BR112017000885B1 - Método para proteger plantas de patógenos prejudiciais - Google Patents

Abstract

resumo ?clonostachys rosea inoculadas em materiais vegetais com fungicidas e adjuvantes.? as estirpes de clonostachys rosea têm uma nova utilidade como inoculan-tes de plantas que promovem o vigor, a saúde, o crescimento, o rendimento e a re-dução do stress competitivo causado por outros fungos quando usados isoladamen-te ou sequencialmente com muitos fungicidas num sistema integrado de controle de pragas (ipm). as sementes e as utilizações foliares são mostradas para inocular e subsequentemente conseguir a colonização endofítica da porção da planta tratada. embora se tenha demonstrado que os conídios de germinação deste organismo to-leram vários grupos de fungicidas, o micélio estabelecido de clonostachys rosea é significativamente mais tolerante aos fungicidas sistémicos, facilitando o seu uso em aplicações de sementes e foliar. o tratamento e colonização das sementes pode ocorrer a qualquer momento após a colheita, resultando em sementes endófitas que ignoram ou são ligeiramente alteradas por outros organismos fúngicos e podem ser adequadas para alimentação, alimentos e utilizações de sementes.

Description

PEDIDOS RELACIONADOS

[001]Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório dos EUA No. 62 / 024,137 depositado em 14 de julho de 2014, que é incorporado no presente documento a título de referência.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO A. Campo Técnico

[002]O uso de inoculantes microbianos para promover a saúde da planta é conhecido. Geralmente, os micróbios, incluindo bactérias e fungos, podem ser aplicados a uma planta para melhorar a nutrição vegetal, promover o crescimento das plantas, proporciona a resistência à doença e para tratar a doença. Exemplos de inoculantes microbianos incluem rizobactérias promotoras do crescimento, tais como “Rhizobium sp.” que aumentam a nutrição nitrogenada em leguminosas, como soja e grão de bico, bactérias de solubilização de fosfato tais como Agrobacterium radiobacter, inoculantes fungos, incluindo fungos micorrízicos e fungos endofíticos, como Piriformis indica, que proporcionam benefícios nutricionais de plantas e inoculantes compostos que têm mostrado efeitos sinérgicos no crescimento e nutrição.

[003]Um endófito é um endosimbionte, muitas vezes, uma bactéria ou um fungo, que vive dentro de uma planta para, pelo menos, parte da sua vida, sem causar doença aparente. Os endófitos são ubíquos e têm sido encontrados em todas as espécies de plantas estudadas até o presente momento. Os endófitos podem ser transmitidos verticalmente (diretamente de pais para filhos) ou horizontalmente (de indivíduo para indivíduo não relacionada). Os fungos endófitos transmitidos verticalmente são tipicamente assexuada e transmitir a partir da planta mãe à prole através de hifas fúngicas penetrantes sementes do hospedeiro. Desde que a sua aptidão reprodutiva esteja intimamente ligada à de sua planta hospedeira, estes fungos são muitas vezes mutualistas. Por outro lado, fungos endófitos horizontalmente transmissíveis são sexual e se transmitem por meio de esporos que podem ser transmitidos por vetores vento e ou insetos. Os endófitos podem beneficiar plantas hospedeiras, evitando que organismos patogênicos se colonizem. A colonização extensiva do tecido da planta por endófitos cria um "efeito de barreira", onde os locais endófitos são completados e previnem os organismos patogênicos de tomar a preensão. Os endófitos podem também produzir produtos químicos que inibem o crescimento dos concorrentes, incluindo organismos patogénicos.

[004]Vários endófitos, em particular fungos, têm sido utilizados, a fim de controlar doenças de plantas, visando o crescimento e viabilidade de patógenos de plantas. Além de sua utilidade diversa, inoculantes microbianos podem substituir ou reduzir significativamente a necessidade de uso nocivo de fertilizantes químicos e tratamentos fitossanitários, que é cada vez mais importante à medida que regulamentos impõem restrições severas à utilização de tais produtos químicos entrarem em vigor. O uso de controle biológico e organismos fúngicos bioestimulantes nas culturas arvenses e hortícolas convencionais ainda é relativamente novo. A pesquisa publicada cobriu o uso de muitos organismos fúngicos como auxiliares na agricultura.

[005]Clonostachys rosea (anteriormente conhecida como Gliocladium roseum) é reconhecida como um organismo benéfico. Clonostachys roseaé uma espécie de fungo na família Bionectriaceae que coloniza as plantas vivas como um endófito. Clonostachys rosea deve ser capaz de estabelecer qualquer endofiticamente em, ou epiphytically em, órgãos de plantas, mas a última não é significativo no campo (excepto talvez em casos de raízes), pois o organismo está significativamente controlada por UV-A e UV-B . O uso de endófitos de Clonostachys roseaé preferível a alguns outros agentes de controle biológico, porque Clonostachys roseasão rápidos colonizadores internos, com melhor capacidade de competir contra outros organismos. Há uma variedade de cepas de Clonostachys rosea, que todos compartilham as mesmas características comuns de crescer rapidamente, tendo um micélio feltro-like, e não ter efeitos prejudiciais sobre plantas superiores.

[006]Clonostachys roseaé um endófito localmente sistêmico que translamina frequentemente denominado, ou seja, ele se move da parte superior da folha para baixo colonizar tecidos em todo o / área inoculada pulverizado. Geralmente, não há movimento na haste ou folhas de raízes. Um spray em partes das flores pode colonizar a semente. Clonostachys roseanão tem nenhum estágio sexual, e conídios é transmitida de cotilédones de soja ou de folhas dentro de rosa que são digeridos e forma de conídios.

[007]Os modos de ação de C. rosea como agente de controle biológico não são totalmente conhecidos, embora a ocupação local, micoparasitismo, competição por nutrientes e produção de metabolitos secundários têm sido sugeridos para desempenhar papéis importantes. A falta de compreensão do papel de Clonostachys rosea e outros endófitos na vida das plantas é muitas vezes dominada pela ideia errada de que toxinas ou antibióticos estão sempre envolvidos, bem como a classificação de organismos endofíticos como biopesticidas muitas vezes perdeu o real papel na saúde das plantas.

[008]O modo de ação das estirpes Clonostachys rosea envolve colonização e posse de um sistema de raiz ou parte tratada de uma planta por micélio, seguido pela negação de alimentos para outros organismos. Em interação microbiana, a posse é 9 / 10ths da lei. A colonização precoce de sementes, de folhagem, de flores e de frutos alcança os melhores resultados.

[009]Além disso, a investigação atual postulou que segregam hidrofobinas C. rosea, que são pequenas proteínas produzidas apenas por fungos filamentosos, que forma camadas anfipáticas na superfície exterior das paredes das células fúngicas. (Dubey et al, hidrofobinas são necessários para dade hidrofóbico de conídios e colonização da raiz da planta no agente de biocontrole de fungos Clonostachys rosea, BMC Microbiology 2014, 14:18). O lado hidrofóbico da camada anfipática é exposto ao ambiente exterior, enquanto que o lado hidrófilo é dirigida para polissacáridos da parede celular. Tem sido relatado que Clonostachvs rósea CAN proteases subtilisina secretos-serina como extracelular ou outras substâncias potencialmente durante a infecção. C. rosea produz a enzima hidrolase a zearalenona (ZHD101), o que degrada a zearalenona ("ZEA"), que é produzida por espécies de Fusarium, produtores de micotoxinas, incluindo F.graminearum e F. culmorum. Uma micotoxina que exibe crescimento antifúngico.Zealerones são micotoxinas com atividade estrogênica-mímica. (Kakeya, biotransformação da micotoxina, Zealerone, a um composto não estrogénico por uma estirpe fúngica de Clonostachys sp., Bioscience, Biotechnology, Biochemistry e, Vol. 66 (2002) No. 12, P 2723-2726). Em um caso, tem sido relatado que a patogénese iniciado a partir da aderência de conídios a cutícula do nemátodo para a germinação, seguido pela penetração de entrada de tubos germinais, para dentro do corpo de nemátodos e a morte subsequente e a degradação dos nemátodos. (Zhang et ai, investigação sobre o mecanismo de infecção do fungo Clonostachys rosea contra nemátodos usando a proteína fluorescente verde, Applied Microbiology and Biotechnology abril de 2008, Volume 78, Issue 6, pp 983 a 990).

B. Descrição da técnica relacionada

[010] As estirpes Clonostachys rosea toleram certos fungicidas, e, assim, Clonostachys rosea foi considerada uma candidata para o sistema de manejo integrado de pragas.

[011]Bio-escorvamento de sementes tem sido bem conhecido. Veja, por exemplo, Callan, o tratamento de sementes Bio-priming para o Controle Biológico de Pythium ultimum Preemergence amortecimento-off em SH2 milho doce, doenças das plantas, Vol. 74 No.5 (1990); Rao, Bio-Priming de sementes: uma potencial ferramenta na gestão integrada de Alternaria Blight do girassol, HELIA, 32, Nr. 50, P.P. 107 a 114, (2009);

[012]A literatura publicada indica que as sementes são sujeitas a um tratamento fungicida, seguindo-se a inoculação de um organismo biológico. Assim, Rao, 2009, descreve que, para opções integradas de tratamento de sementes testadas para a gestão de Alternaria praga de girassol, o maior benefício foi obtido do tratamento de sementes com carbendazim + Iprodiona (Quintal) a 0,3% em água, juntamente com pulverização foliar hexaconazol (0,1%) seguido por tratamento de sementes com Pseudomonas fluorescens (0,8%) em geleia + hexaconazol pulverização foliar.

[013]A literatura publicada para culturas indica que ele tem sido geralmente considerado que Clonostachvs roseanão é aplicado em conjunto com fungicidas. Ver, por exemplo, Patente EUA 6.495.133 para Xue que relataram que "ACM941 mais de 50% da taxa regular de tirame era o tratamento mais eficaz, que aumentou o rendimento de 21%... Os resultados também indicam que bioagente ACM941 é compatível com fungicida tirame" e que "Os resultados deste estudo também indicam que o bioagente ACM941 é compatível com fungicida metalaxil. Pesquisas posteriores por Sutton e Brown mostrou que tirame e não metalaxil é tóxico para Clonostachys rosea ACM941. Uma maior eficácia foi geralmente observada quando ACM941 foi combinado com fungicida metalaxil. "Ver também Macedo et al, de sensibilidade dos quatro isolados de Clonostachys rosea a pesticidas utilizados na cultura do morangueiro no Brasil, J. Pestic. Sci. 37(4), 333 a 337 (2012). Macedo et al determinaram a sensibilidade de quatro isolados de Clonostachys rosea de fungicidas e outros pesticidas, e concluiu que todos os fungicidas inibiram o crescimento micelial e a germinação de conídios de todos os isolados. Por essa razão, a pesquisa na área tem, em geral em comparação rósea de fungicidas no lado por testes laterais, em vez de uma forma integrada Clonostachys. Ver, por exemplo, Xue et al. controle biológico de Fusarium giberela do trigo com a estirpe Clonostachys rosea ACM941, Can. J. Pathol Plant. 31:169 a 179 (2009).

[014]Uma composição inoculante compreendendo Clonostachys roseaé divulgado no United States Patent Publication 20120021906A1 para Sutton e Mason. Sutton e Mason divulga uma composição de um veículo que possui um teor de não mais do que cerca de 5% de humidade, e um método de inoculação de uma planta para promover o crescimento, aumentam a resistência a condições adversas ou promover o re-crescimento também é fornecida compreendendo a aplicação da composição inoculante para a planta

RESUMO

[015]A descrição abaixo proporciona sistemas e métodos para efetuar o biocontrole em culturas, e em particular inclui uma descrição de comb nações sinérgicas de métodos e microrganismos para facilitar a germinação e utilização de Clonostachys rosea para o biocontrole.

[016]Os métodos e microrganismos podem ser utilizados como parte de um programa de manejo integrado de pragas (MIP). Os compostos ou composições adicionais podem ser um acaricida, um bactericida, um fungicida, um inseticida, um microbicida, um nematicida, um fertilizante, ou um conservante de alimentos.

[017]A composição de Clonostachys rosea pode estar na forma de um pó, um grânulo, uma pelete, um gel, uma suspensão aquosa, uma solução ou uma emulsão. A composição pode ser fornecida com um transportador. O transportador pode ser uma semente.

[018]Os métodos e microrganismos divulgados também incluem exemplos de um método para tratar, inibir ou prevenir o desenvolvimento de uma doença patogénica da planta. O método envolve a aplicação de Clonostachys rosea em uma semente, ou sobre ou na proximidade de uma planta hospedeira. O Clonostachys roseaé geralmente estabelecido como um endófito sobre a semente ou planta. As combinações de sistemas integrados são particularmente eficazes contra fungos patogénicos do género Fusarium, Pythium e / ou Rhizoctonia. O agente patogénico causador da doença patogénica que é controlada pelas combinações de sistemas integrados podem ser Aspergillus fumigatus, Botrytis cinerea, Cerpospora betae, Curvularia sp., Ganoderma boninense, Geotrichum candidum, Mycosphaerella fijiensis, Phytophthora palmivora, Phytophthora ramorum, Pythium ultimum, Rhizoctonia solani, Rhizopus sp., Schizophyllum sp., Sclerotinia sclerotiorum, ou Verticillium Dahlia. Por exemplo, Fusarium giberela, causada por Gibberella zeae (SYN. Fusarium graminearum), é uma das doenças mais importantes de trigo no Canadá. A infecção do trigo pelos resultados do patógeno em perda de rendimento de grãos, a redução da qualidade, e porcentagem de grãos contaminados com desoxinivalenol (DON) e outras micotoxinas. gestão corrente desta doença depende de fungicidas na maioria das áreas de produção de trigo. Várias aplicações de fungicidas têm aumentado o custo econômico para os produtores e as preocupações do público sobre os riscos de pesticidas e de resistência do patógeno aos fungicidas. rósea Clonostachys é uma alternativa orgânica aos fungicidas químicos rígidos ou químicas. Além disso, o laboratório preliminar e com efeito de estufa de experimentos também mostraram que Clonostachys rosea (ACM941) suprime significativamente a podridão de raiz, uma doença soybeah importante causada por membros do complexo Fusarium graminearum incluindo F., F. oxysporum e F. solani.

[019]Outro aspecto dos métodos e microrganismos é proporcionar ocorrência não natural sementes e plantas infectadas com Clonostachys rosea.

[020]Em outro aspecto, são proporcionados métodos para o tratamento, inibição ou prevenção de uma doença relacionada com o patogênico da planta. Em algumas formas de realização, os métodos envolvem o crescimento de uma cultura de Clonostachys rosea sobre as sementes ou sobre ou na vizinhança da planta hospedeira, ou no meio de crescimento ou no solo da planta hospedeira antes de ou em simultâneo com o crescimento das plantas no meio de crescimento ou no solo . Em uma ou mais das formas de realização acima, o método é eficaz para controlar o patogênico da planta. Em várias formas de realização, o agente patogénico da planta está associada com a semente ou planta hospedeira, ou está no meio de crescimento ou no solo da planta hospedeira antes de ou em simultâneo com o crescimento das plantas no meio de crescimento ou no solo.

[021]Outro aspecto se refere a um método para matar, inibir ou prevenir o desenvolvimento de um organismo indesejado, tal como um fungo, uma bactéria, um microrganismo, um nemátodo, e um inseto. O método envolve a exposição ou contato o organismo ou com uma quantidade eficaz de Clonostachys rosea como parte do sistema de gestão integrada tal como descrito abaixo.

[022]A proteção de material de propagação de plantas (especialmente sementes) com ingredientes ativos são aplicações alvo que abordam parcialmente a necessidade de uma redução de exposição do trabalhador e do ambiente, quando utilizado sozinho ou em conjunção com aplicações foliares de ingredientes ativos ou no sulco.

[023]Existe uma necessidade continuada para proporcionar combinações de pesticidas que proporcionam melhor qualidade, por exemplo, as propriedades biológicas, por exemplo, propriedades sinérgicas, especialmente para o controlo de agentes patogénicos.

[024]As necessidades de um sistema eficaz de manejo integrado de pragas utilizando biocontrole são pelo menos parcialmente conseguido utilizando as atuais divulgações. Em conformidade, em um primeiro aspecto, os métodos e organismos descritos proporcionam uma combinação de tratamento integrado de pesticida utilizando o agente de biocontrole de Clonostachys rosea em combinação com química ou fungicidas químicos rígidos.

[025]Os métodos e organismos divulgados também fornecem um método de proteção de um material de propagação da planta, uma semente, uma planta, partes de um dos órgãos das plantas e / ou plantas que crescem em um ponto posterior no tempo contra danos patogénico ou danos causados por pragas através da aplicação à semente, planta, partes da planta, ou os seus arredores a combinação, tal como definido no primeiro aspecto, em uma sequência. A invenção também se refere a um material de propagação da planta tratado com a combinação definida no primeiro aspecto.

[026]Além disso, em uma concretização, os métodos e organismos descritos refere-se a um método que compreende (i) tratar um material de propagação de planta, tal como uma semente, tal como definido no primeiro aspecto, e (ii) plantar ou semear o material de propagação tratado, em que a combinação protege contra danos patogénico ou danos causados por pragas do material de propagação de plantas tratado, partes de plantas e / ou plantas crescidas a partir do material de propagação tratado.

[027]Além disso, em uma forma de realização dos métodos e organismos descritos refere-se a um método que compreende (i) tratar um material de propagação de planta, tal como uma semente, tal como definido no primeiro aspecto, e (ii) plantar ou semear o material de propagação tratado, e (iii) assegurar a proteção contra danos patogénico ou danos causados por pragas do material de propagação de plantas tratadas, partes de vegetais e / ou planta cultivada a partir do material de propagação tratada.

[028]Os métodos descritos no presente documento de um modo preferido de biocontrole e, opcionalmente, compreendem um adjuvante, e mais preferivelmente um adjuvante que é microencapsulado.

[029]As combinações de pesticidas integrado de acordo com a invenção têm propriedades muito vantajosas para proteger as plantas contra (i) patogénico, tal como fitopatogénicos, especialmente fungos, ataque ou infestação, o que resulta em uma doença e os danos para a planta e / ou (ii) ataque de pragas ou danos; particularmente no caso de plantas, os métodos e organismos pode controlar ou prevenir os danos patogénico e / ou danos causados por pragas em uma semente, partes de raiz da planta e / ou subterrâneo ou porções nível do solo divulgados caule de uma planta crescida a partir da semente tratada.

[030]Para a realização dos fins anteriores e relacionados, certos aspectos ilustrativos são descritos aqui em ligação com a descrição seguinte e os desenhos anexos. Estes aspectos são indicativos, no entanto, de apenas algumas das várias maneiras em que os princípios da matéria reivindicada podem ser empregues e a matéria reivindicada destina-se a incluir todos esses aspectos e os seus equivalentes. Outras vantagens e características novas podem tornar-se evidentes a partir da descrição detalhada que se segue quando considerada em conjugação com os desenhos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[031]As Figuras de 1 até 21b são imagens que mostram os resultados de testes que são descritos na secção de Exemplos da presente memória descritiva. A descrição das Figuras na seção Descrição detalhada é incorporada no presente documento.

[032]A Figura 1 é uma fotografia que mostra resultado após inoculação de adição de fungicidas diferentes simultaneamente com a inoculação de Clonostachys rosea.

[033]A Figura 2 é uma fotografia que mostra resultado da adição de diferentes fungicidas simultaneamente com a inoculação de Clonostachys rosea aplicado a um relvado de conídios frescos de C. rosea 88 a 710.

[034]A Figura 3 é uma fotografia que mostra resultado da adição de diferentes fungicidas simultaneamente com a inoculação de Clonostachys rosea aplicado a um relvado de conídios frescos C. rosea ACM491.

[035]A Figura 4 é uma fotografia que mostra resultado da adição de diferentes fungicidas simultaneamente com a inoculação de Clonostachys rosea aplicado a um relvado de conídios frescos C. rosea 88 a 710 tomadas 2 dias após os discos de papel foram colocados sobre relva de esporos acabada de preparar do fungo.

[036]A Figura 4a é uma fotografia que mostra o resultado da adição de diferentes fungicidas simultaneamente com a inoculação de Clonostachys rosea aplicado a um relvado de conídios frescos C. rosea 88 a 710 efetuadas 10 dias após os discos de papel foram colocados sobre relva de esporos acabada de preparar do fungo.

[037]A Figura 5 é uma fotografia que mostra resultado de fungicidas testes Quadris, Prosaro, Stratego e Tilt com C. rosea 88 a 710.

[038]A Figura 6 é uma fotografia é uma fotografia que mostra resultado da adição de diferentes fungicidas em 48 horas de idade gramado do Clonostachys roseaapós inoculação.

[039]A Figura 7 é uma fotografia que mostra o ensaio de efeito de fungicidas no crescimento e desenvolvimento de conídios C. rosea 88 a 710 quando os discos tratados com fungicidas foram aplicados a um tapete de micélio do fungo estabelecida.

[040]A Figura 8 é uma fotografia que mostra o ensaio de efeito de fungicidas no crescimento e desenvolvimento de conídios C. rosea ACM491 quando os discos tratados com fungicidas foram aplicados a um tapete de micélio do fungo estabelecida.

[041]A Figura 9 é uma fotografia que mostra o teste de CruiserMaxx® Beans- sementes de milho revestidas sobre a relva fresca de esporos de C. rosea 88 a 710, no 2,4 e 10 dias.

[042]A Figura 10 é uma fotografia que mostra o teste de CruiserMaxx® Beans- sementes de milho revestido no gramado esporos frescos de C. rosea ACM491, em 4 e 10 dias.

[043]A Figura 11 é uma fotografia é uma fotografia que mostra resultado da adição de diferentes fungicidas para um gramado de Clonostachys rosea 88 a 710.

[044]A Figura 12 é uma fotografia de sementes de soja tratada com CruiserMaxx® Feijão aplicada a uma placa de PDA do gramado esporos frescos de C. rosea 88 a 710, aos 2, 6 e 10 dias.

[045]A Figura 13 é uma fotografia de sementes de soja tratada com CruiserMaxx® Feijões aplicadas a uma placa de PDA de um relvado 48 horas de idade de esporos de C. rosea estabelecida 88 a 710 a 4 e 8 dias.

[046]A Figura 14 é uma fotografia de plantas de trigo cultivadas a partir de sementes pulverizadas com 10 ml de água / Kg de sementes de trigo, sem qualquer inoculação, com a metade esquerda, sem secagem e a metade direita do ar seco depois de 24 horas e, em seguida, colocados em sacos de plástico.

[047]A Figura 15 é uma fotografia de plantas de trigo cultivadas a partir de sementes pulverizadas com 10 ml de suspensão de Clonostachys rosea / kg de semente de trigo, sem C-molhada, com a metade esquerda, sem secagem e a metade de ar direito seca após 24 horas e, em seguida, colocados em sacos de plástico.

[048]A Figura 16 é uma fotografia de plantas de trigo cultivadas a partir de sementes pulverizadas com 10 ml de suspensão de Clonostachys rosea / kg de semente de trigo, com adjuvante C-molhada, com a metade esquerda, sem secagem e a metade de ar direito seca após 24 horas e, em seguida, colocada no saco de plástico.

[049]A Figura 17 é uma fotografia de plantas de soja cultivadas a partir de sementes pulverizadas com 10 ml de água / Kg de sementes, sem qualquer inoculação, com a metade esquerda, sem secagem e a metade direita do ar seco depois de 24 horas e, em seguida, colocados em sacos de plástico.

[050]A Figura 18 é uma fotografia de plantas de soja cultivadas a partir de sementes pulverizadas com 10 ml de suspensão de Clonostachys rosea / kg de sementes, sem C-molhada, com a metade esquerda, sem secagem e a metade direita do ar seco depois de 24 horas e, em seguida, colocados em sacos de plástico.

[051]A Figura 19 é uma fotografia de plantas de soja cultivadas a partir de sementes pulverizadas com 10 ml de suspensão de Clonostachys rosea / kg de sementes, com o adjuvante C-molhada, com metade esquerda sem secagem e meia ar direita seca após 24 horas e, em seguida, colocados em sacos de plástico.

[052]A Figura 20a é uma Beans fotografia CruiserMaxx® tratada sementes de milho foi colocado madura ACM941 micélio C. roseaapós 4 dias.

[053]A Figura 20b é uma fotografia da semente Os grãos de milho CruiserMaxx® tratada foi colocada em madura ACM941 micélio C. roseaapós 10 dias.

[054]A Figura 21 é uma fotografia de um Beans CruiserMaxx® sementes tratadas de milho foi colocado em madura C. rosea 88 a 710 micélio após 4 dias.

[055]A Figura 21 é uma fotografia b feijões CruiserMaxx® sementes tratadas de milho foi colocado em madura C. rosea 88 a 710 micélio após 10 dias.

DESCRIÇÃO DETALHADA Definições

[056]Os termos a seguir utilizados na presente memória descritiva são definidos como segue:

[057] O “controle biológico"significa que o controlo de um agente patogénico ou de qualquer outro organismo indesejável pela utilização de um segundo organismo. Um exemplo de um mecanismo conhecido de controlo biológico é a utilização de microrganismos que controlam o apodrecimento da raiz por fungos- competindo para fora de um espaço na superfície da raiz, ou microrganismos que, ou inibir o crescimento ou matar o patógeno. A "semente de acolhimento" ou "planta hospedeira", no contexto do controle biológico é a semente ou planta que é suscetível à doença causada pelo patógeno. No contexto de isolamento de um organismo, tal como uma espécie fúngica, a partir do seu ambiente natural, a “semente hospedeira” ou "planta hospedeira"é uma semente ou da planta que suporta o crescimento do fungo, por exemplo, uma semente ou planta de uma espécie com uma relação endofíticos com Clonostachys rosea.

[058] A "Composição"significa uma combinação de um ou mais agentes ativos e / ou outro composto, veículo ou composição, inerte (por exemplo, um agente detectável ou marcador ou veículo líquido) ou ativo, tal como um pesticida.

[059] "Controle", "proteger" e suas inflexões significa reduzir qualquer efeito indesejado, como patogênico, como fitopatogênicos, especialmente fungos, infestação ou de ataque e danos ou praga patogênico danos na, uma planta, parte da propagação da planta ou vegetal material a um nível tal que é uma melhoria demonstrada.

[060]"Cultura" significa a propagação de organismos sobre ou em meios de vários tipos.

[061]"Quantidade eficaz" significa uma quantidade suficiente para afetar os resultados benéficos ou desejados. Uma quantidade eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações. Em termos de tratamento, inibição ou proteção, uma quantidade eficaz é aquela quantidade suficiente para melhorar, estabilizar, inverter, abrandar ou retardar a progressão da infecção alvo ou estados de doença.

[062]"Fungicida" significa a capacidade de uma substância para diminuir a taxa de crescimento de fungos ou para aumentar a mortalidade dos fungos.

[063]"Fungo" ou "fungos" pretende-se incluir uma ampla variedade de organismos nucleados portadores de esporos que são desprovidas de clorofila. Exemplos de fungos incluem leveduras, bolores, mofos, oxidam (rusts), e cogumelos.

[064]"Inoculação" significa a adição de células de Clonostach rosea aos materiais de propagação de plantas.

[065] As "plantas cultivadas" significam todas as plantas que são cultivadas onde desejado ou plantada, e incluem ambas as plantas e as plantas nativas que foram modificados pela criação de animais, mutagênese ou engenharia genética.

[066]"Material de propagação de plantas" significa todas as partes generativas da planta, tais como sementes e material de planta vegetativo tais como estacas, tubérculos e que podem ser utilizadas para a multiplicação da planta. Isto inclui sementes, raízes, frutos, tubérculos, bolbos, rizomas, rebentos, rebentos e outras partes de plantas, incluindo sementes e plantas jovens, que estão a ser transplantadas após a germinação, ou após a emergência a partir do solo.

[067]"Planta" é um termo que inclui tanto as plantas cultivadas e materiais de propagação de plantas.

Breve visão geral

[068]Os métodos e organismos divulgados ajudar a resolver o duplo desafio ao uso generalizado de bioestimulantes de fungos ou biopesticidas vivos, que são:

[069]1. Colonização ou estabelecimento do organismo dentro de uma planta; e

[070] 2. Tolerância ou a capacidade de usar os micróbios benéficos com fungicidas e inseticidas tradicionais de química difícil em um sistema de manejo integrado de pragas (MIP).

[071]Clonostachys rosea é útil no controlo de agentes patogénicos. Contudo, Clonostachys rosea por si só não pode controlar completamente fungos patogênicos. Infelizmente, as estirpes de Clonostachys rosea mostram geralmente uma falta de tolerância para muitos fungicidas químicos convencionais, e existe sempre um risco significativo de que em qualquer conjunto particular de condições do meio ambiente um fungicida pode ser prejudicial. Por exemplo, em experiências em estufa, Clonostachys rosea demonstraram tolerância in vitro para o fungicida Switch®, mas pouca ou nenhuma tolerância para Pristine® e Maestro. Veja, por exemplo, Reeh et al, eficácia Laboratório e compatibilidade fungicida de Clonostachys rosea contra Botrytis chaga em blueberry lowbush, Canadian Journal of Plant Science, 2013, 93 (4): 639 a 642; Xue 2003, supra. Assim, o uso de fungicidas químicos convencionais pode se tornar problemático quando se fundamentalmente Clonostachys roseaé utilizado, porque, a aplicação adequada ausentes tal como aqui proporcionado, o fungicida pode prejudicar, se não essencialmente destruir, a Clonostachys rosea.

[072]Foi agora descoberto que Clonostachvs rósea podem ser utilizados com segurança em combinação com os fungicidas químicos como tanto um tratamento de semente e o campo, quando as sementes e / ou plantas são inoculados em primeiro lugar com Clonostachys rosea, seguido por tratamento com um fungicida cerca de 48 horas mais tarde, mediante o estabelecimento de micélio de Clonostachys rosea. Os fungicidas têm significativamente maior eficácia contra conídios de Clonostachys rosea que em micélios. Além disso, em geral, o desenvolvimento de micélios corresponde a tolerância aos fungicidas. Assim, Clonostachys roseamicélio, uma vez dentro das sementes ou plantas de cerca de uma semana após a inoculação ter maior ou tolerância aumentada aos fungicidas do que depois de apenas cerca de dois dias.

Clonostachys rosea

[073]Qualquer espécie ou estirpe de Clonostachys rosea pode ser utilizada nos métodos e organismos divulgados. C. rosea ACM941 e 88 a 710 estirpes foram consideradas particularmente úteis. Clonostachys roseaé comercialmente disponível sob a marca registada EndoFine® (disponível a partir de adjuvantes Além disso Inc., ingsville, Ontário N9Y2Y8).

[074]As composições do invento que compreendem a cultura de Clonostachys rosea podem estar em uma variedade de formas, incluindo, mas não limitados a, culturas ainda, culturas completas, os estoques de micélio e / ou de hifas (particularmente glicerol existências) armazenado, ágar tiras, armazenado ágar tampões em glicerol / água, congelar stocks secos, e os estoques de seca, como micélio seco em papel filtro ou inoculadas em sementes de grãos vivos ou esterilizados.

[075]A invenção proporciona ainda uma composição que inclui Clonostachys rosea e um transportador. O transportador pode ser qualquer um ou mais de um número de transportadores que conferem uma variedade de propriedades, tais como uma maior estabilidade, molhabilidade, capacidade de dispersão, etc. Os agentes molhantes tais como tensioativos naturais ou sintéticos, que podem ser agentes tensioativos não iónicos ou iónicos, ou uma combinação dos mesmos podem ser incluídos em uma composição do invento. As formulações adequadas que podem ser preparados incluem pós molháveis, grânulos, géis, tiras de agar ou peletes, espessantes, e as partículas microencapsuladas, como, e semelhantes, tais como líquidos escoáveis aquosas, suspensões aquosas, emulsões de água-em-óleo, etc. A formulação pode incluir grãos ou leguminosas produtos (por exemplo, grãos moídos ou feijão, caldo de carne ou farinha de derivados de grãos ou feijão), amido, açúcar ou óleo. O transportador pode ser um transportador agrícola. Em certas formas de realização, o veículo é uma semente, e a composição pode ser aplicada ou revestido sobre a semente ou permitido para saturar a semente.

[076]A transportadora agrícola pode ser de solo ou de médio crescimento da planta. Outros transportadores agrícolas que podem ser utilizados incluem água, fertilizantes, óleos à base de plantas, umectantes, ou suas combinações. Alternativamente, o transportador agrícola pode ser um sólido, tal como terra de diatomáceas, barro, sílica, alginato, argila, bentonite, vermiculite, casos de sementes, outros produtos vegetais e animais, ou de combinações, incluindo grânulos, peletes, ou suspensões. As misturas de qualquer dos ingredientes acima mencionados são também contempladas como transportadores. As formulações podem incluir fontes de alimento para os organismos cultivados, tais como cevada, arroz, ou outros materiais biológicos, tais como sementes, partes de plantas, cascas ou talos de processamento de grãos, material vegetal do solo ("resíduos de quintal") ou de madeira de local de construção recusar, serradura ou fibras pequenas provenientes da reciclagem de papel, tecido ou madeira. Outras formulações adequadas serão conhecidas dos peritos na técnica.

[077]A invenção contempla que diferentes estirpes de Clonostachys rosea podem ser usadas para inocular plantas simultaneamente ou sequencialmente. Essa combinação de Clonostachys rosea pode fornecer um espectro mais amplo de atividade e proteção para a planta.

Fungicidas

[078]Uma grande variedade de fungicidas podem ser utilizados com os métodos e organismos divulgados. Os exemplos de fungicidas de tipo azole são tiabendazol, oxpoconazol, ipconazol e protioconazol; especialmente preferidos são o tiabendazol, ipconazol e protioconazol. Exemplos de tipo fungicidas fenilamida incluem mefenoxam (metalaxil-M), metalaxyi, benalaxil, benalaxil-M, oxadixil e furalaxil. Os exemplos de fungicidas estrobilurina são azoxistrobina, picoxistrobina, metominostrobina, piraclostrobina, famoxadona, fenamidona, fluoxastrobina, cresoxime-metilo e trifloxistrobina. Exemplos de fungicidas são fenilpirrole fenpiclonil e fludioxonil. fungicidas potencialmente úteis também incluem derivados bisoxime cíclicos descritos nos Estados Unidos Publicação de Patente 20140162980A1 para Stierli; os derivados de bifenilmetilo-carboxamida-N-cicloalquilo N- descritos na Patente dos Estados Unidos Publicação 20140171474A1 para Desbordes et ai, cuja revelação é incorporada no presente documento a título de referência; os derivados de carboxamidas de pirazole descritos na Publicação de Patente dos Estados Unidos 20140148411 Al para Bartels et al, cuja revelação é incorporada no presente documento a título de referência.

[079]Os fungicidas podem também ser usadas em combinação de fungicidas, como descrito na Publicação de Patente dos Estados Unidos 20140148338A1 para Hoffmann et al, cuja revelação é incorporada no presente documento a título de referência.

Inoculação e tratamento de semente

[080]A invenção é útil como método de inoculação e o tratamento de sementes para prevenir a atividade patogénica e para melhorar o rendimento das culturas. A invenção se refere ainda a sementes tratadas de acordo com as descrições aqui. Uma grande parte dos danos às plantas das culturas causadas por organismos prejudiciais é desencadeado por uma infecção das sementes durante o armazenamento ou após a semeadura, bem como durante e após a germinação da planta, porque as raízes e rebentos da planta em crescimento são particularmente sensíveis, e até mesmo pequenos danos às raízes que crescem pode resultar em danificar a planta. Consequentemente, existe grande interesse em proteger as sementes antes da sementeira.

[081]O controlo de fungos fito patogênicos por tratamento da semente de plantas é conhecida há muito tempo, mas ainda pode ser melhorada. Uma das vantagens dos métodos e organismos descritos é que, por causa das propriedades particulares das composições de acordo com a invenção, o tratamento das sementes com estas composições não só protege a semente no momento da colheita por meio de plantio após o plantio, e para o restante da temporada a partir de fungos fito patogênicos. Deste modo, o tratamento imediato da cultura na altura da sementeira, ou pouco depois pode ser dispensado. Os métodos e organismos descritos podem, potencialmente, permitir que os agricultores distribuam com aplicação adicional de proteção de colheitas agentes na semeadura. Assim, a invenção aperfeiçoa ainda mais a quantidade e o efeito de Clonostachs rosea e ingredientes ativos fungicidas utilizados para fornecer proteção máxima para a semente e a planta germinação do ataque de fungos fito patogênicos, sem danificar a planta em si pelo composto ativo utilizado.

[082]Os métodos para a aplicação ou o tratamento de pesticidas ingredientes ativos e as suas misturas em materiais de propagação de plantas, especialmente sementes, são conhecidos na arte, e incluem vestir, revestimento, granulação e métodos de aplicação de imersão do material de propagação. É preferido que o material de propagação da planta é uma semente.

[083]Os ingredientes ativos podem ser aplicados para a C. rosea sementes inoculadas usando técnicas de tratamento convencionais e máquinas, como as técnicas de fluido ized cama, o método de moinho de cilindros, tratadores de sementes rotostatic, e os revestidores de tambor. Outros métodos, tais como leitos de jorro pode também ser útil. As sementes podem ser previamente dimensionadas antes do revestimento. Após o revestimento, as sementes são tipicamente secas e depois transferidas para uma máquina de colagem para o dimensionamento. Tais procedimentos são conhecidos na técnica.

[084]Em uma forma de realização, a combinação é aplicada sobre as sementes em uma quantidade e por um método tal que a germinação das sementes não é induzida, e que a semente não é afetada negativamente, ou que a planta resultante não seja danificada. Isto se deve ter em conta, nomeadamente, no caso de substâncias ativas que podem ter efeitos fito tóxicos em certas taxas de aplicação. Geralmente a embebição das sementes induz a germinação, porque o conteúdo de humidade da semente resultante é demasiado elevado.

[085]As composições de acordo com a invenção podem ser aplicadas diretamente como um pó para a semente, isto é, sem que compreenda os componentes adicionais e sem terem sido diluídos. Em geral, é preferível aplicar as composições à semente na forma de uma formulação apropriada. As formulações e métodos para o tratamento de sementes adequado são conhecidos pelo perito na técnica e são descritos, por exemplo, nos seguintes documentos: Patente EUA. N ° s. 4, 272.417; 4.245.432; 4,808.430; e 5.876.739; e Publicações 2003/0176428 Al, WO 2002 / 080675A1 e WO 2002 / 028186A2.

[086]Por conseguinte, exemplos de métodos adequados para a aplicação (ou tratamento de) de um material de propagação da planta, tal como uma semente, é o tratamento de sementes, recobrimento de sementes ou revestimento de sementes e semelhantes.

[087]É preferido que a semente esteja em um estado suficientemente durável que não incorre em danos durante o processo de tratamento. Tipicamente, a semente seria uma semente que foi colhida do campo; removida da planta; e separada de qualquer espiga, caule, casca exterior e polpa envolvente ou outro material vegetal não semente. A semente também seria preferivelmente biologicamente estável ser na medida em que o tratamento iria induzir atividade endófito de Clonostachys rosea, mas sem causar danos biológicos à semente. Acredita-se que o tratamento de Clonostachys rosea pode ser aplicado à semente em qualquer altura entre a colheita da semente e a sementeira da semente, mas de preferência antes do processo de semeadura.

[088]Mesmo na distribuição dos ativos de Clonostachys rosea e posteriores ingredientes fungicidas e a sua aderência às sementes é desejada durante semente integrado tratamento de combinação, a aplicação pode variar de uma película fina (curativo) da formulação contendo o ingrediente ativo(s) em uma semente, onde o tamanho e / ou forma originais são reconhecíveis para um estado intermediário (tal como um revestimento) e depois para uma película mais espessa (por exemplo, granulação com muitas camadas de diferentes materiais (tais como transportadores, por exemplo, argilas; formulações diferentes, tal como de outros ingredientes ativos, polímeros, e corantes) em que a forma original e / ou o tamanho das sementes não é reconhecível. Como resultado das aplicações combinadas, os ingredientes ativos na combinação estão coladas à semente e, por conseguinte, disponível para pragas e / ou controlo de doenças. As sementes tratadas podem ser armazenadas, manuseadas, semeadas e cultivadas no mesmo modo que qualquer outra semente tratada ingrediente ativo.

[089]A combinação do sistema integrado de acordo com os métodos e organismos descritos é adequada para sementes de culturas: milho (milho), arroz, café, cereais (trigo, cevada, centeio, aveia, milho, arroz, sorgo, triticale e culturas relacionadas); beterraba (beterraba sacarina e de beterraba forrageira); plantas leguminosas (feijões, lentilhas, ervilhas, soja); plantas oleaginosas (colza, mostarda, girassóis); plantas de pepino (abóboras, pepinos, melões); plantas fibrosas (algodão, linho, cânhamo, juta); legumes (espinafre, alface, espargos, couves, cenouras, cebolas, tomates, batatas, pimentão); bem como gramado e plantas ornamentais (flores, arbustos, árvores de folhas largas e sempre-vivas, tais como coníferas). Especialmente adequadas são as sementes de trigo, cevada, centeio, aveia, triticale, sorgo, milho, soja e; cada combinação é vantajosamente preferida para as culturas de sorgo, milho e soja. As composições de acordo com a invenção são adequadas para proteger sementes de uma variedade vegetal empregue na agricultura, na estufa, em florestas ou na horticultura ou viticultura, (ver também abaixo).

[090]As sementes ou outro material de propagação de plantas tratadas com uma combinação sistema integrado de os métodos e organismos descritos são, por conseguinte, resistentes a doenças e / ou danos causados por pragas; Assim, os métodos e organismos divulgados também fornecem um material de propagação da patogenicidade e / ou planta de pragas resistentes, que é tratado com a combinação e, por conseguinte, pelo menos, os seus ingredientes ativos estão aderidas sobre o material de propagação, tal como uma dessas sementes.

[091]A combinação do tratamento de sementes do sistema integrado e composições também podem compreender, ou podem ser aplicados em conjunto com outros compostos ativos, em que o Clonostachys rosea e um fungicida são aplicados sequencialmente com pelo menos cerca de 48 horas diferencial, e onde os outros ingredientes ativos pesticidas são aplicados em combinação com o fungicida, embora os ingredientes ativos fungicidas não pode ser aplicado na semente em qualquer altura.

[092]O ingrediente ativo de pesticida não fungicida pode ter atividade em mais do que a área de controlo de pragas, por exemplo, um pesticida pode ter atividade inseticida e nematicida.

[093]Uma formulação de tratamento de revestimento de sementes ou as sementes podem ser aplicadas às sementes na sequência empregando as composições da invenção e um diluente em uma forma de formulação de revestimento de sementes adequada, e.g. como uma suspensão aquosa ou em uma forma de pó seco com boa aderência às sementes. Estas formulações de revestimento de sementes ou tratamento de sementes são conhecidas na técnica. Tais formulações podem conter os ingredientes ativos isolados ou a combinação de ingredientes ativos em forma encapsulada, por exemplo, como cápsulas de liberação lenta ou microcápsulas.

[094]Verificou-se que as sementes inoculadas com Clonostachys rosea tal como EndoFine® SI irão permanecer viáveis por mais de quatro anos se armazenadas em local fresco (35 ° F a 41 ° F).

[095]As sementes são preferencialmente inoculadas por Clonostachys rosea dentro de um curto período de tempo após a colheita, tal como, por exemplo, dentro de dois dias ou uma semana após a colheita, embora as sementes também possam ser tratadas de um mês ou seis semanas ou alguns meses ou mesmo anos após a colheita. Quanto mais cedo a inoculação, mais provável é que as sementes irão obter os benefícios da inoculação, e particularmente se as sementes são inoculadas antes do tratamento de sementes e revestimento ou peletização.

[096]Uma taxa de aplicação típica de Clonostachys roseaàs sementes como uma suspensão líquida é de 10 gramas por litro de água, como a mistura de suspensão e 10 mis de que a suspensão (1 a 2 x 10 <7> CFU) seria usada para inocular um quilograma de semente. Uma típica aplicação a seco para plantar seria de 0,5 a 1 grama por quilograma. A típica faixa de aplicação foliar seria de 300 a 1.850 gramas por hectare, dependendo das condições do tamanho da colheita e do tempo até e incluindo árvores de frutas e nozes maduras.

Aplicações de Solo e de Planta

[097]A invenção proporciona métodos para a prevenção ou tratamento de uma doença relacionada com o agente patogénico para plantas, em que o método inclui a aplicação de uma composição que compreende um ou mais organismos Clonostachys rosea para o solo ou em um meio de crescimento de plantas. Um meio de crescimento das plantas não pode ser o solo areia, vermiculite, fibras, um meio de gel ou líquido à base para o crescimento de plantas, etc. Em algumas formas de realização, o meio de crescimento no solo ou planta tratada com uma composição de Clonostachys roseacontém sementes de plantas de uma ou mais plantas da espécie de interesse. Em algumas formas de realização, o solo ou outro meio de crescimento da planta é tratado com uma composição de Clonostachys rosea e é subsequentemente plantado com uma ou mais plantas da espécie de interesse. A plantação pode ser de sementes, rebentos, raízes, ou transplante de plantas inteiras (tais como, mas não limitado a, mudas). A composição de Clonostachys rosea pode ser misturada para o meio de crescimento ou no solo, furada ou injetada no solo ou meio de crescimento, pulverizado, embebido, polvilhados, espalhados ou no meio de crescimento ou no solo e, opcionalmente, revestida.

[098]A invenção proporciona, portanto, um método para usar as composições de Clonostachys rosea para matar patógenos de plantas no solo. As formulações adequadas para o tratamento do solo são evidentes para os peritos na técnica e incluem pós molhados, grânulos, pastilhas, e semelhantes, encapsulações em um meio apropriado e semelhantes, tais como líquidos escoáveis aquosas e suspensões aquosas e concentrados emulsionáveis. As formulações podem incluir fontes de alimento para os organismos em cultura, tais como a cevada, o arroz, ou outros materiais orgânicos, tais como cachos de frutos vazios.

[099]A composição que contém Clonostachys rosea pode ser enterrada no solo antes da plantação de uma cultura ou durante a plantação de sementes, raízes ou rebentos ou repicagem das plantas, ou a composição pode ser aplicado ao solo após plantas foram estabelecidas. A composição pode também ser diretamente aplicada às raízes das plantas. As plantas em algumas formas de realização têm a doença de raiz causada por um agente patogénico da planta.

[0100]A invenção utiliza a característica de estirpes de Clonostachys rosea de rápida germinação de conídios, e a nova compreensão do papel de conídios na colonização e a influência da natureza hidrofóbica de conídios na colonização de espécies de Clonostachys rosea.

Adjuvantes

[0101] Os agentes molhantes adequados que podem estar presentes nas formulações de revestimento de sementes que podem ser usadas de acordo com a invenção incluem todas as substâncias que promovem o humedecimento e habituais na formulação de substâncias agroquímicas ativas, desde que o tratamento é aplicado tanto evitar quaisquer adjuvantes que podem prejudicar ou matar a Clonostachys rosea em solução ou por utilização de microencapsulação que resulta em um agente tensioativo que é seguro no produto seco, bem como em segurança no tanque de pulverização.

[0102][Como para o fungicida ou outros ingredientes não ativos de Clonostachys rosea, a invenção abrange, dependendo da natureza dos compostos de ingredientes ativos a serem formulados, os compostos tensoativos adequados que são tensoativos não iônicos, catiônicos e / ou aniônicos, que possuem boas propriedades emulsionantes, dispersantes e molhantes. O termo "surfactantes"irá também ser entendido como compreendendo misturas de surfactantes. Os adjuvantes promotores da aplicação vantajosa são também fosfolípidos naturais ou sintéticos das séries de cefalina e lecitina, por exemplo, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilglicerol e lisolecitina. Geralmente, dispersantes e / ou emulsionantes que podem estar presentes na porção fungicida das formulações de revestimento de sementes que podem ser usadas de acordo com a invenção incluem todos os não iónicos, aniônicos, catiônicos e agentes dispersantes que são usuais na formulação de substâncias agroquímicas ativas adequadas. Os dispersantes não iónicos particularmente adequados são polímeros de blocos de óxido de etileno-óxido de propileno, éteres de poliglicol de alquilfenol, e éteres de poliglicol de tristirilfenol e os seus derivados sulfatados ou fosfatados. Os dispersantes aniônicos particularmente adequados são os lignossulfonatos, sais poliacrílicos, e condensados de formaldeído-arilsulfonato. Os anti espumantes que podem estar presentes no fungicida ou em outras preparações de sementes não Clonostachys rosea. As formulações a ser utilizadas de acordo com a invenção incluem todos os compostos de inibição de espuma que são usuais na formulação de compostos agroquimicamente ativos. É dada preferência ao uso de agentes anti espuma de silicone, estearato de magnésio, emulsões de silicone, álcoois de cadeia longa, ácidos gordos e seus sais e também os compostos organofluorine e suas misturas. Os conservantes que podem estar presentes nas formulações de revestimento de sementes a serem utilizadas de acordo com a invenção incluem todos os compostos que podem ser utilizados para tais fins em composições agroquímicas. A título de exemplo, pode ser feita menção de diclorofeno e hemiformal de álcool benzílico. Os espessantes secundários que podem estar presentes nas formulações de revestimento de sementes a serem utilizadas de acordo com a invenção incluem todos os compostos que podem ser utilizados para tais fins em composições agroquímicas. É dada preferência aos derivados de celulose, derivados de ácido acrílico, polissacáridos, tais como goma de xantano ou Veegum, argilas modificadas, filossilicatos, tais como atapulgite e bentonite, e ácidos silícicos também finamente divididos. Os adesivos adequados que podem estar presentes nas formulações de revestimento de sementes para ser usada de acordo com a invenção incluem todos os agentes ligantes usuais que podem ser usados em revestimentos de sementes.

[0103]As formulações de agentes de biocontrole naturais, como Clonostachys rosea apresentam desafios diferentes. Os adjuvantes microencapsulados melhoram a velocidade de um dos conídios rápidos que já estão germinando, facilitando a mais rápida colonização e ampliando as condições de utilização. Particularmente úteis são os adjuvantes microencapsulados dentro de formulações à base de conídios secos ou adicionados no momento da pulverização. Os adjuvantes microencapsulados mais preferidos são aqueles que têm sido desenvolvidos pelo Dr. Gary Harman da Universidade de Cornell, e divulgado no Pedido EUA Número de Série 14 / 407.868, cuja divulgação é incorporada no presente documento a título de referência. Em particular, foi descoberto que as ciclodextrinas fornecem uma ferramenta de formulação útil. Estes são radicais de glicose circularizado de 6 a 8 unidades; o centro da molécula de ciclodextrina é hidrofóbico e, por isso, forma complexos de inclusão com moléculas hidrófobas, incluindo aqueles que são úteis para as formulações de Clonostachys rosea. A porção hidrofóbica interior da molécula sequestra eficazmente moléculas oleofílicos, prende-los neste centro e libera-los quando a água está presente. Isto permite a produção de uma formulação estável que limita a libertação de materiais voláteis e sequestra materiais, tais como agentes tensioativos que prejudicariam a Clonostachys rosea. As ciclodextrinas não são afetadas por forças de cisalhamento e se dispersam facilmente para uso em produtos líquidos. O pedido de patente de Número de Série US 14/407,868 descreve as formulações de Clonostachys rosea nos Exemplos 4 e 5, que são incorporadas a título de referência.

[0104]Assim, a seguir o número de série 14 / 407.868, proporciona-se uma suspensão líquida única e inovadora feita por um processo de combinação ou mistura de uma ciclodextrina ou outro dextrina e Clonostachys rosea em diferentes proporções, com proporções mais elevadas de Clonostachys rosea a dextrina proporcionando uma percentagem maior de livre e vagamente ligados Clonostachys rosea de rácios mais baixos. Nesta composição, a ciclodextrina ou outro dextrina e Clonostachys rosea interage, e alguma da ciclodextrina é misturada com, mas não interage diretamente com, Clonostachys rosea.

[0105]O adjuvante preferido para Clonostachys roseaé C-Wet ™ (disponível a partir de Adjuvants Plus Inc., Kingsville, Ontario N9Y2Y8), que é um adjuvante em pó seco encapsulado feito a partir de ciclodextrina capturada de copolímero de siloxano de óxido de polialquileno, na proporção de aproximadamente 10: 3, e feita de forma consistente com o pedido de patente de número de série US 14/407.868.

EXEMPLOS Exemplo Comparativo 1

[0106]O efeito da adição de diferentes fungicidas simultaneamente com a inoculação de Clonostachys rosea foi testado.

[0107] As placas de ágar de dextrose de batata ("PDA") foram inoculadas. Em uma série de experimentos, as placas de PDA foram inoculadas com C. rosea 88 a 710 e, em um segundo conjunto de experimentos, com ACM941. Os discos de papel de filtro (7 mm de diâmetro) foram embebidos com a solução de trabalho de cada fungicida testado (ver Tabela 1 abaixo). Os quatro discos dos discos encharcados de fungicidas foram colocados sobre o gramado de esporos de C. rosea imediatamente após as placas de PDA serem inoculadas com os conídios de Clonostachys rosea.

[0108]As placas de PDA sobre a inoculação são mostradas na Figura 1. Tiveram 3 placas replicadas para cada tratamento.

[0109]Os resultados das experiências são mostrados nas Tabelas 2 e 3, e as figuras 2, 3 e 4. A Tabela 2 mostra que o diâmetro médio das zonas de inibição de dois isolados de C. rosea (em mm ± S.E.) circundante discos de papel de filtro tratado com fungicidas após 2, 4, e 6 dias de incubação. Os discos foram colocados sobre a forma imediatamente após conídios de C. rosea foram distribuídos sobre o meio. A Tabela 3 mostra o diâmetro médio das zonas de inibição de dois isolados de C. rosea 88 a 710 (em mm ± S.E.) circundante discos de papel de filtro tratado com fungicidas após 2 e 6 dias de incubação. Os discos foram colocados sobre a forma imediatamente após os conídios de C. rosea serem distribuídos sobre o meio. A tabela 3 inclui também sementes de soja como um controle. Todos os testes incluem esterilizada destilada ( "DP") de água como controlo.

[0110]Nota: Os valores na mesma coluna dentro do isolado com as diferentes letras maiúsculas diferem significativamente (P <0,05). Os valores na mesma linha com as diferentes letras minúsculas diferem significativamente (P <0,05).

[0111]A Figura 2 documenta os resultados dos fungicidas testados aplicados a um gramado conídios frescos de C. rosea 88 a 710. A Figura 3 documenta os resultados dos fungicidas testados aplicados a um gramado conídios frescos de C. rosea ACM941. Em ambos os casos, as imagens foram tiradas após dois dias que os discos de papel foram aplicados às placas de PDA.

[0112]Acapela não afetou visivelmente germinação e crescimento dos isolados C. rosea (sem zonas claras). Tilt 250E marcadamente suprimida germinação e crescimento C. rosea (33 mm zonas claras de inibição da germinação; nenhum crescimento para trás sobre zonas claras). Os outros fungicidas produziram zonas de inibição de 20 a 31 mm de diâmetro (Quadro2 Médias). Folicur não inibiu a germinação de esporos (há zonas claras), mas mostrou alguma inibição crescimento micelial e esporulação. Prosaro, Caramba e Headline produzida zonas claras de 1 a 5 mm de distância dos discos. Headline suprimiu completamente esporulação de C. rosea 88 a 710, mas não da ACM941. Em zonas de inibição, 88 a 710 esporulados principalmente via inibidores de verticillate enquanto ACM941 produziu conidióforos principalmente penicilado; isto pode indicar que ACM941 é marginalmente mais resistente aos fungicidas testados do que é 88 a 710. No registo fotográfico das placas de ensaio apresentados nas Figuras 2 e 3, a compatibilidade de C. rosea com os fungicidas testados é apresentada no fim da mais para a menos compatível. A compatibilidade foi baseada no tamanho das zonas de inibição, zonas claras em torno dos discos e esporulação de C. rosea.

[0113]A Figura 4 documenta os resultados dos fungicidas testados e aplicados a um gramado conídios frescos de C. rosea 88 a 710. As fotos foram tiradas após 2 dias e os discos de papel foram colocados sobre relva de esporos acabada de preparar do fungo. A Figura 4a mostra a compatibilidade, do mais ao menos, de C. rosea 88 a 710 com os fungicidas testados. As fotografias foram tiradas 10 dias após os discos de papel foram colocados sobre relva de esporos acabada de preparar do fungo. Como Stratego e Tilt inibiu o crescimento C. rosea, bactérias contaminadas começou crescimento na área descoberta.

[0114]A Figura 5 mostra que testar fungicidas (Quadris, Prosaro, Stratego e Teld) tem pouco ou nenhum efeito sobre o crescimento e esporulação de C. rosea 88 a 710 quando os discos tratados com fungicidas são aplicados em um gramado de micélio estabelecendo o fungo.

Exemplo 2

[0115]O método do Exemplo Comparativo 1 foi seguido, exceto os quatro discos dos discos embebidos de fungicidas que foram colocados sobre o relvado de esporos de C. rosea 48 horas depois que as placas de PDA foram inoculadas com os esporos de Clonostachys rosea.

[0116]As placas de PDA quando inoculadas são mostradas na Figura 6. Os resultados das experiências são mostrados nas Figuras 7 e 8. A Figura 7 documenta os resultados dos fungicidas testados e aplicados a uma idade de 48 horas de C. rosea gramado 88 a 710. A Figura 8 documenta os resultados dos fungicidas testados e aplicados a uma idade de 48 horas de C. rosea gramado ACM941. Em ambos os casos, as imagens foram tiradas 2, 4, 6 e 10 dias após os discos de papel serem aplicados ao relvado de idade de 48 horas em placas de PDA.

[0117]A Figura 7 mostra que os fungicidas testados mostraram pouco ou nenhum efeito sobre o crescimento e desenvolvimento de conídios C. rosea 88 a 710 quando os discos tratados com fungicidas foram aplicados a um tapete de micélio do fungo estabelecida. A Figura 8 mostra que os fungicidas testados mostraram pouco ou nenhum efeito sobre o crescimento e desenvolvimento de conídios C. rosea ACM 941, quando os discos tratados com fungicidas foram aplicados a um tapete de micélio do fungo estabelecida.

Exemplo Comparativo 3

[0118]O método do Exemplo Comparativo 1 foi seguido com exceção de sementes de milho que foram testadas à taxa de inoculo mais elevada. Neste exemplo, milho de Beans CruiserMaxx® ™ foi utilizado. Os feijões CruiserMaxx® são uma combinação de um inseticida com fungicidas, e contém 22,61% de inseticida tiametoxam, 1,70% de mefenoxam, 1,12% de fludioxonil, isômeros de Metalaxil M7S, fungicidas de azoxistrobina e 74,57% de outros ingredientes. Quatro feijões CruiserMaxx® revestidos com sementes de milho foram colocados sobre o gramado de esporos de C. rosea 88 a 710 e ACM941 imediatamente após as placas de PDA serem inoculadas com os esporos. Tiveram 3 placas replicadas para cada tratamento.

[0119]As Figuras 9 e 10 registram os resultados. A Figura 9 documenta as sementes de milho revestidos CruiserMaxx® Beans- no gramado esporos frescos de C. rosea 88 a 710. A Figura 10 documenta as sementes de milho revestidos CruiserMaxx® Beans- no gramado esporos frescos de C. rosea ACM941.

Exemplo 4

[0120]O método do Exemplo 2 foi seguido, exceto fungicidas diferentes que foram testadas. Os resultados são mostrados na Figura 11. A Figura 11 documenta que os fungicidas testados tinham pouco ou nenhum efeito sobre o crescimento e esporulação de C. rosea 88 a 710 quando os discos tratados com fungicidas foram aplicados em um gramado de micélio estabelecido.

Exemplo Comparativo 5

[0121]As sementes de soja foram tratadas com um fungicida (Beans CruiserMaxx®, uma combinação de inseticida e fungicida, contendo 22,61% de tiametoxame (CAS No 153719 23 4); 1,70% de mefenoxam (*CAS número 70630 17 0 e CAS número 69516 34 3), e 1,12% de Fluidoxonil (CAS de número 31341 86-1)) e foram então aplicadas a uma placa de PDA do gramado esporos frescos de C. rosea 88 a 710. Os resultados estão documentados na Figura 12.

Exemplo 6

[0122]As sementes de soja foram tratadas com um fungicida (feijão CruiserMaxx®), e depois foram aplicadas a uma placa de PDA de um relvado de 48 horas de idade de esporos de C. rosea estabelecida 88 a 710. Os resultados estão documentados na Figura 13, que mostra que os fungicidas testados têm pouco ou nenhum efeito sobre C. rosea 88 a 710, quando as sementes de soja revestidas de fungicidas aplicadas no relvado de esporos do fungo foram estabelecidas.

[0123]As observações para discos colocados sobre o ágar imediatamente após a aplicação de esporos de C. rosea mostram que a inclinação 250E e Stratego marcadamente suprimida a germinação e o crescimento de C. rosea (zonas 35 milímetros claros de inibição da germinação; pouco crescimento para trás sobre zonas claras) (Tabela 3). Outros fungicidas produziram zonas de inibição de 20 a 25 mm de diâmetro (Tabela 2). Prosaro inibiu C. rosea a germinação de esporos, resultando zonas claras 1 a 3 mm de distância a partir dos discos, mas não suprimir a esporulação do fungo. Quadris não inibiu a germinação de esporos (há zonas claras), mas mostrou alguma inibição do crescimento micelial e esporulação (Figuras 4 e 4a).

[0124]Quando os discos de papel de filtro embebido com fungicidas ou as sementes foram colocados para o relvado micélios de 48 horas estabelecidas, os fungicidas testados tinham pouco ou nenhum efeito inibidor (Figura 5).

Exemplo 7 C-molhado foi testado no tratamento de sementes.

[0125]Sementes de soja, trigo, milho e sementes de relva foram pesadas para Ziplok sacos e tratados com uma suspensão de conídios de Clonostachys rosea. Uma solução de estoque de cada tratamento foi preparada utilizando 400 mis de água destilada estéril com C. rosea com uma contagem de CFU de 1 x 106 e 2 x 106 com e sem adjuvante C-molhados em 0,3% em peso v. A suspensão foi filtrada através de um filtro fino de combustível dentro de um funil de plástico. As quantidades de suspensão foram calculadas para ser aplicado ao equivalente de 10 ml por kg de sementes. A suspensão foi aplicada usando uma bomba de spray garrafa inserida em um frasco de 10 ml que tinha um topo de plástico flexível com um pequeno orifício que selado em torno do tubo de sucção da bomba de pulverização reduzido. Duas pulverizações foram aplicadas sobre a semente no saco Ziplok. O conteúdo dentro do saco foi misturado por rotação do saco. O procedimento foi repetido mais duas vezes para esvaziar o frasco. Uma suspensão extra de 10% foi aplicada para compensar a perda para os lados do saco de plástico. O conteúdo dos sacos foi bem misturado para obter uma distribuição relativamente uniforme sobre a superfície de cada semente.

[0126]As amostras de cada lote de sementes foram divididas ao meio após 24 horas e a uma parte seca ao ar. O restante foi mantido selado no saco de plástico até que uma parte era ou plantadas ou enviadas para análise da colonização.

[0127]Os tratamentos são identificados na seguinte Tabela 4:

[0128]Todos os tratamentos foram aplicados a sementes de trigo e de soja. Sementes de milho com sementes (sílex) e sementes de relva com capim recebeu os tratamentos 1, 7 e 9 (rotuladas como 1, 2 e 3). Uma amostra de cada tratamento de sementes foi analisada para determinar a colonização.

[0129]As amostras das várias sementes de colheitas foram plantadas em uma estufa. As sementes foram plantadas em bandejas rasas usando uma multa de mudas mistura Fafard cobertura (milho 10 sementes e soja, 15 de trigo e 30 mistura de relva). A mesma mistura de mudas de cobertura também foi usada para cobrir as sementes. As bandeijas plásticas realizadas em 16 fileiras de sementes tratadas cada uma; 8 linhas de não seca e 8 linhas de semente seca ao ar.

[0130]As fotografias de crescimento foram tomadas para determinar a influência do tratamento de C. rosea na altura de planta e no comprimento da raiz. Os tabuleiros contendo as várias plantas de cultura foram cortados e plaqueados para medir a colonização.

[0131]A Figura 14 mostra as sementes de trigo pulverizadas com 10 ml de água / Kg de sementes de trigo, sem qualquer inoculação, e mantido dentro de um saco de plástico. Metade das sementes foi seca ao ar após 24 horas e colocada em um segundo saco de plástico. A semelhança da raiz e do desenvolvimento da parte aérea pode ser observada na imagem.

[0132]A Figura 15 mostra as sementes de trigo pulverizadas com 10 ml de suspensão de Clonostachys rosea (1 x 106 unidades formadoras de colónias ["cfu”]) / kg de semente de trigo, sem C- molhado, e mantido dentro de um saco de plástico. Metade das sementes foi seca ao ar após 24 horas e colocada em um segundo saco de plástico. Na figura, as plantas do lado esquerdo são a partir de sementes não secas, e as plantas no lado direito são a partir de sementes secas. A mudança de root e desenvolvimento da parte aérea pode ser observada na imagem.

[0133]A Figura 16 mostra as sementes de trigo pulverizadas com 10 ml de suspensão de Clonostachys rosea (1 x 106 de cfu / kg de sementes de trigo, com adjuvante C-molhado, e mantido dentro de um saco de plástico. Metade das sementes foi seca ao ar após 24 horas e colocada em um segundo saco de plástico. Na figura, as plantas do lado esquerdo são a partir de sementes não secas, e as plantas do lado direito são de sementes secas. A experiência indica que Clonostachys rosea teve inoculação similar em ambos as sementes molhadas e secas, o que indica uma absorção rápida de Clonostachys rosea quando suplementadas com C-Wet.

[0134]As Figuras 17, 18 e 19 são os resultados dos testes com sementes de soja, e as descrições seguir às das figuras 14 a 16, respectivamente. A Figura 17 mostra raízes e caule semelhante. A Figura 18 mostra uma mudança de raiz com sementes de soja tratadas com Clonostachys rosea sem adjuvante. A Figura 19 mostra que as sementes tratadas com Clonostachys rosea em combinação com show de C-Wet em desenvolvimento semelhante no caso de ambas as sementes molhadas e secas, indicando que C-Wet promovido absorção de Clonostachys rosea em sementes de soja.

[0135]Os experimentos não indicaram qualquer diferença significativa entre a manutenção de sementes em 12 a 13% de umidade e secagem ao ar.

Exemplo 8

[0136]Os efeitos da irradiação de C-wet e UV sobre a capacidade dos esporos Clonostachys rosea para germinar e estabelecer endofiticamente em folhas de trigo e milho foram testados com o objetivo de determinar os efeitos de C-Wet empregues como um adjuvante inoculo com esporos Clonostachys rosea, e de períodos de exposição após a inoculação do inóculo à irradiação UV, sobre a capacidade de C. rosea para germinar e estabelecer como um endófito em folhas de trigo e milho.

[0137]As plantas testadas foram mudas cultivadas em estufa de trigo (estágio de 3 folhas) e milho (estágio de 2 a 3 folhas). O trigo estava em vasos de plástico de 4 polegadas e o milho em apartamentos de mudas.

[0138]O estirpe de Clonostachys rosea 88 a 710 foi preparado com e sem C- Wet imediatamente antes que as mudas foram inoculadas. Quatro mls da solução de estoque foi removida com uma seringa e colocada em um frasco com um senhor de pulverização.

[0139]A folhagem das mudas foi pulverizada com inóculo com ou sem C- Wet. O pulverizador névoa foi carregado com o inóculo pressionando delicadamente o gatilho do spray. As plântulas foram colocadas cerca de 20 cm a partir do pulverizador e o gatilho duas vezes rapidamente espremido para aspirar toda a mistura de inoculo sobre a folhagem das plântulas. Todas as plântulas foram inoculadas dentro de 15 minutos. O senhor spray e frasco foram enxaguados três vezes com água engarrafada entre cada aplicação às mudas. Todos os tratamentos com o inoculo sozinho foram aplicados antes do inoculo com a C-wet.

[0140]As mudas inoculadas foram imediatamente posicionadas abaixo de uma UV "negro de fumo" de tal forma que os topos das folhas ficaram de 25 a 50 cm dos tubos de luz. (Lamp unidade: Blak-Ray modelo da lâmpada XX-15; 115 v, 60 Hz 0,75 amp; UVP, San Gabriel, CA 91778. Tubos de luz: GE, Nela Park, Cleveland OH 44112; 15 Watt luz negra F15 T8 / BLB "light psychodelic". Dois tubos de luz 15 polegadas) (Nota: A lei inversa da raiz quadrada afirma que a intensidade da luz é inversamente proporcional ao quadrado da distância da lâmpada.)

[0141]As plantas tratadas foram removidas por baixo da lâmpada, depois dos seguintes períodos de exposição de UV: 0 h, 1,5 h, 3,0 h, 6,0 h, 9,0 h, 15 h e 24 h. Durante estes períodos, a temperatura era de 20 a 22 ° C e umidade relativa de 70 a 80%

[0142]Em cada tempo de amostragem, as folhas foram cortadas transversalmente em segmentos e colocadas em meio de agar paraquat- cloranfenicol (PCA) em placas de Petri. As tesouras utilizadas para os segmentos de corte foram limpas com um tecido molhado com 95% de EtOH seguido por um pano seco entre cada corte. Cada segmento foi posicionado em contato estreito com o APC para facilitar a absorção do paraquat e, assim, acelerar a senescência foliar. A justificativa para o plaqueamento em PCA é que C. rosea estabelece symptomlessly dentro de folhas e outros tecidos vegetais como endófito benéfico e esporula sobre os tecidos somente após os tecidos começam a renascer. A observação de esporulação é um meio indireto para determinar o estabelecimento de endofíticos e a viabilidade de C. rosea nos tecidos. O Paraquat acelera a senescência natural e escurecimento dos tecidos e, assim, permite C. rosea para esporulam de forma relativamente rápida, muitas vezes dentro de 8 a 9 dias e, assim, facilita a avaliação de estabelecimento de endofíticos do fungo. O cloranfenicol é incluído como um antibiótico antibacteriano de largo espectro.

[0143]Para a amostragem do trigo, as duas folhas foram cortadas a partir de duas plantas de cada um dos 3 vasos de cada tratamento e cortada em segmentos de 10 a 14 mm de comprimento. Um total de 22 a 30 segmentos por tratamento (ou seja, C. roseaúnica; e C. rosea mais C-wet) foram colocados em APC em duas placas de Petri.

[0144]Para a amostragem do milho, todas as folhas de uma muda da Cr somente e tratamentos de CR + C-wet foram cortadas em pedaços de aproximadamente 8 mm de comprimento e posicionadas em PCA em duas placas de Petri.

[0145]As placas de Petri com segmentos foliares banhados foram colocadas em caixas plásticas translúcidas. As tampas das caixas foram fechadas, e todas as caixas foram mantidas em um carrinho de laboratório em 21a 24 ° C em luz interior fraca durante o dia.

[0146]Os segmentos de folhas banhados foram examinados diariamente para a esporulação de C. rosea. Todos os segmentos foram avaliados para a esporulação de Clonostachys no dia 6. A estimativa de esporulação é um meio indireto para estimar os níveis de criação endofíticos de C. rosea nos tecidos vegetais.

[0147]A escala de classificação esporulação: a esporulação observada foi avaliada em uma escala de 0 a 10 em que 0 = sem esporulação, 1 = 1 a 10% da área foliar com esporulação, 2 = 11 a 20% da área foliar com esporulação 10 = 90 a 100% com a esporulação. A escala de classificação aproxima uma % de escala. Tabela 5: Classificação média de esporulação

Tabela 6: Meios de Taxas de esporulação de C. rosea ± erro padrão para mudas de_segmentos de folhas de_trigo_média.

Nota: Os valores no interior da coluna com as diferentes letras maiúsculas Diff significativamente (p <0,05). Os valores dentro da linha com as diferentes letras minúsculas diferem significativamente (P <0,05). Tabela 7: Taxas de esporulação de C. rosea ± erro padrão para os segmentos de folhas de plântulas de milho média.

Nota: Os valores no interior da coluna com as diferentes letras maiúsculas Diff significativamente (p <0,05). Os valores dentro da linha com as diferentes letras minúsculas diferem significativamente (P <0,05).

[0148]Os resultados indicam que o C-molhada aumentada a área de esporulação de C. rosea por 174 a 374% em trigo e por 166 a 263% em milho (Tabelas 6 a 7). Isso indica que C-Wet aumentou a colonização endofítica das folhas por C. rosea por esses valores.

[0149]As taxas de esporulação diminuiram com o aumento do período de exposição aos raios UV e humidade reduzida, principalmente, quando o período excedeu 9 horas, independentemente de se foi utilizado C-molhada. (Note-se que os períodos de incubação de APC de folhas colocadas em placas a 15 h e 24 h após a inoculação foram 15 e 24 h menos do que o total de 6 dias para as amostras 0 h. Os níveis de esporulação, eventualmente, ter aumentado um pouco dado este tempo extra.)

[0150]O declínio nos índices de esporulação quando os períodos de exposição de UV foram aumentados de 9 h a 24 h foi menor quando C-Wet foi usada (para o trigo, 66% declínio sem C-Molhado e 47% com C-Wet. Para o milho, 43% declínio sem C-Molhado e 26% com C-Wet). Isto sugeriu que o C-Wet fornecia alguma proteção dos esporos contra UV ou contra a dessecação ou ambos. Este foi apoiado também pelos crescentes valores de % crescente para os períodos de exposição de 9 a 24 horas (ver Tabela 7).

[0151]Os períodos de exposição de até 6 ou 9 horas não afetaram significativamente as classificações de esporulação em qualquer tratamento. As classificações excepcionalmente elevadas para o trigo tratado molhado C- e milho em exposição a UV 0 h em comparação com 1,5 h de exposição (mas não na ausência de C-molhado) foi talvez relacionadas com a difusão e a subsequente secagem do C- molhado em locais tais como bordas das folhas (C-Wet parecia promover a esporulação nas bordas da folha sem cortes).

[0152]Há alguma possibilidade de fatores que não as variáveis de tratamento poderia potencialmente ter afetado a germinação de esporos e estabelecimento endófito de Clonostachys rosea e, assim, a esporulação do fungo sobre as folhas. Esses fatores, que são típicos da variabilidade biológica e limitações de testes inerentes, incluem a uniformidade da aplicação por pulverização; ângulo e distância de folhas em relação ao pulverizador e lâmpada UV; contato do segmento de folha com o PCA (principalmente bom); outros fungos presentes (os segmentos de folhas chapeados eram quase inteiramente livres de crescimento visível ou esporulação de outros fungos; cerca de 7 a 10 segmentos com esporulação visível e micélio de Penicillium e / ou Fusarium não foram utilizados para estimar esporulação de Clonostachys rosea); e secagem de folhas para diferentes períodos após o tratamento de pulverização e antes do plaqueamento dos segmentos.

Exemplo 9

[0153]As sementes de mistura de soja, trigo, milho e Turf-grass foram inoculadas na queda com e sem C-Wet, como descrito nos exemplos anteriores. As sementes foram então armazenadas em uma garagem ou apenas acima de zero. Um fungicida, Feijão CruiserMaxx®, foi aplicado cerca de Abril em 6,6 ml / kg de sementes (aumento de 10% para a perda de saco).

[0154]Os resultados foram que a incidência de germinação de sementes de trigo, de milho, de soja e que foram tratados com Clonostachys rosea com ou sem C-molhada, ou não tratado, e armazenadas durante o inverno, foi > em 98% em todos os casos. A alta germinação semelhante também foi obtida em todos os casos, quando as sementes de estes tratamentos foram também tratados com o fungicida feijões CruiserMaxx®.

[0155]Os estimados (detectados) valores de incidência de Clonostachys rosea em sementes tratadas que foram armazenadas durante o inverno e não tratadas com Beans CruiserMaxx® foram os seguintes: TRIGO: 40 a 50% MILHO: 100% SOJA: 70 a 80% MISTURA DE GRAMA DE RELVA: > 90% Os Estimados (detectados) valores de incidência de Clonostachys rosea em sementes tratadas que foram armazenadas durante o inverno e tratadas com Beans CruiserMaxx® foram os seguintes: TRIGO: > 90% MILHO: 100% SOJA: 70 a 80%

[0156]A Clonostachys rosea foi marcadamente suprimida por principais "moldes de armazenamento" (Aspergillus e Penicillium) em sementes de milho e sementes de relva-grama (>supressão de 92% no segundo). Paecilomyces, Alternaria e alguns outros fungos.

[0157]A influência de adjuvante de C-wet na colonização de Clonostachys rosea no tratamento das sementes não foi evidente seis meses após a aplicação inicial. Os resultados sugerem que o micélio de estirpes Clonostachys vai atingir um nível óptimo de colonização no interior da semente e essa relação é verdadeiramente simbiótica como não houve alteração na germinação das sementes testadas. A tolerância de fungicida foi excelente como indicado pelo trabalho anterior com micélio estabelecida. A semente Bin de prazo de trigo apresentou melhora de germinação quando tratada com Cruise Maxx.

Exemplo 10

[0158]CruiserMaxx® Beans tratados com sementes de milho foi colocado em madura C. micélio rósea ACM941 (48 horas). A Figura 20 mostra que não houve efeito do fungicida sobre o crescimento do micélio de 4 dias (Figura 20a) e 10 dias (Figura 20B) mais tarde.

[0159]CruiserMaxx® Beans tratados sementes de milho foi colocado em madura C. rosea 88 a 710 de micélio (48 horas). A Figura 21 mostra que não havia pouco, ou nenhum, efeito do fungicida sobre o crescimento do micélio de 4 dias (Figura 21a) e 10 dias (Figura 21b) mais tarde.

[0160]Embora o objeto tenha sido descrito na linguagem específica para as características estruturais e / ou atos metodológicas, é para ser entendido que a matéria definida nas reivindicações anexas não está necessariamente limitada às características específicas ou atos descritos acima.

Exemplo 11

[0161]Os efeitos de C-Wet e CruiserMaxx® Beans sobre Clonostachys, patógenos e moldes foram testados em tratamentos de sementes de Clonostachys de soja, trigo e milho seguindo o armazenamento do inverno.

[0162]As sementes de CR foram inoculadas com 88 a 710 ou com 88 a 710 e C-wet, como mostrado no Exemplo 7. Algumas das sementes foram tratadas com CruiserMaxx® Beans. O fungicida foi aplicado seis meses após a inoculação com 88 a 710. O teste foi realizado seis meses após a data do pedido de CruiserMaxx® Beans. As sementes tratadas foram semeadas em meio de agar Paraquat- cloranfenicol em placas de Petri em (5 placas de Petri, cada uma com 10 sementes de soja e milho, e 5 placas, cada uma com 15 sementes de trigo). Os pratos de Petri e as sementes foram mantidos em caixas de plástico transparente a 21a 26 ° C (principalmente 23 a 25 °C). As sementes foram examinadas microscopicamente para germinação de sementes e para o crescimento de fungos e esporulação após 3 dias de incubação, e depois diariamente até o dia 8, com uma verificação final no dia 10.

[0163]Os tratamentos de sementes são mostrados na Tabela 8:

[0164]Os efeitos dos tratamentos de sementes em germinação de sementes, a presença de fungos de armazenagem (grupo Aspergillus / Penicillium) e moldes com micélio aéreo substancial estão apresentados na Tabela 9. Os moldes foram observados no dia 4.

[0165]Os +Aspergillus e Penicillium foram agrupados e avaliados por densidade sobre as sementes (escala de 0 a 10) e a % de cobertura de sementes a esta densidade. "A a M"é a classificação de micélio aéreo sobre a semente e / ou micélio fofo espalhando-se a partir da semente. "ND" significa que não há resultados foram obtidos porque obscurecido pelo micélio de outros fungos.

[0166]Conforme refletido na Tabela 9, acima, as seguintes observações podem ser feitas dos resultados de germinação:

[0167](i) CruiserMaxx® Beans atrasado e germinação parcialmente bloqueada de soja e trigo, e germinação completamente bloqueada da semente de milho.

[0168](ii) A germinação das sementes de soja tratadas com 88 a 710 + C- WET + CruiserMaxx® Beans era maior e mais rápida do que a germinação de grãos de CruiserMaxx® sozinho. A porcentagem de germinação nos dias 6 e 7 foi cerca de três vezes maior do que com CruiserMaxx® Beans sozinho. Não está claro porque há sementes tratadas com 88 a 710 + CruiserMaxx® Beans germinadas.

[0169](iii) A germinação de sementes de trigo tratadas com CruiserMaxx® Beans ou com 88 a 710 + CruiserMaxx® Beans foi semelhante (no máximo cerca de 40%). No entanto, o tratamento com 88 a 710 + C-Wet + CruiserMaxx® Beans resultou em 77% de germinação. Assim, parece que o C-Wet contraria parcialmente os efeitos de CruiserMaxx® Beans. As raízes que crescem a partir de sementes tratadas com CruiserMaxx® Beans eram geralmente curtas e grossas e tinham considerável crescimento do calo semelhante ao desenvolvido perto das sementes. Estes efeitos de CruiserMaxx® Beans eram muito menos pronunciados na presença de 88 a 710 + C-wet (isto é, 88 a 710 + C-Wet + CruiserMaxx® Beans).

[0170]Conforme refletido na Tabela 9 acima, as observações abaixo podem ser feitas a partir dos resultados do molde. Para avaliação, o crescimento de fungos em sementes foi categorizado como moldes de armazenamento (iisto é, Aspergillus além de Penicillium ou Asp. Peni), que geralmente esporulados perto da superfície da semente, e outros fungos que geralmente produzidas uma grande quantidade de micélio aéreo com ou sem esporos (grupo A a M) (Tabela 9).

[0171](iv) Morfologicamente diversas formas de Aspergillus e Penicillium cresceram e esporularam sobre as sementes de soja. No dia 4, a densidade destes fungos sobre as sementes foi classificada como a luz (02/01). Nessa altura, a percentagem de superfície de sementes com estes fungos foi elevada (perto de 90%) nos controlos não tratados e no tratamento 88 a 710 + C-wet, mas muito mais baixa (20 a 30%) em todos os tratamentos com CruiserMaxx® Beans. Assim, CruiserMaxx® Beans reduziu o crescimento e esporulação destes moldes de armazenamento. A densidade de Aspergillus, mais Penicillium em sementes dos controlos não tratados e tratamento de 88 a 710 + C-wet aumentada durante 5 a 8 dias. Em sementes tratadas com CruiserMaxx® Beans (isoladamente ou em combinações) o crescimento destes e de outros fungos foi geralmente escasso.

[0172](v) Aspergillus e Penicillium foram relativamente escassas (classificação de 10) em sementes de trigo de todos os tratamentos e a percentagem de cobertura das sementes foi baixa especialmente nos CruiserMaxx® Beans e nos tratamentos de 88 a 710 + C-Wet + CruiserMaxx® Beans.

[0173](vi) Aspergillus e Penicillium foram esparsos (classificação 1) sobre a maior parte (90%) da superfície da semente do milho nos tratamentos em que não feijão CruiserMaxx® foi aplicado (ou seja, os controlos e 88 a 10 + C-molhado). As sementes de milho tratadas com Beans CruiserMaxx® foram rapidamente cobertas por micélio aéreo de outros fungos que obscureciam Aspergillus e Penicillium.

[0174](vii) Muitas colónias de fungos em sementes tratadas com CruiserMaxx (isoladamente ou em combinação) mostraram um crescimento anormal, como seria de esperar.

[0175](viii) Fusarium spp. e outros fungos com micélio aéreo cresceram mais de algumas sementes de soja e trigo.

[0176](ix) No caso do milho, Fusarium spp, incluindo F. verticillioides (= F. moniliforme), e outros fungos não identificados com micélio aéreo cresceu rapidamente e em abundância e em torno de sementes tratadas com Beans CruiserMaxx® (isoladamente ou em combinação), nenhum dos quais germinadas. O crescimento aéreo pequeno desenvolvido nos controlos não tratados ou no tratamento 88 a 710 + C-húmido que germinaram bem. Assim, os Beans CruiserMaxx® aparentemente predispostos as sementes para o crescimento de fungos talvez porque inicialmente estressado e, finalmente, matou as sementes.

[0177]Como refletido ainda mais na tabela 9 acima, as seguintes observações podem ser feitas sobre a Clonostachys rosea:

[0178](x) de soja e trigo: esporulação de Clonostachys roseanão foi encontrada em soja ou trigo sementes de qualquer tratamento (dia da avaliação final 10), por razões que não são claras.

[0179](xi) de milho: Clonostachys rosea foi encontrada em sementes inoculadas com 88-710 (isto é, 88a710 + C-wet, 88 a 710 + CruiserMaxx® Beans e 88 a 710 + C-Wet + CruiserMaxx® Beans), mas não sobre as sementes não inoculadas (isto é, os controlos não tratados e feijões CruiserMaxx®). Os valores de percentagem de sementes com Clonostachys rosea não foram obtidos por razões práticas. A Clonostachys rosea foi identificada pela primeira vez no dia 5 e foi mais abundante no dia 8. Como em anteriores conclusões, a Clonostachys rosea exibiu tolerância de feijões CruiserMaxx®, e não pareceu ser morfologicamente afetada pelo fungicida.

[0180](xii) A Clonostachys rosea foi identificada com base na morfologia conidióforo (forma verticillate estava presente) e da forma de feijão tamanho, uniformidade e renal dos esporos. As observações foram feitas com um microscópio estereoscópico, e em um microscópio composto utilizando-se a uma amplificação de 400X. Conidióforos e esporos foram observados diretamente sobre as sementes e envolvente meio de agar. Esporos e conidióforos na forma foram observadas em parte, colocando uma gota de água sobre o agar e cobrindo-o com uma tampa microscópio glass.to evitar o embaciamento da 40 X).

[0181]Como refletido ainda mais na tabela 9 acima, as seguintes observações podem ser feitas sobre a germinação:

[0182](xiii) o fungicida CruiserMaxx® Beans reduziu acentuadamente a % de germinação de soja e trigo e bloqueou a germinação do milho. Estes resultados estão em contraste com outras descobertas em que a germinação não foi reduzida.

[0183](xiv) A percentagem de germinação das sementes de controlo não tratados e sementes tratadas com 88 a 710 + C-Wet (não feijão CruiserMaxx®) se manteve elevada.

[0184](xv) Clonostachys rosea se manteve bem estabelecida na ou sobre a 88 a 710 tratadas com sementes de milho (com ou sem Beans CruiserMaxx®); se houve alguma redução em % de sementes com Clonostachys não foi determinado.

[0185](xvi) Beans CruiserMaxx® germinação da soja reduzida em quando utilizado sozinho, mas em apenas 32%, quando usado em combinação com 88 a 710 e C- molhado (isto é, 88 a 710 + C-Wet + CruiserMaxx®Beans). Assim 88 a 710 + C-Wet melhorou o impacto da Beans CruiserMaxx® embora 88 a 710 não foi recuperado a partir das sementes no momento da avaliação.

[0186](xvii) Da mesma forma CruiserMaxx® Beans reduziu a germinação do trigo em 56%, quando utilizado isoladamente em comparação com 25%, quando usado em combinação com 88 a 710 + C-wet. Mais uma vez, 88 a 710 não foi recuperado a partir das sementes no momento da avaliação.

[0187](xviii) Tomados em perspectiva com os resultados mostrados no Exemplo 9 que mostraram alta incidência de 88 a 710 C. rosea nas sementes, os dados observados em XVII e XVIII sugerem que houve um efeito fisiológico residual de Clonostachys rosea anteriormente na colonização de sementes em que a resistência das sementes a tensão associada com o tratamento dos feijões CruiserMaxx® foi melhorada.

Exemplo 12

[0188]Um experimento foi realizado para determinar a eficácia do tratamento de sementes com Clonostachys rosea 88 a 710 e Clonostachys rosea ACM491, com C-Molhado, na redução da incidência de Fusarium graminearum e concentração de Fusarium Cabeça Blight ("FHB") nas sementes durante o armazenamento à temperatura fria (16 a 18 °C). Tal eficácia poderia potencialmente aumentar o grau de sementes contaminadas.

Os materiais e os métodos foram como se segue:

[0189]Os lotes de sementes compostos de trigo duro com "5,8% FHB inicial" e trigo duro com "FHB inicial de 18,2%", ambos provenientes de Saskatchewan, Canadá.

Os tratamentos de sementes:

[0190]# 1 Controlo de 10 mL de água / Kg de sementes

[0191]# 2 ACM-491 + C-Wet por 1 10 ml de suspensão / semente Kg

[0192]# 3 ACM-491 + C-Wet por 2 suspensão de 10 mL / Kg de sementes

[0193]# 4 Endofine Expresso 10 mL de suspensão / semente Kg

[0194]Ver 1 e Ver 2 foram mais cedo e um pouco as formulações instáveis de C. rosea ACM491 além de um sistema adjuvante. A endorfina expressa é uma formulação em pó de 88 a 710 C. rosea(concentração de esporos de 2 x 106 / mL) mais C- molhado a 5% por peso.

[0195]Oito amostras (isto é, os dois lotes de sementes x os quatro tratamentos; 250 g tratadas sementes de cada) foram tratados com Vers 1/2 e a endorfina expressa como indicado. As sementes de cada tratamento foram plaqueadas em meio de agar paraquat-cloranfenicol em 9 de Março (25 sementes em cada uma das 5 placas de Petri por tratamento, isto é, 125 sementes por tratamento). Antes de chapeamento, pequenas quantidades de sementes (15 a 25) foram escavadas a partir do saco com um mini colher laboratório para minimizar possível viés de seleção sementes afetadas (lápides, enrugado etc) e as sementes que apareceram "boas”. Todas as ferramentas de manipulação de sementes foram esterilizadas com EtOH entre as amostras. As sementes plaqueadas (isto é, placas de Petri em caixas de plástico transparente) foram incubadas a 22 a 24 ° C com um pouco de baixa intensidade de luz artificial e natural a cada dia.

[0196]As sementes foram examinadas em um microscópio estereoscópico em 3 e 4 dias após o plaqueamento, e fotos foram tiradas de placas representativas no dia 5. Depois de examinar as sementes de cada tratamento, foi tomada uma decisão para estimar / contar as quatro variáveis seguintes:

[0197]# 1 Número de sementes com colônias de micélio de Fusarium (estas colônias foram bem desenvolvidos com micélio aéreo; crescimento menor micélio não incluído; identidade confirmada para amostras de cada tratamento, observando a morfologia em um microscópio composto; alguns foram subcultivadas em estreptomicina PDA meio de agar).

[0198]# 2 número de sementes com colônias de micélio que também mostrou pigmento avermelhado (típico de Fusarium) quando visto de baixo das placas.

[0199]# 3 Número de sementes com Penicillium / Aspergillus. Apenas as sementes com colónias óbvias destes foram contados. Dados aproximados. Os valores mudaram muito ao longo do tempo.

[0200]# 4 Número de sementes germinadas.

[0201]Variáveis de 1 a 4 foram avaliadas no dia 4 após o plaqueamento.

[0202]As sementes foram examinadas para C. rosea nos dias 6 e 7. Outros fungos estiveram muito pouco frequentes (incluído Alternaria, e talvez dois fungos mucoraceous) e não foram avaliados numericamente.

[0203]Os resultados são mostrados na Tabela 10.

[0204]Na tabela acima, os valores percentuais para Fusarium são baseados no número total de sementes com colônias de micélio de Fusarium e entre parênteses, os valores de % de colônias que também mostrou pigmento avermelhado (Red P.). Os efeitos do tratamento nas duas primeiras colunas expresso como % dos controlos, por exemplo, para os testes FHB 5,8%, Ver uma diminuição da incidência de colônias de Fusarium 36,4% e as sementes com pigmento vermelho 27,5%.

[0205]Conforme refletido na Tabela acima, as observações abaixo podem ser feitas dos resultados:

[0206](i) versão 1, versão 2 e Endofina expressa para cada Fusarium suprimida nas sementes de trigo (com base nos métodos utilizados para quantificar o agente patogénico).

[0207](ii) Em geral, os resultados para Versão F1 e Endofina Expressa eram muito semelhantes e superiores à Versão 2.

[0208](iii) Os dados indicam que (em comparação com os controlos) Clonostachys rosea ACM941 e 88 a 710 nas três produtos suprimiram a capacidade de Fusarium para (a) crescer a partir das sementes para formar micélio aéreo e (B) ou crescem intensamente sobre perto das sementes de modo a produzir o pigmento vermelho. Estes resultados podem ser interpretados para indicar que as estirpes Clonostachys rosea activamente suprimida Fusarium em / nas sementes durante o armazenamento (isto é, entre o momento em que as sementes foram tratadas e quando plaqueadas em APC), e durante a incubação subsequente de acordo com as condições de humidade sobre a APC.

[0209](iv) As frequências de sementes com pigmento vermelho aumentou durante os dias seguintes as avaliações do dia 4. Isto significa que, presumivelmente, Fusarium continuaram a crescer no ambiente de PCA, mesmo a partir de zonas de colonização semente pelo patógeno que foram muito limitadas no momento do plaqueamento.

[0210](v) Clonostachys rosea suprimida esporulação do grupo Penicillium / Aspergillus (como observado no passado).

[0211](vi) A porcentagem de germinação das sementes nestes lotes de sementes foi variável. O defeito mais as sementes quanto maior fosse a infestação geralmente Fusarium.

[0212]O estabelecimento de Clonostachys rosea nas sementes de trigo foi então avaliado. As sementes de trigo banhados foram examinados para esporulação de Clonostachys rosea no dia 7 após o plaqueamento utilizando um microscópio estereoscópico. A esporulação foi mais facilmente visto em sementes ou partes de sementes com pouco ou nenhum micélio de Fusarium. No entanto, em todos os tratamentos, houve uma variabilidade considerável na incidência e densidade de esporulação Clonostachs nas sementes, com uma densidade variando de muito leve a extremamente denso.

[0213]A esporulação estimada de Clonostachys nas sementes de trigo em 7 dias após o plaqueamento em PCA é mostrado na Tabela 11:

[0214]Conforme refletido na Tabela acima, as observações abaixo podem ser feitas dos resultados:

[0215](i) A esporulação foi muito pesada em algumas sementes, porém esparso sobre os outros. A causa provável é a capacidade diferencial para estabelecer em sementes com diferentes níveis de doença ou senescência.

[0216](ii) Substancialmente menos esporulação foi encontrada nas sementes com 18,2% de FHB em comparação com 5,8% de FHB. A razão não é clara.

Exemplo 13

[0217]Os experimentos foram realizados para determinar a compatibilidade de uma aplicação por pulverização de fungicidas Elevate® (a 50DWG de ingrediente ativo Número fenehexamida (CAS: 126833-17-8), Scala® SC fungicida (pirimetanil: 4,6-dimetil-N-fenil- 2-pirimidinamina), Rovral (Iprodione: 3- [3,5-diclorofenil] -N- [l- metil-etil] -2,4- dioxo-l-imidazolidinecarboxamide), Prosaro (mistura de ingredientes ativos: Protioconazol, 2- [2- (l-clorociclopropilo) -3- (2-clorofenil) -2-hidroxipropil] -l, 2- di-hidro-3H-l, 2, 4, -triazol-3-tiona, 19,0%; e tebuconazol, alfa- [2- (4- clorofenil) etil] - alfa- (l, l-dimetiletil) -lH-l, 2, 4, -triazoIe-l-etanol, 19,0%); e Quadris® (Azoxistrobina: metil (E) -2- {2- [6- (2-cianofenoxi) pirimidin-4- iloxi] fenil} -3-metoxiacrilato de metilo) com aplicações anteriores da EndoFine produtos de biocontrolo e EndoFine expresso. Endofine é C. rosea 88-710 (concentração de esporos de 2 x 106 / mL). Endofine Express é uma formulação em pó de C. rosea 88-710 (concentração de esporos 2 x 106 / mL) mais C-Wet a 5% em peso em peso.

[0218]Foi realizado um teste em condições de vinha. Para cada tratamento foram 3 parcelas replicadas (Fileiras de vinhas).

[0219]As folhas foram amostradas em todas as parcelas, na manhã de 15 de agosto de 2014, dois dias após as aplicações de fungicidas finais (isto é, 8 dias após a Endofine foram aplicados tratamentos). Para cada tratamento, nove folhas foram tiradas ao acaso de cada lado da linha de uva (ou seja, amostras 1 e 2 de cada parcela). Os dois grupos de nove folhas foram colocadas em sacos Ziploc separados em um refrigerador com pacotes de congelador e entregues para análise laboratorial.

[0220]Vinte discos de 15 milímetros de diâmetro foram cortados a partir de cada amostra de 9 folhas (isto é, dois discos de cada folha, mais dois discos adicionais de folhas aleatórios). Os discos foram cortados a partir de sites aleatórios sobre as folhas com uma sonda esterilizada e colocada no PCA em placas de Petri em 16 de agosto e 17 de 2014. Para cada tratamento foram posicionados discos 10 6-9 mm para além de cada um dos dois pratos de Petri para um total de 20 discos por tratamento (fotos tiradas). Um total de 1920 discos foram então plaqueados em placas de Petri de 192. As placas de Petri foram incubadas em caixas de plástico translúcido em baixa luz intensidade em 20 a 22 °C. Os discos foram examinados diariamente quanto a esporulação inicial começando no dia 7 após o plaqueamento. Os discos foram observados em um microscópio estereoscópico com algumas confirmações de identidade feitas com ampliações superiores em um microscópio composto. As observações são como se segue:

[0221](i) Clonostachys rosea esporula principalmente como os tecidos torna- se castanha (ecologicamente é um colonizador pioneiro rápido de senescência e tecidos mortos). Browning entre os discos de folha era um pouco irregular ao longo do tempo por razões tais como:

[0222](A) A diversidade fisiológica natural entre as folhas a partir do qual foram extraídos os discos (algumas folhas foram intensamente verde e levam mais tempo para senesce do que outros que eram verde pálido ou amarelado; deixa variada de espessura e, provavelmente, espessura de cera de superfície).

[0223](B) A taxa de absorção de Paraquat do meio de agar para os discos depende de quão bem os discos têm contato com o meio. O contato foi limitado em alguns discos de "ondulação"natural disco e por veios de uma folha de espessura variável segurando os discos parcialmente acima do agar.

[0224](C) Clonostachys roseaé identificado por reconhecimento de estruturas de rolamento spore- árvores como a de que existem dois tipos ou seja, "conidióforos verticillate" e "conidióforos penicilado". Os "conidióforos verticillate" tendem a aparecer em primeiro lugar e são favorecidos por maior umidade, como gotas de perto escorrendo de tecidos mortos. Os "conidióforos penicilado"são extremamente branca e geralmente fácil de reconhecer, em um microscópio estereoscópico.

[0225](ii) Por causa da senescência um tanto irregular e escurecimento entre os discos de folhas, discos de todos os tratamentos foram avaliados duas vezes por Clonostachys rosea. Na primeira avaliação (9 dias após o plaqueamento) discos observados como positivo para a esporulação foram marcados (nas partes inferiores das placas de Petri). Na segunda avaliação (dia 12) esporulação nos discos marcados foi confirmada e todos os discos adicionais esporulação foram marcados. Os números totais de discos positivos foram registados. Foi tomado cuidado para evitar falsos positivos, como poderiam ser causados pelo crescimento de Clonostachys rosea ao longo do tempo a partir de um disco para outro (reavaliação no dia 12 evitado este). Como bem, conídios de Clonostachys rosea podem ser dispersos por ácaros; estes eram poucos (inicialmente uma por 15 a 20 placas) e foram facilmente localizados e "tirados" com precisão militar com a pinça (bolas de naftalina foram utilizadas nas caixas de plástico com as placas de Petri única após dia 12).

[0226](iii) O crescimento do míldio micélio (Plasmopara) foi freqüente e muitas vezes abundantes nos lados de baixo dos discos foliares; tendem a quebrar- se durante 12 dias de incubação. Como para os outros: Botrytis cinerea (ocasional); Alternaria alternata (comum); Cladosporium (não é comum); Penicillium e Aspergillus (ocasional); Pestalotia (não é comum).

[0227]Os resultados da endorfina estão refletidos nas Tabelas 12 e 13, indicando se Clonostachys esporulado no disco, sem avaliação quantitativa:

Os resultados de endorfina expressa são refletidos nas tabelas 14 e 15:

[0228]Como refletido nas tabelas acima, as seguintes observações podem ser feitas:

[0229](i) 30 a 50% dos discos com esporulação sugere uma excelente cobertura com EndoFine, especialmente tendo em conta que as folhas tiveram uma boa quantidade de variabilidade fisiológica e fatores microclimáticas. Alguns discos classificados como negativo pode ser colonizada levemente tal que Clonostachys rosea ainda surgirão. Taxa de emergência através da epiderme dos centros dos discos é mais lenta do que a partir do corte (isto é, feridos) arestas.

[0230](ii) A média geral (isto é, para todos os tratamentos) para discos% da folha com Clonostachys foi 1,72 vezes maior para Endofine expresso em comparação com EndoFine. Valor para únicos tratamentos EndoFine Expresso / Endofine (isto é, para o dia 1 + 6) é cerca de 1,6 vezes.

[0231](iii) A quantidade de esporulação em discos de folhas tratadas com EndoFine Expresso aparentemente mais elevada, em média, do que para EndoFine, embora não medidas quantitativas foram feitas.

Exemplo 14

[0232]Os experimentos foram conduzidos para determinar os efeitos de um programa de pulverização de EndoFine Expresso sobre a incidência de Clonostachys rosea 88 a 710, fungos e outros microbiota fúngica nas folhas de cereja doce e framboesa, e, particularmente, para determinar o estabelecimento endofíticos de Clonostachys rosea em cerejeira e framboesa folhagem quando aplicado em combinação com efeitos C-molhado (isto é, como a formulação EndoFine Express) em um programa de pulverização, e para determinar o programa de pulverização no desenvolvimento da doença / agente patogénico.

Em cerejas doces, os resultados dos testes foram como se segue:

[0233](i) Observações dos discos de folha em 8 dias após o plaqueamento em PCA mostraram que, com as folhas tratadas com EndoFine Express, C. rosea esporulados em 18 de 32 discos de folha que foram plaqueadas lado adaxial para cima (lado superior para cima) ou 56% do discos. Isto indica que Clonostachvs rósea tinham colonizado, pelo menos, metade da superfície da folha de cereja.

[0234](ii) Áreas de discos (incluindo alguns discos inteiros) com esporulação C. rosea foram quase inteiramente livres de esporulação e crescimento micelial visível de outros fungos. Isso indica que Clonostachys rosea ocupa senescentes tecidos como um colonizador pioneiro e blocos de colonização por outros fungos (incluindo agentes patogénicos).

[0235](iii) Também foi observado que C. rosea estava crescendo em outros fungos incluindo Epicoccum nigrum e sobre picnídios de Coniothyrium. Este foi presumido, mas não comprovada, para ser micoparasitismo / hiperparasitemia.

[0236](iv) A esporulação de C. roseatambém foi encontrada em discos que foram colocados em lado abaxial ou inferior para cima, mas os cabelos da folha, gotas da umidade e exsudato e alguns micélio de outros fungos confundidos em quaisquer contagens de incidência realistas.

[0237](v) A não esporulação de C. rosea foi encontrada em discos de folhas não tratadas.

[0238](vi) Os mesmos tipos de fungos foram encontrados nas folhas tratadas e não tratadas. A % de área foliar coletivamente ocupada por estes fungos foi significativamente menor (cerca de menos de 40 a 50%) nas folhas tratadas por causa de exclusão / exclusão de áreas de ocupação por Clonostachys rosea. Foi impraticável, no entanto, para avaliar as áreas ocupadas por fungos específicos. Com referência aos fungos específicos:

[0239](A) Alternaria alternata. Este foi abundante (como esperado na folha da planta). Algumas cepas são patogênicas para as cerejas (manchas foliares, podridão frutas). Clonostachys rosea parecia estar crescendo em (parasitando) algumas das colónias de Alternaria. C. roseaé conhecido por ser um agente de biocontrole boa contra vários Alternarias.

[0240](B) Cladosporium spp. Novamente, estes são abundantes na folhagem da planta.

[0241](C) Coniothyrium sp. Estes têm sido relatados para causar cancros estaminais e manchas foliares em cerejas. Picnídios com exalando marrom escuro às gotas enegrecidas contendo esporos eram visíveis nos discos de folha usando um microscópio estereoscópico.

[0242](D) Colletotrichum sp. A partir de descrições isso foi Colletotrichum acutatum; este diagnóstico foi baseado na forma fusiforme (afuniladas em ambas as extremidades) forma dos esporos unicelulares. Esta espécie não está listado no cerejas doces em "Fungos sobre as plantas e produtos vegetais nos Estados Unidos", mas é extremamente destrutivo em morangos (antracnose).

[0243](E) Fusarium spp. Em geral, estes produziram principalmente micélio (em cima e os discos de folhas) e esporos.

[0244](F) Epicoccum nigrum foi localizado nos discos e presumivelmente parasitado em algumas áreas por C. rosea. Epicoccum é um colonizador comum no início da senescência folhagem da planta.

[0245](G) Botrytis cinerea. Apenas vestígios foram encontrados.

[0246]Em framboesas, os resultados dos testes observada 9 dias após o plaqueamento em PCA (observações também foram feitas no dia 12, mas os resultados foram essencialmente os mesmos que no dia 9) foram como se segue:

[0247](vii) Clonostachys rosea esporulados em 12 de 34 discos de folhas tratadas com EndoFine, isto é, expresso em 34% dos discos. Dadas as proporções dos discos de folhas com esporulação, este indicou que Clonostachys rosea tinha geralmente estabelecidos como um endófito em cerca de 15 a 25% da área foliar das framboesas. Frequência de esporulação foi sobre o mesmo, independentemente de qual caminho até os discos foram semeadas (isto é, adaxial ou abaxial). A intensidade da esporulação em discos avaliados como positivo foi considerada como sendo menor do que nos discos de cereja.

[0248](viii) Não foram encontrados fungos esporulação em mais de 60% da área da superfície dos discos (9 dias). As bactérias podem ter ocupado os tecidos foliares como eles morreram no meio PCA, mas há colónias de bactérias foram encontradas nos discos. Não foi prático para se estimar a área ocupada por outros fungos diferiam nos discos de framboesas tratados e não tratados. Com referência aos fungos específicos:

[0249](A) Alternaria alternata. Este era relativamente abundante. A. Alternaria pode afetar framboesas colhidas.

[0250](B) Cladosporium sp. Bastante abundante. colonizador precoce.

[0251](C) Pestalotia sp. Isto não é listado como um patógeno de framboesa. Encontrado em discos de folhas tratadas e não tratadas.

Exemplo 15

[0252]Os experimentos foram conduzidos para determinar a tolerância a fungicidas em taxas altas e compatibilidade de uma aplicação por pulverização de Elevate, Scala, Rovral, Prosaro ou Quadris fungicidas com aplicações anteriores dos produtos de biocontrole EndoFine Express (Clonostachys rosea str 88a710) e DONguard {Clonostachys rosea str ACM941) em cereja e framboesa folha, e, particularmente, para determinar a influência de Elevate, Scala, Rovral, Prosaro e Quadris sprays aplicado a cereja e framboesa foliar no desenvolvimento endofíticos e atividade biológica de estirpes de Clonostachys rosea anteriormente aplicadas à folhagem como formulações EndoFine Express e DONguard.

[0253]A contagem de CFU nas duas estirpes eram como se segue: ACM941 foi 2,34 x 108 e 88 a 710 foi de 1,44 x 108. Portanto, a porcentagem de colonização deve ser ajustada para cima, multiplicando a contagem EndoFine Express por 1,5.

[0254]Os resultados são mostrados nas Tabelas 16 a 19: Tabela 16: Discos doces de folha de cereja

Tabela 17: Discos doces de folha de cereja

Tabela 18: Discos de folhas de framboesa e meias bagas

Tabela 19: Discos de folhas de framboesa e meias bagas

As seguintes observações podem ser feitas:

[0255](i) Os discos de cereja doce em placas de 1 a 5 eram a partir de folhas progressivamente mais velhos; os números de placas diferem ligeiramente por causa da disponibilidade de tecido foliar. Bom estabelecimento de Clonostachys rosea em folhas.

[0256](ii) Elevate, Rovral e Escala não parecerem afetar o estabelecimento de Clonostachys rosea (A escala é reforçada?). Esporulação extensa em discos com Elevate.

[0257](iii) Principalmente nenhuma diferença no estabelecimento mais jovem versus as folhas mais velhas (ou seja, como o progresso da chapa 1 para a placa 5) em DONguard mais Elevate, Rovral, ou Escala. A verificação DONguard é baixa em folhas mais jovens, provavelmente como resultado de uma única aplicação 2 dias antes da aplicação fungicida.

[0258](iv) Prosaro e Quadris essencialmente inativados de Clonostachys rosea na sua experiência em particular, onde ambos os lados da folha foram tratados.

[0259](v) Estabelecimento de Clonostachys com EndoFine Express em alguns experimentos foi de cerca de metade para DONguard (Tabela 16) nas folhas tratadas com Elevar, Rovral ou Scala. No entanto, por causa da baixa UFC, Prosaro e Quadris essencialmente inativado Clonostachys rosea em EndoFine expresso.

[0260](vi) Nem DONguard nem EndoFine expresso foram inativados por Elevar (fenehexamida), Scala (pirimetanil) ou Rovral (iprodiona). Os resultados anteriores a taxas mais baixas têm mostrado a tolerância à estrobilurina e química conazole.

[0261]Muitas variações da invenção ocorrerão aos peritos na técnica. Algumas variações incluem formulações líquidas. Outras variações podem ser chamadas de formulações sólidas. Todas estas variações são entendidas como estando dentro do âmbito e espírito da invenção.

[0262]Embora algumas formas de realização sejam apresentadas para incluir certas características ou etapas, a requerente contempla especificamente que qualquer característica ou etapa divulgada no presente documento pode ser utilizada em conjunto ou em combinação com qualquer outra característica ou etapa em qualquer forma de realização da invenção. É também contemplado que qualquer característica ou etapa pode ser especificamente excluída de qualquer forma de realização da invenção.

Claims (6)

1. Método para proteger plantas de patógenos prejudiciais, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de: inocular o lócus de uma planta com Clonostachys rosea; e depois disso tratar o referido lócus com um fungicida químico por pelo menos cerca de 48 horas após a referida inoculação, em que a biomassa da referida Clonostachys rosea é aumentada em comparação com o tratamento do lócus simultaneamente com o referido fungicida químico.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a inoculação compreende uma suspensão líquida compreendida por conídios de Clonostachys rosea em uma quantidade tal que resulta na colonização do lócus com micélio, em que o estado micelial é substancialmente não afetado pela aplicação subsequente de fungicidas químicos.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a inoculação ocorre através de um pó ou pó molhável compreendido por conídios de Clonostachys rosea em uma quantidade tal que resulta na colonização do lócus com micélio, em que o estado micelial é substancialmente não afetado pela aplicação subsequente de fungicidas químicos.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a inoculação compreende a aplicação da referida Clonostachys rosea à folhagem, hastes, flores ou frutos durante o período em que as plantas estão crescendo em uma quantidade tal que resulte na colonização de pelo menos parte do lócus com micélio.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a inoculação compreende uma suspensão de um pó molhável que compreende a Clonostachys rosea e um adjuvante tendo a capacidade de aumentar a velocidade de colonização de Clonostachys rosea, e subsequente colonização da Clonostachys rosea, prevenção da inativação ultravioleta da Clonostachys rosea.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o lócus da planta são sementes, e a germinação das referidas sementes é aumentada em comparação com o tratamento das sementes simultaneamente com um fungicida químico.

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