JP4488460B2

JP4488460B2 - 免疫分析方法および試薬

Info

Publication number: JP4488460B2
Application number: JP2000257198A
Authority: JP
Inventors: 聡江口; 泰史白波瀬
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 2000-08-28
Filing date: 2000-08-28
Publication date: 2010-06-23
Anticipated expiration: 2020-08-28
Also published as: JP2002071691A

Description

【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、臨床検査診断薬の分野でとりわけ免疫測定方法および測定試薬に利用される。
【０００２】
【従来の技術】
臨床検査等の分野では、試料中の被検物質を、免疫比濁法または比ろう法等の免疫測定方法により測定することは日常的に行なわれている。該免疫比濁法および免疫比ろう法では、通常被検物質に対する抗血清または抗体を適当な濃度に希釈したものを該被検物と反応させることにより、生じる濁りを光学的に測定している（「臨床検査法提要」、金原出版株式会社）。
【０００３】
免疫測定法、とりわけ免疫比濁法または比ろう法で被検物質を測定する場合には、用いる抗体の力価や親和性が測定感度、測定範囲に影響することは知られており、被検物質に対する抗体力価が低い抗体では測定範囲が狭くかつ感度の低い試薬となり、親和性の低い抗体では感度が低くなる（石川栄治、河合忠、宮井潔「酵素免疫測定法」：医学書院、Ｐ．６２（１９７８））。
【０００４】
しかしながら、抗血清または抗体の力価を同一に調整しても、被検物質の量に対する検量線の形状がシグモイド状となり、直線性の良い検量線が得られないか、或いは全体的に傾きの小さい検量線となる等により感度不足になり、該免疫測定に用いる試薬のロットの違いにより測定値がばらつく等の問題がしばしば起こっていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、免疫測定法において、上記のような感度不足を解消する方法および測定試薬を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、免疫測定方法において、測定に用いる抗体に多量体を構成する免疫グロブリンを含むことにより、本発明の課題を解決できることを見出し、本発明を完成させた。
【０００７】
免疫学的測定方法においてシグモイド状の検量線を形成するのは、この検量線の形状から被検物質の低値領域での試薬の感度不足が原因であることが考えられた。そこで、本発明者らはその原因を追求したところ、試薬の抗体中に含まれるＩｇＭ画分の差によって、検量線の形状に違いが生じることを見出した。すなわち測定に使用する抗体にＩｇＭ型抗体のような多量体を構成する免疫グロブリンを含むことにより、被検物質の量による測定範囲に影響することなく、シグモイド状の検量線は取らず、原点を通過し、直線性が良く、更に傾きも大きい検量線を描き、感度の良い測定方法を提供できることを見出し、本発明を完成させた。
更に、本発明は上記の免疫測定方法に用いる測定用試薬にも及ぶ。
【０００８】
すなわち本発明は、以下の通りである。
１．Ｃ反応性蛋白質（以下「ＣＲＰ」という。）に対する抗体を用いて、試料に含まれるＣＲＰの分析を行う免疫測定方法であって、ＣＲＰに対する抗体が、ＩｇＧ型抗体と、多量体を構成する免疫グロブリンとしてのＩｇＭ型抗体を含むことを特徴とするＣＲＰの免疫測定方法。
２．多量体を構成する免疫グロブリンとしてのＩｇＭ型抗体を、検量線が原点を通る直線を描くのに十分量に、含むことを特徴とする請求項１に記載のＣＲＰの免疫測定方法。
３．多量体を構成する免疫グロブリンとしてのＩｇＭ型抗体の抗体力価が、ＣＲＰに対する抗体の全抗体力価の少なくとも２％であることを特徴とする請求項１又は２に記載のＣＲＰの免疫測定方法。
４．免疫測定方法が免疫比濁法または免疫比ろう法である請求項１〜３のいずれか１に記載のＣＲＰの免疫測定方法。
５．試料に含まれるＣＲＰを分析するための免疫測定試薬であって、ＣＲＰに対する抗体が、ＩｇＧ型抗体と、多量体を構成する免疫グロブリンとしてのＩｇＭ型抗体とを含むことを特徴とするＣＲＰの免疫測定試薬。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を実施するための条件について詳細に説明するが、本発明は以下の記載により何ら制限されるものではない。
【００１０】
本発明において、免疫測定方法とは、試料中の被検物質に対する抗体を被検物質反応させることによって、その結果生じた反応生成物について光学的、またはその他の方法により測定する測定方法をいい、具体的には例えば免疫比濁法、免疫比ろう法、免疫拡散法（ＳＲＩＤ法）等が挙げられる。
【００１１】
被検物質は、特に限定されないが、例えばＣＲＰ、免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ等）、トランスフェリン、セルロプラスミン、ヘモペキシン、α１−酸性糖蛋白質、α２−マクログロブリン、β２−ミクログロブリン、アポＡＩ、アポＡＩＩ、アポＢ、アポＣＩＩ、アポＣＩＩＩ、アポＥ、Ｃ_３、Ｃ_４、アルブミン、Ｌｐ（ａ）、シスタチンＣ等が例示される。
【００１２】
多量体を構成する免疫グロブリンは特に限定されないが、例えばＩｇＭ型抗体あるいはＩｇＡ型抗体が使用される。より好適にはＩｇＭ型抗体が使用される。
【００１３】
本発明の測定に用いられる抗体の由来は特に限定されないが、一般的にウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、モルモット、マウス、ウマ、ロバ等に抗原を免疫して得られた抗血清または抗体が用いられる。また、一般的な方法によって調製されたモノクローナル抗体であっても良い。抗体のクラスはＩｇＭの他にＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ等が知られている。
【００１４】
上記抗体は、市販の抗血清または抗体、さらには自家調製した抗血清または抗体を使用することができる。
抗体の組み合わせは、特に限定されないが、例えば以下のような組み合わせが例示される。
ＩｇＭ型モノクローナル抗体とＩｇＧ型ポリクローナル抗体、
ＩｇＭ型モノクローナル抗体とＩｇＧ型モノクローナル抗体、
ＩｇＭ型ポリクローナル抗体とＩｇＧ型ポリクローナル抗体、
ＩｇＭ型ポリクローナル抗体とＩｇＧ型モノクローナル抗体。
また、上記の組み合わせのうち、ＩｇＭ型抗体の替わりにＩｇＡ型抗体を組み合わせても良い。さらに、クラスの異なる抗体の組み合わせに、ＩｇＭ型抗体および／またはＩｇＡ型抗体を含有しても良い。
【００１５】
多量体を構成する免疫グロブリンの量は、測定に用いる抗体の全抗体力価の少なくとも２％以上であればよく、好適には２％〜５０％、より好適には５〜２０％であれば良い。
【００１６】
上記の抗体力価を求める方法は特に限定されないが、酵素免疫測定法、ＳＲＩＤ法等の測定方法、またはＨＰＬＣによって得られた分布の面積比等によって求められる。
【００１７】
このような分析によって得た総抗体力価の少なくとも２％、好適には２％〜５０％、より好適には５〜２０％のＩｇＭ型抗体を含む画分を選択して用いることができる。さらにポリクローナル抗体で調製する場合には、免疫スケジュールを調整してＩｇＭ型抗体の力価が高い抗血清を得、ＩｇＧ型抗体の力価の高い抗血清と混合して用いることにより調製することができる。他の方法として、通常のＩｇＧ型抗体にＩｇＭ型のモノクローナル抗体を加えて調製することも可能である。この例は、モノクローナル抗体を組み合わせても同様に調製できる。
【００１８】
免疫測定法のうち、特に免疫比濁法、または免疫比ろう法について、自動分析機を用いて測定する場合は、試薬としてリン酸緩衝液またはトリス緩衝液等の適当な緩衝液に凝集促進剤、例えばポリエチレングリコール類等を加えたものを調製する。さらに必要に応じて他の化合物等を加えて第一試薬を調製する。
【００１９】
被検物質に対する抗体、例えば抗ＣＲＰ抗体（ヤギ由来）を適当な力価となるようにリン酸緩衝液またはトリス緩衝液等の適当な緩衝液で希釈し、第二試薬を調製する。ここで用いる抗体は、抗血清をそのまま用いてもよいし、また塩析等の操作を加えて免疫グロブリン画分を分画して用いてもよい。さらにクロマトグラフィ操作によって精製した画分を用いることも可能である。第二試薬の全抗体力価は、通常０．１〜３．０ｍｇ／ｍＬ、好適には０．５〜２．５ｍｇ／ｍＬ、さらに好適には１．０〜２．０ｍｇ／ｍＬとなるように調整される。
【００２０】
測定条件としては、反応温度は特に限定されないが、好ましくは約２５℃〜４０℃であり、反応時間は目的により自由に定められる。第二試薬分注後の吸光度変化を測定することにより、検量線より算出して被検物質の濃度を求める。
【００２１】
【実施例】
以下に実施例をあげて本発明を更に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００２２】
【実施例１】
ヒトＣＲＰ測定用試薬を次のように調製した。
第一試薬として、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．２）に０．１５Ｍの塩化ナトリウムと３％（Ｗ／Ｖ）のポリエチレングリコール６０００を加えて調製した。
【００２３】
第二試薬として、抗ヒトＣＲＰヤギ抗体を総力価１．５ｍｇ／ｍＬとなるように０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．２）に添加して調製した。第二試薬について、抗ヒトＣＲＰヤギ抗体の総力価の中でＩｇＭ型抗体の占める力価を０、０．５、１、２、５、１０、１５％と変化させた。
【００２４】
試料液は、被検物質であるＣＲＰの濃度が、０、０．４５、２．３５、４．７、９．２、１９．３ｍｇ／ｄＬとなるよう調製した。
【００２５】
測定は日立７１７０型自動分析装置を用いて行った。具体的には、各試料液１５μＬを測定用チューブにとり、そのうえに第一試薬２５０μＬを加えた。３７℃で５分間インキュベートした後、第二試薬５０μＬを加えて３７℃で５分間反応させた。反応液について、波長３４０ｎｍで５分間の吸光度変化量を求めた。その結果を表１及び図１に示した。
【００２６】
第一試薬組成
５０ｍＭＨＥＰＥＳ
０．１５Ｍ塩化ナトリウム
１ｍＭＥＤＴＡ
０．１％アジ化ナトリウム
３％ＰＥＧ６０００
【００２７】
第二試薬試薬組成
５０ｍＭＨＥＰＥＳ
０．１５Ｍ塩化ナトリウム
１ｍＭＥＤＴＡ
０．１％アジ化ナトリウム
１．５ｍｇ／ｍＬ抗ヒトＣＲＰ抗体ヤギ血清
【００２８】
【表１】

【００２９】
以上の結果よりＩｇＭ型体の力価が総力価の２％以上の場合にはＣＲＰ濃度２．３５ｍｇ／ｍＬ以下でも感度が上昇し、検量線が直線的に改善されることがわかった。
【発明の効果】
本発明によれば、測定に使用する抗体にＩｇＭ型抗体のような多量体を構成する免疫グロブリンを含むことにより、被検物質の量による測定範囲に影響することなく、シグモイド状の検量線は取らず、直線性が良く、更に傾きも大きい感度の良い測定方法を提供できることを見出し、本発明を完成させた。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１におけるＣＲＰ濃度と吸光度の関係を示す図である。図中、〇−〇はＩｇＭ型抗体の含量が０％、□−□は同０．５％、△−△は同１％、●−●は同２％、■−■は同５％、▲−▲は同１０％、◆−◆は同１５％をそれぞれ示す。

Claims

Ｃ反応性蛋白質に対する抗体を用いて、試料に含まれるＣ反応性蛋白質の分析を行う免疫測定方法であって、Ｃ反応性蛋白質に対する抗体が、ＩｇＧ型抗体と、多量体を構成する免疫グロブリンとしてのＩｇＭ型抗体を含むことを特徴とするＣ反応性蛋白質の免疫測定方法。
多量体を構成する免疫グロブリンとしてのＩｇＭ型抗体を、検量線が原点を通る直線を描くのに十分量に、含むことを特徴とする請求項１に記載のＣ反応性蛋白質の免疫測定方法。
多量体を構成する免疫グロブリンとしてのＩｇＭ型抗体の抗体力価が、Ｃ反応性蛋白質に対する抗体の全抗体力価の少なくとも２％であることを特徴とする請求項１又は２に記載のＣ反応性蛋白質の免疫測定方法。
免疫測定方法が免疫比濁法または免疫比ろう法である請求項１〜３のいずれか１に記載のＣ反応性蛋白質の免疫測定方法。
試料に含まれるＣ反応性蛋白質を分析するための免疫測定試薬であって、Ｃ反応性蛋白質に対する抗体が、ＩｇＧ型抗体と、多量体を構成する免疫グロブリンとしてのＩｇＭ型抗体とを含むことを特徴とするＣ反応性蛋白質の免疫測定試薬。