CN103175964B - 神经元特异性烯醇化酶含量检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种神经元特异性烯醇化酶含量检测试剂盒及其制备方法，属于人体神经元特异性烯醇化酶含量检测领域。所述检测试剂盒由彼此独立的试剂Ⅰ和试剂Ⅱ组成，其中，试剂Ⅰ的组分包括：生物缓冲剂、防腐剂、促凝剂、无机盐和水；试剂Ⅱ的组分包括：包被神经元特异性烯醇化酶抗体的胶乳颗粒、生物缓冲剂、防腐剂、助悬剂和水。本发明用神经元特异性烯醇化酶单克隆体和多克隆抗体复合包被粒径为80-240nm的胶乳颗粒，保证检测试剂盒具有高灵敏度及较宽的检测线性范围，具有操作简便、快速、特异性强、稳定性好，灵敏度高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种人体内酶含量的检测试剂盒,尤其涉及人体内神经元特异性烯醇化酶含量的检测试剂盒及其制备方法，属于人体神经元特异性烯醇化酶含量的检测领域。
背景技术
小细胞肺癌（Small Cell Lung Cancer，SCLC）约占肺癌的20%，恶性程度高，倍增时间短，转移早而广泛，对化疗、放疗敏感，初治缓解率高，但极易发生继发性耐药，容易复发，治疗以全身化疗为主。如果能在发病后早辨别高危患者并及时进行治疗，则小细胞肺癌的病死率及预后将会有明显改善。因此，在SCLC的诊断及预后过程中，肿瘤标志物具有重要的作用。
近年来，神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)作为SCLC的肿瘤标志物，被广泛的应用于医疗诊断。神经元特异性烯醇化酶(NSE)是参与糖酵解途径的烯醇化酶中的一种，存在于神经组织和神经内分泌组织中。NSE在脑组织细胞的活性最高，外周神经和神经分泌组织的活性水平居中，最低值见于非神经组织、血清和脊髓液。NSE存在4种二聚体同功酶(αα，αβ，αγ，ββ和γγ)形式，它们由三种不同的亚单位α，β，γ组成。小细胞肺癌患者的NSE水平明显高于肺腺癌、肺鳞癌、大细胞肺癌等非小细胞肺癌（NSCLC），可用于鉴别诊断。并且小细胞肺癌治疗有效时NSE浓度逐渐降低至正常水平，复发时血清NSE升高，神经元特异性烯醇化酶监测小细胞肺癌的复发，比临床确定复发要早4～12周。神经元特异性烯醇化酶还可用于神经母细胞瘤和肾母细胞瘤的鉴别诊断，前者神经元特异性烯醇化酶异常增高而后者增高不明显，对神经母细胞瘤的早期诊断亦有较高的临床应用价值，也可用来监测神经母细胞瘤的病情变化，评价疗效和预报复发。还有神经内分泌细胞肿瘤，如嗜铬细胞瘤，胰岛细胞瘤，甲状腺髓样癌，黑色素瘤，视网膜母细胞瘤等患者的血清NSE含量也会增高。研究还发现肿瘤患者血清中NSE含量的动态变化可以作为预测癌细胞是否有脑转移趋势的一个重要指标。
目前临床上神经元特异性烯醇化酶的测定方法主要有放免法、ELLSA法、化学发光法，其中酶联免疫法自动化程度不高，且受人为操作因素影响很大；放射免疫法存在着放射物质的污染问题；而化学发光法灵敏度虽高，但测定线性范围较小且检测成本较高，需要配套的化学发光检测仪，这些原因导致其应用范围较小。迄今为止,临床上缺乏一种操作简单、灵敏度高、线性范围宽的检测神经元特异性烯醇化酶（NSE）含量的试剂盒。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种操作简单、灵敏度高、线性范围宽的神经元特异性烯醇化酶（NSE）含量检测试剂盒。
本发明的目的之二是提供一种所述神经元特异性烯醇化酶（NSE）含量检测试剂盒的制备方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
一种神经元特异性烯醇化酶（NSE）含量检测试剂盒，由彼此独立的试剂Ⅰ和试剂Ⅱ组成，所述试剂Ⅰ的组分包括：生物缓冲剂、防腐剂、无机盐、促凝剂和水；所述试剂Ⅱ的组分包括：包被神经元特异性烯醇化酶抗体的胶乳颗粒、生物缓冲剂、助悬剂、防腐剂和水。
本发明通过大量的试验发现，包被神经元特异性烯醇化酶抗体的胶乳颗粒的粒径的大小对于检测的灵敏性、准确性及线性范围等有着非常显著的影响，本发明通过大量的试验最终确定，当包被神经元特异性烯醇化酶抗体的胶乳颗粒的粒径为80-240nm时，相比于其它的粒径的胶乳颗粒，其检测的灵敏度及线性范围等特性有非常显著的改善。由此，本发明试剂盒中的包被神经元特异性烯醇化酶抗体的胶乳颗粒的粒径优选为80-240nm，采用此粒径的胶乳颗粒制备的检测试剂盒其灵敏度及线性范围广等特性明显优于其它粒径的包被神经元特异性烯醇化酶抗体的胶乳颗粒。其中，当包被神经元特异性烯醇化酶抗体的胶乳颗粒的粒径为150nm时，检测的灵敏度及线性范围能达到最好的效果。
制备包被神经元特异性烯醇化酶抗体的胶乳颗粒可以有多种制备方法，诸如化学交联法、物理吸附法等；本发明通过实验发现，采用化学交联法制备的致敏胶乳颗，神经元特异性烯醇化酶抗体与胶乳颗粒结合紧密，不容易从胶乳颗粒上脱落，提高了抗体结合的稳定性，可显著提高检测试剂盒的稳定性。
作为一种优选的方案，本发明所述的包被神经元特异性烯醇化酶抗体的胶乳颗粒采用下述步骤进行制备：
（1）洗涤胶乳;（2）活化胶乳;（3）致敏胶乳;（4）封闭胶乳;（5）洗涤。
其中，优选的，所述的洗涤胶乳包括：将PBS缓冲液和表面活性剂依次加入到粒径为80-240nm的胶乳溶液中混合均匀，离心弃上清，沉淀用PBS缓冲液复溶，超声震荡，使胶乳颗粒均匀分散;
优选的，所述的活化胶乳包括：将1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺（EDC）和N-羟基硫代琥珀酰亚胺（NHS）用磷酸盐缓冲溶液溶解后加入步骤（1）的胶乳溶液中，震荡混合均匀，置于25℃恒温摇床反应；
优选的，所述的致敏胶乳包括：向步骤（2）的反应溶液中加入神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体和多克隆抗体，震荡混合均匀，置于水平摇床上在室温下进行反应；
优选的，所述封闭胶乳包括：向步骤（3）的反应产物中加入甘氨酸溶液混合均匀，室温下反应后，再向反应产物中加入BSA溶液，混合均匀，于室温下反应；
优选的，步骤（5）中所述的洗涤包括：将步骤（4）的反应产物离心弃上清，用超纯水洗涤沉淀两次，再用PBS缓冲液复溶，即得。
本发明采用神经元特异性烯醇化酶（NSE）的单克隆抗体和神经元特异性烯醇化酶多克隆抗体采用化学交联法复合包被胶乳颗粒，能够有效提高测定结果的准确性。
试剂Ⅰ的pH值的范围优选为7.0-8.0，试剂Ⅱ的pH值的范围优选为6.5-7.5。
为了达到更好的检测效果，本发明每1升试剂Ⅰ中各组分的用量为：生物缓冲剂1-100g，促凝剂1-60g，防腐剂0.02-10g，无机盐1-80g，余量为水；
本发明的试剂Ⅱ中包被神经元特异性烯醇化酶（NSE）单克隆抗体或多克隆抗体的胶乳颗粒，可特异性识别并结合血清或尿液中的NSE抗原，每1升试剂Ⅱ中各组分的含量为：包被神经元特异性烯醇化酶抗体的胶乳颗粒0.05-10g，生物缓冲剂1-80g，助悬剂1-80mL，防腐剂0.02-10g，余量为水。
进一步优选的，每1升试剂Ⅰ中各组分的用量为：生物缓冲剂7-20g，促凝剂3-20g，防腐剂0.1-5g，无机盐2-15g，余量为水；
每1升试剂Ⅱ中各组分的用量为：包被神经元特异性烯醇化酶抗体的胶乳颗粒0.5-5g，生物缓冲剂5-30g，助悬剂5-50mL，防腐剂0.1-6g，余量为水。
最优选为：每1升试剂Ⅰ中各组分的用量为：生物缓冲剂12.1g，促凝剂8g，防腐剂1g，无机盐10g，余量为水；
每1升试剂Ⅱ中各组分的用量为：包被神经元特异性烯醇化酶抗体的胶乳颗粒1.5g，生物缓冲剂10.5g，助悬剂20mL，防腐剂1g，余量为水。
本发明所述的生物缓冲剂是能够用于维持一定PH值的各种生物缓冲剂，例如三羟甲基氨基甲烷（Tris）、三羟甲基甲胺基乙磺酸（TES）、2-(N-吗啡啉）乙磺酸（MES）、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸（HEPES）、三羟甲基甲胺基丙磺酸（TAPS）、哌嗪-1,4-二羟基丙磺酸（POPSO）、3-（N-吗啉）丙磺酸(MOPS)中的一种或是几种；为了达到更好的检测效果，本发明试剂Ⅰ所述的生物缓冲剂优选为三羟甲基氨基甲烷，本发明试剂Ⅱ所述的生物缓冲剂优选为3-（N-吗啉）丙磺酸。
本发明试剂Ⅰ所述的促凝剂可以促进抗原抗体反应，有利于胶乳颗粒交联物的形成和增大，提高检测灵敏度和线性范围，诸如PEG-4000、PEG-6000、PEG-8000、PEG-10000、PEG-20000中的一种或几种复配均可作为本发明试剂盒中的促凝剂，优选为PEG-6000。
本发明所述试剂Ⅰ和试剂Ⅱ中的防腐剂主要是为了防止细菌滋生导致的产品变质，所以任何一种能起到防止细菌滋生作用的防腐剂均能适用于本发明，如：苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸、山梨酸钾、叠氮钠及其盐等中的一种或几种等；本发明优选叠氮钠作为试剂Ⅰ或试剂Ⅱ中的防腐剂。
本发明试剂Ⅰ所述无机盐是为了维持反应体系的稳定性并能控制胶乳颗粒的反应度，如：氯化钠、氯化钾或氯化镁等中的一种或几种复配，优选为氯化钠。
本发明所述试剂Ⅱ中的助悬剂可以帮助胶乳颗粒维持一个很好的分散状态，防止胶乳颗粒下沉影响检测试剂盒的品质及开瓶稳定性，常用的助悬剂为乙二醇、丙三醇、乳糖和麦芽糖等一种或几种复配，本发明优选乙二醇作为助悬剂。
本发明的目的之二是提供一种制备所述检测神经元特异性烯醇化酶（NSE）试剂盒的方法，包括：
（1）制备试剂Ⅰ：将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，定容，得到试剂Ⅰ；（2）制备试剂Ⅱ：制备神经元特异性烯醇化酶抗体包被的胶乳颗粒溶液；将其余各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中得到混合溶液；将胶乳颗粒溶液与混合溶液混合均匀，定容，得到试剂Ⅱ；（3）将试剂Ⅰ和试剂Ⅱ单独分装，密封，即得。
本发明的目的之三是提供所述神经元特异性烯醇化酶（NSE）检测试剂盒检测样品中NSE含量的检测方法（该方法为两点终点法），包括以下步骤：
向2.5μL待检测样本（校准管以校准品做样品，空白以蒸馏水为样品，购自英国Randox公司）中加入120μL的试剂Ⅰ充分混匀，于37℃恒温5分钟，再向混合体系中加入30μL试剂Ⅱ，混匀，37℃恒温5分钟后，空白管调零，波长570nm，测定各管吸光度A1，4分钟后测定各管吸光度A2，计算ΔA＝A2-A1。根据多点校准品浓度和对应吸光度变化值ΔA，采用多点非线性校准模式确定工作曲线，样本吸光度变化在工作曲线上相对应的浓度值即为测定浓度。
本发明检测试剂盒采用粒径为80-240nm的胶乳颗粒制备包被神经元特异性烯醇化酶（NSE）抗体的胶乳颗粒，能有效保证试剂盒的高灵敏度及较宽的检测线性范围，同时本发明检测试剂盒抗体包被胶乳颗粒的工艺采用化学法保证了检测试剂盒具有良好的开瓶稳定性好，包被胶乳颗粒的NSE抗体能特异性的识别样本中的抗原，保证试剂盒具有良好的特异性。
附图说明
图1本发明检测试剂盒的标准工作曲线。
图2本发明检测试剂盒以及对照检测试剂盒的标准工作曲线。
图3本发明检测试剂盒37℃热稳定性试验结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更加清楚。但这些实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均在本发明的保护范围内。
预备实施例1
（1）洗涤胶乳：取1mL浓度为10%粒径为80nm的胶乳溶液（购自PolyMicrospheres公司）于50mL离心管中，再向离心管中加入9mL pH7.0的PBS缓冲液，震荡混合均匀，后再向离心管中加入4μL吐温-20，震荡混合均匀，将离心管置于离心机中于25000转/min，离心30min，弃上清，并用9mL pH7.0的PBS缓冲液复溶，超声震荡60秒，使胶乳颗粒均匀分散。
（2）活化胶乳：准确称取50mg1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺（EDC）和50mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺（NHS）并用1mL0.12M磷酸盐缓冲溶液溶解，并将此溶液加入（1）步胶乳溶液中，震荡混合均匀，并置于25℃恒温摇床上，200转/min，反应1h；
（3）致敏胶乳：向（2）步反应完成的溶液中加入1mL1mg/mL神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体和1mL1mg/mL神经元特异性烯醇化酶多克隆抗体（武汉华美生物工程有限公司有售），震荡混合均匀，置于水平摇床上，室温，200转/min，反应10h；
（4）封闭胶乳：步骤（3）反应完成后，向反应体系中加入200μL5%浓度的甘氨酸溶液，混合均匀，并于室温下静置反应45min，再向反应体系中加入100μL5%浓度的BSA溶液，混合均匀，并于室温下静置反应20min；
（5）洗涤：将（4）步反应完成的体系于15000转/min，离心30min，弃上清，并用超纯水洗涤沉淀两次，即得包被神经元特异性烯醇化酶白抗体的胶乳颗粒，用10mL pH7.0的PBS缓冲液复溶，得包被抗体的胶乳颗粒溶液。
预备实施例2
（1）洗涤胶乳：取1mL浓度为10%粒径为240nm的胶乳溶液（购自PolyMicrospheres公司）于50mL离心管中，再向离心管中加入9mL pH7.0的PBS缓冲液，震荡混合均匀，后再向离心管中加入4μL吐温-20，震荡混合均匀，将离心管置于离心机中于25000转/min，离心30min，弃上清，并用9mL pH7.0的PBS缓冲液复溶，超声震荡60秒，使胶乳颗粒均匀分散。
（2）活化胶乳：准确称取50mg1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺（EDC）和50mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺（NHS）并用1mL0.12M磷酸盐缓冲溶液溶解，并将此溶液加入（1）步胶乳溶液中，震荡混合均匀，并置于25℃恒温摇床上，200转/min，反应1h；
（3）致敏胶乳：向（2）步反应完成的溶液中加入1mL1mg/mL神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体和1mL1mg/mL多克隆抗体（武汉华美生物工程有限公司），震荡混合均匀，置于水平摇床上，室温，200转/mi n，反应10h；
（4）封闭胶乳：步骤（3）反应完成后，向反应体系中加入200μL5%浓度的甘氨酸溶液，混合均匀，并于室温下静置反应45min，再向反应体系中加入100μL5%浓度的BSA溶液，混合均匀，并于室温下静置反应20min；
（5）洗涤：将（4）步反应完成的体系于15000转/min，离心30min，弃上清，并用超纯水洗涤沉淀两次，即得包被神经元特异性烯醇化酶白抗体的胶乳颗粒，用10mL pH7.0的PBS缓冲液复溶，得包被抗体的胶乳颗粒溶液。
预备实施例3
（1）洗涤胶乳：取1mL浓度为10%粒径为150nm的胶乳溶液（购自Poly Microspheres公司）于50mL离心管中，再向离心管中加入9mL pH7.0的PBS缓冲液，震荡混合均匀，后再向离心管中加入4μL吐温-20，震荡混合均匀，将离心管置于离心机中于25000转/min，离心30min，弃上清，并用9mL pH7.0的PBS缓冲液复溶，超声震荡60秒，使胶乳颗粒均匀分散。
（2）活化胶乳：准确称取50mg1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺（EDC）和50mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺（NHS）并用1mL0.12M磷酸盐缓冲溶液溶解，并将此溶液加入（1）步胶乳溶液中，震荡混合均匀，并置于25℃恒温摇床上，200转/min，反应1h；
（3）致敏胶乳：向（2）步反应完成的溶液中加入1mL1mg/mL神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体和1mL1mg/mL多克隆抗体（武汉华美生物工程有限公司有售），震荡混合均匀，置于水平摇床上，室温，200转/min，反应10h；
（4）封闭胶乳：步骤（3）反应完成后，向反应体系中加入200μL5%浓度的甘氨酸溶液，混合均匀，并于室温下静置反应45min，再向反应体系中加入100μL5%浓度的BSA溶液，混合均匀，并于室温下静置反应20min；
（5）洗涤：将（4）步反应完成的体系于15000转/min，离心30min，弃上清，并用超纯水洗涤沉淀两次，即得包被神经元特异性烯醇化酶白抗体的胶乳颗粒，用10mL pH7.0的PBS缓冲液复溶，得包被抗体的胶乳颗粒溶液。
预备实施例4
（1）洗涤胶乳：取1mL浓度为10%粒径为200nm的胶乳溶液（购自PolyMicrospheres公司）于50mL离心管中，再向离心管中加入9mL pH7.0的PBS缓冲液，震荡混合均匀，后再向离心管中加入4μL吐温-20，震荡混合均匀，将离心管置于离心机中于25000转/min，离心30min，弃上清，并用9mL pH7.0的PBS缓冲液复溶，超声震荡60秒，使胶乳颗粒均匀分散。
（2）活化胶乳：准确称取50mg1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺（EDC）和50mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺（NHS）并用1mL0.12M磷酸盐缓冲溶液溶解，并将此溶液加入（1）步胶乳溶液中，震荡混合均匀，并置于25℃恒温摇床上，200转/min，反应1h；
（3）致敏胶乳：向（2）步反应完成的溶液中加入1mL1mg/mL神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体和1mL1mg/mL多克隆抗体（武汉华美生物工程有限公司有售），震荡混合均匀，置于水平摇床上，室温，200转/min，反应10h；
（4）封闭胶乳：步骤（3）反应完成后，向反应体系中加入200μL5%浓度的甘氨酸溶液，混合均匀，并于室温下静置反应45min，再向反应体系中加入100μL5%浓度的BSA溶液，混合均匀，并于室温下静置反应20min；
（5）洗涤：将（4）步反应完成的体系于15000转/min，离心30min，弃上清，并用超纯水洗涤沉淀两次，既得包被神经元特异性烯醇化酶白抗体的胶乳颗粒，用10mL pH7.0的PBS缓冲液复溶，得包被抗体的胶乳颗粒溶液。
实施例1检测试剂盒的制备
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于900mL蒸馏水或双蒸水中，用2mol/L盐酸和2mol/L氢氧化钠调节pH至7.5，后用蒸馏水定容至1升，密封4℃保存，备用。
2、试剂Ⅱ的制备：
按所述用量取各组分：
3-(N-吗啉）丙磺酸（MOPS） 10.5g
叠氮钠 10g
乙二醇 20mL
将上述各组分溶解于700mL蒸馏水或双蒸水中，后加入15份预备实施例3制备的包被NSE抗体的胶乳颗粒溶液，用2mol/L盐酸和2mol/L氢氧化钠调节pH至7.0，后用蒸馏水定容至1升，密封4℃保存，备用。
实施例2检测试剂盒的制备
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于900mL蒸馏水或双蒸水中，用2mol/L盐酸和2mol/L氢氧化钠调节pH至7.5，后用蒸馏水定容至1升，密封4℃保存，备用。
2、试剂Ⅱ的制备：
按所述用量取各组分：
3-(N-吗啉）丙磺酸（MOPS） 10.5g
叠氮钠 10g
乙二醇 20mL
将上述各组分溶解于700mL蒸馏水或双蒸水中，后加入15份预备实施例1制备的包被NSE抗体的胶乳颗粒溶液，用2mol/L盐酸和2mol/L氢氧化钠调节pH至7.0，后用蒸馏水定容至1升，密封4℃保存，备用。
实施例3
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于900mL蒸馏水或双蒸水中，用2mol/L盐酸和2mol/L氢氧化钠调节pH至7.3，后用蒸馏水定容至1升，密封4℃保存，备用。
2、试剂Ⅱ的制备：
按所述用量取各组分：
3-(N-吗啉）丙磺酸（MOPS） 20g
防腐剂 0.2mL
乙二醇 25mL
将上述各组分溶解于800mL蒸馏水或双蒸水中，后加入10份预备实施例2制备的包被NSE抗体的胶乳颗粒溶液，用2mol/L盐酸和2mol/L氢氧化钠调节pH至7.2，后用蒸馏水定容至1升，密封4℃保存，备用。
实施例4
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于900mL蒸馏水或双蒸水中，用2mol/L盐酸和2mol/L氢氧化钠调节pH至7.6，后用蒸馏水定容至1升，密封4℃保存，备用。
2、试剂Ⅱ的制备：
按所述用量取各组分：
3-(N-吗啉）丙磺酸（MOPS） 17g
叠氮钠 5g
乙二醇 15mL
将上述各组分溶解于800mL蒸馏水或双蒸水中，后加入20份预备实施例3制备的包被NSE抗体的胶乳颗粒溶液，用2mol/L盐酸和2mol/L氢氧化钠调节pH至7.2，后用蒸馏水定容至1升，密封4℃保存，备用。
实施例5
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于900mL蒸馏水或双蒸水中，用2mol/L盐酸和2mol/L氢氧化钠调节pH至7.6，后用蒸馏水定容至1升，密封4℃保存，备用。
2、试剂Ⅱ的制备：
按所述用量取各组分：
3-(N-吗啉）丙磺酸（MOPS） 22g
叠氮钠 2.7g
乙二醇 35mL
将上述各组分溶解于800mL蒸馏水或双蒸水中，后加入9份预备实施例4制备的包被NSE抗体的胶乳颗粒溶液，用2mol/L盐酸和2mol/L氢氧化钠调节pH至7.2后用蒸馏水定容至1升，密封4℃保存，备用。
对比实施例1脂联素胶乳检测试剂盒的制备
除了胶乳溶液的粒径为70nm外，其余均与实施例2完全相同。
对比实施例2脂联素胶乳检测试剂盒的制备
除了胶乳溶液的粒径为50nm外，其余均与实施例2完全相同。
对比实施例3脂联素胶乳检测试剂盒的制备
除了胶乳溶液的粒径为30nm外，其余均与实施例2完全相同。
对比实施例4脂联素胶乳检测试剂盒的制备
除了胶乳溶液的粒径为250nm外，其余均与对比实施例3完全相同。
对比实施例5脂联素胶乳检测试剂盒的制备
除了胶乳溶液的粒径为280nm外，其余均与对比实施例3完全相同。
对比实施例6脂联素胶乳检测试剂盒的制备
除了胶乳溶液的粒径为300nm外，其余均与对比实施例3完全相同。
试验例1本发明检测试剂盒线性试验
配制浓度为0mg/L，15mg/L，40mg/L，80mg/L，160mg/L的神经元特异性烯醇化酶白标准品溶液，用本发明实施例1-5以及对比实施例1、2、4和5所制备的神经元特异性烯醇化酶含量检测试剂盒对其进行检测，绘制各检测试剂盒标准工作曲线。
测定结果见图1和图2。从图1可以看出本发明实施例1-5所制备的检测试剂盒能保持良好的线性，另本发明采用最优化的条件制备出的试剂盒（实施例1），其标准工作曲线较其余优选条件制备出的试剂盒线性更优良；根据图2可以看出本发明实施例1-5所制备的检测试剂盒的线性范围要明显的优于对比实施例1-6所制备的检测试剂盒。
试验例2本发明检测试剂盒准确度及精确性检测试验
使用靶值分别为6.85ng/ml(5.35-8.15ng/ml)和50.35ng/ml(44.25-56.45ng/ml)的冻干质控品（购自英国Randox公司）进行准确度实验，按照质控品说明书要求分别用去离子水复融后，按照试剂盒各自的检测方法对质控品连续检测50次，将检测结果均值与靶值范围进行测定偏差计算。结果表明本发明试剂盒（实施例1）测低值质控偏差小于5％，测高值质控偏差小于10％，本发明实施例1制备的试剂盒测值准确性好于实施例5制备的试剂盒。准确度实验数据如表1所示：
表1本发明试剂盒的准确度：单位ng/ml
试验例3本发明检测试剂盒稳定性试验
将本发明实施例1所制备的检测试剂盒置于37℃分别热处理0天、3天、5天和7天，在不同的处理时间之后分别测定神经元特异性稀醇化酶（NSE）校准品，记录其ΔA值，并绘制其变化曲线。试验结果见图3。从图2中结果可知本发明检测试剂盒具有良好的热稳定性。
Claims (10)
1.神经元特异性烯醇化酶含量的检测试剂盒，其特征在于：该检测试剂盒由彼此独立的试剂Ⅰ和试剂Ⅱ组成；其中，试剂Ⅰ的组分包括：生物缓冲剂、防腐剂、促凝剂、无机盐和水；试剂Ⅱ的组分包括：包被神经元特异性烯醇化酶抗体的胶乳颗粒、生物缓冲剂、防腐剂、助悬剂和水，其中，所述包被神经元特异性烯醇化酶抗体的胶乳颗粒的粒径是80-240nm，每1升试剂Ⅰ中各组分的用量为：生物缓冲剂1-100g，促凝剂1-60g，防腐剂0.02-10g，无机盐1-80g，余量为水；每1升试剂Ⅱ中各组分的用量为：包被神经元特异性烯醇化酶抗体的胶乳颗粒0.05-10g，生物缓冲剂1-80g，助悬剂1-80mL，防腐剂0.02-10g，余量为水。
2.按照权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：所述包被神经元特异性烯醇化酶抗体的胶乳颗粒的粒径为150nm。
3.按照权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：所述包被神经元特异性烯醇化酶抗体的胶乳颗粒由神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体和神经元特异性烯醇化酶多克隆抗体复合包被粒径是80-240nm的胶乳颗粒制备而成。
4.按照权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的包被神经元特异性烯醇化酶抗体的胶乳颗粒采用下述步骤制备得到：
(1)洗涤胶乳；(2)活化胶乳；(3)致敏胶乳；(4)封闭胶乳；(5)洗涤。
5.按照权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于：所述的洗涤胶乳包括：将磷酸盐缓冲液和表面活性剂依次加入到粒径为80～240nm的胶乳溶液中混合均匀，离心弃上清，沉淀用磷酸盐缓冲液复溶，超声震荡，使胶乳颗粒均匀分散；
所述的活化胶乳包括：将1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺用磷酸盐缓冲溶液溶解后加入步骤(1)的胶乳溶液中，震荡混合均匀，置于恒温摇床进行反应；
所述的致敏胶乳包括：向步骤(2)的反应溶液中加入神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体和神经元特异性烯醇化酶多克隆抗体，震荡混合均匀，置于水平摇床上在室温下进行反应；
所述封闭胶乳包括：向步骤(3)的反应产物中加入甘氨酸溶液混合均匀，室温下反应后，再向反应产物中加入BSA溶液，混合均匀于室温下反应；
步骤(5)中所述的洗涤包括：将步骤(4)的反应产物离心弃上清，用超纯水洗涤沉淀两次，再用磷酸盐缓冲液复溶。
6.按照权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：每1升试剂Ⅰ中各组分的用量为：生物缓冲剂7-20g，促凝剂3-20g，防腐剂0.1-5g，无机盐2-15g；
每1升试剂Ⅱ中各组分的用量为：包被神经元特异性烯醇化酶抗体的胶乳颗粒0.5-5g，生物缓冲剂5-30g，助悬剂5-50mL，防腐剂0.1-6g。
7.按照权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的促凝剂为PEG-6000；所述的助悬剂为乙二醇；所述的无机盐为氯化钠；
试剂Ⅰ中所述的生物缓冲剂为三羟甲基氨基甲烷；试剂Ⅱ中所述生物缓冲剂为3-(N-吗啉)丙磺酸。
8.按照权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：试剂Ⅰ的pH值的范围为7.0-8.0，试剂Ⅱ的pH值的范围为6.5-7.5。
9.一种制备权利要求1所述检测试剂盒的方法，包括：(1)制备试剂Ⅰ：将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，定容得到试剂Ⅰ；(2)制备试剂Ⅱ：首先制备神经元特异性烯醇化酶抗体包被的胶乳颗粒溶液；将其余各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中得到混合溶液；将神经元特异性烯醇化酶抗体包被的胶乳溶液与混合溶液混合均匀，定容，得到试剂Ⅱ；(3)将试剂Ⅰ和试剂Ⅱ单独分装，密封，即得。
10.按照权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：每1升试剂Ⅰ中各组分的用量为：生物缓冲剂12.1g，促凝剂8g，防腐剂1g，无机盐10g；
每1升试剂Ⅱ中各组分的用量为：包被神经元特异性烯醇化酶抗体的胶乳颗粒1.5g，生物缓冲剂10.5g，助悬剂20mL，防腐剂1g。
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