CN103695362B - 一株抗Bt小菜蛾有活性的苏云金芽孢杆菌HLJ-66及其应用 - Google Patents
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Abstract
一株抗Bt小菜蛾有活性的苏云金芽孢杆菌HLJ-66及其应用。本发明菌株为苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）HLJ-66，简称HLJ-66，保藏号：CGMCCNo.8445，保藏日期为2013年11月08日，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号。所述菌株经毒力生物测定筛选对抗Cry1Ac杀虫晶体蛋白及Btk小菜蛾有毒力的菌株。利用该菌株生产高效、广谱的杀虫剂，用于防治鳞翅目重要害虫小菜蛾，同时对抗性害虫具有很好的效果，有利于田间抗性小菜蛾的防治，提高了应用价值，且对人、畜及其他动物无害，对环境无污染，具有良好生态效益，及极佳的应用推广前景。
Description
技术领域
本发明涉及一株对抗Btk小菜蛾有活性的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）HLJ-66菌株，以及在制备杀虫剂中的应用。
背景技术
苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt），是土壤中的一种能够产生芽孢的需氧型革兰氏阳性细菌。1901年Ishiwate等首次从患病的家蚕(Bombyx morl)幼虫当中分离出一种能够在其芽孢的形成阶段，产生晶体蛋白的细菌，1915年Berliner等在地中海粉螟(Epetia kuhniella)中也成功分离出这种细菌，同时将其命名作苏云金芽孢杆菌-Bt.thuringiensis。苏云金芽孢杆菌在其芽孢的形成过程当中，能够产生一种杀虫晶体毒素蛋白(Insecticidal Crystal Proteins，δ-内毒素)，这种晶体蛋白对鳞翅目(Lepidoptera)昆虫、同翅目(Homoptera)昆虫、鞘翅目(Coleoptera)昆虫、双翅目(Diptera)昆虫、膜翅目(Hymenoptera)昆虫、直翅目(Orthoptera)昆虫等多个目的昆虫，同时包括对原生动物、螨类以及线虫等都具有特异性地杀虫活性，由于这种晶体蛋白对害虫高效、对非靶标生物安全以及对环境友好，因此在整个世界范围内得到了广泛的应用。该菌菌剂作为喷洒型杀虫剂主要成分的使用时间已经超过50年，是目前世界上用途最广、产量最大的微生物杀虫剂，占微生物杀虫剂总量的90%-95%。
苏云金芽孢杆菌的不同杀虫毒素由不同种类的cry基因控制，各种cry基因已经被成功克隆，并根据不同需要，利用转基因技术转入到不同作物中，用于害虫等有害生物的防治。自1996年转Btcry基因作物的种植开始，转Bt基因作物在世界范围内被广泛种植，种植面积逐年增长。据2008年的统计显示，转Bt基因作物的种植面积已增长至4,600万公顷。
但随着其长期使用及转Bt作物的迅速推广，害虫对Bt毒素的抗性已成为不容忽视的问题。随着Bt毒素的大量长期使用以及转Bt作物的广泛种植，昆虫长期处于选择压之下，从而导致了昆虫都Bt的抗性发展。通过室内筛选，发现许多昆虫对Bt毒素产生了抗性，例如印度谷螟Plodia interpunctella、烟蚜夜蛾Heliothis virescens、小菜蛾Plutella xylostella、甜菜夜蛾Spodoptera exigua、欧洲玉米螟Ostrinia nubilalis、棉红铃虫Pectinophora gossypiella、棉铃虫Helicoverpa armigera。1990年，Tabashnik等报道田间小菜蛾对Bt制剂产生了抗性，这是第一例关于害虫在田间对Bt制剂产生抗性的报道；Janmaat等于2003年报道，加拿大不列颠哥伦比亚商业化大棚里的粉纹夜蛾对Bt制剂Dipel和Abbott产生了抗性。Tabashnik等于1989年检测到田间种群对Bt制剂（kurstaki亚种）产生了25倍的抗药性，首次报道了田间小菜蛾对Bt杀虫剂产生了抗药性。Tang等测定弗罗里达州田间小菜蛾对Bt制剂（BtKNRD12）的抗药性大于1500倍。Wright等报道马来西亚田间小菜蛾种群在室内筛选饲养7代后对BtA和BtK制剂的抗药性分别为330倍和160倍。此外，日本、中美洲、墨西哥和印度等国家和地区也有抗Bt小菜蛾的报道。2000年Zhao等报道从美国南卡罗尼那州田间采集的对Cry1C有31倍抗性的小菜蛾抗性品系，在实验室先用Cry1C原毒素继续汰选，然后用表达高剂量的Cry1C毒素的转基因花椰菜汰选，26代后，该品系对Cry1C毒素抗性高达63100倍（2龄幼虫）。国内，冯夏等报道深圳、东莞地区等供港菜区小菜蛾对Bt的抗药性为17.2-30.2倍。李建洪等通过对深圳、东莞和广州菜区的田间小菜蛾种群检测，发现小菜蛾对苏云金芽孢杆菌标准品Cs3ab-1991的抗药性倍数分别为8.9、6.5、2.1倍。周程爱等报道长沙地区的小菜蛾对Bt的抗药性由1997-1999年的敏感性由1.1-4.1倍发展到2000年的6.2倍的低水平抗药性。余德亿等报道福建地区田间种群的小菜蛾对湖北Bt和福建Bt的抗药性分别由1997年的2.1倍和3.1倍上升到1999年的8.2倍和10.1倍。郭世俭等报道浙江省杭州、萧山、金华、温州四地的小菜蛾对Bt制剂还没有产生抗药性。王崇利等报道广东惠州田间小菜蛾种群对Cry1Ab和Cry1Ac的抗性达到了高抗水平；对Btk制剂的抗性达到了中抗水平；对Cry1Aa和Cry2Aa具有低水平抗性；福建福州、浙江杭州和江苏南京田间小菜蛾种群对Cry1Ab、Cry1Ac具有低至中等水平抗性（8-28倍），对Btk制剂具有低水平抗性（3.5-7倍）。
以上可以看出，小菜蛾对Bt产生的抗性问题已经十分突出，因此筛选到对抗Bt小菜蛾高活性的菌株，用于防治抗Bt害虫已迫在眉睫。
发明内容
本发明目的在于提供一株抗Bt小菜蛾有活性的苏云金芽孢杆菌HLJ-66及其应用，该菌株对鳞翅目害虫、抗Btk鳞翅目害虫及抗Cry1Ac杀虫晶体蛋白鳞翅目害虫具有毒杀作用，利用该菌株能开发一种广谱、高效且对抗Bt害虫有效的Bt杀虫剂。
本发明的一株抗Bt小菜蛾有活性的苏云金芽孢杆菌HLJ-66，它为苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）HLJ-66，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2013年11月08日，保藏号为CGMCCNo.8445。
本发明的一株抗Bt小菜蛾有活性的苏云金芽孢杆菌HLJ-66是作为制备防治鳞翅目及抗Bt鳞翅目害虫的杀虫剂中的应用。
本发明的一种防治鳞翅目及抗Bt鳞翅目害虫的杀虫剂，包含上面所述的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）HLJ-66。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明选择了鳞翅目主要害虫（小菜蛾）为靶标昆虫，同时汰选得到了对Bt（Kurstaki亚种）粉剂具有高抗的抗Btk小菜蛾种群和对Cry1Ac杀虫晶体蛋白具有高抗的抗Cry1Ac杀虫晶体蛋白小菜蛾种群，作为靶标昆虫，苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）HLJ-66同时对上述鳞翅目主要害虫敏感及抗Btk及Cry1Ac杀虫晶体蛋白害虫，均具有较强的毒杀作用。利用该菌株生产高效、广谱的杀虫剂，用于防止鳞翅目重要害虫小菜蛾，同时对抗性害虫具有很好的效果，有利于田间抗性小菜蛾的防治，提高了经济价值，且对人、畜及其他动物无害，不污染环境，具有良好经济、生态效益，具有良好的应用推广前景。由于Bt粉剂及转Bt基因作物的广泛种植，小菜蛾对Bt抗性严重，对抗Bt小菜蛾有效的Bt杀虫剂产品鲜为报道，而采用本发明得到的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）HLJ-66却能很好的解决这一问题。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式的一株抗Bt小菜蛾有活性的苏云金芽孢杆菌HLJ-66，它为苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）HLJ-66，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2013年11月08日，保藏号为CGMCCNo.8445。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：
从土壤中分离的一株苏云金芽孢杆菌。用发酵培养基进行发酵，培养至伴孢晶体脱落。对相对敏感小菜蛾、抗Btk小菜蛾及抗Cry1Ac杀虫晶体蛋白小菜蛾黄粉虫进行生物测定，对上述供试害虫均具有较强杀虫作用。对菌株进行形态学、生理生化特征分析，分析菌株所含的杀虫晶体蛋白基因类型。其命名为苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）HLJ-66。该菌株保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏日期为：2013年11月08日，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号：CGMCCNo.8445。
本实施方式的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）HLJ-66获得步骤，具体步骤如下：
1、取黑龙江土样1g加入100mL无菌水中，30℃振荡培养30min，在75-80℃水浴中热处理14-20min，得培养液；
2、将培养液稀释到100倍浓度，均匀涂布于分离培养基平板上，置于28-30℃恒温培养箱中培养；其中，所述的分离培养基由牛肉膏3g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、15～20g琼脂和水1000mL混合后，调pH值至7.0，即得分离培养基；
3、培养3-4d后，挑选培养特征类似苏云金杆菌的菌株涂片，用石碳酸复红染色镜检，观察有无芽孢和伴孢晶体；
4、将产生芽孢和伴孢晶体的菌株检出纯化后，接种于发酵培养基中进行摇瓶发酵，至伴孢晶体脱落；其中，所述的发酵培养基由蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl10g和水1000mL混合而成，调pH值至7.0，即得发酵培养基；
5、取5mL上一步的发酵液与50μL含量为5%的Triton100混合均匀（Triton100终浓度为0.05%），采用浸叶法对相对敏感小菜蛾、抗Bt小菜蛾、抗Cry1Ac杀虫晶体蛋白小菜蛾及黄粉虫进行室内毒力测定；
其中，毒力测试的具体方法如下：选老嫩适中的甘蓝叶片洗净晾干，剪成直径2cm大小，放入药液（含Triton100终浓度为0.05%）中，浸泡10s晾干，放入铺有湿润滤纸的平皿中。以无菌水混合Triton100（Triton100终浓度为0.05%）浸泡叶片作为对照。选取2-3龄小菜蛾幼虫，每个处理10头，设4个重复，置于温度25℃、相对湿度65%-70%、光照比L：D=16:8的条件下饲养，3d后观察小菜蛾幼虫死亡情况，5d后观察黄粉虫幼虫死亡情况，计算死亡率；
6、对上述筛选得到的菌株进行形态学描述；
7、对上述筛选得到的菌株进行生理生化特征分析研究；
8、对上述筛选得到的菌株进行所含杀虫晶体蛋白基因类型鉴定。
通过上述方法鉴定出苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）HLJ-66具有以下性质：
根据上述实施方法，得到一株对鳞翅目害虫、抗Bt鳞翅目害虫、抗Cry1Ac杀虫晶体蛋白鳞翅目害虫及鞘翅目害虫具有毒杀作用的苏云金芽孢杆菌菌株，命名为BacillusthuringiensisHLJ-66，该菌株于2013年11月08日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号：CGMCCNo.8445。
1、苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）HLJ-66的杀虫活性：该菌株在发酵培养基中培养至伴孢晶体脱落，对鳞翅目害虫小菜蛾（Plutella xylostalla）相对敏感种群的致死中浓度（LC50）为4.41mg/L，对鳞翅目害虫小菜蛾抗Bkt种群的致死中浓度（LC50）为5.29mg/L，对鳞翅目害虫小菜蛾抗Cry1Ac杀虫晶体蛋白种群的致死中浓度（LC50）为6.21mg/L，显示出较强毒杀作用。
2、苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）HLJ-66的形态特征：菌落均呈白色圆形、扁平，表面干燥无光泽，边缘缺刻；在普通LB平板上能生长，为好氧菌；细胞杆状，有鞭毛，革兰氏染色为阳性，且一个营养细胞只有一个芽孢，芽孢为中生、次端生或端生，孢子囊不膨大，有晶体存在。
3、苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）HLJ-66的生理生化特性：
4、苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）HLJ-66的携带的杀虫晶体蛋白基因有cry1Ac、cry2Ab和cry7,8，以及外毒素cyt基因。
本实施方式选择了鳞翅目主要害虫（小菜蛾）为靶标昆虫，同时汰选得到了对Bt（Kurstaki亚种）粉剂具有高抗的抗Btk小菜蛾种群和对Cry1Ac杀虫晶体蛋白具有高抗的抗Cry1Ac杀虫晶体蛋白小菜蛾种群，作为靶标昆虫，苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）HLJ-66同时对上述鳞翅目主要害虫敏感及抗Btk及Cry1Ac杀虫晶体蛋白害虫，均具有较强的毒杀作用。利用该菌株生产高效、广谱的杀虫剂，用于防止鳞翅目重要害虫小菜蛾，同时对抗性害虫具有很好的效果，有利于田间抗性小菜蛾的防治，提高了经济价值，且对人、畜及其他动物无害，不污染环境，具有良好经济、生态效益，具有良好的应用推广前景。由于Bt粉剂及转Bt基因作物的广泛种植，小菜蛾对Bt抗性严重，对抗Bt小菜蛾有效的Bt杀虫剂产品鲜为报道，而采用本实施方式得到的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）HLJ-66却能很好的解决这一问题。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）HLJ-66，携带的杀虫晶体蛋白基因有cry1Ac、cry2Ab和cry7,8，以及外毒素cyt基因。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：所述的抗Bt小菜蛾有活性的苏云金芽孢杆菌HLJ-66是一株对鳞翅目害虫、抗Btk鳞翅目害虫、抗Cry1Ac杀虫晶体蛋白鳞翅目害虫及鞘翅目害虫具有高毒力的苏云金芽孢杆菌。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式的一株抗Bt小菜蛾有活性的苏云金芽孢杆菌HLJ-66的应用，是作为制备防治鳞翅目及抗Bt鳞翅目害虫的杀虫剂中的应用。
本实施方式选择了鳞翅目主要害虫（小菜蛾）为靶标昆虫，同时汰选得到了对Bt（Kurstaki亚种）粉剂具有高抗的抗Btk小菜蛾种群和对Cry1Ac杀虫晶体蛋白具有高抗的抗Cry1Ac杀虫晶体蛋白小菜蛾种群，作为靶标昆虫，苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）HLJ-66同时对上述鳞翅目主要害虫敏感及抗Btk及Cry1Ac杀虫晶体蛋白害虫，均具有较强的毒杀作用。利用该菌株生产高效、广谱的杀虫剂，用于防止鳞翅目重要害虫小菜蛾，同时对抗性害虫具有很好的效果，有利于田间抗性小菜蛾的防治，提高了经济价值，且对人、畜及其他动物无害，不污染环境，具有良好经济、生态效益，具有良好的应用推广前景。由于Bt粉剂及转Bt基因作物的广泛种植，小菜蛾对Bt抗性严重，对抗Bt小菜蛾有效的Bt杀虫剂产品鲜为报道，而采用本实施方式得到的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）HLJ-66却能很好的解决这一问题。
具体实施方式五：本实施方式的一种防治鳞翅目及抗Bt鳞翅目害虫的杀虫剂，包含具体实施方式一所述的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）HLJ-66。
下面通过具体实施例的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。
实施例1菌株分离与培养
1、取黑龙江土样1g加入100mL无菌水中，30℃振荡培养30min，在75-80℃水浴中热处理14-20min，得培养液；
2、将培养液稀释到100倍浓度，均匀涂布于分离培养基平板上，置于28-30℃恒温培养箱中培养；其中，所述的分离培养基由牛肉膏3g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、15～20g琼脂和水1000mL混合后，调pH值至7.0，即得分离培养基；
3、培养3-4d后，挑选培养特征类似苏云金杆菌的菌株涂片，用石碳酸复红染色镜检，观察有无芽孢和伴孢晶体；
4、将产生芽孢和伴孢晶体的菌株检出纯化后，接种于发酵培养基中进行摇瓶发酵，至伴孢晶体脱落；其中，所述的发酵培养基由蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl10g和水1000mL混合而成，调pH值至7.0，即得发酵培养基；
5、取5mL上一步的发酵液与50μL含量为5%的Triton100混合均匀（Triton100终浓度为0.05%），采用浸叶法对相对敏感小菜蛾、抗Bt小菜蛾、抗Cry1Ac杀虫晶体蛋白小菜蛾及黄粉虫进行室内毒力测定；
其中，毒力测试的具体方法如下：选老嫩适中的甘蓝叶片洗净晾干，剪成直径2cm大小，放入药液（含Triton100终浓度为0.05%）中，浸泡10s晾干，放入铺有湿润滤纸的平皿中。以无菌水混合Triton100（Triton100终浓度为0.05%）浸泡叶片作为对照。选取2-3龄小菜蛾幼虫，每个处理10头，设4个重复，置于温度25℃、相对湿度65%-70%、光照比L：D=16:8的条件下饲养，3d后观察小菜蛾幼虫死亡情况，5d后观察黄粉虫幼虫死亡情况，计算死亡率；
6、对上述筛选得到的菌株进行形态学描述；
7、对上述筛选得到的菌株进行生理生化特征分析研究；
8、对上述筛选得到的菌株进行所含杀虫晶体蛋白基因类型鉴定。
通过上述方法鉴定出苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）HLJ-66。
实施例2菌株Bt.HLJ-66对敏感小菜蛾的生物测定
一、供试昆虫：
小菜蛾相对敏感种群：在室内用干净无虫的萝卜苗和甘蓝苗饲养，期间从未施用过任何杀虫剂。小菜蛾种群在室内进行隔离饲养，将蛹放入成虫饲养笼中（R=10cm，L=40cm），饲养笼四周以80目的纱网包围，成虫羽化后，笼内挂浸过10%蜂蜜糖水的脱脂棉球一个，为成虫补充营养，让其在甘蓝苗上产卵，卵孵化后再转入新鲜的甘蓝苗上饲养。饲养温度是25±1℃，相对湿度为60%-70%，光周期为光照：黑暗=16h：8h。
二、菌株活性测定
挑实施例1培养鉴定后的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）HLJ-66的单菌落接种于发酵培养基中，在30℃恒温摇床上200rpm培养3-4d。离心收集孢晶混合物，洗涤后真空抽干，得到干粉混合物。称取孢晶混合物，加入定量无菌水配成500mg/L的溶液或悬浮液，置4℃备用。
取1mL孢晶混合液与10μl含量为5%的Triton100混合均匀（Triton100终浓度为0.05%），选老嫩适中的甘蓝叶片洗净晾干，剪成直径2cm大小，放入孢晶悬液（含Triton100终浓度为0.05%）中，浸泡10s晾干，放入铺有湿润滤纸的平皿中。以无菌水混合Triton100（Triton100终浓度为0.05%）浸泡叶片作为对照。选取3龄小菜蛾幼虫，每个处理10头，设3个重复，25℃下饲养3d。记录幼虫死亡情况，计算死亡率和校正死亡率。
三、LC50测定
通过预试验测定小菜蛾在90%和10%死亡率的孢晶混合物的浓度，在其范围内设计5-7个浓度梯度，每个浓度4个重复，每重复10头3龄幼虫，25℃饲养3d，记录幼虫死亡情况，利用POLO软件计算菌株的LC50值。
四、结果
经过测定，苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）HLJ-66对鳞翅目害虫小菜蛾（Plutellaxylostalla）敏感种群的致死中浓度（LC50）为4.41mg/L。
实施例3苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）HLJ-66对抗Btk小菜蛾的生物测定
一、供试昆虫：
小菜蛾抗Bt种群：采自上海田间，在室内进行隔离饲养，将蛹放入成虫饲养笼中（R=10cm，L=40cm），饲养笼四周以80目的纱网包围，成虫羽化后，笼内挂浸过10%蜂蜜糖水的脱脂棉球一个，为成虫补充营养，让其在甘蓝苗上产卵，卵孵化后再转入新鲜的甘蓝苗上饲养。饲养温度是25±1℃，相对湿度为60%-70%，光周期为光照：黑暗=16h：8h。利用Bt（Kurstaki亚种）制剂进行抗性选育。对Bt粉剂已有近千倍抗性。
二、菌株活性测定
挑实施例1培养鉴定后的苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis）HLJ-66的单菌落接种于发酵培养基中，在30℃恒温摇床上200rpm培养3-4d。离心收集孢晶混合物，洗涤后真空抽干，得到干粉混合物。称取孢晶混合物，加入定量无菌水配成500mg/L的溶液或悬浮液，置4℃备用。
取1mL孢晶混合液与10μl5%的Triton100混合均匀（Triton100终浓度为0.05%），选老嫩适中的甘蓝叶片洗净晾干，剪成直径2cm大小，放入孢晶悬液（含Triton100终浓度为0.05%）中，浸泡10s晾干，放入铺有湿润滤纸的平皿中。以无菌水混合Triton100（Triton100终浓度为0.05%）浸泡叶片作为对照。选取3龄小菜蛾幼虫，每个处理10头，设3个重复，25℃下饲养3d。记录幼虫死亡情况，计算死亡率和校正死亡率。
三、LC50测定
通过预试验测定小菜蛾在90%和10%死亡率的孢晶混合物的浓度，在其范围内设计5-7个浓度梯度，每个浓度4个重复，每重复10头3龄幼虫，25℃饲养3d，记录幼虫死亡情况，利用POLO软件计算菌株的LC50。
四、结果
经过测定，苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）HLJ-66对鳞翅目害虫小菜蛾（Plutellaxylostalla）抗Btk种群的致死中浓度（LC50）为5.29mg/L。
实施例4苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）HLJ-66对抗Cry1Ac杀虫晶体蛋白小菜蛾的生物测定
一、供试昆虫：
小菜蛾抗Cry1Ac杀虫晶体蛋白种群：采自深圳田间，在养虫室内，利用甘蓝苗结合养虫纱笼法在室内饲养，将蛹放入成虫饲养笼中（R=10cm，L=40cm），笼四周以80目的纱网包围，成虫羽化后，笼内挂浸过10%蜂蜜糖水的脱脂棉球一个，为成虫补充营养，让其在甘蓝苗上产卵，卵孵化后再转入新鲜的甘蓝苗上饲养。饲养温度是25±1℃，相对湿度为60%-70%，光周期为光照：黑暗=16h：8h。其间只施用Cry1Ac杀虫晶体蛋白进行汰选，不施用其它任何药剂。其对Cry1Ac杀虫晶体蛋白的LC50大于5000mg/L，抗性高于5000倍。
二、菌株活性测定
挑挑实施例1培养鉴定后的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）HLJ-66的单菌落接种于发酵培养基中，在30℃恒温摇床上200rpm培养3-4d。离心收集孢晶混合物，洗涤后真空抽干，得到干粉混合物。称取孢晶混合物，加入定量无菌水配成500mg/L的溶液或悬浮液，置4℃备用。
取1mL孢晶混合液与10μl5%的Triton100混合均匀（Triton100终浓度为0.05%），选老嫩适中的甘蓝叶片洗净晾干，剪成直径2cm大小，放入孢晶悬液（含Triton100终浓度为0.05%）中，浸泡10s晾干，放入铺有湿润滤纸的平皿中。以无菌水混合Triton100（Triton100终浓度为0.05%）浸泡叶片作为对照。选取3龄小菜蛾幼虫，每个处理10头，设3个重复，25℃下饲养3d。记录幼虫死亡情况，计算死亡率和校正死亡率。
三、LC50测定
通过预试验测定小菜蛾在90%和10%死亡率的孢晶混合物的浓度，在其范围内设计5-7个浓度梯度，每个浓度4个重复，每重复10头3龄幼虫，25℃饲养3d，记录幼虫死亡情况，利用POLO软件计算菌株的LC50。
四、结果
经过测定，苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）HLJ-66对鳞翅目害虫小菜蛾（Plutella xylostalla）抗Cry1Ac杀虫晶体蛋白种群的致死中浓度（LC50）为6.21mg/L。
实施例7苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）HLJ-66的生物学特征
苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）HLJ-66分离自黑龙江土壤中，其的形态特征是：菌落均呈白色圆形、扁平，表面干燥无光泽，边缘缺刻；在普通LB平板上能生长，为好氧菌；细胞杆状，有鞭毛，革兰氏染色为阳性，且一个营养细胞只有一个芽孢，芽孢为中生、次端生或端生，孢子囊不膨大，有晶体存在。
苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）HLJ-66的生理生化特性：
可知，苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）HLJ-66的携带的的杀虫晶体蛋白基因有cry1Ac、cry2Ab和cry7,8，以及外毒素cyt基因。
综上所述，本实施例选择了鳞翅目主要害虫（小菜蛾）为靶标昆虫，同时汰选得到了对Bt（Kurstaki亚种）粉剂具有高抗的抗Btk小菜蛾种群和对Cry1Ac杀虫晶体蛋白具有高抗的抗Cry1Ac杀虫晶体蛋白小菜蛾种群，作为靶标昆虫，苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）HLJ-66同时对上述鳞翅目主要害虫敏感及抗Btk及Cry1Ac杀虫晶体蛋白害虫，均具有较强的毒杀作用。利用该菌株生产高效、广谱的杀虫剂，用于防止鳞翅目重要害虫小菜蛾，同时对抗性害虫具有很好的效果，有利于田间抗性小菜蛾的防治，提高了经济价值，且对人、畜及其他动物无害，不污染环境，具有良好经济、生态效益，具有良好的应用推广前景。由于Bt粉剂及转Bt基因作物的广泛种植，小菜蛾对Bt抗性严重，对抗Bt小菜蛾有效的Bt杀虫剂产品鲜为报道，而采用本实施例得到的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）HLJ-66能很好的解决这一问题。
需要指出的是，以上说明及优选实施例不可解释为限定本发明的设计思想。在本发明的技术领域里持有相同知识者可以将本发明的技术性思想以多样的形态改良变更，这样的改良及变更应理解为属于本发明的保护范围内。
Claims (3)
1.一株抗Bt小菜蛾有活性的苏云金芽孢杆菌HLJ-66，其特征在于它为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)HLJ-66，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2013年11月08日，保藏号为CGMCC No.8445；所述的苏云金芽孢杆菌HLJ-66，携带的杀虫晶体蛋白基因有cry1Ac、cry2Ab和cry7,8，以及外毒素cyt基因。
2.如权利要求1所述的一株抗Bt小菜蛾有活性的苏云金芽孢杆菌HLJ-66的应用，其特征在于它是在制备防治鳞翅目及抗Bt鳞翅目害虫的杀虫剂中的应用。
3.一种防治鳞翅目及抗Bt鳞翅目害虫的杀虫剂，其特征在于所述的杀虫剂包含权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌HLJ-66。
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