CN103667123B - 高活性的苏云金芽孢杆菌菌株hncs-93及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株高活性的苏云金芽孢杆菌菌株Bacillus thuringiensisHNCS‑93及其应用，保藏号：CGMCC No. 8446，该菌携带有杀虫蛋白编码基因cry1Ac和cry2Aa。该菌株以相对敏感小菜蛾、抗Btk小菜蛾、抗Cry1Ac毒蛋白小菜蛾为试虫，经毒力生物测定筛选对抗Bt及Cry1Ac毒蛋白小菜蛾有毒力的菌株。利用该菌株生产高效、广谱的杀虫剂，用于防治鳞翅目重要害虫小菜蛾，同时对抗性害虫具有很好的效果，有利于田间抗性小菜蛾的防治，提高了经济价值，对人、畜及其他动物无害，不污染环境，具有良好经济、生态效益，具有良好的应用推广前景。

Description

高活性的苏云金芽孢杆菌菌株 HNCS-93 及其应用

技术领域

本发明涉及一株高活性的苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis HNCS-93菌株，以及该苏云金芽孢杆菌在防治鳞翅目害虫或/和抗Bt鳞翅目害虫中的应用。

背景技术

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis, 简称Bt），是一种分布非常广泛的革兰氏阳性细菌，在《伯杰氏细菌鉴定手册》第九版中将其归为第二类第十八群芽孢杆菌属（Bacillus）的一个种，种下区分不同的亚种。因贝利纳(Berliner Ernst)于1911年在德国苏云金地区的地中海粉螟(Anagastra kuehniella)中发现而得名。最初是由日本学者石渡在死亡的家蚕中分离到的，命名为Bt猝倒亚种（Bacillus thuringiensis subsp.scotto）。在芽孢形成过程中，苏云金杆菌可以产生多种类型的伴孢晶体蛋白，即δ-内毒素（delta-endotoxin）或杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal protein，ICPs)，对鳞翅目(Lepidoptera)、双翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、膜翅目(Hymenoptera)、同翅目(Homoptera)、直翅目(Orthoptera)、食毛目(Mallophaga)等多种昆虫具有特异性的杀虫活性，对线虫（Nema todes）、螨类（Mi tes）和原生动物（Protozoa）等也有控制作用。Bt，因其具有对害虫高效、对人畜安全、对环境友好的优点，在世界范围内得到广泛的应用，成为目前世界上应用最广、产量最大的微生物杀虫剂，占微生物杀虫剂总量的95%以上。

Bt杀虫的主要因子是它的杀虫晶体蛋白（Insecticidal Crystal Proteins, ICPs），昆虫食入该毒蛋白晶体后，在中肠的高PH环境和蛋白水解酶的作用下，毒蛋白晶体溶解并被激活。近30年来，随着现代分子生物学技术的发展和应用，使人们对ICPs的分子结构有了进一步的认识，编码Bt杀虫晶体蛋白的基因被克隆、测序，转入到了多种重要的粮棉作物中，如：棉花、玉米、马铃薯、烟草、水稻、番茄等，在减少害虫危害、增加作物产量、减少化学农药对环境的污染等方面发挥了重要作用(Zhaoet al, 2005)。自上世纪70年代以来，人类认识和应用Bt资源的速度和范围得以空前发展。在我国，转Bt基因作物的研究起步较晚，但进展很快。在863高新技术计划的资助下，于1991年开始了Bt杀虫基因CrylA人工合成，1992年底，中国农科院生物技术研究中心郭三堆等研究小组，在国内首先合成了CrylA杀虫晶体蛋白结构基因，中科院田颖川、白永延等也先后合成和部分改造了CrylA杀虫晶体蛋白结构基因，并导入烟草、甘蓝和棉花中，获得抗虫植株。中科院生物技术研究所将人工合成的CrylA基因与修饰后的cirri即SCK基因组合在一起导入棉花中，成功研究出能同时产生两种杀虫蛋白的双价抗虫棉，并首次在国际上开发应用。目前，国内Bt基因导入棉花中的研究及商品化生产已有长足发展。1995年，浙江大学核农所舒庆尧等与加拿大渥太华大学合作，利用农杆菌介导法，将Bt基因导入“秀水11"品种中，获得了抗虫转基因植株，并于1998年通过浙江省技鉴委的技术鉴定，并定名为克螟稻，它是国内第一个育成的自交繁殖代数最高，抗性遗传最稳定(100％抗性)、Bt毒蛋白含量表达最高(1％)、最具生产与育种应用价值的转基因水稻抗虫品系，并被农业部生物基因工程安全管理委员会确定其生物安全等级为1级，即最安全等级。因该 Bt基因对二化螟、三化螟、大螟、稻纵卷叶螟、稻青虫等8种水稻鳞翅目害虫具有较高的抗性。由官春云教授领导的科研小组，采用基因工程技术将Bt毒蛋白基因转入油菜细胞中，使油菜获得抗虫性，并在油菜中稳定遗传和表达。表达Bt杀虫晶体蛋白（ICPs）的转基因作物在害虫防治中起着巨大的作用，对农业发展产生深远的影响（Shelton, 2002）。目 前 已 发 现 对 小 菜 蛾 Plutella xylostella (L.) 有 毒 力 的 基 因 有: cry1Aa、cry1Ab、cry1Ac、cry1B、cry1C、cry1F、cry2A、cry1I、cry7Ba1和 cry9A、cry9B，其中 cry1Aa、cry1Ab、cry1Ac 已在我国应用。自1996年转Bt cry基因作物的种植开始，转Bt基因作物在世界范围内被广泛种植，种植面积逐年增长。据2012年的统计显示，转Bt基因作物的种植面积已增长至17,030万公顷。

苏云金芽孢杆菌菌剂的应用及转Bt cry基因作物的种植，在控制田间害虫方面效果显著，有利于作物的产量和质量的提高，同时减少了化学农药的使用，对农林业生产和环境保护发挥了积极的作用。然而苏云金芽孢杆菌制剂和转Bt基因作物广泛应用，也使得部分害虫对Bt产生了一定抗性。自1985年McGaughey报道了印度谷螟Plodia interpunctella (Huber)通过室内选育对Bt产生抗性以来，害虫对Bt产生抗性这一课题就越来越引起科学家们的关注。小菜蛾（Plutella xylostella）和粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）分别在田间和温室对Bt制剂产生抗性。在田间，Kirsch和Schmutterer (1988)最早报道在菲律宾田间暴露于Bt杀虫剂很多年的小菜蛾对Bt筛剂产生了抗药性，随后Tabashnik等(1990)报道在夏威夷田间小菜蛾也表现出对Bt产生了抗药性，小菜蛾对Bt产生抗药性终止了Bt制剂对其控制作用。Shelton等(1993 )用两种Bt杀虫剂对1990年采于芸苔植物的11个小菜蛾品系进行生物测定，结果发现Bt杀虫剂连续使用很多年的佛罗里达地区的小菜蛾LC₅₀最高，具有显著差异。1992年又进行了一些试验研究，对佛罗里达不同地区的小菜蛾用Bt杀虫剂分别进行田间及室内生物测定，研究发现Bt杀虫剂对小菜蛾失去控制作用，表明小菜蛾对Bt杀虫剂出现抗性。至今，小菜蛾在田间对Bt产生抗性在很多地区被发现（表1-1）。在温室，粉纹夜蛾种群被报道能够快速地对B.thuringiensis subsp. kurstaki产生抗性，达到一定程度的抗性水平，在实验室没有Bt杀虫剂选择压情况下，种群抗性水平会快速下降(Janmaat and Meyers Janmaat, 2003 )。

近几年来，有报道称某些主要靶标害虫在田间对转Bt基因作物产生抗性或耐受性增加。在美国东南部田间发现美洲棉铃虫对表达Cry1Ac的Bt棉花产生抗性（Tabashnik et al., 2008）；在南非发现了对表达CrylAb的Bt玉米产生抗性的玉米楷夜蛾种群（Busseola fusca）（Van Rensburg et al., 2007）；另外在南非还发现了对表达Cry1F的Bt玉米产生抗性的草地贪夜蛾（Spdoptera frugiperda）种群；在我国的河北安慈和山东夏津，因连续多年大面积种植转Bt基因棉花，也发现了棉铃虫（Helicoverpa armigera）种群对转Cry1Ac基因抗虫棉的抗性水平呈明显的上升趋势

国内，冯夏等报道深圳、东莞地区等供港菜区小菜蛾对Bt 的抗药性为17.2-30.2倍。李建洪等通过对深圳、东莞和广州菜区的田间小菜蛾种群检测，发现小菜蛾对苏云金芽孢杆菌标准品Cs3ab-1991的抗药性倍数分别为8.9、6.5、2.1倍。周程爱等报道长沙地区的小菜蛾对Bt的抗药性由1997-1999年的敏感性由1.1-4.1倍发展到2000年的6.2倍的低水平抗药性。余德亿等报道福建地区田间种群的小菜蛾对湖北Bt和福建Bt的抗药性分别由1997年的2.1倍和3.1倍上升到1999年的8.2倍和10.1倍。郭世俭等报道浙江省杭州、萧山、金华、温州四地的小菜蛾对Bt制剂还没有产生抗药性。王崇利等报道广东惠州田间小菜蛾种群对Cry1Ab和Cry1Ac的抗性达到了高抗水平；对Btk制剂的抗性达到了中抗水平；对Cry1Aa和Cry2Aa具有低水平抗性；福建福州、浙江杭州和江苏南京田间小菜蛾种群对Cry1Ab、Cry1Ac具有低至中等水平抗性（8-28倍），对Btk制剂具有低水平抗性（3.5-7倍）。害虫对Bt抗药性的产生，是Bt在农业生产应用中有效性和持效性最大的威胁。

以上可以看出，小菜蛾对Bt产生的抗性问题已经十分突出，因此筛选到对抗Bt小菜蛾高活性的菌株，用于防治抗Bt害虫已迫在眉睫。

发明内容

本发明目的在于提供一株对抗Bt小菜蛾有高活性的苏云金芽孢杆菌菌株，该菌株对鳞翅目害虫、抗Btk鳞翅目害虫以及抗Cry1Ac毒蛋白鳞翅目害虫有毒杀作用，利用该菌株能开发一种广谱、高效且对抗Bt害虫有效的Bt杀虫剂。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：

从非正常饲养小菜蛾幼虫体内分离的一株苏云金芽孢杆菌。用发酵培养基进行发酵，培养至伴孢晶体脱落。对相对敏感小菜蛾、抗Btk小菜蛾及抗Cry1Ac毒蛋白小菜蛾进行生物测定，对上述供试害虫均具有较强杀虫作用。对菌株进行形态学、生理生化特征分析，分析菌株所含的杀虫晶体蛋白基因类型。其命名为苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis HNCS-93（简称HNCS-93）。该菌株于2013年 11月 8 日为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC所保藏（保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），其保藏号为CGMCC No. 8446，经检测存活。

本发明与先有技术相比，具有以下优点：本发明选择了鳞翅目主要害虫（小菜蛾）、为靶标昆虫，同时从田间采集对Bt（Kurstaki亚种）粉剂具抗性的小菜蛾种群并继续汰选得到高抗的抗Bt小菜蛾种群和对Cry1Ac毒蛋白具有高抗的抗Cry1Ac毒蛋白小菜蛾种群，作为靶标昆虫，苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis HNCS-93同时对上述鳞翅目主要害虫及田间抗Bt及Cry1Ac毒蛋白害虫，均具有较强的毒杀作用。利用该菌株生产高效、广谱的杀虫剂，用于防止鳞翅目重要害虫小菜蛾，同时对抗性害虫具有很好的效果，有利于田间抗性小菜蛾的防治，提高了经济价值，切对人、畜及其他动物无害，不污染环境，具有良好经济、生态效益，具有良好的应用推广前景。由于Bt粉剂及转Bt基因作物的广泛种植，小菜蛾对Bt抗性严重，对抗Bt小菜蛾有效的Bt杀虫剂产品尚为见报道。

具体实施方式

下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。

实施例 1 ：菌株分离与培养

1、从田间采集的非正常死亡小菜蛾幼虫进行表面处理，方法如下：用镊子夹住幼虫头部，蘸取95%乙醇灼烧后，放入75%乙醇中2 s，再放入3%次氯酸钠溶液中浸泡3 min，取出幼虫用无菌水清洗3次。将处理好的虫体放入装有0.5 ml无菌水的1.5 ml离心管中打碎，制成虫体悬液。取虫体悬液0.1ml加入100ml无菌水中，30℃振荡培养30min，在75-80℃水浴中热处理14-20min。

2、将培养液稀释到适当浓度，均匀涂布于分离培养基平板上，置于30℃恒温培养箱中培养。

3、培养3-4d后，挑选培养特征类似苏云金杆菌的菌株涂片，用石碳酸复红染色镜检，观察有无伴孢晶体。

其中，分离培养基：牛肉膏3 g、蛋白胨5 g、葡萄糖10 g、15~20 g琼脂、水1000ml，调pH值至7.0。

发酵培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，水1000mL，调pH值至7.0。

4、将产生芽孢和伴孢晶体的菌株检出纯化后，接种于发酵培养基中进行摇瓶发酵，至伴孢晶体脱落。

5、取发酵液与Triton100混合均匀（Triton100终浓度为0.05%），采用浸叶法对相对敏感小菜蛾、抗Bt小菜蛾、抗Cry1Ac毒蛋白小菜蛾进行室内毒力测定。具体方法：选老嫩适中的甘蓝叶片洗净晾干，剪成直径2 cm大小，放入发酵液（含Triton100终浓度为0.05%）中，浸泡20s晾干，放入铺有湿润滤纸的平皿中。以无菌水混合Triton100（Triton100终浓度为0.05%）浸泡叶片作为对照。选取2-3龄小菜蛾幼虫，每个处理10头，设4个重复，置（温度25℃、相对湿度65%-70%、光照比L：D=16:8）条件下饲养。3d后观察小菜蛾幼虫死亡情况，计算死亡率。

实施例 2 ：菌株的鉴定

根据上述实施例1的实施方法，得到一株对鳞翅目害虫、抗Bt鳞翅目害虫、抗Cry1Ac毒蛋白鳞翅目害虫及鞘翅目害虫具有毒杀作用的苏云金芽孢杆菌菌株，命名为Bacillus thuringiensis HNCS-93（简称HNCS-93），该菌株的保藏号：CGMCC No. 8446。具体鉴定结果如下：

1、苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis HNCS-93的杀虫活性：该菌株在发酵培养基中培养至伴孢晶体脱落，对鳞翅目害虫小菜蛾（Plutella xylostalla）相对敏感种群的致死中浓度（LC₅₀）为5.07mg/L，对鳞翅目害虫小菜蛾抗Btk种群的致死中浓度（LC₅₀）为6.57mg/L，对鳞翅目害虫小菜蛾抗Cry1Ac毒蛋白种群的致死中浓度（LC₅₀）为4.93mg/L。显示出较强毒杀作用。

2、苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis HNCS-93的形态特征：菌落均呈白色圆形、扁平，表面干燥无光泽，边缘缺刻；在普通LB平板上能生长，为好氧菌；细胞杆状，有鞭毛，革兰氏染色为阳性，且一个营养细胞只有一个芽孢，芽孢为中生、次端生或端生，孢子囊不膨大，有晶体存在。

3、苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis HNCS-93的生理生化特性：

形态特征和生化特性	Bt. HNCS-93菌株
		杆状：宽（µm）	1.5-2.0
长（µm）	3.3-4.7
		革兰氏染色	+
芽孢 椭圆	+
		圆形	-
内生或偏内生	+
		芽孢囊膨大	-
伴孢晶体	菱形
		生长温度（℃）：最高	40-43
最低	9-10
		运动性	+
菌膜试验Bacteria film test	+
		伏普试验Voges-Prokauer test	+
卵磷脂酶Lecithinas	+
		水杨苷Salicin	+
蔗糖Sucrose	+--
		纤维二糖Cellobiose	+++
甘露糖Carbinose	--
		七叶灵Esculin	-
甲基红Methyl Red test	+
		脲酶试验Urease test	+
明胶液化Gelatin Liquefaction	+
		乳糖Lactose	---
山梨醇Sorbitol	---
		果糖Fructose	-++
阿拉伯糖Arabinose	---
		麦芽糖Maltose	+++
木糖Xylose	---
		葡萄糖Glucose	-++
几丁质酶chitinase	＋

4、苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis HNCS-93的携带的的杀虫晶体蛋白基因有cry1Ac和cry2Aa。

实施例 3 ：菌株 HNCS-93 对敏感小菜蛾的生物测定

一、供试昆虫：

小菜蛾相对敏感种群：在室内用干净无虫的萝卜苗和甘蓝苗饲养，期间从未施用过任何杀虫剂。小菜蛾种群在室内进行隔离饲养，将蛹放入成虫饲养笼中（R=10cm，L=40cm），饲养笼四周以80目的纱网包围，成虫羽化后，笼内挂浸过10%蜂蜜糖水的脱脂棉球一个，为成虫补充营养，让其在甘蓝苗上产卵，卵孵化后再转入新鲜的甘蓝苗上饲养。饲养温度是25±1℃，相对湿度为60%-70%，光周期为光照：黑暗=16h：8h。

二、菌株活性测定

挑单菌落接种于LB液体培养基中，在30℃恒温摇床上200 rpm培养72 h。离心收集孢晶混合物，洗涤后真空抽干，得到干粉混合物。称取孢晶混合物，加入定量无菌水配成1000 mg/L的溶液或悬浮液，置4℃备用。

取孢晶混合液与Triton100混合均匀（Triton100终浓度为0.05%），将甘蓝叶片剪成直径2cm大小，放入孢晶悬液（含Triton100终浓度为0.05%）中，浸泡20s晾干，放入铺有湿润滤纸的平皿中。以无菌水混合Triton100（Triton100终浓度为0.05%）浸泡叶片作为对照。选取2龄初小菜蛾幼虫，每个处理10头，设4个重复，25℃下饲养3d。记录幼虫死亡情况，计算死亡率和校正死亡率。

三、LC₅₀测定

通过预试验测定小菜蛾在90%和10%死亡率的孢晶混合物的浓度，在其范围内设计5-7个浓度梯度，每个浓度4个重复，每重复10头2龄初小菜蛾幼虫，25℃饲养3d，记录幼虫死亡情况，利用POLO软件计算菌株的LC₅₀值。

四、结果

经过测定，苏云金芽孢杆菌Bt.HNCS-93对鳞翅目害虫小菜蛾（Plutella xylostalla）相对敏感种群的致死中浓度（LC₅₀）为5.07mg/L。

实施例 4 ：菌株 HNCS-93 对抗 Bt 小菜蛾的生物测定

一、供试昆虫：

小菜蛾抗Bt种群：采自上海田间，在室内进行隔离饲养，将蛹放入成虫饲养笼中（R=10cm，L=40cm），饲养笼四周以80目的纱网包围，成虫羽化后，笼内挂浸过10%蜂蜜糖水的脱脂棉球一个，为成虫补充营养，让其在甘蓝苗上产卵，卵孵化后再转入新鲜的甘蓝苗上饲养。饲养温度是25±1℃，相对湿度为60%-70%，光周期为光照：黑暗=16h：8h。利用Bt（Kurstaki亚种）制剂进行抗性选育。对Bt粉剂已有近千倍抗性。

二、菌株活性测定

挑单菌落接种于LB液体培养基中，在30℃恒温摇床上200 rpm培养72 h。离心收集孢晶混合物，洗涤后真空抽干，得到干粉混合物。称取孢晶混合物，加入定量无菌水配成1000 mg/L的溶液或悬浮液，置4℃备用。

取孢晶混合液与Triton100混合均匀（Triton100终浓度为0.05%），取甘蓝叶片剪成直径2cm大小，放入孢晶悬液（含Triton100终浓度为0.05%）中，浸泡20s晾干，放入铺有湿润滤纸的平皿中。以无菌水混合Triton100（Triton100终浓度为0.05%）浸泡叶片作为对照。选取2龄初小菜蛾幼虫，每个处理10头，设4个重复，25℃下饲养3d。记录幼虫死亡情况，计算死亡率和校正死亡率。

三、LC₅₀测定

通过预试验测定小菜蛾在90%和10%死亡率的孢晶混合物的浓度，在其范围内设计5-7个浓度梯度，每个浓度4个重复，每重复10头2龄初小菜蛾幼虫，25℃饲养3d，记录幼虫死亡情况，利用POLO软件计算菌株的LC₅₀值。

四、结果

经过测定，苏云金芽孢杆菌Bt.HNCS-93对鳞翅目害虫小菜蛾（Plutella xylostalla）抗Btk种群的致死中浓度（LC₅₀）为6.57mg/L。

实施例 5 ：菌株 HNCS-93 对抗 Cry1Ac 毒蛋白小菜蛾的生物测定

一、供试昆虫：

小菜蛾抗Cry1Ac毒蛋白种群：采自深圳田间，在养虫室内，利用甘蓝苗结合养虫纱笼法在室内饲养，将蛹放入成虫饲养笼中（R=10cm，L=40cm），笼四周以80目的纱网包围，成虫羽化后，笼内悬挂浸过10%蜂蜜糖水的脱脂棉球一个，为成虫补充营养，让其在甘蓝苗上产卵，卵孵化后再转入新鲜的甘蓝苗上饲养。饲养温度是25±1℃，相对湿度为60%-70%，光周期为光照：黑暗=16h：8h。其间只施用Cry1Ac毒蛋白进行汰选，不施用其它任何药剂。其对Cry1Ac毒蛋白的LC₅₀大于4000mg/L，抗性高于1500倍。

二、菌株活性测定

挑单菌落接种于LB液体培养基中，在30℃恒温摇床上200 rpm培养72h。离心收集孢晶混合物，洗涤后真空抽干，得到干粉混合物。称取孢晶混合物，加入定量无菌水配成1000 mg/L的溶液或悬浮液，置4℃备用。

取孢晶混合液与Triton100混合均匀（Triton100终浓度为0.05%），取甘蓝叶片剪成直径2cm大小，放入孢晶悬液（含Triton100终浓度为0.05%）中，浸泡20s晾干，放入铺有湿润滤纸的平皿中。以无菌水混合Triton100（Triton100终浓度为0.05%）浸泡叶片作为对照。选取2龄初小菜蛾幼虫，每个处理10头，设4个重复，25℃下饲养3d。记录幼虫死亡情况，计算死亡率和校正死亡率。

三、LC₅₀测定

通过预试验测定小菜蛾在90%和10%死亡率的孢晶混合物的浓度，在其范围内设计5-7个浓度梯度，每个浓度4个重复，每重复10头2龄初小菜蛾幼虫，25℃饲养3d，记录幼虫死亡情况，利用POLO软件计算菌株的LC₅₀值。

四、结果

经过测定，苏云金芽孢杆菌Bt.HNCS-93对鳞翅目害虫小菜蛾（Plutella xylostalla）抗Cry1Ac毒蛋白种群的致死中浓度（LC₅₀）为4.93mg/L。

Claims (3)

1.一株对抗Bt小菜蛾有高活性的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis），其保藏号为CGMCC No. 8446，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.如权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌在防治小菜蛾中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述小菜蛾是抗Bt小菜蛾。