CN110643551A - 一株防治水稻稻瘟病的嗜根寡养单胞菌s11及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株防治水稻稻瘟病的嗜根寡养单胞菌S11，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.18346；并公开了嗜根寡养单胞菌S11在制备防治水稻稻瘟病的药物中的应用。同时，还公开一种防治水稻稻瘟病的生防菌剂及其制备方法和在防治水稻稻瘟病中的应用，该生防菌剂包含所述的嗜根寡养单胞菌S11。本发明通过平板对峙培养法测定，发现S11菌株对稻瘟病菌有强烈的拮抗作用，抑菌圈直径可达到44mm；温室接种及大田试验均表明，S11生防菌剂可有效防治水稻稻瘟病。因此，本发明公开的嗜根寡养单胞菌S11菌株可用于水稻稻瘟病的生物防治，具有广阔的推广和应用前景。

Description

一株防治水稻稻瘟病的嗜根寡养单胞菌S11及其应用

技术领域

本发明涉及农作物生物防治技术领域，特别是涉及一株防治水稻稻瘟病的嗜根寡养单胞菌S11及其应用。

背景技术

水稻是世界上年产量超过五千万吨的三种禾谷类作物之一，它是世界上(尤其是亚洲)30多亿人每天基本食物的主要来源。稻瘟病(rice blast disease)是最严重的水稻病害之一，世界各水稻产区均有发生，每年可造成水稻减产10～30％。水稻各组织部位皆可发病，如叶部发病形成叶瘟，是最为常见的病症，严重时可导致叶片死亡；除叶片外，茎上也可以发病，形成节瘟，该部位患病后植株易倒伏和枯萎；在抽穗期发病则易形成穗茎瘟，发病率高时能严重影响灌浆，造成水稻品质及产量下降，另外，稻穗上还可发生谷粒瘟。

稻瘟病的发生对温湿度要求比较严格，尤其是后者。一般而言，水稻种植区多雨的季节，日平均气温在24～32℃之间，稻田深水灌溉且通风透气性较差，再加上田间荫蔽，相对湿度经常超过90％，这样的温湿度特别适宜稻瘟病发生和流行。水稻各生长发育阶段皆可感病，相比较而言有两个易感期，一是苗期，因为组织幼嫩，抗病性弱，易于侵染，形成叶瘟或茎瘟；二是抽穗期，此发育阶段常多雨，抽穗部位多有水珠聚集，分生孢子易于吸附，多诱发穗茎瘟。

稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae或Pyricularia oryzae)是稻瘟病的病原菌，它是一种丝状真菌，有性世代属于子囊菌。稻瘟病菌分生孢子从分生孢子梗末端分化形成，成熟后多由三个细胞构成，呈梨形(pyriform)，经风吹或雨水冲刷落到水稻组织表面后，被诱导形成一种特化的侵染细胞－附着胞(appressorium)，该细胞通过在细胞壁内侧沉淀一层厚厚的黑色素，并在胞内合成大量甘油，产生巨大的膨压，并借此侵入水稻组织，在其中生长扩展，导致病斑的发生。侵染菌丝可以从病斑部位向空气中伸展形成分生孢子梗，并在末端分化出分生孢子，进行再一轮侵染。除侵染水稻外，该丝状真菌还可以侵染其它植物如：大麦、小麦以及禾本科的一些杂草。

与治理其它病害类似，稻瘟病菌同样遵循“预防为主，综合治理”的原则。如选育抗病品种，迄今为止，已经有多个水稻抗稻瘟病基因得到克隆；目前，化学防治仍旧是治理稻瘟病的常规防治方法，常用的化学农药有三环唑、氰菌胺等，主要是通过抑制黑色素的生物合成途径来抑制稻瘟病的发生。由于化学防治可能会造成农药残留，存在危及人类健康及生态环境的风险，近年来，以生物防治为主的绿色防控技术获得广泛认可，亟需大力发展。

主要的微生物源农药有细菌类、放线菌类和真菌类。张海霞等从采自全国各地的48份土样中分离到403株放线菌，30株对稻瘟病有抑制作用，其中鲜黄链霉素WM2-4对稻瘟病的抑制效果最好，抑菌率达到89.35％。王巧兰等的研究也表明，几种木霉属的真菌对稻瘟病菌有很好的抗生效果。近年来，有科研工作者开始研究真菌病毒在防控稻瘟病中的应用并取得了初步结果。用于稻瘟病防治的微生物源农药以细菌类为主，其中芽孢杆菌居多。游春平等筛选到枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌，可显著抑制稻瘟病菌的分生孢子萌发及附着胞形成。彭化贤等从水稻根部分离获得对稻瘟病菌防治效果较好的蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。另外，科研工作者发现一种短杆类芽孢杆菌的发酵液对叶瘟的田间防效达到57％～64％，具有较好的商业应用潜力。

采用生物农药防治稻瘟病的研究与应用是水稻生产可持续发展的需要，可以满足人们对水稻这种主要粮食作物安全生产的要求。尽管植物保护工作者目前已分离到多株可显著抑制稻瘟病菌生长及发育的生防菌株，但距离大田有效防控稻瘟病仍有较大差距，本领域中还缺少对水稻稻瘟病具有高效防控能力且易于在稻田中定殖的生防菌株，寻找新的高效生防菌株将有助于水稻稻瘟病的绿色防控。

发明内容

本发明的目的是提供一株防治水稻稻瘟病的嗜根寡养单胞菌S11，以解决上述现有技术存在的问题，该菌分离自水稻田土壤中，对水稻生长无不良影响，可用于水稻稻瘟病的生物防治。

本发明还有一个目的是提供一种防治水稻稻瘟病的生防菌剂，包含所述的嗜根寡养单胞菌S11。

本发明还有一个目的是提供一种防治水稻稻瘟病的生防菌剂的制备方法，直接通过液体发酵的方法获取含有大量嗜根寡养单胞菌S11的生防菌剂。

本发明还有一个目的是提供嗜根寡养单胞菌S11在制备防治水稻稻瘟病的药物中的应用，以及在防治水稻稻瘟病中的应用。

本发明还有一个目的是提供生防菌剂在防治水稻稻瘟病中的应用。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一株防治水稻稻瘟病的嗜根寡养单胞菌S11，其分类命名为：Stenotrophomonas rhizophila，于2019年7月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏号为CGMCC No.18346。

优选的是，培养特征为：菌落圆形，中央隆起，边缘整齐，有粘性，黄色，不透明。

本发明还提供一种防治水稻稻瘟病的生防菌剂，包含所述的嗜根寡养单胞菌S11。

本发明还提供一种防治水稻稻瘟病的生防菌剂的制备方法，包括以下步骤：所述嗜根寡养单胞菌经液体培养基扩大培养，获取生防菌剂。

优选的是，扩大培养前先进行嗜根寡养单胞菌S11种子液的制备，所述种子液制备采用PDB液体培养基培养，所述PDB液体培养基包括以下重量份的组分：200份马铃薯、20份葡萄糖，1000份水，pH 7.0-7.2；培养条件：于28-30℃，180-200rpm条件下，培养24h。

优选的是，将所制备的种子液按体积比1:100接种于PDB液体培养基中，于28-30℃，180-200rpm条件下，扩大培养48h，获得生防菌剂。

优选的是，所述生防菌剂中活菌浓度为0.5×10⁹-1×10⁹CFU/mL。

本发明还提供所述的嗜根寡养单胞菌S11在制备防治水稻稻瘟病的药物中的应用。

本发明提供所述的嗜根寡养单胞菌S11在防治水稻稻瘟病中的应用。

本发明提供所述的生防菌剂在防治水稻稻瘟病中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

本发明公开的嗜根寡养单胞菌S11分离自吉林省某水稻田土壤，能在水稻田中定殖，对水稻生长无不良影响。固体培养基对峙培养表明，嗜根寡养单胞菌S11对稻瘟病菌有强烈的拮抗作用，抑菌圈直径可达到44mm；温室接种及大田试验均表明，嗜根寡养单胞菌S11可有效防治水稻稻瘟病，对叶瘟和穗颈瘟均有优异的防治作用。以上结果表明，本发明得到的嗜根寡养单胞菌S11菌株可用于水稻稻瘟病的生物防治。

本发明公开的嗜根寡养单胞菌S11菌株，还专门针对水稻稻瘟病开发了生防制剂。由于是生物制剂，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，因而有利于水稻的无公害生产，农民可以在保证水稻产量和品质的前提下，减少(或不用)其他化学农药，这不仅为农民节省开支，而且有利于生产绿色产品，提高效益。另外，由于嗜根寡养单胞菌S11菌株分离自水稻田，可预见其能与水稻长期共存，互惠共生，将其喷施到水稻植株上用于病害防治，不改变稻米营养品质，对稻米的食用及其加工产品来说安全可靠。

本发明所公开的嗜根寡养单胞菌S11，具有易培养，且与水稻亲和能力强等特点，可应用到水稻稻瘟病的防治或者制备防治水稻稻瘟病的药物中，具有商业化潜力和很好的开发应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明嗜根寡养单胞菌S11在LB培养基平板上的菌落形态；

图2为本发明嗜根寡养单胞菌S11的16s rDNA的ITS序列扩增电泳图谱；M为DL2000(DNA Marker)；

图3为本发明嗜根寡养单胞菌S11与稻瘟病菌的对峙培养结果；其中，左侧平板为稻瘟病菌JJ88与S11对峙培养的生长情况；右侧平板为稻瘟病菌正常生长情况，接种无菌水作为对照(CK)。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1

嗜根寡养单胞菌S11菌株的筛选与鉴定

(1)样品采集：采集样品为初冬休眠季节水稻大田土壤，地点为吉林省松原市。取表层5-20cm的冻土块，用聚乙烯塑料袋装好，带回实验室分离。

(2)菌株分离：用100mL的三角瓶装50mL灭菌水，称取5g土样(去除残枝碎叶)，在摇床上震荡30min，取出静置10min，吸取上清液，用无菌水进行梯度稀释，稀释的浓度有10^-3g/mL、10^-4g/mL、10^-5g/mL及10^-6g/mL，分别吸取100μL至LB培养基(每升LB培养基含：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠5g，琼脂粉15g)，涂布均匀，每个浓度设三个重复。28℃培养24～48h，根据形态和颜色等不同，挑取单菌落，在LB培养基上划线纯化，将纯化好的菌株放置到斜面培养基上备用。

S11菌株是通过上述方法所获得细菌中的一株，发明人已将本菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期为2019年7月29日；保藏编号为CGMCC No.18346。

(3)生防菌株S11的菌落特征：S11菌株的菌落圆形，中央隆起，边缘整齐，有粘性，黄色，不透明(如图1所示)。革兰氏阴性菌，菌体杆状，可运动。

(4)生防菌株S11的分子鉴定：提取S11菌株的基因组DNA，采用细菌通用引物：

27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)；

1429R(5’-GCTACCTTGTTACGACTT-3’)，扩增S11菌株的16S rDNA片段，反应体系为：10mmol/L dNTP Mixture，0.5μL；10×PCR buffer，2.5μL；上下游引物各1μL(10μmol/mL)；模板DNA，1μL；Ex-Taq，0.2μL(5U)；ddH₂O，18.8μL；扩增程序为：94℃预变性3min；然后94℃，变性30s，56℃，退火30s，72℃，延伸60s，循环30次；72℃延伸6min。

扩增片段通过琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行分离(如图2所示)，纯化后委托生工生物工程(上海)股份有限公司测序，对于所测序列在NCBI网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行序列比对，获得鉴定信息。通过16S rDNA基因片段序列分析，将S11菌株鉴定为Stenotrophomonas rhizophila(嗜根寡养单胞菌)(如表1所示)，是一种细菌。

表1生防菌株S11的16S rDNA序列比对结果

实施例2

嗜根寡养单胞菌S11菌株对稻瘟病菌的抑制活性测定

采用平板对峙培养法进行测试，固体平板为PDA培养基(每升含：200g马铃薯煮熟过滤液，20g葡萄糖，15g琼脂粉，pH值为7.0～7.2)。在PDA培养基一侧接种稻瘟病菌JJ88(该菌由吉林大学植物分子生物学实验室提供)，在相对的另一侧通过划线方式接入制备好的嗜根寡养单胞菌S11菌株，置28℃进行对峙培养，测定嗜根寡养单胞菌S11菌株对稻瘟病菌生长的抑制能力，以无菌水作为对照。每处理设三次重复，7d后观察并测量稻瘟病菌生长情况。

平板对峙培养结果显示，稻瘟病菌朝向嗜根寡养单胞菌S11一边的菌落扩展非常缓慢，后期则完全被抑制住，无法继续扩展，即使延长观察时间至14d，菌落也不再扩展，而对照的菌落扩展良好(如图3所示)。

经测量，对稻瘟病菌的抑菌圈直径可达到44土2.7mm，说明嗜根寡养单胞菌S11菌株可极显著抑制稻瘟病菌菌丝的生长。

实施例3

嗜根寡养单胞菌S11生防菌剂的制备及其抑菌活性检测

(1)嗜根寡养单胞菌S11生防菌剂的制备

嗜根寡养单胞菌S11种子菌液的制备：实施例2的对峙培养测试已表明，在PDA上培养的嗜根寡养单胞菌S11菌株，可产生抑制稻瘟病菌生长的化合物。因此，采用配方类似的PDB液体培养基(每升含：200g马铃薯煮熟过滤液，20g葡萄糖，pH为7.0～7.2)，对S11生防菌株进行发酵培养。

具体为：挑取划线培养的嗜根寡养单胞菌S11(CGMCC No.18346)新鲜菌落，接种至PDB液体培养基中，在28～30℃，摇床震荡速率为180～200rpm条件下培养24h左右，16h后在超净工作台中每隔3h取样测量600nm处的OD值，测定过程中以未接菌的培养液来调零，直到种子菌液OD值达到0.5～0.8时结束培养，获得S11的种子菌液。

嗜根寡养单胞菌S11生防菌剂的制备：将S11种子菌液以1:100体积比在PDB液体培养基中进行扩大发酵培养，在28～30℃，摇床震荡速率为180～200rpm条件下培养48h，获得生防菌剂，活菌浓度为0.5×10⁹～1×10⁹CFU/mL。

(2)嗜根寡养单胞菌S11生防菌剂的抑菌活性测定

采用牛津杯法进行测定，对嗜根寡养单胞菌S11生防菌剂的抑菌活性进行测试。具体地，依照上述方法获得嗜根寡养单胞菌S11发酵生防菌剂，用0.22μm滤膜过滤获得无菌发酵液，备用。在PDA培养基四周接种稻瘟病菌JJ88，在中央已事先插入的无菌牛津杯中接入100μL嗜根寡养单胞菌S11菌株无菌发酵液，置28℃进行对峙培养，测定嗜根寡养单胞菌S11发酵液对稻瘟病菌生长的抑制能力。以PDB液体培养基作为对照，以含有嗜根寡养单胞菌S11的发酵液作为平行处理。每处理设三次重复，7d后观察并测量稻瘟病菌生长情况。

对峙培养结果显示，稻瘟病菌朝向S11发酵液一边的菌落扩展受到极显著抑制，经测量，抑菌圈直径可达到37土2.3mm。含有嗜根寡养单胞菌S11的发酵液抑菌效果与实施例2类似，抑菌圈直径可达到44土3.3mm(如表2所示)。该项测试表明，嗜根寡养单胞菌S11菌株的PDB发酵生防菌剂中，不仅活菌细胞具有抑制稻瘟病菌效果，去除活菌细胞的发酵液也可极显著抑制稻瘟病菌菌丝的生长。

表2嗜根寡养单胞菌S11生防菌剂对稻瘟病菌生长的抑制活性测定

注：数值＝均值土标准误，不同小写字母表示差异显著性(p<0.05)

实施例4

嗜根寡养单胞菌S11生防菌剂对稻瘟病防治效果的温室测试

采用温室接种实验，测试了嗜根寡养单胞菌S11生防菌剂对稻瘟病的防控效果，具体操作如下：

在温室育苗盘内播种水稻栽培品种吉粳88，待其生长至三叶期(约18d)，喷施嗜根寡养单胞菌S11菌株的PDB发酵生防菌剂(1×10⁸～2×10⁸CFU/mL)，以PDB液体培养基作为对照。36h后喷雾接种稻瘟病菌JJ88孢子液(浓度为5×10⁵CFU/mL)，保温保湿培育，7d后分析发病情况。

实验结果显示，提前喷施嗜根寡养单胞菌S11生防菌剂对水稻具有高效的保护作用，可极显著抑制稻瘟病的发生，病斑极少出现，发病率只有对照的13％，偶尔出现的病斑微小且难以扩展，嗜根寡养单胞菌S11生防菌剂防效可达到84.2％，而对照组发病率与病斑扩展均正常(如表3所示)，表明嗜根寡养单胞菌生防菌株S11可有效防治水稻稻瘟病。

叶瘟病情分级标准：0级，无病；1级，病斑小而少，病斑面积占叶面积1％以下；2级，病斑小而多，或大而少，病斑面积占叶片面积的1％～5％；3级，病斑大而较多，病斑面积占叶片面积5％～10％；4级，病斑大而多，病斑面积占叶片面积10％～50％；5级，病斑面积占叶片面积50％以上，全叶将枯死。计算公式：发病率％＝发病叶数/调查总叶数×100；病情指数＝∑(各级发病数×各级代表值)/(调查总叶数×最高级代表值)×100。

表3嗜根寡养单胞菌S11生防菌剂对稻瘟病防治效果的温室测试

说明：数值＝均值土标准误，不同小写字母表示差异显著性(p<0.05)

实施例5

嗜根寡养单胞菌S11生防菌剂对稻瘟病防治效果的田间试验

采用田间稻田试验，测试了嗜根寡养单胞菌S11生防菌剂对稻瘟病的防控效果。在吉林省永吉县一拉溪镇进行嗜根寡养单胞菌S11生防菌剂的田间药效试验，栽培品种为稻花香，喷施嗜根寡养单胞菌S11菌株的PDB发酵生防菌剂(1×10⁸～2×10⁸CFU/mL)。对照药剂为三环唑·异稻瘟净可湿性粉剂(河北中保绿农作物科技有限公司生产)，施用量是100～150g/亩，兑水40～50kg。平均每个试验小区面积是50m²，不进行任何防治的试验小区作为负对照。每处理设置3个重复。收获前3～4周分别调查嗜根寡养单胞菌S11生防菌剂对叶瘟和穗瘟的防治效果。

田间试验结果显示，喷施嗜根寡养单胞菌S11生防菌剂对水稻具有高效的保护作用，可极显著抑制稻瘟病的发生，对叶瘟和穗瘟均可有效防控，防效分别达到80.9％和82.0％，病斑均极少出现，偶尔出现的病斑小且不易扩展；嗜根寡养单胞菌S11生防菌剂的防治效果与对照药剂相比较，没有显著差异(如表4所示)，表明嗜根寡养单胞菌S11生防菌剂可有效防治田间水稻稻瘟病的发生，可替代化学农药，用于水稻田稻瘟病的绿色、高效防治。

穗瘟病情分级标准：0级，无病；1级，个别枝梗发病；2级，1/3左右枝梗发病；3级，穗颈或主轴发病；4级，穗颈发病，大部分秕谷；5级，穗颈发病造成白穗。计算公式：发病率％＝发病穗数/调查总穗数×100；病情指数＝∑(各级发病数×各级代表值)/(调查总穗数×最高级代表值)×100。

表4嗜根寡养单胞菌S11生防菌剂对稻瘟病防治效果的田间测试

说明：数值＝均值土标准误，不同小写字母表示差异显著性(p<0.05)

从实施例2-5可以看出，本发明从水稻土壤中筛选出的嗜根寡养单胞菌S11可以有效抑制水稻稻瘟病病菌，并且不仅仅可用于室内试验，还能用于大田试验中，并且可以有效的抑制叶瘟和稻瘟，本发明提供了一种高效生防菌株，有助于水稻稻瘟病的绿色防控。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一株防治水稻稻瘟病的嗜根寡养单胞菌S11，其特征在于，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.18346。

2.如权利要求1所述的一株防治水稻稻瘟病的嗜根寡养单胞菌S11，其特征在于，培养特征为：菌落圆形，中央隆起，边缘整齐，有粘性，黄色，不透明。

3.一种防治水稻稻瘟病的生防菌剂，其特征在于，包含权利要求1所述的嗜根寡养单胞菌S11。

4.如权利要求3所述的一种防治水稻稻瘟病的生防菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：所述嗜根寡养单胞菌经液体培养基扩大培养，获取生防菌剂。

5.如权利要求4所述的一种防治水稻稻瘟病的生防菌剂的制备方法，其特征在于，扩大培养前先进行嗜根寡养单胞菌S11种子液的制备，所述种子液制备采用PDB液体培养基培养，所述PDB液体培养基包括以下重量份的组分：200份马铃薯、20份葡萄糖，1000份水，pH7.0-7.2；

培养条件：于28-30℃，180-200rpm条件下，培养24h。

6.如权利要求5所述的一种防治水稻稻瘟病的生防菌剂的制备方法，其特征在于，将所制备的种子液按体积比1:100接种于PDB液体培养基中，于28-30℃，180-200rpm条件下，扩大培养48h，获得生防菌剂。

7.如权利要求4所述的一种防治水稻稻瘟病的生防菌剂的制备方法，其特征在于，所述生防菌剂中活菌浓度为0.5×10⁹-1×10⁹CFU/mL。

8.如权利要求1所述的嗜根寡养单胞菌S11在制备防治水稻稻瘟病的药物中的应用。

9.如权利要求1所述的嗜根寡养单胞菌S11在防治水稻稻瘟病中的应用。

10.如权利要求3所述的生防菌剂在防治水稻稻瘟病中的应用。

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