CN111349587B - 一株防控腐烂茎线虫的蜡样芽孢杆菌hdn-1及其应用 - Google Patents

一株防控腐烂茎线虫的蜡样芽孢杆菌hdn-1及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株防控腐烂茎线虫的蜡样芽孢杆菌HDN‑1，属于微生物农药技术领域。本发明涉及的菌株HDN‑1，已于2019年10月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.18717。室内试验表明，该菌株发酵液原液以及不同稀释梯度下对腐烂茎线虫具有良好的触杀活性。田间试验表明，利用HDN‑1菌株发酵液进行马铃薯种薯拌种处理后，与空白对照相比腐烂茎线虫病的发病率和病情指数显著降低，与化学药剂10％噻唑膦相比无显著差异；同时，马铃薯经蜡样芽孢杆菌HDN‑1发酵液拌种处理后，产量均显著高于药剂对照和空白对照。

Description

一株防控腐烂茎线虫的蜡样芽孢杆菌HDN-1及其应用
技术领域：
本发明属于微生物农药技术领域，具体涉及一株防控腐烂茎线虫的蜡样芽孢杆菌HDN-1及其应用。
背景技术：
腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)属于迁移性植物内寄生线虫，被列为重要的检疫性有害生物。据报道，该线虫寄主范围较广，已报道的寄主植物超过120种，主要为害马铃薯和甘薯，其他常见寄主包括鸢尾、郁金香、大菖蒲、甜菜、三叶草、大丽菊、人参、胡萝卜、花生、向日葵、大豆、番茄、烟草、甘蔗等多种野生植物及栽培植物。资料显示，腐烂茎线虫病在北京、天津、山东、河北、河南、江苏、新疆、甘肃等地均有发生，一般可造成甘薯和马铃薯减产30％～50％，严重时可减产80％以上，甚至绝收，严重威胁马铃薯和甘薯等相关产业的发展。由于腐烂茎线虫抗逆性强且寄主范围极广，可在土壤、病残体中长期存活，对于该病害的防控极其困难，效果甚微。目前，生产上多使用化学方法防治植物线虫病害，但大多数化学杀线剂严重污染环境，破坏生态平衡，促使人们将目光转向生物防治。未来对于腐烂茎线虫病的防治，应在加强植物检疫的基础上，积极探索并应用生物防治技术。
微生物是植物线虫病害的重要生防因子，多项研究表明，芽孢杆菌可用于根结线虫病等多种线虫病害的防治。已有报道苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)和巨大芽孢杆菌(B.megaterium)对腐烂茎线虫具有较强的抑制活性和毒杀作用。因此，有必要针对腐烂茎线虫进一步筛选高活性的生防因子，加快微生物杀线剂的研发与应用，对于该病害的有效防控意义重大。
发明内容：
本发明针对腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)筛选生防因子，将微生物菌株进行常规液体发酵后，利用发酵液处理线虫，以评价其触杀效果。
本发明筛选获得的菌株HDN-1，利用16S rDNA序列进行分子鉴定，鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)。该菌株的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏日期：2019年10月22日；保藏登记入册的编号：CGMCC No.18717。
本发明的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)HDN-1在室内试验中显示出对腐烂茎线虫具有良好的触杀效果，田间试验表明该菌株对腐烂茎线虫病有显著的防治效果。
本发明的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)HDN-1菌剂可以在马铃薯播种时拌种使用。
本发明的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)HDN-1菌剂是通过菌株平板活化后，经液体发酵制备，其具体方法如下：
1.平板活化
培养基配方为Luria-Bertani培养基(LB)：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL。菌株接种于LB平板上，培养2d～3d。
2.液体发酵培养
其中液体发酵培养基配方为：以重量百分比计，胰蛋白胨1％～2％，酵母提取物0.5％～0.6％，NaCl 0.5％～0.6％，余下为蒸馏水，pH为6.8～7.0。
将菌种接种到250mL三角瓶(每瓶装100mL)液体培养基中，25℃～28℃下，摇床转速以150r·min-1～180r·min-1、发酵2d～3d。
具体实施方式：
为了更详细地进一步阐明而不是为了限制本发明，给出了下列实施例。
实施例1：蜡样芽孢杆菌HDN-1的活化及发酵
首先将蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)HDN-1菌株进行平板活化，培养基配方为Luria-Bertani培养基(LB)：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，琼脂20g，蒸馏水1000mL；菌株接种于LB平板上，培养2d。
再将菌种接种到250mL三角瓶(每瓶装100mL)液体培养基中，其中液体发酵培养基配方为：以重量百分比计，胰蛋白胨1％～2％，酵母提取物0.5％～0.6％，NaCl 0.5％～0.6％，余下为蒸馏水，pH为6.8～7.0；发酵温度为25℃～28℃，摇床转速150r·min-1～180r·min-1、发酵时间2d～3d。
实施例2：蜡样芽孢杆菌HDN-1的分子生物学鉴定
1.菌株的培养
按前述的平板活化和液体发酵方法培养蜡样芽孢杆菌HDN-1，备用。
2.形态学鉴定
菌株HDN-1在LB固体培养基上，25℃培养24h后，菌落呈圆形，乳白色，表面粗糙，似毛玻璃或蜡状。菌落细胞呈直杆状，单细胞大小一般为12.0～13.0μm×2.0～3.0μm，常以成对或链状排列，革兰氏染色呈阳性，兼性厌氧，产芽孢，顶生，稀少周生鞭毛。根据形态观察，查看常见《细菌系统鉴定手册》可知，菌株HDN-1与蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)相符。
3.分子生物学鉴定
采用CTAB法提取细菌基因组DNA，利用16S通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACG-ACTT-3’)对菌株16S rDNA片段进行PCR扩增。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测合格后，送到上海生工有限公司进行测序，获得序列经NCBI在线BLAST分析，并结合形态学特征鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)。
实施例3：蜡样芽孢杆菌HDN-1发酵液对腐烂茎线虫的室内触杀活性测定
1.发酵液的制备
按前述液体发酵培养方法制备蜡样芽孢杆菌HDN-1的发酵液，备用。
2.供试线虫悬液的制备
采用改良的贝曼漏斗法从甘薯或马铃薯薯块中分离腐烂茎线虫，用吸管将分离到的线虫转移至10mL离心管中，加入35％的蔗糖溶液后3500r/min离心2min；取表层线虫悬浮液，转移至无菌水中，4000r/min离心5min；弃上清液，用0.5％的次氯酸钠消毒1min后，4000r/min离心5min；弃上清液，加入0.5％硫酸链霉素和0.5％青霉素的混合液中消毒6min，离心后去除消毒液，用无菌水冲洗3遍后4℃保存备用。
3.室内触杀试验设计
将蜡样芽孢杆菌HDN-1的发酵液6000r/min离心5min，取上清液。用无菌水将发酵液依次稀释2、6、10、20倍和发酵原液共5个浓度梯度。用移液枪在12孔细胞培养板中分别加入各个浓度的发酵液1.5mL，再将腐烂茎线虫约50条注入细胞培养板。每个处理3次重复，以无菌水为对照。最后放入聚乙烯袋中，用橡皮筋固定，放入25℃培养箱中，24h、48h、72h后记录线虫死亡数。
4.触杀效果评价
线虫死亡率(％)＝(死亡线虫数/供试线虫总数)×100
线虫校正死亡率(％)＝(处理组线虫死亡率-对照组线虫死亡率)/(100-对照组线虫死亡率)×100
5.试验结果
试验结果表明：HDN-1发酵液原液处理24h、48h、72h后，腐烂茎线虫校正死亡率分别达到41.90％、66.41％、78.44％；稀释2倍液处理24h、48h、72h后，腐烂茎线虫校正死亡率分别达到36.52％、58.87％、75.65％；稀释6倍液处理24h、48h、72h后，校正死亡率分别达到27.75％、56.71％、74.17％；稀释10倍液处理24h、48h、72h后，校正死亡率分别达到25.19％、32.37％、39.39％；稀释20倍液处理24h、48h、72h后，校正死亡率分别达到14.59％、24.50％、31.37％。
表1 蜡样芽孢杆菌HDN-1对腐烂茎线虫的触杀活性
Figure BSA0000206821490000041
实施例4：蜡样芽孢杆菌HDN-1防治腐烂茎线虫病的田间试验
1.发酵液的制备
按前述液体发酵方法制备蜡样芽孢杆菌HDN-1的发酵液，备用。
2.试验用种子与化学效剂
马铃薯品种：费乌瑞它，由内蒙古赛丰种业有限公司提供。
化学药剂：10％噻唑膦(福气多)颗粒剂，日本石原产业株式会社。
3.腐烂茎线虫病分级标准及病情指数的计算
腐烂茎线虫病分级标准参照表2；
发病率＝(发病薯块总数/调查薯块总数数)×100％；
病情指数＝[∑(各级病薯块数×相对级代表数值)/(调查总株数×4)]×100。
4.田间试验设计
在田间自然发病土中种植马铃薯，试验地为重茬马铃薯田。田间试验设置3个处理(对照)，4次重复，共12个小区，完全随机区组排列。每个小区种植四垄，垄宽1m，小区面积12m2(3m×1m×4m)，每垄约12株，株距25cm，每个小区共约50株，试验区外围设置1m～2m宽的保护行。以HDN-1发酵液拌种作为处理，分别设置10％噻唑膦(福气多)药剂1∶100的药种比拌种对照及空白对照(未拌种)，待马铃薯收获后，每个小区随机取30个马铃薯块茎进行调查，计算出发病率和病情指数。产量调查方法：收获期，各小区选取面积为1.44m2对马铃薯进行测产，并折合公顷产量。
表2 腐烂茎线虫病分级标准*
Figure BSA0000206821490000051
注：*参考段玉玺、吴刚等
5.试验结果
结果表明，与空白对照相比，马铃薯种薯经蜡样芽孢杆菌HDN-1发酵液拌种后，腐烂茎线虫病的发病率和病情指数显著降低，产量显著提高；处理组平均发病率和病情指数分别为17.49％和6.39(空白对照为92.50％和28.73)，防效达到77.76％；化学药剂对照(10％噻唑膦)腐烂茎线虫病的发病率和病情指数分别为17.85％和4.46，与菌剂拌种处理无显著差异，但均显著低于空白对照，防效达到84.48％。此外，经蜡样芽孢杆菌HDN-1发酵液拌种处理后，产量均显著高于药剂对照和空白对照，分别提高了13.97％和26.23％。
与化学农药相比，生物防治具有低毒、环保、无残留，不产生抗药性等优点。本研究发现马铃薯种薯经蜡样芽孢杆菌HDN-1发酵液拌种处理后，防治效果与常用药剂福气多(10％噻唑膦)相当，且具有显著的增产效果。因此，生产上可以推荐使用蜡样芽孢杆菌HDN-1防治马铃薯腐烂茎线虫病，以替代化学药剂福气多(10％噻唑膦)。
表3 蜡样芽孢杆菌HDN-1对腐烂茎线虫的田间防治效果
Figure BSA0000206821490000052

Claims (4)

1.一株防控腐烂茎线虫和提高马铃薯产量的蜡样芽孢杆菌HDN-1，其特征在于：该菌株为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，已于2019年10月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.18717。
2.权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌HDN-1制备的生防菌剂。
3.权利要求2中所述的生防菌剂的制备方法：其特征在于，1)将蜡样芽孢杆菌HDN-1菌株接种于LB平板上，培养2d；培养基配方：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL；2)将菌种转接到250mL三角瓶中，每瓶装100mL液体培养基，25℃～28℃下，摇床转速以150r·min-1～180r·min-1液体发酵培养2d～3d；液体发酵培养基配方为：胰蛋白胨1％～2％，酵母提取物0.5％～0.6％，NaCl 0.5％～0.6％，余下为蒸馏水，pH为6.8～7.0。
4.权利要求2所述的生防菌剂在防治马铃薯腐烂茎线虫病和提高马铃薯产量中的应用。
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