UA121062C2

UA121062C2 - Штам бактерій bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum bs89 як засіб підвищення продуктивності рослин та їх захисту від хвороб

Info

Publication number: UA121062C2
Application number: UAA201803272A
Authority: UA
Inventors: Владімір Кузміч Чєботар; Владимир Кузьмич Чеботарь; Сєргєй Вікторовіч Єрофєєв; Сергей Викторович Ерофеев
Original assignee: Общєство С Огранічєнной Отвєтствєнностью "Бісолбі Плюс"; Общество с ограниченной ответственностью "БИСОЛБИ ПЛЮС"
Priority date: 2015-09-02
Filing date: 2016-09-01
Publication date: 2020-03-25
Also published as: WO2017039491A1; TR201806559T1; CN110520519A; BG67257B1; PH12018550036A1; BG112709A; RS20180250A1; RU2599416C1; US20200029571A1

Abstract

Винахід стосується штаму бактерій Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89, який є засобом підвищення продуктивності рослин та захисту їх від хвороб, що викликаються фітопатогенними мікроорганізмами.

Description

Винахід стосується біотехнології та сільського господарства та стосується нового штаму ризосферних бактерій р. Васійш5 як засобу для підвищення продуктивності рослин та їх захисту від фітопатогенних мікроорганізмів.

Сучасне високоефективне сільськогосподарське виробництво неможливо без застосування добрив та засобів захисту рослин. Так, широке використання мінеральних добрив, в першу чергу азотних, дозволило за останні 50 років більше ніж в 5 разів підняти врожайність основних сільськогосподарських культур у розвинених країнах. Однак, процес отримання і застосування мінеральних азотних добрив є найбільш енергомістким - на нього витрачається до від 30 до 50 95 всієї енергії, яка споживається у сільськогосподарському виробництві.

В наш час відомо безліч мікробіологічних препаратів для сільського господарства різного призначення: ті, що стимулюють ріст, а також ті, що пригнічують розвиток фітопатогенних бактерій та грибів.

Мікроорганізми можуть стимулювати їх ріст (Аго5ріййЙШит), зв'язувати азот (АпПігобріийт), запобігати захворюванням рослин (Рзепдотопаб5 або Васійй5), або ж знищувати шкідливих комах (Зігеріотусев).

Відомий "Спосіб обробки насіння", описаний у заявці Мо 2170987 Великобританії з пріоритетом від 14.02.85 р. МКІ 4 А 01 С 1/06, був опублікований у ІСМ Ме10 за 1987 р. Вказаний спосіб передбачає обробку насіння складом, який складається з мікроорганізмів, носія, наприклад, висівок, та клею, такого як смола гатті. Найбільш сприятливі результати отримують при обробці насіння пшениці.

Відомий патент РФ Мо 2140138 на групу винаходів "Спосіб передпосівної обробки насіння овочевих культур та спосіб отримання препарату для передпосівної обробки насіння овочевих культур" за заявкою Мо 98120341 з пріоритетом від 13.11.1998 р. на імя ЗАТ ССПР "СОРТСЕМОВОЩ", МПК АО1С1/06, який був опублікований 27.10.1999 р.

Вказані способи здійснюються за допомогою біофунгіцидного препарату, який містить штам бактерій Васійив5 зибійй5 Ч-13 (депонований під реєстр. номером ВНДІСГМ Д-60б в групі епіфітних мікроорганізмів). Спосіб отримання біофунгіцидного препарату полягає у змішуванні культуральної рідини, яка містить штам В.5. Ч-13, який попередньо культивують у рідкому стерильному живильному середовищі, з емульсією ПВА, водним розчинником і стерильною

Зо крейдою або доломітом у певних пропорціях. Винаходи дозволяють підвищити ефективність захисту овочевих культур від фітопатогенних грибів шляхом передпосівної обробки насіння.

Відомий патент РФ Мо 2099947 на винахід "Біопрепарат Фітоспорин для захисту рослин від хвороб" за заявкою 96121980 з пріоритетом від 15.11.1996 р. на ім'я Інституту Мікробіології і вірусології НАН України (ОА) ї НВО "Башкирское" (КО), МПК АО1М63/00; С12М1/20; С121:125, публікація 27.12.1997 р.

Основу препарату "Фітоспорин" складає штам бактерій Васіййє 5и,ибБійвБ ВНДІСГМ 128 з концентрацією клітин 109 - 1019 на 1 мл. фізрозчину в кількості 92-98 об. 95 і наповнювач в кількості 2-8 об. 95. При цьому штам Васійив5 зибійв ВНДІСГМ 128 характеризується високою антагоністичною активністю відносно фітопатогенних бактерій і грибів, що дозволяє використовувати його для захисту різних видів сільськогосподарських (зернових і бобових) і декоративних деревних рослин шляхом передпосівної обробки насіння.

Відомий патент РФ Мо 2478290 на винахід "Біопрепарат для стимулювання росту і захисту рослин від хвороб, підвищення врожайності і грунтової родючості" патенту РФ Мо 2478290 (заявка Мо 2011145665) з пріоритетом від 11.11.2011 р. на ім'я ТОВ "Бациз", МПК АО1М63/02, А0О1С1/06, С12М1/20, С12К1/07, публікація заявки 20.05.2012 р., патенту - 10.04.2013 р.

Біопрепарат містить біомасу Васійи5 атуїіоїїдиєтасієпе ВКМ В-11008 ї гумати з наступним співвідношенням компонентів, в об. 90: біомаса вегетативних клітин і спор бактерій ВасішШв5 атупоїїдиетасієпе ВКМ В-11008 1,24-1,30 х 1010 КУО/мл культуральної рідини і вмістом спор 94 95 від загальної кількості КУО - 99,0, гумати - 1,0. Біопрепарат дозволяє захистити рослини від грибних та бактеріальних хвороб, поліпшити фітосанітарний стан грунту і підвищити його родючість, збільшити врожайність культур.

Недоліком є обмежена галузь застосування (тільки зернові культури: пшениця і ячмінь), а також необхідність високого значення титру клітин і спор штаму-продуцента у складі препарату для ефективного його застосування.

Відомий патент РФ Мо 2528058 на винахід "Штам бактерій Васіїшв5 атуйпоїїдиєтасіеп5, який має фунгіцидну і бактерицидну дію, і біологічний препарат на його основі для захисту зернових рослин від захворювань, які викликаються фітопатогенними грибами" за заявкою 2013125726 з пріоритетом від 04.06.2013 р. на ім'я ФДУП (Федеральне державне унітарне підприємство) "ДержНдДігенетика", МПК АО1М63/02, АО1С1/06, С12М1/20, С12К1/07, публікація 10.09.2014 р.

Було описано штам бактерій Васійи5 атуіоїїдиетасіеп5 ВКПМ В-11475, який має фунгіцидну і бактерицидну дію. Також запропоновано біологічний препарат для захисту зернових рослин від захворювань, які викликаються фітопатогенними грибами. Біологічний препарат отримують шляхом змішування активного початку у вигляді культуральної рідини вказаного штаму з титром 2-3 х 109КУО/мл і носія у вигляді дрібнодисперсних гранул діатоміту у відношенні до об'єму 1:3 з подальшим висушуванням.

Винаходи дозволяють підвищити врожайність зернових рослин і зменшити процент їх зараженості фітопатогенними грибами.

Недоліком є обмежена галузь застосування (тільки зернові культури) і відсутність у штаму бактерицидної активності.

Відомі патентна заявка Китаю СМ102703354 (А) від 03.10.2012 р. на бактерії штаму Васійшв5 атупо!їїдиеїтасієп5 5!0р5р. ріапіагит В203, який проявляє фунгіцидний ефект проти антракнозу полуниці і деяких інших хвороб, які викликаються грибами; МПК АО1М63/00, -/02; АОТРЗ/ОО0;

С12М1/20; С12К1/07 і патентна заявка Китаю СМ104195072 (А) від 10.12.2014 р. на базі національної заявки СМ20141385641 з пріоритетом від 06.08.2014 р. на бактерії штаму Васійши5 атупоїїдиеїасієп5 5!ц05р. ріапіагит В232, який має фунгіцидний ефект проти дотихицієвого некрозу тополі і деяких інших грибних хвороб; МПК АО1М63/00; АОТРЗ3/00; С12М1/20; С1221/07.

Недоліком описаних штамів є обмежена галузь їх застосування (полуниця, тополя) і відсутність у них бактерицидної активності. Крім того, в патентах не вказані титри препарату, при яких вони є ефективними для контролю грибних захворювань полуниці і, відповідно, тополі.

Відома патентна заявка Румунії ВО127468 (Аг) від 29.06.2012 р. на базі національної заявки на винахід КО20100001379 з пріоритетом від 21.12.2010 р. "Штам Васійни5 атупоїїдиетасієп5 5иБзр. ріапіагит В100 для росту сільськогосподарських культур", МПК АО1М63/00; С12М1/20.

Штам проявляє фунгіцидний (продукція ліпопептидних і полікетидних антибіотиків) і бактерицидний ефект проти широкого спектру фітопатогенних грибів в грунті і бактеріальних хвороб фруктових дерев, а також стимулюючий ефект за рахунок ендофітного виробництва ростових факторів. Здатний продукувати ряд ферментів: протеази, лактонази, амілази, фітази і целюлази. Здатний розчиняти неорганічні сполуки фосфору, селена. Може використовуватися для зміцнення зерна зернових культур (пшениці і кукурудзи) в регіонах з дефіцитом селену.

Зо В цій публікації не вказано титру Васійн5 аптуїоїіїдиетасієпе взиИиб5р. ріапіагит В100, необхідного в препараті при використанні штаму цих бактерій для контролю захворювання рослин. Недоліком також є обмежена галузь застосування (зернові культури і плодові дерева).

Відома також міжнародна заявка УУО2012130221 (А2) від 24.03.2012 р. на базі національної заявки Німеччини ОЕ20111015803 з пріоритетом від 01.04.2011 р. на винахід "Засіб проти фітопатогенних мікроорганізмів", МПК АО1М63/00; СО7К14/32; С12М1/20; С12А1/07.

Описано новий штам Васійни5 атуїоїїдиеїасієпе 5!Ииб5р. ріапіапит АВІО1, який характеризується високою ефективністю проти хвороби кореневої гнилі (чорна парша") в картоплі, викликаної ВПі2осіопіа 5о0іапі.

Розроблено протигрибний препарат Бактеріоцин для лікування грибних та інших мікробних і вірусних інфекцій, який отримують на основі спор бактерій Васійй5 атуйпоїїдцегасієпе 5!Ирзгр. ріапіагтит АВ101, які мають сильний ефект відносно грампозитивних бактерій.

Штам Васіїив5 атуїоїїдиетасієпе 5з!йирер. ріапіагит АВТО продукує 10 різних речовин: фунгіцидних (різних груп антибіотичних речовин: дипептидних, ліпопептидних і сідерофорів), бактерицидних (полікетидів і бактеріоцинів) і антивірусних, проти широкого спектру хвороб рослин і особливо проти кореневої гнилі картоплі, викликаної фітопатогенним грибом

КПі2госіопіа зоїапі Може використовуватися у сільському господарстві, у захисті рослин і у біотехнології.

В даній публікації не вказано титру штаму, необхідного в препараті при використанні цих бактерій для контролю хвороб рослин.

Недоліком також є обмежена галузь використання - в основному описаний ефект проти кореневої гнилі картоплі, викликаної фітопатогенним грибом ВНіосіопіа зоїапі.

Відомий патент Ме2495119 на винахід "Штам бактерій Васійи5 з!ибБій5 8А як засіб підвищення продуктивності рослин та їх захисту від фітопатогенних мікроорганізмів" за заявкою Мо 2012151104 з пріоритетом від 29.11.2012 на ім'я ДНУ ВНДІСГМ (Державна наукова установа "Всеросійський науково-дослідний інститут сільськогосподарської мікробіології")

Россільгоспакадемії, який було вибрано як прототип.

Штам депоновано в колекції ДНУ ВНДІСГМ Россільгоспакадемії 14.11.2011 р. під номером

ЕСАМ 00876 як засіб підвищення продуктивності рослин та їх захисту від фітопатогенних мікроорганізмів. Вказаний штам володіє високою фунгіцидною і бактерицидною активністю. бо Встановлена також висока рістстимулююча активність штаму Васійи5 5,иБій5 8А і біопрепарату на його основі, що приводить до підвищення врожайності рослин. Дослідним шляхом підтверджено, що ефективність штаму зумовлена здатністю його бактерій створювати з рослинами мікробно-рослинну систему шляхом колонізування ризосфери і кореневої системи рослин.

У зв'язку з тим, що штами бактерій таксономічної групи Васійй5 атуїоїіїдиетасієпе 5!,регр. ріапіагит депоновані в колекціях, розташованих від замовника територіально далеко (і навіть в інших державах), а також, що в деяких публікаціях не вказано титр штаму бактерій, необхідний при його використанні в біопрепараті, як прототип було обрано доступний замовнику штам бактерій Васійи5 5,иБій5 8А, депонований в колекції ДНУ ВНДІСГМ.

Задачею винаходу є виявлення штаму ризосферних бактерій, придатного для застосування в сільському господарстві як засобу для захисту рослин від фітопатогенних мікроорганізмів, поліпшення живлення сільськогосподарських культур, підвищення продуктивності рослин, та який дозволяє розширити арсенал подібних засобів.

Вказана задача вирішується за рахунок того, що як засіб підвищення продуктивності рослин та їх захисту від фітопатогенних мікроорганізмів в сільському господарстві використовується штам ризосферних бактерій Васйи5 атуїпоїїдиетасієп5 5иб5р. ріапіагит В589, який дозволяє розширити арсенал подібних засобів.

Штам ризосферних бактерій Васійи5 атупоїіїдиегасієп5 зирегр. ріапїагит В589 був виділений з коренів озимої пшениці сорту "Лира", яка росте на чорноземних грунтах Краснодарського краю

Російської Федерації.

Штам депоновано у Відомчій колекції корисних мікроорганізмів сільськогосподарського призначення (КСАМ) ФДБНУ ВНДІСГМ (Федеральна державна наукова установа "Всеросійський науково-дослідний інститут сільськогосподарської мікробіології") 09.07.2015 р. під номером КСАМ 03458 як засіб підвищення продуктивності рослин та їх захисту від фітопатогенних мікроорганізмів (копія довідки про депонування додається).

Штам характеризується наступними морфолого-культуральними і фізіолого-біохімічними ознаками.

Клітини мають форму правильних паличок із закругленими кінцями і монополярним перитрихіальним розташуванням джгутиків. Розмір клітин (0,9-1,8) мкм. Штам утворює спори,

Зо розташовані в центрі клітини, позитивно забарвлюється за Грамом. Через 24 години росту на рідкому живильному середовищі спостерігалось накопичення полі-В-оксибурата. Зростання в рідкому і напіврідкому живильному середовищі мікроаерофільне, метаболізм - дихальний і бродильний. На м'ясо-пептонному агарі утворює сухі колонії кремового кольору, пастоподібної консистенції з нерівними порізаними краями. Діаметр колоній (5-12) мм. Оптимальна температура для росту 33 "С. При температурі більше 45 "С і менше 15 "С ріст уповільнений.

Оптимальне значення рН середовища 6,8, ріст має місце також при рН від 4,5 до 9,0. Штам гідролізує казеїн, желатину, крохмаль і лакмусове молоко. Лакмус при цьому знебарвлюється.

Штам має сильну каталазну активність, амілазну, протеазну, ліпазну і фосфоліпазну активність.

Штам здатний рости при 50 "С, 10 95 масі та 0,001 95 лізоциму.

Як єдине джерело вуглецю штам використовує арабінозу, ксилозу, маніт, глюкозу, галактозу, фруктозу, мальтозу, сорбіт, гліцерин, декстрин, крохмаль з утворенням кислоти та рамнозу і дульцит з утворенням лугу. Використовує переважно мінеральні форми азоту - солі амонію і нітрати, а також амінокислоти і білки.

Дослідним шляхом було встановлено, що штам бактерій Васіїшв5 атупоїїдиетасієп5 5ирегр. ріапіагит 8589 підвищує врожай рослин і проявляє антагоністичні властивості відносно збудників хвороб сільськогосподарських культур, а саме: - пшениця озима і яра - проти мучнистої роси (Егузірне дгатіпів), бурої іржі (Риссіпіа гесопайа), фузаріозної кореневої гнилі (Ризагпшт сиітогит), базального бактеріозу (Рзеидотопаз зугіпдає); 5О - ячмінь ярий - проти пліснявіння насіння (Репісіїйшт, АМНетагіа), кореневих гнилів (Віроїагіз зогокіпіапа), темно-бурої плямистості (Огеспіега зогокіапа); - капуста білокачанна і кольорова - проти судинного бактеріозу (Хапіпотопав сатревігіз), Чорної ніжки (Впігосіопіа зоіапі), пітіозної кореневої гнилі (Руїшіт ітедшіагє); - картопля - проти фітофторозу (РНуїорпога іпіезіапх), ризоктоніозу (Впігосіопіа воЇапі), фузаріозного в'янення (Ризагит охузрогит); - цукровий буряк - проти коренеїда (Руїпішт дерайапит, Рота Беїав), церкоспорозу (Сегсозрога Беїісоїа);

- соняшник - проти білої гнилі (сієгоїпіа зсієгойогит), фомопсису (Рпоторзвів

Пеїїапіні); - льон - проти фузаріозу (Ризапцт амепасеут Засс, Разапцт охузрогит у. огіпосегозв Її.

Іпі (Вої!) Віаї), бактеріозу (Сіозідіит тасегап5 бспаго).

Дослідним шляхом також було встановлено, що штам бактерій Васійшв5 атуїоїїдиєтасіеп5 5ирер. ріапіагит 8589 має фунгіцидну активність проти фітопатогенних грибів Ризагт сцтогит, Еивагйт дгатіпеагшт, Еивзагішт зрогоїіспіоіде5, Егузірпе адгатіпі5, Рпуюрніога іптевіап5, НПі2госіопіа 5оіапі, РуїШішт імтедшіаг, Ріазторага міїйсоїа, Опсіпша песаїйог, Воїгуїї5 сіпегеа, а також бактерицидну активність проти фітопатогенних бактерій Хапіпотопав5 сатревігів, Рзендотопаз зугіпдає, Сіамірасієг тіспідапепзе.

В таблицях 1, 2 надані результати перевірки антагоністичної активності проти фітопатогенних мікроорганізмів 3-х штамів ризосферних бактерій: Рзендотопавз Пиогезсепв АР- 33 (мікробний препарат Планриз), Васійи5 зибійв5 ВНДІСГМ 128 (мікробний препарат

Фітоспорин), Васіїйи5 зибБійв 8А (прототип), Васіййв5 атупоїіїдцеїгасієпв зиб5р. ріапіагит 8589 (штам, який заявляється).

Бактерицидну активність перевіряли на 5 штамах фітопатогенних бактерій: Рзейидотопав вугіпдає 8300, Рзепдотопа5 зугіпдає 2314, Епміпіа сагоїомога А-1, Егміпіа сагоїомога 3391,

Сіамірасієг тіспідапепвзе 17-1.

Спочатку висіювали бактерії бактеріологічною петлею суцільним газоном на поверхні живильного агару і культивували 48 годин при 28"С. В день перевірки на бактерицидну активність висіювали суцільним газоном на голодному картопляному агарі штами вказаних фітопатогенних бактерій. Потім переносили на поверхню тільки-но засіяного середовища вирізані стерильним пробковим свердлом агарові блочки зі зрілою культурою бактерій, які тестуються. Перенос робили за допомогою стерильного скальпелю і прожареного пінцету.

Чашки з блочками культивували протягом 24 годин при температурі 28 "С, після чого заміряли діаметр зони інгібування навколо блочків.

Результати вимірів надані в Таблиці 1.

Таблиця 1

Антагоністична активність штамів ризосферних бактерій відносно фітопатогенних бактерій

Штам бактерій Ееміпіа Рзейдотопав | Рвендотопав Ееміпіа СіІамірасіег сагоїомога зугіпдає зугіпдає сагоїюмога | тіспідапеп5е

А-1 8300 2314 3391 17-1

Рзепдотопав

ТПиогезсеп5 АР-3З3 (Планриз) 11,020,8 7,550,3 11,35-1,0 12,5:5-1,1 15,6--1,1

Васіїив5 5ЇИбБіїв

ВНДІСГМ 128 (Фітоспорин) 9,85-0,7 11,0-0,8 12,55-1,0 17,55-1,2 17,75-1,3

Васіїив5 5!,ибійй5 вА (прототип) 17,5:21,3 25,55-1,9 217,752,0 24,151,7 22,15-1,7

Васіїй5 атупоїїдиетасієеп5 зирегр. ріапіагит В589 (який заявляється 20,521,7 35,152,5 49,753,7 55,3ж3,9 42,312,9

З даних, які наведено в Таблиці 1, видно, що заявлений штам бактерій Васійи5 ату!оїїдиеїтасіеєпе 5!цИр5р. ріапіалит 8589 має більшу антагоністичну активність відносно фітопатогенних бактерій у порівняні з прототипом - штамом Васіїшв зи,иБІійї5 вА.

Фунгіцидну активність перевіряли відносно 5 фітопатогенних грибів: Рнпуїорптюога іпіезіапв,

Впі2осіопіа з5оіапі, Гизагйт сиітогит, Ризагішт 50оїапі, Руїпішт ийітит з використанням методу "колодців".

У розігрітий та остиглий до температури 37 "С картопляно-декстрозний агар додавали суспензію спор грибів (105 КУО/мл) з розрахунку 1 мкл суспензії на 1 мл середовища. Отриману суміш розливали по чашках Петрі, після застигання в ній робили прожареним пробковим свердлом 4 рівних наскрізних отвори, розташовані квадратом. В ці отвори заливали по 100 мкл бактеріальної суспензії з титром клітин 103 КУО/мл. Одна чашка була залишена з пустими "колодцями" як контрольний варіант. Всі чашки з "колодцями" культивували протягом 72 годин при температурі 280. Фунгіцидну активність визначали як зони інгібування росту фітопатогенного грибу навколого "колодців". Результати вимірів надано в Таблиці 2.

Таблиця 2

Антагоністична активність штамів ризосферних бактерій відносно фітопатогенних грибів

Зона інгібування росту, мм

Штам бактерій Рпуїорніога | Впігосіопіа Ризагішт | Ризагпт | Рушіт іптевіапв воїапі ситогит воїапі МКітит

Рзейдотопавз Пиогезсеп5 АР-3З3 (Планриз) 3,5ж0,2 11,1-0,7 7,550,5 12,68:20,9 | 12,5:51,1

Васіїив5 5,ибійй5 ВНДІСГМ 128 (Фітоспорин) 11,1-0,8 13,55-1,0 19,51, 21,4-1,5 ) 25,3532,0

Васіїив 5иЇибійї5 вА (прототип) 21,321,9 19,5:5-1,1 23,5ж1,5 0 25,352,0 0 27,71321

Васіїи5 атупоїїдиетасієп5 5!р5р. ріапїіагит В589 (який заявляється) 28,7-1,9 35,8:2,9 37,3ж-2,9 | 30,7-1,8 | 45,3:53,1

З даних, наведених у Таблиці 2, видно, що заявлений штам бактерій Васішв5 ату!оїїдиеїтасієпе 5!Ир5р. ріапіаглит 8589 має більшу антагоністичну активність відносно фітопатогенних грибів у порівнянні зі штамом - прототипом Васійив 5,ибБійїв 8А.

Як показав аналіз повногеномного секвенування, така активність штаму Васіїїшв5 атупо!їїдиеїтасієп5 зирер. ріапіагит В589 зумовлена наявністю в його геномі генів, які кодують продукцію фунгіцидних і бактерицидних речовин: сурфактинів, фенгіцинів, бациломіціну Д, циклічних ліпопептидів, бацилобактину, бацилолізину, бацилену, макролактину, плантазоліцину, амілоциклізину (Таблиця 3).

Нерибосомні синтезовані пептиди (НСПП) включають в себе широке коло структурно неоднорідних антибіотичних сполук. Найбільш відомі і досліджені НСП включають сурфактини, фенгіцини і ітурини.

Ітгурини і фенгіцини відомі як основні фактори, які визначають антифунгальну активність різних бацил. (11.

Фенгіцини особливо активні відносно міцеліальних грибів. (21.

Сурфактини необхідні для формування біоплівки і розповсюдження бактерій у навколишньому середовищі, тим самим сприяючи їх колонізації у коренях і тканинах рослин і прояву їх біоконтрольної активності (ЗЇ. Крім того, сурфактини та, в меншій мірі, фенгіцини здатні запускати захисні механізми рослин (11.

Таблиця З

Кластери генів, які залучені до синтезу антибіотичних метаболітів штаму Васіїйи5 атупіоїїдиегасієп5 зирегр. ріапїагит В589

Метаболіт, що . . . .

Клас речовин "ц Кластер генів Біологічна функція продукується

Нерибосомні Сурфактин 5ПАВСО Утворення біоплівок, пептиди, які антифунгальна активність синтезуються

Фенгіцин ТепАВСОЕ Антифунгальна активність

Бациломіцин ртусвАао Антифунгальна активність

Циклічний пІзАВСОЕЕ Невідомо ліпопептид

Бацилібактин апБАСОЕР Синтез сидерофорів

Бацилізин расАВСОЕ Антибактеріальна активність

Полікетиди Дифіцидин апАУХВСОЕРа Антибактеріальна активність

Бацилен раеєвСср ЄС НІМІ. Антибактеріальна активність

Макролактин тіпАВСОЕРані Антибактеріальна активність

Невеликі Плантазоліцин ргпЕкКаніІМЧео Нематицидна і антибактеріальна пептиди, які активність ибосомно : : : : й одукуються Амілоциклізин аспвАСОЕР Антибактеріальна активність родуку проти грампозитивних бактерій

Крім ліпопептидів, кластер генів ДБ залучено до синтезу сидерофора бацилібактину.

Бактеріальні сидерофори мають високу спорідненність для тривалентного заліза і здатні ефективно зв'язувати його в залізо-дефіцитних середовищах, наприклад, в грунтах, в результаті чого іони заліза стають менш доступними фітопатогенам і тим самим сприяють біоконтрольній діяльності сидерофор-продукуючих бактерій |4Ї. Оперон анНЬ, який керує синтезом бацилібактину, є подібним до такого ж оперону у грамнегативних бактерій, які продукують ентеробактин.

Штам Васіїнз5 атупоїїдиеїтасіеп5 зирегр. ріапіагит В589 має три великих кластери генів, які кодують полікетиди: дифіцидин, бацилен і макролактин (Таблиця 3). Всі три метаболіти мають широку антибактеріальну активність відносно патогенів рослин і людини і можуть бути потенціально використані в медицині (5,6).

Геном штаму Васіїи5 атуїоїїдиетасієпе зирвр. ріапіагит В589 містить кластер генів для виробництва двох невеликих пептидів, які рибосомно продукуються: плантазоліцина і амілоциклізина (Таблиця 3). Плантазоліцин є новим типом невеликих пептидів, які рибосомально продукуються, з вузьким спектром антимікробної активності відносно інших бацил, особливо В. Апінгасіз (збудник сибірської виразки) І|7|. Крім того, цей метаболіт здатний пригнічувати нематоди, які утворюють гали (новоутворення) на коренях рослин. Декілька інших грампозитивних бактерій, в т.ч. Сіамірбасієг тіспідапеп5і5 зиб5р. зередопісив, Согуперасівегійт игеаіуйсит Ю5М7109 і Вгєемірасієтіит Ііпеп5 ВІ 2 також мали подібний біосинтетичний кластер в своїх геномах |8). Амілоциклізин є циклічним пептидом, який належить до групи бактеріоцинів.

Він має високу антибактеріальну активність відносно тісно зв'язаних грампозитивних бактерій -- ця перевага може використовуватися для пригнічення бактеріальних конкурентів в ризосфері

Ї/!. Кластер генів асп, який керує синтезом цього бактеріоцина, широко розповсюджений серед видів роду ВасіПн5/Раєпірасійй5 таксономічних груп. Ще один невеликий пептид мерасцидин було знайдено в декількох видах Васійи5 атупоїїдиегасієпев зирзр. Ріапіагит (9), але штам В589 містить лише фрагментарні частини всього кластера генів і може бути не в змозі синтезувати мерасцидин.

Експеріментально встановлено, що штам бактерій Васійш5 атуйпоїїдиегасієпв зибБзгр. ріапіаплит 8589 має не тільки фунгіцидну активність проти фітопатогенних бактерій і фітопатогенних грибів, але і фітостимулюючий ефект по відношенню до різних сільськогосподарських культур (наприклад, редис, пшениця).

Аналіз рістстимулюючої активності штамів бактерій проводили за оригінальною методикою з використанням рослин редису сорту "Дуро" і пшениці сорту "Веда". Для цього насіння спочатку стерилізували протягом 2-х хвилин в 70 95 етанолі і відмивали в стерильній водопровідній воді.

Потім насіння замочували на 30 хв. в суспензії бактерій з титром клітин 107 КУО/мл і розкладали в стерильні вологі камери по 20 шт. в 3-х кратній повторності. Контрольні насіння замочували в стерильній водопровідній воді. Далі рослини інкубували у фітотроні 72 г при 1-28 "С. Після інкубації вимірювали довжину коренів і пагонів, а рістстимулюючу активність штамів бактерій, які тестуються, розраховували відносно контрольних проростків. Результати надані в таблицях 4,5.

Таблиця 4

Рістстимулююча активність штамів ризосферних бактерій на проростках редису

Варіант дослідження Середня довжина | Середня довжина зеленої кореня, мм частини ростка, мм

Контроль (без обробки) 12,120,7 19,5:-1,3

Обробка Васіїшив зибійв 8А (прототип) 15,321,0 25,0521

Обробка Васійн5 атупоіїдпегасієпв зирзгр. ріапіагит В589 (який заявляється) 23,511,5 29,752,3

З даних, наведених у Таблиці 4, видно, що заявлений штам бактерій Васішв5 атупоїїдиеїтасієпе зиб5р. ріапіагит 8589 має більш сильну рістстимулюючу активність на проростках редису у порівнянні зі штамом - прототипом Васійнв5 5,5 8А.

Таблиця 5

Рістстимулююча активність штамів ризосферних бактерій на проростках пшениці

Варіант дослідження Середня довжина кореня, | Середня довжина зеленої

ММ частини ростка, мм

Контроль (без обробки) 9,350,5 13,7-1,0

Обробка Васійив 5,ибійв 8А (прототип) 13,5:241,1 16,9-41,3

Обробка Васійн5 атупоіїднегасієп5 в5иБзр. ріапіагит В589 (який заявляється) 19,9-2-1,2 22,15-41,7

З даних, наведених у Таблиці 5, видно, що заявлений штам бактерій Васішв5 атупоїїдиеїтасієпе зиб5р. ріапіагит 8589 має більш сильну рістстимулюючу активність на проростках пшениці у порівнянні зі штамом - прототипом Васійнв5 5,5 вА.

Висока рістстимулююча активність штаму бактерій Васіи5 аптуйоїїдцеїгасієпв зибБзгр. ріапіагит 8589 ймовірно викликана здатністю продукувати цілий ряд вітамінів: тіамін (В1), рибофлавін (В2), нікотинат (В3), пантотенат (В5), біотин (87), фолат (В9), кобаламін (В12), менакуїнон (К2) (Таблиця 6). Вітаміни є незамінними елементами живлення, виробленими за допомогою різних рослин і бактерій (10). Основна фізіологічна роль вітамінів полягає в тому, щоб служити як кофактори в числених метаболічних процесах і як антиоксиданти. З восьми

Зо відомих вітамінів групи В, шість з них було виявлено в геномі Васіїшв5 атупоїіїднегтасієпе 5!,ирегр. ріапіагит 8589 анотації онтології КЕСО (з використанням серверу КААФБ) і інтелектуального аналізу генома (Таблиця 6). Це: тіамін (В1), рибофлавін (В2), пантотенат (В5), вітамін Вб

(піридоксин), біотин (87) і фолат (89). Крім того, був виявлений білок, який синтезує кобаламін

Соруу (РгокКа 00310), який бере участь у синтезі вітаміну В12, і двох ферментів, які беруть участь в метаболізмі нікотината (вітамін В3), а саме нікотинат-фосфорибозилтрансфераза (РгокКкКа 02867) і нікотинат-нуклеотид-пірофосфорилаза (РгоККа 02473). Крім того, в геномі штаму Васіїй5 атую!їдиетасівень взиБгр. ріапїагтит в589 була виявлена диметилменахінонметилтрансфераза (РгоКкКа 02063), фермент, який каталізує останній крок в біосинтезі вітаміну К2. Ці результати дозволяють припустити, що Васіїїйи5 атупоїіїдпегасієп5 зирегр. ріапіагит В589 може також бути здатним продукувати вітаміни В3, В12 і К2.

Таблиця 6

Вітаміни в геномі штаму Васіїи5 ату!поїїдиетасієп5 зирегр. ріапїагит В589 та їх біологічна роль

Функції в бактерії" Можлива роль у рослинно-мікробних взаємодіях

Тіамін (В1) Декарбоксилювання кетокислот і Кофактор індол-З-піруват реакцій трансамінази декарбоксилази (біосинтез індоліл оцтової кислоти), індукція системної стійкості рослин, стимулюючий ефект на бульбочкові бактерії

Рибофлавін (82) | Окислювально-відновні реакції Індукція системної стійкості рослин, стимуляція росту рослин, активація генів "дпогит-5епвіпд" у бактерій

Нікотинат (83) Нікотинамідаденіндинуклеотид Зменшення сольового стресу, захисні (МАБ) механізми

Пантотенат (85) | Окислення кето кислот і носіїв Невідомо ацилових груп

Піридоксин (Вб) Трансамінування, дезамінування, Захист проти осмотичного і декарбоксилювання і рацемізація окислювального стресу амінокислот

Біотин (87) Біосинтетичні реакції, які Стимуляція росту бактерій і потребують фіксації СО2 колонізації

Фолат (89) Перенос одновуглецевих одиниць, | Невідомо які необхідні для синтезу тіміну, пуринових основ, серину, метіоніну і пантотенату

Кобаламін (В12) | Перенос метилових груп Утворення бобово-ризобіального симбіозу

Менахінон (К2) Процес транспорту електронів "На основі підручника бактеріології он-лайн (пер/ЛехірооКоїрасіегіоіоду.пе/пищго 2.пІті) "На основі огляду Раїасіоз еї аї. (2014)

Нижче наведено приклад отримання біопрепарату на основі штаму бактерій ВасійШ5 атупо!їїдиетасієп5 зиБ5р. ріапіагит В589 в рідкому вигляді.

Маточна культура

Для отримання маточної культури штаму бактерій Васіїив5 атуіоїїдиєтасіеп5 зибзр. ріапіагит

В589 використовували рідке живильне середовище КСБ (картопляно-сахарозний бульйон), для чого спочатку готували картопляний відвар, нарізавши 200 г очищеної картоплі ломтиками і відваривши її в 800 мл дистильованої води протягом 20 хвилин, потім відвар відфільтрували крізь ватно-марльовий фільтр, додали до нього 10 г сахарози і довели значення рН суміші до 7,0.

Отримане рідке живильне середовище розлили в 750 мл - качалочні колби по 100 мл і стерилізували 30 хвилин при 1 атм. Потім провели інокуляцію живильного середовища в колбах з розрахунку: 1 пробірка зі скошеним живильним агаром (ПА), який містить чисту культуру

Васійи5 атуїоїіїдиеїтасієпе вирер. ріапіагит В589, на 1 колбу. Після цього колби помістили на качалку (180 об/хв) і культивували протягом 48 год. при температурі 28 "С. Таким чином, в колбах отримали маточну культуру Васійн5 атуїоїїдиєтасіеп5 зиб5р. ріапіагит В589 з титром бактерій приблизно 4 х 109 КУО/мл, яка може зберігатися в холодильнику до 1 місяця при температурі 4-6 "С для наступного засіву в ферментери.

Робоча культура

Робочу культуру штаму бактерій Васіїшв5 атуїоіїдиеїтасієпе в5!Иирер. ріапіагит 8589 для промислового культивування отримують в ферментерах на середовищі з мелясою і кукурудзяним екстрактом. Норма інокуляції маточною культурою 1-3 95, тривалість культивування - 72 години при температурі 33 "С. Під час вирощування робочих культур допускається підвищення температури до 37 "С. Так отримали концентрат бактеріальної суспензії на основі штаму Васіїи5 атупіоїїдиегасієпв зиревр. ріапіагит 8589 з титром бактерій не менше 1 х 109 КУО/мл.

Рідка форма мікробного препарату на основі штаму Васіїшв атуйоїїдцегасієпв зибБзр. ріапіагит В589

Отриманий концентрат бактеріальної суспензії на основі штаму Васійй5 атупоїЇїдиегтасієпе зирегр. ріапіагит В589 розвели стерильною водою у співвідношенні 1:10 або 1:20, в залежності від титру концентрату бактеріальної суспензії, який отримують. Отриману рідку форму витримували протягом 3-5 днів при температурі 20-25 "С для отримання титру бактерій не менше 1 х 108 КУО/мл препарату, після чого мікробний препарат є готовим для використання в сільському господарстві. Рідкий препарат стерильно розливали в поліетиленові пляшки або каністри, попередньо ополіскуючи їх спиртом.

Термін зберігання отриманого препарату складає не менше 24 місяців.

Експериментально встановлено, що для ефективного використання штаму Васіїсн5 атупоїїдиеїтасієпе зиб5р. ріапіагит В589 у складі різних мікробних препаратів, концентрація (кількість життєздатних клітин і спор) його бактерій повинна складати 107-109 клітин в 1 мл

Зо культуральної рідини, оскільки використання штаму в концентрації менше 107 кл/мл призводить до зниження антагоністичного і рістстимулюючого ефекту, а підвищення концентрації більше 109 кл/мл не призводить до його збільшення.

Ефективність мікробного препарату, отриманого вказаним вище способом на основі штаму ризосферних бактерій Васійи5 атупоїіїдиетасієпе зирегр. ріапіагит В589, який заявляється, була перевірена у вегетаційних дослідженнях на озимій пшениці сорту "Веда" і редисі сорту "Дуро

Краснодарське".

Для проведення цих дослідів сосуди об'ємом по З л (для пшениці і редису) наповнювали грунтом до ваги 3,4 кг. Перед посадкою насіння грунт проливали до повної польової вологоємності водопровідною водою об'ємом 200 мл. Насіння редису і пшениці були попередньо відібрані за розміром, простерилізовані і пророщені у стерильних чашках Петрі зі стерильним фільтрувальним папером.

Однакові за розміром паростки рослин розділили на три частини. Одну частину паростків протягом 30 хв. інокулювали в рідкому препараті на основі штаму-прототипу Васійив5 5!,бБійі5 8А з титром 107 КУО/мл, іншу частину - в препараті, отриманому вказаним вище способом на основі штаму Васіїїн5 атупоїїдиегТасівєп5 зирзр. ріапіагит В589, який заявляється, з титром 107 КУО/мл, а третю частину проростків обробили стерильною водою (контроль). Через 25 днів провели вимірювання біомаси рослин редису, а через 30 днів - вимірювання біомаси рослин пшениці.

Результати дослідів наведені в Таблицях 7 і 8.

Таблиця 7

Ефективність штамів ризосферних бактерій в вегетаційних дослідженнях на пшениці сорту "Веда"

І І І І І Прибавка біомаси

Варіант дослідження: обробка біопрепаратом на основі штаму )/ Біомаса, до контролю бактерій Г

Васіїив 5иЇибійї5 вА (прототип)

Васіїив5 атупоїїдиетасієп5 5,ир5р. ріапіатит В589 (який заявляється) 122 37 43,5

Таблиця 8

Ефективність штамів ризосферних бактерій в вегетаційних дослідженнях на редисі сорту "Дуро Краснодарское"

Варіант дослідження: обробка штаму бактерій контролю контролю

Контроль (безобробк) 00425 101180

Васіїи5 атуїоїїдиетасієп5 65,3 53,6 38,5 113,9 в5иБзр. ріапіагит В589 (який заявляється)

Порівняння даних, отриманих за результатами вегетаційних дослідів на пшениці сорту "Веда" і редисі сорту "Дуро Краснодарское", які наведені у таблицях 7 і 8, дозволяють зробити висновок, що мікробний препарат, отриманий на основі заявленого штаму бактерій ВасіПив5 атупоїїдиеїтасієпе 5!ирер. ріапіагит В589, є більш ефективний при дії на пшеницю і редис у порівнянні з мікробним препаратом на основі штаму-прототипу Васіїйив5 зи,иБійї5 ВА.

Дослідним шляхом було встановлено, що для обробки насіння сільськогосподарських рослин оптимальним є застосування 10 95 розчину мікробного препарату на основі штаму ризосферних бактерій Васіи5 атуїпоїїдиегтасіеп5 зирзр. ріапіагит В589, який заявляється, а для вегетуючих рослин - (0,1-3)95 його розчин.

Ефективність використання штаму Васйи5 атуїоїїдиеїтасієпе 5иб5р. ріапіагит 8589 для підвищення продуктивності і якості продукції була перевірена в польових дослідженнях на зернових, овочевих і технічних культурах (ярої, озимої пшениці, ячменю, картоплі, капусті, льоні, соняшнику, цукровому буряку) із застосуванням трьох мікробних препаратів: Фітоспорина на основі штаму бактерій Васіййв5 зиБій5 ВНДІСГМ 128), мікробного препарату на основі штаму - прототипу Васіййе зибБіййв 8А і мікробного препарату на основі заявленого штаму бактерій

Васійв5 атупоїїдиєтасіеп5 зирзр. ріапіагит В589, який отримують способом, вказаним вище.

Польове дослідження з ярою пшеницею районованого сорту "Лада" проводили в

Краснодарському краї на грунті: чорнозем міцний, середньо суглинковий середньо гумусний, гумус за Тюриним 3,24 95, нітратний азот - 8,3 мг/кг, фосфор - 64 мг/кг, калій - 150 мг/кг, рн водна 6,46.

Польове дослідження проводили згідно з методикою проведення досліджень в Географічній мережі дослідів ВІУА (Оценка зффективности микробньїх препаратов в земледелии / Под ред.

Завалина А.А. - М.: Россельхозакадемия, 2000г. - 82 с.). Посівна площа ділянки 40 ме, розрахункова - 30 м. Повторність дослідження чотирикратна. Посів пшениці проводили на ділянці, попередником якої була пара. Фон добрива - МеРе2 (амофос). Передпосівна обробка -

культивація на глибину 5-7 см, норма висівання ярої пшениці 5,0 млн. зерен, що зійшли, на гектар.

В день посіву частину насіння пшениці нічим не оброблювали (контроль), іншу частину насіння оброблювали рідким біопрепаратом Фітоспорин на основі штаму Васіїйи5 зиБбіййв5 128

ВНДІСГМ (стандарт), третю частину насіння - рідким біопрепаратом на основі штаму Васйив5

З,иБій5 А (прототип), а останню частину насіння - рідким препаратом на основі штаму бактерій

Васій5 атуїйоїїдиетасіеп5 5иб5р. ріапіагит В589, який отримано описаним вище способом. При цьому обробку насіння пшениці проводили із розрахунку на 1 т насіння - 1 л відповідного біопрепарату на 9 ол води з додаванням 20-30г Ма-КМЦ - натрієвої солі карбоксиметилцелюлози.

Перед посівом проводили культивацію грунту, для чого в нього додатково вручну вносили мінеральні добрива у вигляді амофосу (МеР5г) відповідно до схеми дослідження, після чого здійснювали посів насіння пшениці з виділенням певних посівних зон згідно обробці відповідним біопрепаратом і зони контролю.

Некореневу обробку рослин проводили в фазу 3-5 листя і в фазу кінця кущіння початку виходу в трубку шляхом їх обприскування вручну за допомогою ранцевого оприскувача із розрахунку 1 л відповідного біопрепарату на 300 л води на гектар.

Агротехніка вирощування пшениці відповідала зональній технології. Облік урожаю суцільний, поділяночний, виконаний комбайном САМПО-130. Урожай доведено до 100 95 чистоти і 14 95 вологості. Кількість клейковини визначали за ГОСТом 13586.1/68, кількість білка - за ГоСТом 10846/91. Статистична оцінка достовірності отриманих результатів проведена на основі дисперсійного аналізу при 95 95 рівні значущості. Результати дослідження з ярою пшеницею наведені у Таблиці 9.

Таблиця 9

Вплив штамів ризосферних бактерій на урожай і якість зерна ярої пшениці сорту "Лада" (Краснодарський край)

Варіант Урожай й

Чо одиниць | зерна

Кенволь 1111890 1225185

Васіїив5 5,ибійй5 ВНДІСГМ 128 (Фітоспорин - стандарт) 42,5 43 | 11,0 23,5 З "Басів (прототи.? БИ 06056020 803

Васіїи5 атупоїїдиетасієп5 5!р5р. ріапіагит 8589 (який заявляється) 49,7 10,7) 274 26,0 75 2

Польове дослідження с озимою пшеницею сорту "Мироновская 808" проводили в

Ульянівській області на грунті: чорнозем вилужений середньо міцний суглинковий, середньо гумусний, гумус за Тюриним - 2,89 905, нітратний азот - 9,5 мг/кг, фосфор - 79 мг/кг, калій - 140 мг/кг, рН водна 6,62.

Посівна площа ділянки 30 м, облікова - 25 м?. Повторність дослідження чотирикратна.

Посів пшениці проводили на ділянці, попередником якої була пара. Фон добрива - МеР52 (амофос). Передпосівна обробка -- культивація на глибину 5-7 см, норма висіву озимої пшениці 4,8 млн. зерен, що зійшли, на гектар.

В день посіву частину насіння пшениці нічим не оброблювали (контроль), другу частину насіння оброблювали рідким біопрепаратом Фітоспорин на основі штаму Васіїйи5 зиБбіййв5 128

Васійи5 атуїоїїдиетасіеп5 зир5р. ріапіагит В589, який отримано описаним вище способом.

При цьому обробку насіння пшениці проводили із розрахунку на 1 т насіння - 1 л відповідного біопрепарату на 9 л води з додаванням 20-30 г Ма-КМЦ - натрієвої солі карбоксиметилцелюлози.

У всіх варіантах дослідження посів проводили при додатковому внесенні мінерального добрива у вигляді амофосу (МеР5г), який вносили вручну під передпосівну культивацію відповідно до схеми дослідження, після чого здійснювали посів насіння пшениці з виділенням певних посівних зон згідно обробці відповідним біопрепаратом і зони контролю.

Некореневу обробку рослин проводили в фазу кущіння і в фазу початку виходу в трубку шляхом їх обприскування вручну за допомогою ранцевого оприскувача із розрахунку 1 л відповідного біопрепарату на 200 л води на 1 га.

Агротехніка вирощування озимої пшениці відповідала зональній технології. Збір урожаю проводили комбайном САМІПО-130. Урожай доведено до 10095 чистоти і 14 95 вологості.

Кількість клейковини визначали за ГоСТом 13586.1/68.

Статистична оцінка достовірності отриманих результатів проведена на основі дисперсійного аналізу при 95 95 рівні значущості.

Результати дослідження з озимою пшеницею наведені у Таблиці 10.

Таблиця 10

Вплив штамів ризосферних бактерій на урожай і якість зерна озимої пшениці сорту "Мироновская 808" (Ульянівська область) пшениці, ц/га ор ють 00000000011038701200

Васіїив з,ибійй5 ВНДІСГМ 128 (Фітоспорин - стандарт) 39,1 34 9,5 22,0

Васшйиз атуоїїдиегасієп5 зибзр. ріапіагит

В589 (яка заявляється) 44,7 25,2 25,0

Польове дослідження з ярим ячменем, сорту "Прерия", проводили в Краснодарському краї на грунті: чорнозем міцний суглинковий, середньо гумусний, гумус за Тюриним - 3,24 965, нітратний азот - 8,3 мг/кг, фосфор - 64 мг/кг, калій - 150 мг/кг, рН водна 6,46.

Посівна площа ділянки 40 м", облікова - 30 м7. Повторність дослідження чотирикратна.

Посів ячменю проводили на ділянці, попередником якої була пара. Фон добрива - МеР52 (амофос). Передпосівна обробка - культивація на глибину 5-7 см, норма висіву 4,0 млн зерен, що зійшли, на 1 га.

В день посіву частину насіння ячменю нічим не оброблювали (контроль), другу частину насіння оброблювали рідким біопрепаратом Фітоспорин на основі штаму Васіїйи5 зиБбіййв5 128

Васійи5 аптуїоїїдчетасіеп5 зиб5р. ріапіагит В589, який отримано описаним вище способом. При цьому обробку насіння ячменю проводили із розрахунку на 1 т насіння - 1 л відповідного біопрепарату на 9 л води з додаванням 20-30 г Ма-КМЦ - натрієвої солі

Зо карбоксиметилцелюлози.

Перед посівом проводили культивацію грунту, для чого в нього додатково вручну вносили мінеральні добрива у вигляді амофосу (МеР5г) згідно схеми дослідження, після чого здійснювали посів насіння ячменю з виділенням певних посівних зон згідно обробці відповідним біопрепаратом і зони контролю.

Некореневу обробку рослин проводили в фазу 3-5 листя і в фазу кінця кущіння початку виходу в трубку шляхом їх обприскування вручну за допомогою ранцевого оприскувача із розрахунку 1 л відповідного біопрепарату на 300 л води на 1 гектар.

Агротехніка вирощування ярого ячменю відповідала зональній технології. Облік врожаю суцільний, поділянковий, виконаний комбайном САМПО-130. Урожай доведено до 100 95 чистоти і 14 95 вологості. Кількість білка визначали за ГоСТом 10846/91.

Результати дослідження з ярим ячменем наведені у Таблиці 11.

Таблиця 11

Вплив штамів ризосферних бактерій на урожай і якість зерна ярого ячменю сорту "Прерия" (Краснодарський край)

У й Прибавка Кількість .

Штам рожай зерна білка в зерні ячменю, ц/га ер 00000000 11180

Васйиз з,ибійв ВНДІСГМ 128 (Фітоспорин - 442 32 7,8 стандарт)

ВасіїивзцрійвбА(протти! 00000001 4500 40199 02

Васійи5 атупоїїдиеїасівп5 зибзр. ріапіагит В589 48,3 7,3 17,8 12,5 (який заявляється)

З даних, наведених у таблицях 9, 10 і 11, випливає, що мікробний препарат, отриманий на основі заявленого штаму бактерій Васіїи5 атуїпоїїдиеїасієпв 5!ир5р. ріапіагит 8589, здійснює більш сильну дію на врожайність і якість зернових сільськогосподарських культур у порівнянні з біопрепаратом на основі штаму - прототипу Васійив5 з!ЇБійв 8А.

Польове дослідження з картоплею сорту "Невский" проводили в Ленінградській області на грунті: слабопідзолистий суглинковий, гумус за Тюриним - 2,30 95, нітратний азот - 22,1 мг/кг, фосфор - 315 мг/кг, калій - 52 мг/кг, рН водна 5,6.

Посадковий матеріал: відібрані від однієї прогрітої та перебраної насіннєвої партії картоплі бульби. Маса посадкових бульб 60-70 грамм, очки наклюнулися. Попередник: однорічні трави на зелений корм. Фон добрива: органічні добрива під картоплю не вносили, мінеральні добрива вносили під нарізку гребенів з розрахунку МіооР'зоКізо.

Площа дослідної ділянки - 50 ме, площа облікової ділянки - 25 ме. Повторність в досліді - чотирикратна. Схема посадки 75 х 30 см, що означає гущину посадки - 44000 штук бульб на 1 гектар. К періоду збирання - гущина стояння рослин в середньому складала 43 500 штук на гектар.

В день посіву частину бульб картоплі нічим не оброблювали (контроль), другу частину бульб оброблювали рідким біопрепаратом Фітоспорин на основі штаму Васійив5 5!,иБійв 128 ВНДІСГМ (стандарт), третю частину - рідким біопрепаратом на основі штаму Васійиє виИЇбБійв 8А (прототип), а останню частину бульб - рідким препаратом на основі штаму бактерій Васішив5 атупоїїдиеїтасієпе вирер. ріапіагит В589, який отримано описаним вище способом. При цьому, передпосадкову обробку бульб картоплі проводили із розрахунку 1 л відповідного біопрепарату на 9 л води на 1 тонну бульб картоплі.

Посадку картоплі проводили клоновою саджалкою з шириною міжряддя 75 см і гущиною посадки 400 шт. на 100 м: з виділенням посівних зон згідно обробці відповідним біопрепаратом і зони контролю.

Догляд за рослинами: міжрядні обробки -- дві досходові і одна післясходова; обприскування рослин гербіцидом: Титус (0,03 кг/га) ї Тренд (0,2 кг/га) і інсектицидом Актара, ВДГ (0,06 кг/га),

Зо штанговою апаратурою ОН-600 з нормою розходу робочої рідини 300 л/га. Обприскування рослин в кожній з виділених зон проводили вручну за допомогою ранцевого оприскувача розчином відповідного біопрепарату з розрахунку - 1 л біопрепарату на 300 л води на гектар: перше - в фазі повних сходів, друге - в фазі бутонізації. Скошування ботви перед збором: БД-4- 7. Збір урожаю: картоплекопачем КТН-2Б з підбором бульб вручну.

Результати дослідження з картоплею наведені у Таблиці 12.

Таблиця 12

Ефективність застосування штамів ризосферних бактерій в польових дослідженнях з картоплею сорту "Невский" (Ленінградська область) картоплі, ц/га жо 000091

Васшйиз атуоїїдиегасієп5 зибзр. ріапіагит В589 (який 251 31,4 заявляється)

Польове дрібноділянкове дослідження з капустою білокачанною сорту "Подарок" проводили в Ленінградській області на грунті: підзолистий суглинковий, гумус за Тюриним - 3,50 95, нітратний азот - 30,5 мг/кг, фосфор - 280 мг/кг, калій - 40 мг/кг, рН водна 6,0.

Для отримання розсади насіння білокачанної капусти сорту "Подарок" висіювали в ящики з торфомінеральним субстратом. Субстрат для набивання ящиків готували наступним чином: дерново-підзолковий супіщаний грунт дослідного поля ГНУ ВНДІСГІМ (30 95) змішали з торф'яним грунтом марки "Терравита" виробництва ЗАТ МНІП "Фарт" (50 95) і відмитим кварцовим піском (20 95), куди додали розчин азофоски з розрахунку 100 96 МРК. Отриманий субстрат перемішали і набили в 4 ящика по 10 кг кожний.

Для капусти в досліді використовували 0,1 95 розчин біопрепаратів: на основі штаму Васіїйв5 5,иБій5 128 ВНДІСГМ (Фітоспорин - стандарт); на основі штаму - прототипу Васіив5 5!,бійів 8А; на основі штаму бактерій Васійи5 атупіоїїдиетасієпв зирзгр. ріапіагит В589, що заявляється, який отримано описаним вище способом. В кожний з трьох ящиків вносили по 1 л 0,1 95 розчину одного з вказаних біопрепаратів, в четвертий ящик - воду (контроль). "Школку" капусти вирощували в теплиці при температурі 15-20 "С. Пікірування рослин проводили в фазі 2-3 справжніх листів в торф'яні горшечки об'ємом 0,5 літра з грунтом.

При цьому, одночасно з посадкою рослин капусти з певного ящика в торф'яні горшечки, в лунки вносили 0,1 95 розчин того ж самого препарату, який попередньо вносили в його субстрат (в контролі - воду), в кількості 1 мл розчину на рослину. Повторність вирощування розсади - 30- кратна.

Потім розсаду в фазі 4-5 справжніх листів разом з комом грунту висаджували на постійне місце в грунт з виділенням зон посадки відповідно до обробки одним із вказаних біопрепаратів або водою. Розмір ділянок 5 м", відстань між рядками 50 см, між рослинами в рядку 35 см.

Агротехніка вирощування капусти загальноприйнята. Для боротьби зі шкідниками рослини двічі обробляли 0,15 95 розчином інсектициду димофоса (4095 емульсія), а також проводили підкормку мінеральними добривами: через З тижня після висаджування розсади Мз5РгоКзо і в фазу розетки листя МзоРгоКзв.

Зо В процесі вегетації в кожній виділеній зоні посіву відповідно до способу попередньої обробки одним з біопрепаратів, двічі проводили обприскування рослин 0,595 розчином відповідного біопрепарату із розрахунку 2 л/га (2 л на 400 л води на 1 га) ручним ранцевим оприскувачем

ЗО 0-456. Контроль - без обприскування. Повторність дослідження чотирикратна.

Результати дослідження з капустою надані в Таблиці 13.

Таблиця 13

Ефективність застосування штамів ризосферних бактерій в польових дослідженнях з капустою білокачанною сорту "Подарок" (Ленінградська область) : : г. Урожай капусти, Прибавка урожаю

Варіант дослідження (штам бактерій) / '

Контроль (без обробки) нити

Васіїиз зибійв ВНДІСГМ 128 (Фітоспорин - стандарт)

Васіїив «бітів ВА (прототип)

Васіїив5 атупоїїдиетасієп5 5,ир5р. ріапіатит В589 (який заявляється) 451 61 15,6

З даних, наведених у таблицях 12 і 13, випливає, що біопрепарат, отриманий на основі заявленого штаму бактерій Васіїшив5 атуїоїїдиеїасіеп5 зирер. ріапіагит 8589, здійснює більш сильну дію на врожайність (продуктивність) овочевих сільськогосподарських культур у порівнянні з біопрепаратом на основі штаму-прототипу Васійив в5!ЇбБійі5 8А.

Польові дослідження на цукровому буряку сорту "Рамонская односеменная 47" проводили в навчально-дослідному хазяйстві Башкірського державного аграрного університету, Республіка

Башкортостан на грунті: вилужений чорнозем. Вміст гумусу в грунті - 5,895, реакція середовища рн 6,5, вміст фосфору за Чириковим -- 91,1 мг/кг, вміст калію за Чириковим - 130,8 мг/кг. Сума поглинених основ достатньо висока 54-56 мг/екв, ступінь насиченості основами -- 96- 98 б.

Норма висівання насіння -- біля 5,5 кг/га. Гущина стояння рослин на момент збору 80 тис шт./га. Спосіб висівання цукрового буряку - широкополосний, ширина міжряддя - 45 см, стикових - 50 см. Оптимальна глибина посіву насіння в грунт 3-4 см. Площа дослідної ділянки -- 50 ме, площа облікової ділянки - 25 м". Повторність досліду чотирикратна.

Вся площа висівання цукрового буряку була поділена на чотири зони. В кожній виділеній зоні обробку посівів цукрового буряку проводили 0,5 95 розчином одного з біопрепаратів: на основі штаму Васійи5 5!ирійв5 128 ВНДІСГМ (Фітоспорин - стандарт); на основі штаму - прототипу Васіййе зиИбБійй5 8А; на основі штаму бактерій Васійш5 атуїоїїдиєтасіеп5 5!Їрегр. ріапіагит В589, який заявляється, який отримано описаним вище способом, в контролі - без обробки.

Обробку проводили шляхом обприскування рослин в кожній з виділених зон посіву 0,5 95 розчином одного з вказаних біопрепаратів з розрахунку 2 л біопрепарату на 400 л води на гектар за допомогою ручного ранцевого оприскувача 500-456 двічі: в фазі 4-6 справжніх листів і в фазі смикання бадилля в рядках. Контроль без обприскування. Повторність чотирикратна.

Результати дослідження з цукровим буряком представлені в Таблиці 14.

Таблиця 14

Ефективність застосування штамів ризосферних бактерій в польових дослідженнях з цукровим буряком сорту "Рамонская односеменная 47" (Башкортостан) я Прибавка урожаю

Варіант дослідження (штам бактерій) Урожай цукрового

Контроль (без обробки) 11

Васіїив зибніїв 128 (Фітоспорин)

Васіїив5 атупоїїдиетасієп5 5,ир5р. ріапіатит В589 (який заявляється) 355 65 22,4

Польові дослідження на соняшнику олійному та льоні олійному проводили в

Ставропольському краю на грунті: чорнозем середньо міцний, середньо суглинковий, середньо гумусний, гумус за Тюриним - 3,71 90, нітратний азот - 6,2 мг/кг, фосфор - 75 мг/кг, калій - 180 мг/кг, рН водна 7,15. Агротехніка: попередник ярий ячмінь, соняшник і льон висіювали сіялкою точного висіву СКОС-610 з агрегатом, що висіює порційно.

Варіанти дослідження передбачали посів насіння льону і соняшника без обробки (контроль) та з обробкою насіння біопрепаратами: Фітоспорином (на основі штаму Васіййве 5иЇибБійв 128), препаратом на основі штаму - прототипу Васіїйив5 5!ИбБій5 8А і препаратом на основі штаму

Васіїйн5 атуіоїїдиетасієп5 зиргр. ріапіагит 8589, який заявляється, з розрахунку 2,0 л/т, а також з обробкою цими біопрепаратами рослин по вегетації з розрахунку 1,0 л/га.

Дослідження дрібноділянкове, посівна площина 30 ме, облікова - 25 ме. Повторність дослідження чотирикратна. Збір насіння льону і соняшника проводили малогабаритним комбайном "Вінтерштайгер" та визначали урожай у всіх варіантах дослідження.

Результати досліджень наведені в Таблицях 15 і 16.

Таблиця 15

Ефективність застосування штамів ризосферних бактерій в польових дослідженнях з олійним льоном (Ставропольський край)

У й І Прибавка

Варіант дослідження (препарати на основі штаму бактерій) рожай насіння Урожаю льону, ц/га

Васіїив зибіїв 128 (Фітоспорин)

Васіїив5 атупоїїдиетасієп5 5,ир5р. ріапіатит В589 (який заявляється) 11,3 43 61,4

Таблиця 16

Ефективність застосування штамів ризосферних бактерій в польових дослідженнях з олійним соняшником (Ставропольський край)

У й І Прибавка

Варіант дослідження (штам бактерій) рожай насіння урожаю соняшника, ц/га

Васіїив зибійїв 128 (Фітоспорин) 311298

Васіїи5 атупоїїдиетасієп5 5,ир5р. ріапіатит В589 (який заявляється) 171 4,8 39,0

З даних, наведених в таблицях 14,15 і 16, випливає, що біопрепарат, отриманий на основі заявленого штаму бактерій Васіїи5 ату!іоїїдиеїтасієпе зибрегр. ріапіагит В589, має більш сильну дію на врожайність (продуктивність) технічних сільськогосподарських культур: цукрового буряку, льону, соняшника у порівнянні з біопрепаратом на основі штаму - прототипу Васійив 5,ибБійїв 8А.

Тобто результати досліджень біопрепарату, створеного на основі штаму бактерій ВасіПив5 атупо!їїдиеїтасієп5 5зир5р. ріапіагит 8589, підтвердили в польових дослідженнях ефективність його застосування для підвищення урожаю при обробці таких сільськогосподарських культур, які пшениця, ячмінь, картопля, капуста, цукровий буряк, льон, соняшник, що доводить перспективність його використання в сільському господарстві.

Таким чином, штам ризосферних бактерій ВасіПив5 ату/іоїїдиеїасієп5 зибзр. ріапіагит В589 є придатним для використання в сільському господарстві як ефективний засіб підвищення продуктивності рослин та їх захисту від хвороб, що викликаються фітопатогенними мікроорганізмами, та розширює арсенал подібних засобів.

Джерела інформації: 1. Опдепа М, ЧуЧошаап Е, Адат А, Радиої М, Вгапз А, догіз В, Агрідпу У, Тропап Р. 2007. зЗипасіїп апа Гепдусіп ІГрореїйдев ої Васйив5 5и,ибБійв аз еїїсйог5 ої іпдисед зувієтаїйс гезівіапсе іп ріапів. Епмігоп Містобіо! 9: 1084-1090. 2. МаІГапома М, Егап?ії М, І идіепрего В, Спероїаг У, Опдепа М. 2012. Сусіїс ІПрореїає ргоїйе ої

Те ріапі-бепеїїсіа! епаорнуїйс Ббасієгіит Васіїйив зиБійй5 С8.Агсп Містобіо! 194: 893-899.

З. Ваї5 НР, РаїїЇ А, Мімапсо М. 2004. Віосопіго! ої Васійиє зибБбійб адаййбі іпіесіопо ої

Агарідорвзіє госї5 Бу Рбоепдотопаб5 зугіпдає і5 Тасійатвй Бу бБіойт їТоптайоп апа 5ипасійп ргодисіоп. Ріапі Рпузіо! 134:307-319. 4. КІоеррег У, Геопу у, Теіпуле М. апа 5спгоїт ММ. 1980. Реейдотопав відегорНогев: а теспапівт ехріаїпіпа аізеазе зирргезвіме 5оїЇв. Ситепі Містобіоіоду 4: 317-320. 5. Спеп Х.-У., А. Зепоїг, М. Вогівв, Н. дипде, с. Модеї, 5. Кип2, апа В. Вогізв. 2009. Оінісіаїп апа Бразіїузіп ргодисейа Бу ріапі-аззосіаїед Васійи5 ату/оїіїдиетасієп5 аге ейісієпі іп сопітоїІїпу їге рідні адізеазе. у. Віоїесппої. 140:38-44. 6. Спеп ХН, Коштоціві А, Зсної В, Еізепгєїсн А, ЗсНпеїдег К. єї а). 2007. Сотрагаїїме апаїувів ої Ше сотрієїє депоте 5едиепсе ої Пе ріапії атоулй рготоїїпод басієтіит Васіїи5 атупоїїдПетасіено

Е7В842. Маї Віоїєснпої 25: 1007-1014. 7. ЗсНої? В, Моїопоп КУ, Маспніідаї! У, Маїег У, Магкієу АГ, Зивззтийй ВО, Міїснеї! СА, Вогівв В. 2011. Ріапіагоїїсії, а помеі! тісгосіп В17/зігеріоїувіп 5-ЇїКе пайшта! ргодисі їйот Васіїшв атупюоїїдиеїтасієп5 2842. У ВасіегіоІ.193:215-224. 8. Моіопоп К.).; МеїбБу, 9.0О.; І еє, у).; Емапв, В.5.; Випбраг, К.І-; Витрив, 5.В.; КеїПенНег, М.Ї..;

Міїснеїї, О.А. "БЗігисійге аеїептіпайоп ап іпієгтсеріп ої бБіозупійеїїс іпівптедіаїєв ог Ше ріапіагоїїсіп сіаз5 ої підніу аібзстгітіпайіпуд апіібіоїісв". АС Спет. Віої!., 6:1307-1313 (2011). дої: 10.1021/сь200з39а 9. Не Р, Нао К, Віот .), ВисКегї С, Маїег У еї аі. 2013. Сепоте зедиепсе ої Ше ріапії доми

Зо рготоїіпд вігаіп Васіїйи5 ату!поїїдиетасієп5 5,иБзр. ріапіагит В9601-Уу2 апа ехргезвіоп ої тегзасідіп апа оїпег зесопаагу теїабоїїев. / Віоїеснпо! 164: 281-291. 10. Раїіасіо5 ОА., Вазнап У, де-Вазпап ГЕ. 2014. Ргомеп апа роїепійа! іпмоїметепі ої міїатіпв іп іпіегасійоп5 ої ріапів м/йй ріапі дгоумА-рготоїїпу Басієгіа: ап омегмієму. Віої!. Репії. боїв 50: 415-432.

Claims

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ Штам бактерій Васійиз ату/оїїдиетасіепв в5ирер. р/апіагит В589, депонований в ФДБНУ ВНДІСГМ під номером КСАМ 03458, як засіб підвищення продуктивності рослин та їх захисту від хвороб, що викликаються фітопатогенними мікроорганізмами.