表示为ml/min的肾小球滤过率的计算)”。按照本发明的方法，其与比浊法方法具有更好的相关性，当然比现有技术浊度测定测量方法甚至更好地适用于这一目的。

Claims

1.包含适用于浊度测定法测量的纳米颗粒的纳米颗粒-抗体缀合物用于制备在浊度测定法免疫测定中使用的产品中的应用，所述免疫测定用于评估人体液样品中的人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C，其中：

a)所述纳米颗粒-抗体缀合物用于与所述样品接触而形成测定混合物，其中所述纳米颗粒用包括抗-人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体或所述抗体的抗原结合片段的蛋白质物质的壳包被，以结合所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂C，其中所述包被的纳米颗粒具有在58nm和200nm之间的平均直径，其中，所述人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的含量通过测量所述混合物的浊度的变化而评估，其中所述抗体的重量比例是基于所述纳米颗粒-抗体缀合物重量的5％-35％。

2.权利要求1的应用，其中所述抗体是针对人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的多克隆非人、非啮齿动物抗体。

3.权利要求2的应用，其中所述多克隆抗体是针对人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的禽类抗体。

4.权利要求2和3中任一项的应用，其中以重量计至少25％的所述多克隆抗体或片段通过使用人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C亲和纯化而获得。

5.权利要求1的应用，其中所述抗体包括(a)结合人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的单一表位的单克隆抗体，或(b)一组两种或多种种类的单克隆抗体，其中每种种类的单克隆抗体结合人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的不同的表位，或者两种或多种种类的单克隆抗体以不同的结合强度而结合相同的表位。

6.权利要求5的应用，其中所述单克隆抗体是非人来源的。

7.权利要求1的应用，其中所述包被的纳米颗粒具有80-105nm范围内的平均直径。

8.权利要求1-3中任一项的应用，其中所述包被的纳米颗粒用抗-人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体和至少一种惰性蛋白质的混合物包被。

9.权利要求8的应用，其中所述惰性蛋白质是亲水性的。

10.权利要求9的应用，其中所述亲水性蛋白质选自

血蓝蛋白、触珠蛋白、白蛋白和运铁蛋白。

11.权利要求1-3中任一项的应用，所述纳米颗粒由聚苯乙烯、聚氯乙烯、环氧树脂、聚偏1，1-二氯乙烯、聚-α-萘基甲基丙烯酸酯、聚乙烯萘或它们相对应的共聚物制成。

12.权利要求1-3中任一项的应用，其中所述浊度变化通过在所述测定混合物在500-600nm范围的波长，以及在32-37℃范围内的温度的光吸收的变化而测量。

13.权利要求1-3中任一项的应用，其中在形成所述混合物后，将所述混合物在37℃保持260秒时，关于波长546nm的光的所述浊度的变化，表示为mAbs单位/cm，是

14.按照权利要求1-3中任一项的应用，其中在形成所述混合物后，将所述混合物在37℃保持260秒时，关于波长505nm的光的所述浊度的变化，表示为mAbs单位/cm，是

15.按照权利要求1-3中任一项的应用，其中在形成所述混合物后，将所述混合物在37℃保持260秒时，关于波长570nm的光的所述浊度的变化，表示为mAbs单位/cm，是

16.按照权利要求1-3中任一项的应用，其中在形成所述混合物后，将所述混合物在32℃保持600秒时，关于波长546nm的光的所述浊度的变化，表示为mAbs单位/cm，是

17.按照权利要求1-3中任一项的应用，其中在形成所述混合物后，将所述混合物在37℃保持120秒时，关于波长546nm的光的所述浊度的变化，表示为mAbs单位/cm，是

18.按照权利要求1-3中任一项的应用，其中在形成所述混合物后，将所述混合物在37℃保持260秒时，关于波长546nm的光的所述浊度的变化，表示为mAbs单位/cm，是

19.按照权利要求1-3中任一项的应用，其中在形成所述混合物后，将所述混合物在37℃保持40秒时，关于波长546nm的光的所述浊度的变化，表示为mAbs单位/cm，是

20.按照权利要求1-3中任一项的应用，其特征在于，当构建针对比浊法的相关性曲线时，关于用比浊法获得的0mg/l半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的相对应值，用浊度测定方法获得的是小于0.15mg/l半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的截取值。

21.按照权利要求1-3中任一项的应用，其特征在于，当构建针对非均相免疫测定方法的相关性曲线时，对于0mg/l半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的相对应值获得小于0.25mg/l半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的截取值。

22.按照权利要求1-3中任一项的应用，其特征在于，在所述检测的样品中，对于在1.2mg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l水平的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的测量值，具有来自15mmol/l三酰甘油的小于6％的干扰。

23.按照权利要求1-3中任一项的应用，其特征在于，在1.32-7.5mg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的测量范围内，具有低于5％的线性偏差，并且在0.75-1.32mg半胱氨酸蛋白酶抑制剂C/l的测量范围的测量区域内，具有低于15％的线性偏差。

24.按照权利要求1-3中任一项的应用，其特征在于，通过测量吸收增加的初始速率而确定样品的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C浓度，(a)通过在混合时直接记录，或者(b)通过在混合后立即记录，与吸收的初始增加的后推组合，或者(c)通过在样品和试剂混合后测量在两个或多个小于1分钟的时间点之间的吸收差异而确定。

25.包含适用于浊度测定法测量的纳米颗粒的纳米颗粒-抗体缀合物在制备用于评估哺乳动物的肾小球滤过率的方法中使用的产品中的应用，所述肾小球滤过率的评估通过按照权利要求1-24中任一项所定义的浊度评估人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C而进行。

26.用于实施权利要求1-25中任一项的应用的试剂盒或试剂组，其包括(a)颗粒，其包括以干燥或混悬形式存在的在前述权利要求1-12任一项中定义的抗-半胱氨酸蛋白酶抑制剂C免疫颗粒，(b)以干燥或溶解形式存在的测定缓冲液。

27.权利要求26的试剂盒，其中所述试剂盒还包括(c)分别以干燥或溶解形式存在的校正剂混合物和对照混合物。

28.权利要求26或27的试剂盒，其中所述颗粒和测定缓冲液以干燥或混悬的形式组合提供。

29.按照权利要求1-11中任一项的定义的纳米颗粒-抗体缀合物。

30.权利要求29的纳米颗粒-抗体缀合物在制备用于评估人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的免疫测定中使用的产品或在用于评估哺乳动物的肾小球滤过率的诊断方法中使用的产品中的应用。

31.权利要求29的纳米颗粒-抗体缀合物在制备用于评估人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的免疫测定中使用的产品或在用于评估肾功能障碍的诊断方法中的产品中的应用。