CN111662830A - 一种用于抑制小麦立枯病的昆虫病原真菌及其制备方法 - Google Patents

一种用于抑制小麦立枯病的昆虫病原真菌及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于抑制小麦立枯病的昆虫病原真菌及其制备方法，所述方法首先进行样本选取菌落挑选，然后配制液体培养基，并将病原真菌接种于液体培养基中获得无菌体发酵液，最后应用梯度稀释法测定无菌发酵液对小麦立枯病的拮抗作用，本发明所述球孢白僵菌具有较强的抑制小麦立枯病菌菌丝生长的能力，且随着体积浓度增加而增大，抑菌效果明显，同时其具有培养条件要求低，持效期长，环境友好无毒性等优点，具有良好的应用前景。

Description

一种用于抑制小麦立枯病的昆虫病原真菌及其制备方法
技术领域
本发明涉及昆虫病原真菌领域，尤其涉及一种用于抑制小麦立枯病的昆虫病原真菌及其制备方法。
背景技术
小麦立枯病又叫小麦全蚀病(Gaeu-mannomyces graminsis(sacc.)Arx&OlivierV.)，黑脚病。属于子囊菌门，核菌纲，球壳目，间座菌科，顶囊壳属。小麦苗期和成株期均可发病，以近成熟时病株症状最为明显，主要侵染麦根和茎基部1～2节。苗期病株矮小，严重时造成麦苗连片枯死。拔节期病苗返青迟缓，病株根部大部分变黑。抽穗后田间病株成簇或点片死亡，病根变黑，易于拔起，茎基部呈“黑脚”状，后颜色加深呈黑膏药状病株多在灌浆时出现白穗，遇干热风，病株加速死亡。小麦立枯病属于典型的根部病害，能够引起植株大片枯死，降低有效穗数、穗粒数及千粒重，一般会使小麦减产20％～30％，严重年份减产50％，甚至绝收。调查结果显示：部分麦田受全蚀病危害最低单产仅85kg，一般667m2产量75～100kg。按照《中华人民共和国植物检疫条例》规定，小麦全蚀病为检疫性病害，属国内植物检疫对象，该病害一旦发生，必须封锁疫区，禁止疫情扩散，严禁麦种、商品粮及其加工产品销售。
病原真菌是现在生物防治中重要的应用手段之一，球孢白僵菌(Beauveriabassiana)是当前世界上研究和实践中应用最多的一种病原真菌，在真菌分类学上属于半知菌亚门(Deutero mycotina)、丝孢纲(Hyphomycetaces)、丛梗孢科(Moniliaceae)、白僵菌属(Beauveria)。球孢白僵菌对寄主的侵染是复杂的生化过程，首先侵染、寄生活体昆虫的真菌，病原真菌有时也称虫生真菌，在自然界中广泛分布，其营养机理主要靠侵染后对吸取寄主体内的营养物质(如血淋巴)来维持自身的生长，从而破坏寄主体内的器官组织，真菌会分泌有毒代谢物质使寄主死亡。球孢白僵菌具有对人畜无害、环境友好的特点。目前以球孢白僵菌为代表的昆虫病原真菌已成为一类新型的具有市场开发潜力和应用前景的杀虫的生物资源。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种用于抑制小麦立枯病的昆虫病原真菌及应用，它为球孢白僵菌(Beauveria bassiana)HUBb20菌株，用于防治小麦立枯病菌。
为实现上述目的本发明提供如下技术方案：
一种用于抑制小麦立枯病的昆虫病原真菌制备方法，所述方法首先进行样本选取菌落挑选，然后配制液体培养基，并将病原真菌接种于液体培养基中获得无菌体发酵液，最后应用梯度稀释法测定无菌发酵液对小麦立枯病的拮抗作用；
进一步地，所述方法具体包括以下步骤：
S1:样本选取，挑选菌落
利用黄粉虫诱集法从土样中分离出昆虫病原真菌初生型真菌，用分离得到的昆虫病原真菌感染黄粉虫，挑取白色菌落为出生型菌落；
S2：配制液体培养基
液体培养基为1L改良马丁氏培养基，1L改良马丁氏培养基由如下组分以重量份组成：1000mL过滤后的马铃薯蒸煮液、20g葡萄糖、3gKH2PO4、1.5gMgSO4·7H2O、8mg维生素B1；
S3：接种
将病原真菌球孢白僵菌接种于液体培养基中，在28℃，pH为6.0～6.5，转速为180r/min的条件下，振荡发酵培养36h～48h；
S4：获得无菌体发酵液
将由步骤S3得到的液体倒入离心管中并冷冻离心管，然后取上清液，获得无菌体发酵液；
S5:结果测定
S51：前期准备
将马铃薯早疫病菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上置于26℃恒温培养箱内，培养之菌丝长满培养皿时备用；
S52：制备马铃薯葡萄糖琼脂培养基；
S53：拮抗作用测定；
S54：结果分析；
进一步地，上述步骤S1具体方法包括：选取5龄幼虫，待虫体死亡后，用体积百分含量为75％的酒精浸泡5s后，然后无菌条件下从虫体上刮取少量白色孢子于PDA固体培养基上，至于28℃生化培养箱中培养2-3天，最后挑取白色菌落为出生型菌落；
进一步地，上述步骤S52具体方法包括：称取200g洗净去皮的马铃薯并切成小块，加水煮烂，用八层纱布过滤，加热，再据实际实验需要加15-20g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，分装试管或者锥形瓶，加塞、包扎，115℃条件下灭菌20分钟后取出试管摆斜面或者摇匀，冷却后贮存备用；
进一步地，上述步骤S53具体方法包括：在无菌条件下，用内径为5mm的打孔器在PDA培养基上打孔，所述孔内加入无菌体发酵液60μL，在距所述孔4cm处接种小麦立枯病菌菌块，以加入无菌水为对照，每处理3次重复，置于26℃恒温培养箱内，当对照菌落长至满时，测量抑菌带宽度；
本发明的有益效果如下：
1、本发明所述球孢白僵菌具有较强的抑制小麦立枯病菌菌丝生长的能力，且随着体积浓度增加而增大，抑菌效果明显，同时其具有培养条件要求低，持效期长，环境友好无毒性等特点，具有良好的应用前景；
2、本发明应用梯度稀释法测定无菌发酵液对小麦立枯病的拮抗作用，昆虫病原真菌球孢白僵菌的无菌体发酵液对小麦立枯病菌具有明显的拮抗作用，且持效期较长，能够很好的抑制靠近拮抗菌一侧的小麦立枯病菌的生长。
附图说明
图1为球孢白僵菌对小麦立枯病抑制示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细描述。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。相反，本发明涵盖任何由权利要求定义的在本发明的精髓和范围上做的替代、修改、等效方法以及方案。进一步，为了使公众对本发明有更好的了解，在下文对本发明的细节描述中，详尽描述了一些特定的细节部分。对本领域技术人员来说没有这些细节部分的描述也可以完全理解本发明。
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限定。下面结合附图对本发明的实施例进行详细说明：
如图1所示，本发明提供一种用于抑制小麦立枯病的昆虫病原真菌制备方法，所述方法首先进行样本选取菌落挑选，然后配制液体培养基，并将病原真菌接种于液体培养基中获得无菌体发酵液，最后应用梯度稀释法测定无菌发酵液对小麦立枯病的拮抗作用。
所述方法具体包括以下步骤：
S1:样本选取，挑选菌落
利用黄粉虫诱集法从土样中分离出昆虫病原真菌初生型真菌，用分离得到的昆虫病原真菌感染黄粉虫，挑取白色菌落为出生型菌落；
S2：配制液体培养基
液体培养基为1L改良马丁氏培养基，1L改良马丁氏培养基由如下组分以重量份组成：1000mL过滤后的马铃薯蒸煮液、20g葡萄糖、3gKH2PO4、1.5gMgSO4·7H2O、8mg维生素B1；
S3：接种
将病原真菌球孢白僵菌接种于液体培养基中，在28℃，pH为6.0～6.5，转速为180r/min的条件下，振荡发酵培养36h～48h；
S4：获得无菌体发酵液
将由步骤S3得到的液体倒入离心管中并冷冻离心管，然后取上清液，获得无菌体发酵液；
S5:结果测定
S51：前期准备
将小麦立枯病菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上置于26℃恒温培养箱内，培养之菌丝长满培养皿时备用；
S52：制备马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)；
S53：拮抗作用测定；
S54：结果分析
从产生的抑菌带的第1天至第7天后菌丝绕过无菌发酵液接菌孔，拮抗菌周围平均产生5mm宽的抑菌带，靠近拮抗菌一侧的小麦立枯病菌停止生长。
上述步骤S1具体包括：选取5龄幼虫，待虫体死亡后，用体积百分含量为75％的酒精浸泡5s后，然后无菌条件下从虫体上刮取少量白色孢子于PDA固体培养基上，至于28℃生化培养箱中培养2-3天，最后挑取白色菌落为出生型菌落。
上述步骤S52具体包括：称取200g洗净去皮的马铃薯并切成小块，加水煮烂(煮沸20～30分钟，能被玻璃棒戳破即可)，用八层纱布过滤，加热，再据实际实验需要加15-20g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，分装试管或者锥形瓶，加塞、包扎，(115℃)灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面或者摇匀，冷却后贮存备用。
上述步骤S53具体包括：在无菌条件下，用内径为5mm的打孔器在PDA培养基上打孔，所述孔内加入无菌体发酵液60μL，在距所述孔4cm处接种小麦立枯病菌菌块，以加入无菌水为对照，每处理3次重复，置于26℃恒温培养箱内，当对照菌落长至满时，测量抑菌带宽度。
具体实施方式一：
一种用于抑制小麦立枯病的昆虫病原真菌，球孢白僵菌(Beauveria bassiana)HUBb20菌株，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏时间为2018年6月11日，保藏号为CGMCCNo.15866。
本实施方式的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)HUBb20，是按照以下方式获取的：
利用黄粉虫诱集法从哈尔滨市的土样中分离出昆虫病原真菌初生型真菌：用分离得到的昆虫病原真菌感染黄粉虫(5龄幼虫，虫体死亡后，用体积百分含量为75％的酒精浸泡5s后，无菌条件下从虫体上刮取少量白色孢子于PDA固体培养基上，至于28℃生化培养箱中培养2-3天，挑取白色菌落为出生型菌落并接种于改良马丁氏培养液中(马铃薯蒸煮液(需过滤)1000mL、葡萄糖20g、KH2PO4 3g、MgSO4·7H2O 1.5g、维生素B1 8mg)，于28℃下180r/min振荡培养24h后，按体积比1％转入发酵培养液中振荡培养发酵36-48h后，离心管中冷冻离心，取上清液，以获得无菌发酵液。
所筛选的具有抑制小麦立枯病菌的昆虫病原真菌为球孢白僵菌，在营养培养基上光学显微镜下观察菌落色泽为乳白色。菌落质地为粉状，菌落薄、中间褶皱、呈放射状生长。菌落底部无色或淡黄色。菌株产孢细胞轮生或单生，分生孢子梗反复向顶部轴式产孢，结果形成膝状弯曲的具有小齿突的产孢轴。分生孢子梗光滑呈穗状，分生孢子透明，壁薄且为球形，表面光滑。
对分离筛选得到的昆虫病原真菌进行分子鉴定，按以下步骤进行，提取菌株的总DNA，根据真菌通用引物，以基因组DNA为模板进行PCR扩增。然后利用胶回收试剂盒回收纯化PCR产物，之后进行克隆、转化、测序。测序结果与Genbank中16S rDNA序列进行同源性对比，同源性为99％以上。通过结合菌体形态特征、分子鉴定结果确定昆虫病原真菌HUBb20菌株属于白僵菌属(Beauveria spp.)，为球孢白僵菌(Beauveria bassiana)。
平板抑菌实验表明，在固体培养条件下，本发明球孢白僵菌(Beauveriabassiana)Bb08具有较强的抑制小麦立枯病菌菌丝生长的能力，随着体积浓度的增加而增大，持效期长，抑菌效果显著。
一种具有抑制马铃薯早疫病菌的昆虫病原真菌，用于防治小麦立枯病，还可以采用昆虫病原真菌球孢白僵菌的菌液。
具体实施方式二：
一种用于抑制小麦立枯病的昆虫病原真菌球孢白僵菌菌液制备方法样本选取和菌落的挑选同具体实施方式一，接种是按照以下步骤进行：
将球孢白僵菌(Beauveria bassiana)HUBb20接种于液体培养基中，在28℃，180r/min的条件下，振荡发酵培养36～48h，倒入离心管中冷冻离心后，取上清液，获得无菌体发酵液。
具体实施方式三：
样本选取和菌落的挑选步骤与具体实施方式一相同，所述的液体培养基为改良马丁氏培养基：1L的改良马丁氏培养基是由1000mL马铃薯蒸煮液(需过滤)、20g的葡萄糖、3g的KH2PO4、1.5g的MgSO4·7H2O、8mg的维生素B1组成。
将球孢白僵菌(Beauveria bassiana)HUBb20接种于液体培养基中，在28℃，180r/min的条件下，振荡发酵培养36～48h，倒入离心管中冷冻离心后，取上清液，获得无菌体发酵液。
应用梯度稀释法测定无菌发酵液对小麦立枯病的拮抗作用，具体步骤为：
1、前期准备：将本实验室保存的小麦立枯病菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上置于26℃恒温培养箱内，培养之菌丝长满培养皿时备用。
2、马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)的制备：马铃薯先洗净去皮，再称取200g马铃薯切成小块，加水煮烂(煮沸20～30分钟，能被玻璃棒戳破即可)，用八层纱布过滤，加热，再据实际实验需要加15-20g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，分装试管或者锥形瓶，加塞、包扎，(115℃)灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面或者摇匀，冷却后贮存备用。
3、拮抗作用测定：在无菌条件下，用内径为5mm的打孔器在PDA培养基上打孔，孔内加入无菌体发酵液60μL，在距该孔4cm处接种小麦立枯病菌菌块。以加入无菌水为对照，每处理3次重复。置于26℃恒温培养箱内，当对照菌落长至满时，测量抑菌带宽度。
4、结果分析：经测定球孢白僵菌HUBb20的无菌体发酵液对小麦立枯病有明显的抑制作用，从产生的抑菌带的第1天至第7天后菌丝绕过无菌发酵液接菌孔，拮抗菌周围平均产生5mm宽的抑菌带，靠近拮抗菌一侧的小麦立枯病菌停止生长。
对小麦立枯病的拮抗作用结果如图所示，由图可以看出昆虫病原真菌球孢白僵菌HUBb20的无菌体发酵液对小麦立枯病菌具有明显的拮抗作用，且持效期较长，能够很好的抑制靠近拮抗菌一侧的小麦立枯病菌的生长。
序列表
哈尔滨学院
一种用于抑制小麦立枯病的昆虫病原真菌及其应用
碱基总数：515
DNA
球孢白僵菌(Beauveria bassiana)
TAGTCCTACG CGCGATCAGG ATGAAACGTA AGCTCCAGTG CAAGTCTTCA ACCCACAAAA 60
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GGGGCCGCCC GGCGACCAGG TCAGGCGCAG GCCCGACCCC GCTCAGGCGG CTTCGTTGCT 480
ATCCATCCAA GTGTCTTCCC AATCCCTCAA CTTTT 515
序列表
<110> 哈尔滨学院
<120> 一种用于抑制小麦立枯病的昆虫病原真菌及其制备方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 515
<212> DNA
<213> 球孢白僵菌(Beauveria bassiana)
<400> 1
tagtcctacg cgcgatcagg atgaaacgta agctccagtg caagtcttca acccacaaaa 60
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atccatccaa gtgtcttccc aatccctcaa ctttt 515

Claims (6)

1.一种用于抑制小麦立枯病的昆虫病原真菌制备方法，其特征在于，所述方法首先进行样本选取菌落挑选，然后配制液体培养基，并将病原真菌接种于液体培养基中获得无菌体发酵液，最后应用梯度稀释法测定无菌发酵液对小麦立枯病的拮抗作用。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：
S1:样本选取，挑选菌落
利用黄粉虫诱集法从土样中分离出昆虫病原真菌初生型真菌，用分离得到的昆虫病原真菌感染黄粉虫，挑取白色菌落为出生型菌落；
S2：配制液体培养基
液体培养基为1L改良马丁氏培养基，1L改良马丁氏培养基由如下组分以重量份组成：1000mL过滤后的马铃薯蒸煮液、20g葡萄糖、3gKH2PO4、1.5gMgSO4·7H2O、8mg维生素B1 ；
S3：接种
将病原真菌球孢白僵菌接种于液体培养基中，在28℃，pH为6.0～6.5，转速为180r/min的条件下，振荡发酵培养36 h～48h；
S4：获得无菌体发酵液
将由步骤S3得到的液体倒入离心管中并冷冻离心管，然后取上清液，获得无菌体发酵液；
S5:结果测定
S51：前期准备
将小麦立枯病菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上置于26℃恒温培养箱内，培养之菌丝长满培养皿时备用；
S52：制备马铃薯葡萄糖琼脂培养基；
S53：拮抗作用测定；
S54：结果分析。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，上述步骤S1具体方法包括：选取5龄幼虫，待虫体死亡后，用体积百分含量为75%的酒精浸泡5s后，然后无菌条件下从虫体上刮取少量白色孢子于PDA固体培养基上，至于28℃生化培养箱中培养2-3天，最后挑取白色菌落为出生型菌落。
4.根据权利要求2所述方法，其特征在于，上述步骤S52具体方法包括：称取200g洗净去皮的马铃薯并切成小块，加水煮烂，用八层纱布过滤，加热，再据实际实验需要加15-20g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，分装试管或者锥形瓶，加塞、包扎，115℃条件下灭菌20分钟后取出试管摆斜面或者摇匀，冷却后贮存备用。
5.根据权利要求2所述方法，其特征在于，上述步骤S53具体方法包括：在无菌条件下，用内径为5mm的打孔器在PDA培养基上打孔，所述孔内加入无菌体发酵液60μL，在距所述孔4cm处接种小麦立枯病菌菌块，以加入无菌水为对照，每处理3次重复，置于26℃恒温培养箱内，当对照菌落长至满时，测量抑菌带宽度。
6.一种用于抑制小麦立枯病的昆虫病原真菌，所述真菌由权利要求1~5任一项所述的方法制备。
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