WO2020037384A1

WO2020037384A1 - Composição para controle biológico de fitonematoides

Info

Publication number: WO2020037384A1
Application number: PCT/BR2018/050424
Authority: WO
Inventors: Eduardo Roberto de Almeida BERNARDO; Tiago Domingues ZUCCHI; Thales Facanali MARTINS; Camila GORGULHO
Original assignee: Agrivalle Brasil Industria E Comércio De Produtos Agrícolas Ltda
Priority date: 2018-08-20
Filing date: 2018-11-14
Publication date: 2020-02-27
Also published as: US20210315213A1; BR102018016976A2; EP3841881A4; EP3841881A1

Abstract

Trata-se a presente patente de invenção, de uma composição para controle biológico de fitonematoides, mais particularmente trata-se de uma composição de bactérias com efeitos nematicidas na mitigação dos danos e controle de fitonematoides em plantas cultiváveis. Pertencente ao setor técnico de biotecnologia, essa composição amplia a eficiência específica desses microrganismos por utilizar mecanismos de ação diferentes e complementares. Particularmente, a composição trata de uma formulação com quantidades de Bacillus subtilis ou seus mutantes, Bacillus licheniformis ou seus mutantes, Bacillus amyloliquefaciens ou seus mutantes, concomitantemente com aditivos e excipientes, em composições biológicas com propriedades nematicidas para o controle de fitonematoides em plantas.

Description

"COMPOSIÇÃO PARA CONTROLE BIOLÓGICO DE FITONEMATOIDES".

CAM PO TÉCNICO DA I NVENÇÃO

[1] Trata a presente patente de invenção de uma composição para controle biológico de fitonematoides, mais particularmente trata-se de uma composição de bactérias com efeitos nematicidas na mitigação dos danos e controle de fitonematoides em plantas cultiváveis. Pertencente ao setor técnico de biotecnologia, essa composição amplia a eficiência específica desses microrganismos por utilizar mecanismos de ação diferentes e complementares. Particularmente, a composição trata de uma formulação utilizando 'Bacillus subtilis', 'Bacillus licheniformis' e 'Bacillus amyloliquefaciens'.

H ISTÓRICO DA INVENÇÃO

[2] No atual cenário agrícola mundial, os ganhos de produção têm sido, muitas vezes, vinculados a aumentos gradativos de produtividade sem que ocorra um aumento na área agricultável. Esses aumentos de produtividade vêm sendo obtidos por meio de avanços significativos nas técnicas de cultivo, utilização de variedades mais adaptadas a fatores bióticos e abióticos, adequação do requerimento nutricional da planta e, não obstante, pela mitigação dos danos causados por pragas agrícolas.

[3] Dentre esses avanços, o controle de pragas, ainda, é visto como o maior desafio na manutenção da produtividade das culturas, sendo que diversas técnicas podem ser empregadas, com maior ou menor grau de eficácia, mas, de maneira geral, o uso de defensivos químicos continua sendo o método mais utilizado.

[4] Entretanto, para o controle de fitonematoides, o uso de defensivos químicos tem mostrado, muitas vezes, resultados insatisfatórios, além disso, o uso excessivo de nematicidas químicos tem frequentemente ocasionado problemas de intoxicação humana e/ou animal, concomitantemente a contaminação do meio ambiente. Esses eventos têm levado a um aumento da percepção pública contrário ao uso de nematicidas e consequentemente, a uma busca incessante para técnicas de manejo mais seguras.

[5] Assim, controles alternativos para fitonematoides vêm sendo empregados sempre que possível, mas, adversidades inerentes à biologia desses organismos, costumam inviabilizar o uso de algumas técnicas. Por exemplo, variedades de cultivares resistentes são raramente disponíveis, enquanto que, rotação de cultura costuma ser inviável, devido aos custos económicos ou a grande gama de hospedeiros para algumas espécies (Bird et al., 2003).

[6] Nesse contexto, o controle biológico de fitonematoides utilizando microrganismos vem sendo considerado uma opção viável. Sua principal vantagem, frente as demais tecnologias, recai na possibilidade de explorar modos de ação diferentes dos defensivos químicos (Zucchi et al. 2008). De fato, mecanismo de ação como antagonismo e parasitismo estão sendo largamente empregados em produtos comerciais.

[7] Antagonismo costuma ser o modo de ação predominante de bactérias. Além do efeito direto na mortalidade dos fitonematoides, esses compostos nematicidas podem apresentar ação direta na eclosão de ovos ou mobilidade dos nematoides e, efeitos indiretos, como alteração dos exudatos radiculares ou indução de resistência (Sikora & Hoffmann-Hergarten, 1992; Hosky-Gunther et al. 1998).

[8] O uso de bactérias como agente de controle biológico se mostra mais promissor para fitonematoides endoparasitas (Hallmann et al. 2004), como, por exemplo, o Meloidogyne graminicola. Bacillus megaterium reduziu 40% a penetração e formação de galhas desse fitonematoides nas raízes de arroz, além de diminuir em 60% sua migração para rizosfera e reduzir em 60% a eclosão de ovos (Sikora & Padgham 2007).

Higaki & Araújo (2012), o uso de Bacillus subtilis para o controle de Pratylenchus brachyurus foi tão bom quanto o tratamento químico utilizando Abamectina, apresentando populações extremamente baixas destes fitonematoides no solo, cerca de 1 fitonematoide/cm³ de solo, reduzindo em torno de 90% esta população frente ao tratamento testemunha.

[9] Outros resultados nesta linha de pesquisa, utilizando também Bacillus subtilis para tratamento de sementes é evidenciado por Higaki & Araújo (2012), mostrando que esta alternativa de manejo proporcionou reduções na ordem de 53,87% da população de Pratylenchus spp. 30 dias após a semeadura, agregando 18% em produtividade.

[10] Resultados semelhantes foram encontrados por Higaki (2012) utilizando Bacillus subtilis para controle de Rotylenchulus reniformis e Pratylenchus brachyurus em algodoeiro, o tratamento com o microrganismo apresentou reduções superiores a 50% na população desses fitonematoides nas raízes da cultura.

[11] Outro dado interessante relatado pelo autor, foi que as plantas tratadas com tal microrganismo apresentaram incrementos de massa fresca de raízes e na parte aérea na ordem de 36 e 47%, respectivamente, frente ao tratamento testemunha. De acordo com Araújo et al. (2008), os mecanismos de ação responsáveis pela promoção de crescimento em plantas podem estar ligados inicialmente à inibição direta do patógeno e pela indução de resistência sistémica, dentre outras. Muitas vezes é difícil reconhecer os mecanismos e relacioná-los à promoção direta de crescimento, visto que mais de um mecanismo é produzido pela bactéria.

[12] Apesar dessas vantagens, a maioria dos produtos existentes baseiam-se na premissa de explorar um único microrganismo para controlar fitonematoides. Conforme relatado, alguns agentes de controle biológico possuem mais de um mecanismo de ação os quais podem atuar direta ou indiretamente no fitonematoide alvo. Entretanto, associações entre os diversos agentes de biocontrole, ampliando o espectro de ação desses microrganismos contra fitonematoides, ainda é pouco explorado.

ANÁLISE DO ESTADO DA TÉCNICA

[13] Em pesquisa realizada em bancos de dados especializados foram encontrados documentos referentes à composição para controle biológico de fitonematoides. Um dos documentos, de n^. US 20150050258, trata uma composição compreendendo Bacillus subtilis (DSM 17231) e Bacillus licheniformis (DSM 17236) com efeito nematicida contra fitonematoides em plantas e/ou seu habitat, ao seu uso e processo para sua preparação, uso de Bacillus subtilis (DSM 17231) e Bacillus licheniformis (DSM 17236), processos para controlar, combater e conferir resistência específica a fitonematoides e um kit.

[14] Essa abordagem se mostra mais eficiente, pois, aumenta sinergicamente o efeito individual de cada isolado. A desvantagem é que ela se baseia apenas na antibiose para controle da praga-alvo, o que ocasionalmente, poderá levar a seleção de indivíduos resistentes. Apesar disso, esse exemplo único ilustra uma possível tendência no controle biológico fitonematoides, ou seja, o uso de composições biológicas complexas para mitigar os efeitos deletérios desses organismos.

OBJ ETIVOS DA INVENÇÃO

[15] A presente invenção refere-se ao uso efetivo de quantidades de Bacillus subtilis ou seus mutantes, Bacillus licheniformis ou seus mutantes, Bacillus amyloliquenfacies ou seus mutantes, concomitantemente com aditivos e excipientes, em composições biológicas com propriedades nematicidas para o controle de fitonematoides em plantas.

Assim, o objetivo da presente invenção é desenvolver composições efetivas contra fitonematoides que apresente mais de um mecanismo de ação. Ditas composições envolvem o uso de espécies diferentes de bactérias (antibiose, parasitismo de ovos e redução da capacidade de orientação do fitonematóide).

VANTAGENS OBTIDAS

[16] Com a composição para controle biológico de fitonematoides, assim obtida, a mesma oferece as seguintes vantagens:

- Apresenta ser uma alternativa ao uso de nematicidas químicos, vindo ao encontro do interesse da sociedade para produtos mais ecologicamente seguros;

- Explora uma gama maior de mecanismos de ação contra fitonematoides, garantindo, assim, uma maior eficiência;

- Diminui a seleção de fitonematoides resistentes a produtos químicos; e

- Possui uma versatilidade na aplicação (via sulco de plantio, via barra e/ou tratamento de sementes), facilitando sua utilização em diversos sistemas de plantio.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[17] A presente patente de invenção se refere à "COMPOSIÇÃO PARA CONTROLE BIOLÓGICO DE FITONEMATOIDES", mais precisamente trata-se de uma composição de bactérias com efeitos nematicidas na mitigação dos danos e controle de fitonematoides em plantas cultiváveis. [18] Segundo a presente invenção, a composição para controle biológico de fitonematoides compreende os microrganismos, mas não se limita a, uma concentração final de (em unidades formadoras de colónia, u.f.c.) onde dita composição apresenta os elementos:

- Bocillus subtilis - 1,0 x IO¹⁰ u.f.c./g

- Bacillus licheniformis - 1,0 x 10¹⁰ u.f.c./g

- Bacillus amyloliquenfacies - 1,0 x 10⁶ u.f.c./g

[19] Os isolados foram identificados e classificados pela Coleção Brasileira de Microrganismos de Ambiente e Indústria (CBMAI/UNICAMP), onde encontram-se depositados.

[20] A composição apresenta as seguintes concentrações:

[21] Os aditivos podem ser, mas não se limita a, dispersantes selecionados do grupo consistindo de polímeros iônicos solúveis em água, polímeros aniônicos solúveis em água, surfactantes selecionados do grupo consistindo de surfactantes aniônicos e surfactantes não iônicos e combinações entre eles.

[22] Os excipientes podem ser, não se limitando a, do grupo que consiste em: sílicas, talco, bentonita, carboidratos, carbonatos, caseína, soro de leite e derivados de leite e combinações entre eles.

[23] A composição deve ser empregada como formulação em pó molhável. Entretanto, outras formulações contendo esses microrganismos, tais como, emulsões, suspensões concentradas, grânulos, etc. também podem ser utilizadas.

EXEM PLOS DE OBTENÇÃO

[24] Uma composição contendo 7,0% de Bacillus subtilis, 7,0% de Bacillus licheniformis, 4,5% de Bocillus amyloliquefaciens, 3,0% de polímero de estireno acrílico, 1,0% surfactante aniônico e 67,5% de inerte foi formulada para avaliar sua eficiência no controle de fitonematoides. Os exemplos abaixo ilustram o uso dessa composição:

Exemplo 1: Controle de Meloidoavne incógnita em soja, via sulco de plantio.

Objetivo

[25] Avaliar o efeito, em condições de campo, da formulação biológica contendo os isolados de Bacillus no controle de Meloidogyne incógnita, aplicada no sulco de plantio.

Material e Métodos

[26] O delineamento experimental utilizado: foi o de blocos casualizados, com seis tratamentos e seis repetições (36 parcelas). As parcelas experimentais constituíram de 2,0 m de largura (oito linhas de cultivo) e 4,0 m comprimento, totalizando área de 8,0 m².

[27] Tratamentos e forma de aplicação: Foi realizada uma única aplicação dos tratamentos no sulco do plantio antes da semeadura. Para a aplicação foi utilizado pulverizador costal pressurizado a C0₂, com pressão constante de 30 PSI, acoplado a uma lança comum com ponta de pulverização do tipo leque, e volume de calda equivalente a 100 L.ha-1.

[28] Amostragem e avaliação da eficácia da formulação: Amostras de solo e raízes foram coletadas de forma aleatória, em cinco pontos diferentes da parcela útil que compôs uma amostra composta, com aproximadamente 500 g de solo e lOOg de raízes. As coletas foram realizadas na profundidade de 0 - 20cm. Para a quantificação de ovos e juvenis de M. inconita as amostras de cada parcela experimental foram enviadas ao laboratório de nematologia. A extração do alvo no solo foi realizada pela técnica da flutuação centrífuga em solução de sacarose proposta por Jenkins (1964) em 150 cm³ de solo, sendo as avaliações realizadas previamente, aos 45 e 60 dias após a semeadura. Para a quantificação de nematoides nas raízes foi utilizada a técnica do liquidificador proposta por Coolen & D'herde (1972) em 10 g de raízes, sendo as avaliações realizadas aos 45 e 60 DAS. Foi calculada o fator de reprodução, sendo a relação entre a população final (Pf) e a população inicial (Pi) do fitonematoide, aos 45a 60 DAS, de acordo com a fórmula proposta por OOSTENBRINK (1966), onde FR=Pf/Pi. Na época do florescimento, avaliou-se a altura de 10 plantas no centro de cada parcela experimental, medindo do comprimento da haste rente ao solo até a última folha da planta, com o auxílio de uma trena. Para estimar a produtividade da cultura em quilogramas por hectare, foi realizada a colheita e pesagem dos grãos em 4 m2 e umidade ajustada para 13%, na data 09/03/2017. Os dados brutos das avaliações, quando necessários, foram transformados ou tiveram seus outliers desconsiderados para se obter a normalidade dos dados e então, foram submetidos à análise de variância. As comparações entre as médias foram realizadas pelo teste de Scott-Knott (p<0,05) (1974) e as eficácias dos tratamentos foram calculadas segundo Abbott (1925).

Resultados e Discussão

[29] No monitoramento prévio e ao longo das avaliações não foi detectada a presença de inimigos naturais em quantidade e frequência significativas nas plantas da área experimental, impossibilitando estimar os efeitos dos tratamentos em estudo sobre a dinâmica dessa população. Também foi verificado que não houve qualquer fitotoxicidez provocada pela aplicação dos tratamentos em estudo que comprometesse o crescimento e o desenvolvimento das plantas de soja (Tabela 1).

- Tabela 1. Fitotoxicidade dos tratamentos aplicados à cultura da soja (Glycine max), cultivar NA 5909 RG, ao longo das avaliações. Uberlândia, MG, 2017.

g p.c. ha-1: gramas de produto comercial por hectare; m: notas de fitotoxicidade (média de quatro repetições); DAA: dias após a aplicação.

[30] Na avaliação da altura de plantas (Tabela 2), os tratamentos aplicados não diferiram estatisticamente da testemunha, apresentando altura de plantas que variaram de 38, 35 a 39,97 cm. As rizobactérias podem promover crescimento de plantas (LUZ, 1996), contudo, em áreas com alta infestação de nematoides, o crescimento das plantas pode ser prejudicado e tal efeito pode não ser observado.

- Tabela 2. Altura de plantas de soja (Glycine max), cultivar NA 5909 RG. Uberlândia, MG, 2017.

g p.c. ha-1: gramas de produto comercial por hectare;m: média de 10 plantas por parcela útil (média de seis repetições); fmédias seguidas de mesma letra não diferem entre si nas colunas pelo teste de Scott- Knott (p<0,05); Dados transformados por V(x + 1,0);CV (%): coeficiente de variação.

[31] De acordo com a Tabela 3, no que diz respeito ao efeito dos tratamentos aplicados sobre o número de juvenis e/ou adultos em 150 cm³ de solo, aos 45 DAS foi possível observar diferença significativa entre os tratamentos. As doses de 50, 75, 100, 125 g. p.c. ha-1 da formulação biológica apresentaram controle superior aos demais tratamentos, com eficiência de até 86,30%. Aos 60 DAS, observou-se maior diferenciação entre os tratamentos, sendo as doses de 25 e 50 g. p.c. ha-1 da formulação biológica superiores à testemunha e as doses 75, 100 e 125 g. p.c. ha-1, superiores estatisticamente a todos os demais tratamentos e com eficiência elevada, variando de 68,73% até 75,57%. Esses resultados indicam um efeito prolongado da formulação biológica no solo, possibilitando maior controle da praga e, consequentemente, maior proteção ao longo do ciclo da cultura.

- Tabela 3. Efeito dos tratamentos aplicados para controle do nematoide das galhas (Meloidogyne incógnita) na cultura da soja (Glycine max) sobre o número de juvenis e/ou adultos em 150 cm3 de solo e eficácia dos tratamentos ao longo das avaliações. Uberlândia, MG, 2017.

g p.c. ha ¹: gramas de produto comercial por hectare; DAS: dias após a semeadura;m: número de juvenis e/ou adultos em 150 cm³ de solo(média de quatro repetições); fmédias seguidas de mesma letra não diferem entre si nas colunas pelo teste de Scott-Knott (p<0,05); Dados transformados por l/Vx;E (%): eficácia dos tratamentos segundo Abbott (1925);CV (%): coeficiente de variação.

[32] A Tabela 4 apresenta os efeitos dos tratamentos aplicados sobre número de juvenis e/ou adultos em 10 g raiz. Constatou-se que aos 45 DAS houve uma clara distinção entre os tratamentos, sendo possível separar em dois grupos: a) os tratamentos nas doses 25 e 50 g.p.c.ha-1 que apesar de superiores estatisticamente à testemunha, apresentaram baixa eficiência e b) o grupo com os tratamentos nas doses 75, 100 e 125 g.p.c.ha-1 da formulação biológica que apresentaram eficiência de controle maior, reduzindo a população de nematoides nas raízes em até 66,99%.

[33] Na avaliação realizada aos 60 DAS, o tratamento com dose de 100 g.p.c.ha-1 da formulação biológica apresentou a maior eficiência de controle (73,64%), sendo significativamente superior aos demais tratamentos. Na sequência, as doses de 50 e 75 g.p.c.ha-1 também apresentaram alta eficiência de controle (70,02% e 67,31% respectivamente), e os tratamentos correspondentes às doses de 25 e 125 g.p.c.ha-1 apresentaram as menores eficiências, embora tenham sido estatisticamente superiores à testemunha.

[34] Os resultados de controle de nematoide nas raízes, se assemelham aos resultados obtidos no controle de nematoides no solo (Tabela 5), onde as maiores eficiências de controle foram observadas aos 60 DAS, indicando o efeito contínuo e de longo prazo da formulação biológica.

- Tabela 5. Efeito dos tratamentos aplicados para controle do nematoide das galhas (Meloidogyne incógnita) na cultura da soja (Glycine max) sobre o número de juvenis e/ou adultos em 10 g de raiz e eficácia dos tratamentos ao longo das avaliações. Uberlândia, MG, 2017.

g p.c. ha ¹: gramas de produto comercial por hectare; DAS: dias após a semeadura; m: número de juvenis e/ou adultos em lOg de raiz(média de quatro repetições); fmédias seguidas de mesma letra não diferem entre si nas colunas pelo teste de Scott-Knott (p<0,10); Dados transformados por log x + 1; E (%): eficácia dos tratamentos segundo Abbott (1925);CV (%): coeficiente de variação.

[35] Os reflexos do controle do nematoide das galhas sobre o fator de reprodução, são apresentados na Tabela 6, onde se observa que aos 45 DAS, os tratamentos testemunha e formulação biológica na dose de 25 g.p.c.ha-1 não diferiram entre si estatisticamente. Contudo, as doses 50, 75, 100 e 125 g.p.c.ha-1, apresentaram eficiência significativamente superior, com redução no fator de reprodução que variaram de 45,33% até 81,66%.

[36] Aos 60 DAS os tratamentos testemunha e formulação biológica na dose de 25 e 100 g.p.c.ha-1 não apresentaram diferença significativa entre si, sendo somente os tratamentos com as doses 50, 75 e 125 g.p.c.ha-1, foram significativamente superior à testemunha, apresentando eficiência de controle entre 56,33% e 82,60%.

[37] Quanto à produtividade da cultura, não houve diferença estatística entre os tratamentos aplicados e a testemunha, entretanto, os tratamentos contendo a formulação biológica na dose 100g.ha-l proporcionou incremento de 3,42 % na produtividade da cultura (Tabela 7).

- Tabela 6. Efeito dos tratamentos aplicados para controle do nematoide das galhas (Meloidogyne incógnita) na cultura da soja (Glycine max) sobre o fator de reprodução e eficácia dos tratamentos ao longo das avaliações. Uberlândia, MG, 2017.

g p.c.ha ¹: gramas de produto comercial por hectare; DAS: dias após a semeadura em relação entre a população final (Pf) do nematoide e a população inicial (Pi) em 150 cm³ e lOg de raiz(média de quatro repetições);médias seguidas de mesma letra não diferem entre si nas colunas pelo teste de Scott-Knott (p<0,05); Dados transformados por arcosen(x);E (%): eficácia dos tratamentos segundo Abbott (1925);CV (%): coeficiente de variação.

- Tabela 7. Produtividade e peso de mil grãos da cultura da soja (Glycine max), cultivar NA 5909 RG, em função dos tratamentos aplicados. Uberlândia, MG, 2017.

g p.c.ha ¹: gramas de produto comercial por hectarejkg.ha ¹: quilograma por hectare;IR: incremento na produtividade em relação à testemunha;m: média de quatro repetições; ^† médias seguidas de mesma letra não diferem entre si nas colunas pelo teste de Scott-Knott (p<0,05); Dados transformados por V(x + 1,0);CV (%): coeficiente de variação.

[38] De acordo com os resultados obtidos, formulação biológica apresenta eficiência de controle do nematoide das galhas (Meloidogyne incógnita) na cultura da soja, podendo ser inserido no manejo de controle dessa praga.

Conclusões

[39] Nenhum dos tratamentos avaliados causou fitotoxidez à cultura da soja (Glycine max), cultivar NA 5909 RG. Os tratamentos com formulação biológica nas doses de 50, 75, 100 e 125 g.ha ¹, apresentaram controle do nematoide das galhas (Meloidogyne incógnita), com redução de 25,62 a 86,30% e 38,20% a 73,64% no número de juvenis e/ou adultos no solo e na raiz respectivamente. Além disso, reduziu em 45,33 a 82,60% o fator de reprodução, podendo ser considerado como uma ferramenta eficiente de controle da praga na cultura da soja.

- Exemplo 2: Controle de Pratylenchus brachyurus em soja, via tratamento de sementes.

Objetivo

[40] Avaliar o efeito, em condições de campo, da formulação biológica contendo agentes bacterianos no controle de Pratylenchus brachyurus aplicado via tratamento de sementes. Material e Métodos

[41] Delineamento experimental: o delineamento experimental utilizado foi o de blocos casualizados, com seis tratamentos e seis repetições (36 parcelas). As parcelas experimentais se constituíram de 3,6 m de largura (oito linhas de cultivo) e 2,5 m comprimento, totalizando área de 9,0 m². Os dados das avaliações, quando necessário, foram transformados e submetidos à análise de variância. As comparações entre as médias foram realizadas pelo teste de Scott-Knott (p<0,05) (1974), e as eficácias dos tratamentos foram calculadas segundo ABBOTT (1925).

[42] Tratamentos e forma de aplicação: Os produtos em estudo foram utilizados para tratar as sementes de soja, cultivar NA 5909 RG. Para o tratamento das sementes, o volume de aplicação utilizado foi correspondente a 500 ml de calda para 10 kg de sementes ¹, no qual foi adicionado água à dose indicada do produto, até completar o volume de 3,0 ml. Em seguida, 500 g de sementes de soja, foram adicionados em um saco plástico juntamente com os 3,0 mL da mistura (produto + água). Esse saco foi fechado e agitado até a completa homogeneização dos produtos. Uma amostra de aproximadamente 100 gramas de cada tratamento foi retirada e enviada para o Laboratório de Análises de Sementes credenciado pelo Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento - MAPA - para realização dos testes de germinação. Amostras de solo e raízes foram coletadas de forma aleatória, em cinco pontos diferentes da parcela útil que compôs uma amostra composta, com aproximadamente 500g de solo e lOg de raízes. As coletas foram realizadas na profundidade de 0-20cm. Para a quantificação de ovos e juvenis de P. brachyurus as amostras de cada parcela experimental foram enviadas ao Laboratório de Nematologia. A extração do alvo no solo foi realizada pela técnica da flutuação centrífuga em solução de sacarose proposta por JENKIS (1964) em 150 cm³ de solo, sendo as avaliações realizadas previamente, aos 30 e 60 dias após a semeadura. Para a quantificação de nematoides nas raízes foi utilizada a técnica do liquidificador proposta por COOLEN & D'HERDE (1972) em 10 g de raízes, sendo as avaliações realizadas aos 30 e 60 DAS. Foi calculada o fator de reprodução (FR), sendo a relação entre a população final (Pf) e a população inicial (Pi) do nematoide, entre 30 e 60 DAS, de acordo com a fórmula proposta por OOSTENBRINK (1966), onde FR = Pf/Pi. Na época do florescimento (RB) avaliou-se a altura de 10 plantas no centro de cada parcela experimental, medindo-se do comprimento da haste rente ao solo até a última folha da planta, com o auxílio de uma trena. Para estimar a produtividade da cultura em quilogramas por hectare, foi realizada a colheita e pesagem dos grãos em 4 m² e a umidade ajustada para 13%. Resultados e Discussão

[43] No monitoramento prévio e ao longo das avaliações não foi detectada a presença de inimigos naturais em quantidade e frequência significativas nas plantas da área experimental, impossibilitando estimar os efeitos dos tratamentos em estudo sobre a dinâmica dessa população. Além disso, verificou-se que não houve qualquer fitotoxicidez provocada pela aplicação dos tratamentos em estudo que comprometesse o crescimento e o desenvolvimento das plantas de soja (Tabela 8).

- Tabela 8. Fitotoxidez dos tratamentos aplicados à cultura da soja (Glycine max), cultivar NA 5909 RG, ao longo das avaliações. Jataí, GO, 2017.

g p.c. kg sementes-1: gramas de produto comercial por quilogramas de sementes; m: notas de fitotoxicidade; DAE: dias após a emergência.

[44] Nas avaliações da altura de plantas (Tabela 9), os tratamentos aplicados não diferiram estatisticamente da testemunha, apresentando altura de plantas variando de 35,62 a 39,53cm.

- Tabela 9. Altura de plantas de soja (Glycine max), cultivar NA 5909 RG. Jataí, GO, 2017.

g p.c.kg sementes-1: gramas de produto comercial por quilogramas de sementes; DAS: dias após a semeadura m: média de 10 plantas por parcela útil (média de seis repetições); fmédias seguidas de mesma letra não diferem entre si nas colunas pelo teste de Scott-Knott (p<0,05); CV (%): coeficiente de variação.

[45] Nas avaliações dos efeitos dos tratamentos aplicados sobre o número de juvenis e/ou adultos em 150 cm³ de solo (Tabela 10), aos 30 DAS não foram observada diferenças estatísticas entre a testemunha e as doses avaliadas da formulação biológica. Entretanto, o produto em estudo proporcionou eficiência de controle em até 65,38%, quando comparado com a testemunha. Aos 60 DAS, a mistura biológica nas doses 0,90, 1,40 e 2,00 g. p.c.kg de sementes-1 proporcionaram um controle eficiente da população de nematoides no solo, com eficiência de variando de 61,93% até 80,96%, diferindo estatisticamente dos tratamentos testemunha e menor e maior dose da formulação biológica (0,45 e 2,50 g. p.c.kg de sementes-1 respectivamente).

- Tabela 10. Efeito dos tratamentos aplicados para controle do nematoide das lesões (Pratylenchus brachyurus) na cultura da soja (Glycine max) sobre o número de juvenis e/ou adultos em 150 cm3 de solo e eficácia dos tratamentos ao longo das avaliações. Jataí, GO, 2017.

g p.c.kg sementes-1: gramas de produto comercial por quilogramas de sementes;DAS: dias após a semeadura;m : número de juvenis e/ou adultos em 150 cm3 de solo(média de seis repetições); tmédias seguidas de mesma letra não diferem entre si nas colunas pelo teste de Scott-Knott (p<0,05); E (%): eficácia dos tratamentos segundo Abbott;CV (%): coeficiente de variação .

[46] A Tabela 11 apresenta os efeitos dos tratamentos aplicados sobre número de juvenis e/ou adultos em 10 g raiz. Aos 30 DAS a formulação biológica nas doses 1,40 e 2,50 g. p.c.kg de sementes-1 foram superiores aos demais tratamentos, atuando positivamente no controle do fitonematoide das lesões e apresentando eficiência de controle entre 37,68 e 60,89%, respectivamente. Aos 60 DAS, foi observado uma maior redução no número de fitonematoides nas raízes, apresentando diferença significativa dos tratamentos testemunha e da menor dose (0,45 g. p.c.kg de sementes-1). As doses 0,90, 1,40; 2,00 e 2,50 g. p.c.kg de sementes-1 da formulação biológica apresentaram eficiências que variaram de 55,54% até 82,13% (Tabela 11).

[47] A alta eficiência da formulação biológica no controle de fitonematoides nas raízes ocorre em detrimento das características dos microrganismos da composição. Esses microrganismos colonizam a rizosfera e reduzem a penetração dos nematoides nas raízes, devido à ação de metabólitos nematicidas produzidos pelas bactérias, ou pela redução da sinalização química exsudada pelas plantas, que orienta os nematoides até às raízes (SIDDIQUI & MAHMOOD, 1999).

- Tabela 11. Efeito dos tratamentos aplicados para controle do nematoide das lesões (Pratylenchus brachyurus) na cultura da soja (Glycine max) sobre o número de juvenis e/ou adultos em 10 g de raiz e eficácia dos tratamentos ao longo das avaliações. Jataí, GO, 2017.

g p.c.kg sementes ¹: gramas de produto comercial por quilogramas de sementes; DAS: dias após a semeadura;m : número de juvenis e/ou adultos em lOg de raiz(média de seis repetições); tmédias seguidas de mesma letra não diferem entre si nas colunas pelo teste de Scott-Knott (p<0,05); E (%): eficácia dos tratamentos segundo Abbott;CV (%): coeficiente de variação.

[48] Os reflexos do controle do fitonematoide das lesões sobre o fator de reprodução são apresentados na Tabela 12. Aos 30 e 60 DAS, a mistura biológica nas doses 2,00 e 2,50 g. p.c.kg de sementes-1 promoveram a redução significativas do fator de reprodução, apresentando eficiência de 63,63% e 57,67%, aos 30 DAS e 80,39% e 68,40% aos 60 DAS, respectivamente, indicando que nessas doses (2,00 e 2,50 g. p.c.kg de sementes-1), o produto é eficiente em impedir que a população do nematoide das lesões aumente significativamente, tanto no solo quanto nas raízes.

- Tabela 12. Efeito dos tratamentos aplicados para controle do nematoide das lesões (Pratylenchus brachyurus) na cultura da soja (Glycine max) sobre o fator de reprodução e eficácia dos tratamentos ao longo das avaliações. Jataí, GO, 2017.

g p.c.kg sementes ¹: gramas de produto comercial por quilogramas de sementes; DAS: dias após a semeadura em relação entre a população final (Pf) do nematoide e a população inicial (Pi) em 150 cm³ e lOg de raiz(média de seis repetições); fmédias seguidas de mesma letra não diferem entre si nas colunas pelo teste de Scott-Knott (p<0,05); E (%): eficácia dos tratamentos segundo Abbott;CV (%): coeficiente de variação.

[49] Quanto à produtividade da cultura, não foram observadas diferença estatística entre os tratamentos aplicados e a testemunha. Entretanto, os tratamentos com a formulação biológica proporcionaram incrementos de 6,65 a 22,65% na produtividade da cultura (Tabela 13). A mesma tendência foi observada na avaliação do peso de 1.000 grãos, onde não houve diferença significativa entre os tratamentos.

- Tabela 13. Produtividade e peso de mil grãos da cultura da soja (Glycine max), cultivar NA 5909 RG, em função dos tratamentos aplicados. Jataí, GO, 2017.

g p.c.kg sementes-1: gramas de produto comercial por quilogramas de sementes;kg.ha-l: quilograma por hectare; IR: incremento na produtividade em relação à testemunha; m: média de quatro repetições; † médias seguidas de mesma letra não diferem entre si nas colunas pelo teste de Scott-Knott (p<0,10); CV (%): coeficiente de variação.

[50] Diante do exposto, embora não tenham sido observados efeitos significativos na promoção de crescimento das plantas, na produtividade e no peso de 1.000 grãos, a mistura biológica foi eficiente na redução da população de nematoide das lesões radiculares, tanto no solo, quanto em raízes e interferiu negativamente no fator de reprodução dos mesmos. A formulação biológica pode ser incluída em programas de manejo do referido nematoide.

Conclusões

[51] Nenhum dos tratamentos avaliados causou fitotoxidez à cultura da soja (Glycine max), cultivar NA 5909 RR. Os tratamentos com a formulação biológica, quando aplicado nas doses de 0,90, 1,40, 2,00 e 2,50 g.p.c.kg de sementes-1, apresenta eficiência no controle da população do nematoide das lesões no solo em até 80,96% e nas raízes em até 82,13%, sendo eficiente também em baixar o fator de reprodução dos nematoides em até 80,39% em comparação à testemunha, podendo, assim, ser considerado uma ferramenta eficiente no combate ao nematoide Pratylenchus brachyurus.

[52] O preparo da formulação para controle biológico de fitonematoides deverá seguir o seguinte fluxo de eventos:

• Matéria prima: as matérias primas que irão compor o produto deverão ser recebidas e manipuladas por pessoas treinadas;

• Mistura: as matérias primas deverão ser pesadas e misturadas seguindo o procedimento operacional padrão (POP) nas proporções indicadas;

• Amostragem: após a mistura, deverão ser retiradas amostras para verificação e certificação das garantias do produto. Deve-se analisar número de unidades formadoras de colónias (u.f.c.)/g de produto;

• Envase: o produto formulado que se apresentar dentro das especificações de garantia deverão ser envasados em frascos plásticos ou pouch de 1,0, 5,0 e 10,0 kg, previamente rotulados. Os frascos ou pouch serão fechados com tampa ou selados

• Armazenagem: os frascos são acomodados em pallets e armazenados em local seco, arejado e protegido da luz, permanecendo nessa condição até ser despachado.

[53] O presente invento poderá ser aplicado tanto via sulco de plantio, via barra, tratamento de sementes ou mesmo tratamento de semente industrial por sementeiras para o controle de fitonematóides. O método de aplicação deverá ser analisado caso a caso e dependerá das condições técnicas e necessidade de cada produtor.

[54] É certo que a abrangência da presente patente de invenção, não deve ser limitada aos exemplos de aplicação, mas sim, aos termos definidos nas reivindicações e seus equivalentes.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ABBOTT, W.S. A method of computing the effectiveness of an insecticide. Journalof Economy Entomology, New York, v. 18, n. 1, p. 265-267, 1925.

Araújo, FF. 2008. Inoculação de sementes com Bacillus subtilis, formulado com farinha de ostra e desenvolvimento de milho, soja e algodão. Ciências e Agrotecnologia, Lavras, v. 2, p. 456-462.

ARAÚJO, F. F.; SILVA, J. F. V.; ARAÚJO, A. S. F. Influência de Bacillus subtilis na eclosão, orientação e infecção de Heterodera glycines em soja. Ciência Rural, Santa Maria, v. 32, n. 2, p. 197-203, 2002.

Bird DM, Opperman CH, Davies KG. 2003. Interactions between bactéria and plant- parasitic nematodes: now and then. Int. 1. Parasitol. 33:1269-1276.

COOLEN, W. A.; D'HERDE, C. J. A method for the guantitative extraction of nematodes from plant tissue. Ghent, State Nematology and Entomology Research Station, 1972. 77p.

Hallmann 1, Faupel A, Krechel A, Sikora RA, Berg G. 2004. Endophytic bactéria and biological control of nematodes. Bulletin OILB/SROP. 27:83-94.

Hasky-Gunther K, Hoffmann-Hergarten S, Sikora RA. 1998. REsistance against the potato cyst nematode Globodera pallida systemically induced by the rhizobacteria Agrobacterium radiobacter (G12) and Bacillus sphaericus (B43). Fund. Appl. Nematol. 21:511-517.

Higaki WA. 2012. Bacillus subtilis e abamectina no controle de Rotylenchulus reniformis e Pratylenchus brachyurus e alterações fisiológicas em algodoeiro em condições controladas. Dissertação (Mestrado em Agronomia) - Universidade do Oeste Paulista - Unoeste: Presidente Prudente - SP. Higoki WA; Araújo FF. Bocillus subtilis e abamectina no controle de nematoides e alterações fisiológicas em algodoeiro cultivado em solos naturalmente infestados. Nematropica Vol. 42, No. 2, p.295-303. 2012

JENKINS, W. R. A rapid centrifugal -flotation technigue for separating nematodes from soil. Plant Diasease Report, v. 48, 1964. p. 692.

LUZ, W. C. Rizobactérias promotoras de crescimento de plantas e bioproteção. Revisão Anual de Patologia de Plantas (RAPP), Passo Fundo, v. 4, n. 1, p. 1-49, 1996.

OOSTENBRINK, M. Major characteristics of the relation between nematodes and plants. Mededelingen Van de landbouwhogeschool te wageningen, Nederland, v.66, n.4, p.1-46, 1966.

SIDDIQUI, Z. A.; MAHMOOD, I. Role of bactéria in the management of plant parasitic nematodes: a review. Bioresource Technology, v. 69, n. 2, p. 167-179, 1999.

Sikora RA, Hoffmann-Hergaten S. 1992. Importance of plant health-promoting rhizobacteria for the control of soil-borne fungai diseases and plant parasitic nematodes. Arab. J. Plant Prot. 10:48-53.

Sikora RA, Padgham JL. 2007. Biological control potential and modes of action of Bacillus megaterium against Meloidogyne graminicola on rice. Crop Protection 26:971- 977.

Zucchi TD, Moraes LAB, Melo IS. 2008. Streptomyces sp. ASBV-1 reduces aflatoxin accumulation by Aspergillus parasiticus in peanut grain. J. Appl. Microbiol. 105:2153-

Claims

RE IVI N D ICAÇÕES

1) "COMPOSIÇÃO PARA CONTROLE BIOLÓGICO DE FITONEMATOIDES", mais precisamente trata de uma composição com efeitos nematicidas na mitigação dos danos e controle de fitonematoides em plantas cultiváveis; caracterizado por compreender microrganismos, em unidades formadoras de colónia, u.f.c. e em qualquer concentração: bacillus subtilis - 1,0 x IO¹⁰ u.f.c./g ; bacillus licheniformis - 1,0 x 10¹⁰ u.f.c./g e bacillus amyloliquenfacies - 1,0 x 10⁶ u.f.c./g.

2) "COMPOSIÇÃO PARA CONTROLE BIOLÓGICO DE FITONEMATOIDES", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por elementos da composição apresentarem as seguintes concentrações bacillus subtilis - 1,0 a 20,0%; bacillus licheniformis - 1,0 a 20,0%; bacillus amyloliquefaciens - 1,0 a 10,0%; aditivos - 1,0 a 20,0%; excipientes - 95,0 a 10,0%.

3) "COMPOSIÇÃO PARA CONTROLE BIOLÓGICO DE FITONEMATOIDES", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por aditivos serem dispersantes selecionados do grupo consistindo de polímeros iônicos solúveis em água, polímeros aniônicos solúveis em água e surfactantes selecionados do grupo consistindo de surfactantes aniônicos e surfactantes não iônicos e combinações entre eles.

4) "COMPOSIÇÃO PARA CONTROLE BIOLÓGICO DE FITONEMATOIDES", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por excipientes serem do grupo que consiste em sílicas, talco, bentonita, carboidratos, carbonatos, derivados do leite - soro e leite em pó - e combinações entre eles.

5) "COMPOSIÇÃO PARA CONTROLE BIOLÓGICO DE FITONEMATOIDES", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por composição ser empregada como formulação em pó molhável, emulsões, suspensões concentradas e grânulos.

6) "COMPOSIÇÃO PARA CONTROLE BIOLÓGICO DE FITONEMATOIDES", caracterizado por se prever a aplicação, em separado, dos componentes presentes na formulação da reivindicação 1, particularmente, Bacillus subtilis e seus mutantes, Bacillus licheniformis e seus mutantes e Bacillus amyloliquefaciens e seus mutantes para o manejo fitossanitário de fitonematoides.