TW201433264A - 增進植物之抗非生物性逆境之方法 - Google Patents

Abstract

本發明關於增加土壤養分來增進植物之抗非生物性逆境性之方法，該方法包含將含有枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)或短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)或其突變體之組成物施用於植物、植物之一部分和/或該植物或植物部分周圍的區域。本發明亦針對增加土壤養分之方法，其包含將含有枯草芽孢桿菌或其突變體之組成物施用於土壤。

Description

增進植物之抗非生物性逆境性之方法 相關申請案之交叉參考資料

本申請案主張2012年8月31日提交申請之美國臨時專利申請案第61/696,046號、2012年10月18日提交申請之美國臨時專利申請案第61/715,780號、2013年3月15日提交申請之美國臨時專利申請案第61/792,355號之優先權。前述之各申請案的全部內容在此以引用方式併入本文。

本發明關於增進植物之抗非生物性逆境性及增進土壤內之營養含量的技術領域。

為了促進植物生長、發育和產量，全世界使用以無機和有機物質二者為底質之肥料。另一限制植物生長和生產力之主要因素為非生物性逆境，諸如乾旱逆境、鹽逆境、養分缺乏、重金屬污染、極端溫度或洪水。例如暴露於鹽逆境、乾旱條件或養分缺乏通常會導致植物材料 、種子、果實及其他可食用產品之產量損失。由這些逆境造成之主要農作物(諸如水稻、玉米(maize)(玉米(corn))和小麥)以及林木之作物損失和作物產量損失代表重大之經濟和政治因素，並促成許多開發中國家糧食短缺。研發使植物，例如具有鹽逆境耐受性和/或抗鹽逆境性之方法為可能解決或調解至少一些這些問題的策略。此外，增進土壤養分及從有機物質釋出植物養分的方法可增加植物生長並減輕對植物之環境逆境。

因此，提供使植物對非生物性逆境具耐受性和/或抗性，及增加植物可利用之土壤養分的需求持續存在。本發明之目的係提供方法以賦予或增進植物之非生物性逆境耐受性和/或抗性及增進土壤中之植物養分的可用性。

本發明提供增進植物之抗非生物性逆境性之方法。該方法包括在植物、植物之一部分、該植物周圍的區域及該植物部分周圍之區域施用組成物。通常，該方法包括提供組成物。該組成物包含枯草芽孢桿菌或短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)。於一些實施例中，包含在組成物中之枯草芽孢桿菌或短小芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌或短小芽孢桿菌之已知菌株的突變體。

於某些實施例中，本發明提供增進植物之抗非生物性逆境性之方法，該方法包含將含有足以增進植物 之抗非生物性逆境性之量的枯草芽孢桿菌之組成物施用於植物、植物之一部分和/或該植物或植物部分周圍的區域。

根據一些特殊實施例，該枯草芽孢桿菌為以NRRL編號B-21661保藏之枯草芽孢桿菌QST713或其突變體。於一些實施例中，枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌株QST30002或枯草芽胞桿菌株QST30004(其保藏編號分別為NRRL B-50421和NRRL B-50455)，或其突變體。於其它實施例中，該短小芽孢桿菌株為短小芽孢桿菌2808，其保藏編號為NRRL B-0087且描述於國際專利刊物第WO 2000/058442號中。根據一些其他特殊實施例，該非生物性逆境可能為鹽逆境或養分缺乏。鹽逆境可包括增加之鹽濃度或乾旱。養分缺乏可能是植物周圍的土壤區域中缺乏土壤養分，諸如鉀、磷酸鹽或鐵。經由改善土壤中所缺乏之養分的溶解度可增進對抗(土壤)養分缺乏(諸如磷酸鹽)之抗逆境性。植物或植物部分周圍之區域(其亦可能在果實周圍)可能為，或包括植物生長的所在地，或該所在地之一部分。植物或植物部分周圍之各別區域可為，例如或包括位於該植物或植物部分附近之物質，諸如土壤。果實周圍之各別區域可為，例如或包括長出果實之植物部分，或可為，或包括，諸如位於帶有該果實之植物或植物部分附近的物質，諸如土壤。於一些實施例中，該方法包括將組成物施用在土壤中。該組成物和土壤可獨立與植物接觸。於一些實施例中，該土壤係在施用組成物前 與植物或植物部分接觸。於一些實施例中，該組成物係在植物或植物部分與土壤接觸之前施用。於一些實施例中，該組成物係在植物或植物部分與土壤接觸之同時施用。

在暴露於組成物後，抗非生物性逆境性(諸如抗鹽逆境性或抗養分缺乏性)可有效增進至少約2週。於一些實施例中，該抗鹽逆境性係增進至少約一個月。於一些實施例中，暴露於組成物之植物的抗鹽逆境性係增進至少約2個月，包括至少約3個月、至少約4個月、至少約5個月、至少約6個月、至少約7個月、至少約8個月、至少約9個月、至少約10個月、或至少約11個月。於一些實施例中，各別植物之抗鹽逆境性係增進至少約一年，包括在施用後至少約1½年或更長的時間。

本發明之方法包括在植物之生命週期間的任何時間、在植物之生命週期間的一或多個階段、或在植物之生命週期的固定間隔、或在植物之整個生命中連續地施用組成物。因此，可依需要施用該組成物。例如，可在植物生長期間、開花之前和/或期間、和/或種子發生之前和/或期間施用該組成物。一種說明性實例為在將植物從一個位置移植到另一個位置(諸如從溫室或溫床移至田野)之前，期間和/或之後不久施用組成物。於另一實例中，可在幼苗從土壤或其它生長基質(例如蛭石(vermiculite))冒出後不久施用該組成物。另一實例為組成物可在水栽(hydroponically)植物生長之任何時間施用該組成物。根據本發明之方法可包括在所需之時間期內 將組成物施用於植物、植物之一部分、植物周圍之區域(包括植物附近)、果實上和/或果實周圍的區域(包括果實附近)數次，例如預先選定之次數。於一些實施例中可將各別組成物在所需之間隔施用於植物數次。

於根據本發明之方法中，組成物係被施用於植物、植物之一部分、植物或植物部分周圍的區域、帶有果實之植物和/或果實周圍的區域。果實、植物或植物部分周圍的區域可為，例如在該植物、植物部分、或果實周圍的約2米、約1米、約70厘米、約50厘米、約25厘米、約10厘米或約5厘米內之區域。

於一相關之觀點中，本發明關於枯草芽孢桿菌或短小芽孢桿菌於增進植物之抗鹽逆境性的用途。該用途包括將組成物施用於植物、植物之一部分、植物周圍的區域及植物部分周圍之區域的其中一者。於一些實施例中係將枯草芽孢桿菌或短小芽孢桿菌包含在組成物中。

根據另一實施例，本發明關於增進土壤養分之方法，其包含將包含枯草芽孢桿菌之組成物施用於土壤。該組成物可促進以選自以下群組之水解酶來生物降解有機物質：蛋白酶、纖維素酶及木聚醣酶。於一實施例中，本發明提供增進土壤養分之方法，其包含將包含枯草芽孢桿菌之組成物，以足以增進土壤養分之量施用於土壤，以增進土壤養分。

於一相關之觀點中，本發明關於促進有機物質生物降解的方法，該方法包含將枯草芽孢桿菌以足以促 進水解酶生物降解有機物質之量施用於有機物質。

第1圖描繪以水或SERENADE SOIL®處理並以60mM之鹽灌溉14天之水稻植株。

第2圖描繪以水或SERENADE SOIL®處理並以60mM之鹽灌溉14天(64盎司/英畝等於0.448克/米²)之水稻植株的根部。

第3圖描繪以水或SONATA®處理並以60mM之鹽灌溉14週之水稻植株。

第4圖描繪以水或SERENADE SOIL®或SONATA®處理並以60mM之鹽灌溉14天(64盎司/英畝等於0.448克/米²)之水稻植株的根部。

第5圖描繪以SERENADE ASO®處理之植物及以水處理之植物的根和幼芽之乾燥重量(以毫克表示)。

第6圖描繪從生長在NBRIY基質中之枯草芽孢桿菌株AQ30002(第6A圖)及AQ713(第6B圖)培養產生之可溶性磷酸鹽水準與空白基質之比較。

第7圖顯示包含預測之swrA轉錄子之各種swrA基因組DNA的比對。Bsub_168=枯草芽孢桿菌株168；Bsub_3610=枯草芽孢桿菌株3610；QST713=QST713野生型；AQ30002及AQ30004=本發明之代表菌株；Bamy_FZB42=解澱粉芽孢桿菌株FZB42(B. amyloliquefaciens FZB42)；Bpum_SAFR-032=短小芽孢桿菌株SAFR-032；且Blic_14580=地衣芽孢桿菌株14580(B.licheniformisl 4580)。

第8圖顯示包含預測之swrA轉錄子之各種swrA基因組DNA的比對。縮寫具有與第7圖中相同之swrA含義，且Batr_1942=萎縮芽孢桿菌株1942(B atrophaeus 1942)，Bpum_2808=短小芽孢桿菌株2808。

第9圖顯示從其預測之swrA轉錄子取得之各種蛋白質的比對。縮寫之含義同於第7及8圖中之含義，且Bpum_7061=短小芽孢桿菌7061。

詳細說明

除非另有定義，本文所使用之所有技術和科學術語具有與本發明所屬之技藝中之一般技術人員所通常理解的相同含義。

本文所使用之術語“植物”係指屬於植物界之任何生物體(即，植物界中之任何屬/種)。這包括熟悉之生物體，諸如，但不限於樹木、草本植物、灌木、草、藤本植物、蕨類植物、苔蘚及綠藻。此術語係指單子葉植物(monocotyledonous plants亦稱為monocots)和雙子葉植物(dicotyledonous plants亦稱為dicots)兩者。於一些實施例中，植物具經濟重要性。於一些實施例中，該植物為人工種植之植物，例如栽培之植物，其可能為農業、 造林或園藝用植物。舉些例子，特殊植物之實例包括，但不限於玉米、馬鈴薯、玫瑰、蘋果樹、向日葵、小麥、水稻、香蕉、番茄、opo、南瓜、西葫蘆、生菜、白菜、橡樹、擎天鳳梨(guzmania)、天竺葵、扶桑、威靈仙(clematis)、一品紅(poinsettias)、甘蔗、芋頭、鴨雜草、松樹、肯塔基藍草、結縷草、椰子樹、芸苔屬葉菜類蔬菜(例如西蘭花、球花甘藍、布魯塞爾豆芽、白菜、中國白菜(Bok Choy和Napa)、菜花、cavalo、芥蘭菜、羽衣甘藍、大頭菜、芥菜、油菜及其他芸苔屬葉菜類蔬菜作物)、鱗莖類蔬菜(例如大蒜、韭菜、洋蔥(洋蔥乾鱗莖、大葱、長葱)、蔥及其他鱗莖蔬菜作物)、柑橘類果實(例如葡萄柚、檸檬、萊姆、柳橙、桔子、柑桔雜交種、柚子及其他柑橘類果實作物)、瓜類蔬菜(例如小黃瓜、枸櫞西瓜、食用葫蘆、西印度黃瓜、甜瓜(包括黃瓜瓜類之雜交種和/或栽培變種)、西瓜、哈密瓜及其他瓜類蔬菜作物)、果類蔬菜(包括茄子、鵝莓、人參果、辣椒、番茄、樹蕃茄及果類蔬菜作物)、葡萄、葉菜類蔬菜(例如萵苣)、根/塊莖和球莖蔬菜(例如馬鈴薯)、及樹堅果(杏仁、胡桃、開心果及核桃)、漿果(例如番茄、伏牛花、葡萄乾、接骨木果、醋栗、金銀花、鬼臼根、莢迷、奧勒岡葡萄、沙棘、朴樹果、熊果、越橘、草莓、海葡萄、lackberries、黃梅、楊莓、覆盆子、美莓、糙莓及酒莓)、禾穀類作物(例如玉米、水稻、小麥、大麥、高粱、小米、燕麥、黑麥、黑小麥、蕎麥、非洲小米(fonio )及藥麥)、梨果類果實(例如蘋果、梨)、核果(例如咖啡、棗、芒果、橄欖、椰子、油棕、開心果、杏仁、杏、櫻桃、西洋李子、油桃、桃子及李子)、藤(例如食用葡萄、釀酒葡萄)、麻類作物(例如麻、棉)、觀賞植物。於一些實施例中，該植物可能為住宅/家內植物、溫室植物、農業植物或園藝植物。如上文所指出者，於一些實施例中，該植物可能為硬木，諸如合歡、桉樹、角樹、櫸木、紅木、胡桃木、橡木、梣樹、柳、胡桃木、樺木、板栗、楊樹、榿木、楓樹、梧桐、銀杏、棕櫚樹和楓香。於一些實施例中，該植物可能為針葉樹，諸如柏樹、道格拉斯冷杉、樅、紅杉、鐵杉、雪松、刺柏、落葉松、松樹、紅木、雲杉及紅豆杉。於一些實施例中，該植物可能為產果實之木本植物，諸如蘋果、李子、梨、香蕉、橙、奇異果、檸檬、櫻桃、葡萄、木瓜、花生及無花果。於一些實施例中，該植物可能為木本植物，諸如棉、竹及橡膠植物。於一些實施例中，該植物可能為農業、造林和/或觀賞用植物，即，常用於園藝(例如在公園、花園和陽台)之植物。在大量之觀賞植物間可舉出之一些例子有草皮、天竺葵(geranium)、天竺葵(pelargonia)、矮牽牛、秋海棠及燈籠海棠。術語“植物”亦意欲包括任何植物繁殖體。

術語“植物”一般包括已藉由一或多次育種、誘變和基因工程修改之植物。基因工程係指使用重組DNA技術。重組DNA技術允許不能很容易地經由在自然 環境下交叉育種、基因突變或自然重組取得之修改。於一些實施例中，藉由基因工程取得之植物可能為轉基因植物。

如本文所使用之術語“植物部分”係指植物之任何部分，包括，但不限於幼芽、根、莖、種子、托葉、葉、花瓣、花、胚珠、苞、枝條、葉柄、節間、樹皮、木材、塊莖、軟毛、分蘗、根莖、藻體、葉片、花粉、雄蕊、孢子、果實和種子。生長在本技藝所使用之典型基質(諸如土壤)中的兩種植物之主要部分通常被稱為“地上”部分(亦常被稱為“新枝”)及“地下”部分(亦常被稱為“根”)。

於根據本發明之方法中，該組成物可被施用於長在生長植物所使用之任何類型的基質(例如土壤、蛭石、碎紙板及水)中之任何植物或任何植物之任何部分，或施用於架空種植的植物或植物部分，諸如蘭花或鹿角蕨上。該組成物可，例如藉由噴灑、噴霧、蒸發、撒、揮、澆水、噴、灑或澆注施用。如上文已經指出，施用程序可在所欲植物放置之任何所需地點進行，諸如農業、園藝、森林、農園、果園、苗圃、有機種植之作物、草皮及城市環境。

本發明提供使用包含枯草芽孢桿菌和/或短小芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和/或短小芽孢桿菌之發酵產物、或枯草芽孢桿菌和/或短小芽孢桿菌之無細胞萃取物的組成物來增進植物之抗鹽逆境性的方法。枯草芽孢桿菌 及短小芽孢桿菌為革蘭氏陽性土壤細菌，其經常在植物根圍被找到。如同許多細菌菌種，枯草芽孢桿菌可以表現出兩種不同的增長模式，自由游動，浮游增長模式及無梗生物膜模式(其中細胞聚集體分泌一種細胞外基質以彼此黏附和/或黏附在表面上)。細菌(諸如枯草芽孢桿菌)用來建立生物膜的途徑極其多樣，在不同物種之內和之間及在不同的環境條件下變化頗大。最近，由枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌及相關菌種之特定菌株形成的生物膜已被確認可能有助於控制由植物病原體引起之感染。

包含枯草芽孢桿菌和/或短小芽孢桿菌之組成物可為液體、漿液、可濕性粉末、顆粒，可流動的，無論是乾燥或含水的，或在合適之基質中微膠囊化。

枯草芽孢桿菌及短小芽孢桿菌可以孢子(其為休眠狀態)形式、營養細胞(其為生長狀態)形式、過渡態細胞(其為從生長階段到孢子形成階段之過渡期)、或所有這些細胞類型的組合存在於本發明所使用之組成物中。於一些實施例中，各別組成物主要包括孢子(包括基本上由孢子組成及主要由孢子組成)。於其它實施例中，該組成物包括孢子及在形成孢子前於發酵期間細胞所產生的代謝物。

於一些實施例中，枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌株QST713。枯草芽孢桿菌株QST713為可用於控制植物疾病(包括枯病、黑星病、灰黴病及數種類型之黴病)之天然產生的廣佈細菌。美國和歐洲監管部門已將枯草 芽孢桿菌QST713歸類為對人體或環境無不良影響。該細菌，枯草桿菌，普遍存在於土壤中，並已在全世界之各種棲息地中被發現。已知枯草芽孢桿之QST713菌株可拮抗許多植物真菌病原。

野生型枯草芽孢桿菌QST713、其突變體、其上清液和其脂肽代謝物，以及使用彼等來控制植物病原體和昆蟲之方法充分描述於美國專利第6,060,051號；6,103,228號；6,291,426號；6,417,163號；及6,638,910號中；各篇之全部教示內容以引用方式被具體且全部納入本文中。在這些美國專利案中，該菌株被稱為AQ713(其與QST713同義)。本專利說明書中當提及存在於SERENADE®產品中、以NRRL編號B21661保藏、或在模擬製造SERENADE®產品之條件下的生物反應器中製備之QST713時係指枯草芽孢桿菌QST713(又名AQ713)。

在1998年提交美國專利申請案第09/074,870號(其對應於上述專利)時，該菌株根據典型、生理、生化及形態學方法被命名為枯草芽孢桿菌。芽孢桿菌種之分類學從那時起已逐步發展，尤其是鑑於遺傳學和測序技術的進步，因而物種之命名很大程度上是基於DNA序列，而非1998年所使用的方法。在比對來自解澱粉芽孢桿菌FZB42、枯草芽孢桿菌168和QST713之蛋白質序列後，在解澱粉芽孢桿菌FZB42中發現之蛋白質中約有95%與QST713中發現的蛋白質具有85%或更高之同一性；而在枯草芽孢桿菌168中只有35%與QST713中的蛋白質具有 85%或更高之同一性。然而，即使是較大程度地依賴遺傳學，在反映過去15年對芽孢桿菌分類學之演化理解的相關科學文獻和規範性文件中仍然有分類模糊性。例如，以枯草芽孢桿菌株FZB24(其如同FZB42般與QST713密切相關)為基礎的農藥產品在美國環保局的文件中被歸類為枯草桿菌解澱粉變種。由於命名學中之這些複雜性，此特殊芽孢桿菌種根據該文件被不同地命名為枯草芽孢桿菌、解澱粉芽孢桿菌及枯草芽孢桿菌解澱粉變種。因此，我們保留枯草芽孢桿菌QST713之命名，而非將其改變成目前僅根據序列比較及推斷之分類學所預期的解澱粉芽孢桿菌。

枯草芽孢桿菌株QST713已根據為專利申請程序的微生物備案取得國際承認之布達佩斯條約的規定在1997年5月7日保藏在NRRL，登號編號B21661。NRRL為農業研究服務培養物保藏中心之縮寫，為用於保藏為專利申請程序的微生物備案取得國際承認之布達佩斯條約下之微生物菌株的國際保存單位，地址為61604美國伊利諾州皮奧里亞市北大學街1815號，美國農業部農業研究服務，全國農業利用研究。枯草芽孢桿菌株QST713之合適的調和物可從美國北卡羅萊納州Bayer CropScience LP之市售商品SERENADE®、SERENADE® ASO、SERENADE® SOIL及SERENADE® MAX取得。

SERENADE®產品(美國EPA登記編號69592-12)包含專利之枯草芽孢桿菌株(菌株QST713)及許多 協同工作以破壞疾病病原體，並提供優越之抗菌活性的不同脂肽。SERENADE®產品係用於保護植物(諸如蔬菜、果實、堅果和藤蔓作物)以對抗諸如火疫病(Fire Blight)、灰黴病(Botrytis)、酸腐病(Sour Rot)、銹病(Rust)、菌核病(Sclerotinia)、白粉病(Powdery Mildew)、細菌性斑點(Bacterial Spot)和白黴(White Mold)等疾病。SERENADE®產品可以液體或乾燥調和物之形式取得，其可以葉面和/或土壤處理劑施用。SERENADE®產品之美國EPA主標籤的複本(包括SERENADE® ASO、SERENADE®MAX及SERENADE® SOIL)係透過全國農藥信息檢索系統(NPIRSv)之USEPA/OPP農藥產品標籤系統(PPLS)公開取得。

SERENADE®ASO(水性懸浮液-有機)含有1.34%作為活性成分之乾燥QST713及98.66%其它成分。SERENADE®ASO係經配製以含有最少1×10⁹cfu/克之QST713，而QST713之最大量已經測定為3.3×10¹⁰cfu/克。SERENADE® ASO之替代商品名包括SERENADE® BIOFUNGICIDE、SERENADE SOIL®及SERENADE GARDEN® DISEASE。進一步信息請參閱2010年1月4日之SERENADE® ASO及SERENADE SOIL®的美國EPA主標籤，各篇之全部內容以引用方式被併入本文。

SERENADE®MAX含有14.6%作為活性成分之乾燥QST713及85.4%之其它成分。SERENADE® MAX係經配製以含有最少7.3×10⁹cfu/克之QST713，而 QST713之最大量已經測定為7.9×10¹⁰cfu/克。進一步信息請參閱SERENADE® MAX之美國EPA主標籤，其全部內容以引用方式被併入本文。

如國際專利申請案第WO2012/087980號中之詳細說明，枯草芽孢桿菌QST713之培養實際上為野生型細胞與非常低比例之被命名為“砂紙細胞”(根據其菌落形態)的變異細胞類型之混合物。因此，在SERENADE®產品中發現之QST713或在生長在生物反應器中之QST713細胞中發現之QST713係由野生型細胞及這些砂紙細胞以相同於或類似於SERENADE®產品中所發現之比率混合的族群組成。這些砂紙細胞在營養瓊脂上形成形態及生理上看來高度壓實、疏水、平坦、乾燥且非常“易碎 ”，並且很難從瓊脂去除的菌落。細胞黏附性可以定性方式觀察或可藉由結晶紫染色測量。除了此在營養瓊脂上的獨特菌落形態外，砂紙細胞在表面(諸如根)上形成緻密、緊實之生物膜(或更強健之生物膜)。根據上述之揭露內容，描述於國際專利刊物第WO2012/087980號中之枯草芽孢桿菌株AQ30002(又名QST30002)或AQ30004(又名QST30004)(保藏編號為NRRL B-50421和NRRL B-50455)或具有枯草芽孢桿菌株AQ30002(又名QST30002)或AQ30004(又名QST30004)之所有生理和形態特徵的這些枯草芽孢桿菌株之突變體亦可用於本發明的方法中，無論是單獨或與其他枯草芽孢桿菌株(諸如枯草芽孢桿菌QST713)之混合物。

“野生型”係指物種天然發生時和/或物種以先前已被命名為“野生型”之已知分離形式發生時的典型形式之表型。本文所承認之“野生型(wild type)”的同義詞包括“野生型(wildtype)”、野生型(wild-type)”、“⁺”及“wt”。相對於藉由非標準、“突變體”或“變異體”等位基因所產生者，野生型通常被概念化為在一或多個基因位點之特定基因的標準、“正常”等位基因之產物。一般而言，以及本文所使用者，特殊芽孢桿菌株或分離物之最普遍的等位基因(即，具有最高之基因頻率者)為該被視為野生型者。本文所使用之“QST713野生型”或“QST713野生型swrA ⁺”及其同義詞(例如“QST713 swrA ⁺”、“QST713野生型”、“QST713wt”，等)係指具有能表現經編碼之swrA蛋白質的功能性swrA基因(即，swrA ⁺)的枯草芽孢桿菌QST713。因此，這些術語係指為100% swrA ⁺之選殖的野生型QST713細胞。

如上述所指出，於一些實施例中，該枯草芽孢桿菌株為枯草芽孢桿菌AQ30002或枯草芽孢桿菌AQ30004。於其它實施例中，該枯草芽孢桿菌株為枯草芽孢桿菌3610。於一些實施例中，該短小芽孢桿菌株為短小芽孢桿菌SAFR-032。於一些實施例中，該短小芽孢桿菌株為短小芽孢桿菌2808，其保藏編號為NRRL B-30087且描述於美國專利第6,245,551和6,586,231號，及國際專利刊物第W02000/058442號中。合適之短小芽孢桿菌株2808的調和物可從美國北卡羅萊納州Bayer CropScience LP之商品SONATA®取得。

一般來說，本發明所使用之組成物可為枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌或其突變體之任何發酵肉湯。本文所使用之術語“發酵肉湯”(亦可稱為“全肉湯培養物”或“全肉湯”)係指將微生物發酵後所產生之培養基且包含本文所使用之微生物(即，枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌或其突變體)及其組成部分、未使用之原料基質和發酵過程中由微生物產生的代謝物，等。枯草芽孢桿菌和短小芽孢桿菌均為孢子形成細菌。因此，於一觀點中，這些發酵肉湯包括形成孢子之細菌細胞、彼等之代謝物和殘餘之發酵肉湯。於其它觀點中，該發酵肉湯之形成孢子的細菌細胞主要為孢子。於另一觀點中，該包含發酵肉湯之組成物進一步包含調和物惰性物質及調和物成分。於一些實施例中，該發酵肉湯係經由，例如滲濾過程洗滌，以除去殘留之發酵肉湯和代謝物，從而使發酵產物主要為孢子。從發酵產生之培養基中的細菌細胞、孢子和代謝物可直接使用或藉由習知工業方法，諸如離心、切向流過濾，深度過濾及蒸發濃縮。於另一實施例中，該發酵肉湯或濃縮之發酵肉湯係使用習知之乾燥過程或方法，諸如噴霧乾燥、冷凍乾燥、盤架乾燥、流化床乾燥、圓筒乾燥、或蒸發進行乾燥來創建發酵固體。本文所使用之術語“發酵產物”係指全肉湯、肉湯濃縮物和/或發酵固體。

於一些實施例中，該組成物包含枯草芽孢桿菌或短小芽孢桿菌之特定菌株(諸如枯草芽孢桿菌 QST713或短小芽孢桿菌QST2808)的突變體。術語“突變體”係指衍生自QST713或QST2808之遺傳變種。於一實施例中，該突變體具有一或多種或所有親本株(諸如QST713或QST2808)之識別(功能性)特性。於另一實施例中，至少該突變體或其發酵產物及親本株增進植物之抗非生物性逆境性(為一種鑑別功能特性)。這類突變體可能為其基因組序列與親本株之基因組序列具有大於約85%、大於約90%、大於約95%、大於約98%、或大於約99%之序列同一性的遺傳變異體。突變體可經由以化學品或輻射處理親本株細胞，或經由選擇來自親本株細胞群之自發突變體(諸如具噬菌體抗性或抗生素抗性之突變體)或經由本技藝之技術人士熟知之其他方式取得。

於一些實施例中，該組成物包含在swrA基因(即，swrA ^-細胞)中具有突變之芽孢桿菌細胞，諸如國際專利刊物第WO2012/087980號中所描述者。國際專利刊物第WO2012/087980號亦描述數種在芽孢桿菌細胞中產生swrA ^-細胞之方法。於一實施例中，在swrA基因中之突變係位在對應於如SEQ ID NO.1中所列出之swrA基因的位置26-34中之一或多個位置的位置處，或位在對應於如SEQ ID NO.1中所列出之swrA基因的位置1-3中之一或多個位置的位置處。於一種變化中，該突變為插入或缺失。

本申請案提供之序列表提供來自不同芽孢桿菌種和菌株之swrA基因的序列，如亦顯示於第7圖、第 8圖和第9圖中者。下列表1將SEQ ID NOS與菌株相關聯。除SEQ ID NO.2之外(其為胺基酸序列)，所有序列均為核苷酸序列。

於一些實施例中，swrA活性已藉由除了swrA基因突變以外之方式降低。swrA活性可藉由各種作用劑降低，包括小分子、藥物、化學品、化合物、siRNA、核酶、反義寡核苷酸、swrA抑制抗體、swrA抑制肽、適配體或鏡像適配體。於一實施例中，在swrA ^-細胞中之swrA基因中的突變係位在對應於如SEQ ID NO.1中所列出之swrA基因的位置26-34中之一或多個位置的位置處，或位在對應於如SEQ ID NO.1中所列出之swrA基因的位置1-3中之一或多個位置的位置處。於一種變化中，該突變為插入或缺失。於另一觀點中，該swrA ^-細胞為剔除swrA基 因之結果。

於一實施例中，本發明之形成孢子的細菌細胞為在swrA基因中具有突變之枯草芽孢桿菌QST713細菌細胞及其組成物。於一觀點中，該枯草芽孢桿菌QST713細菌細胞在起始密碼子中包含至少一種核酸鹼基對變化和/或在swrA基因中包含至少一種核酸鹼基對插入或刪除。於其它觀點中，該swrA基因中之插入或缺失係發生在SEQ ID NO.1之位置26-34處的一或多個鹼基對。再於另一觀點中，該枯草芽孢桿菌QST713之swrA ^-細胞係選自以下群組：菌株AQ30002(又名QST30002)和菌株AQ30004(又名QST30004)(其保藏編號分別為NRRL B-50421和NRRL B-50455)。再於本發明之另一觀點中，swrA基因中具有突變之枯草芽孢桿菌QST713為epsC、sfp及degQ之野生型。於另一觀點中，具有突變之枯草芽孢桿菌QST713在其他方面與枯草芽孢桿菌QST713為等基因。

於某些實施例中，該swrA ^-細胞占組成物中之全部細胞的至少約3.5%，且至少70%之swrA ^-細胞為孢子。本發明進一步提供其中該swrA ^-細胞占該組成物中之全部細胞的至少10%、或占該組成物中之全部細胞的至少50%、或占該組成物中之全部細胞的至少100%的這類組成物。本發明進一步提供其中至少約80%、至少約85%、或至少約90%之swrA ^-細胞和/或組成物中之全部細胞為孢子的這類組成物。

於一些實施例中，在本發明之組成物和方法中，swrA ^-細胞在全部細胞中之百分比將為至少3.5%、或至少3.6%、或至少3.7%、或至少3.8%、或至少3.9%、或至少4%、或至少5%、或至少6%、或至少7%、或至少8%、或至少9%、或至少10%、或至少15%、或至少20%、或至少25%、或至少30%、或至少35%、或至少40%、或至少45%、或至少50%、或至少55%、或至少60%、或至少65%、或至少70%、或至少75%、或至少80%、或至少85%、或至少90%、或至少95%、或至少98%、或至少99%、或100%。於本發明之一些實施例中，所有存在於特殊組成物中或用於特殊方法中之細胞均為swrA ^-細胞(即，100% swrA ^-細胞)。

於一些實施例中，在本發明之組成物和方法中，swrA ^-細胞在全部細胞中的百分比將為約3.5%至約99.9%。於另一實施例中，該百分比將為約5%至約99%。於另一實施例中，該百分比將為約10%至約99%。

於一些實施例中，在本發明之組成物和方法中，每克(“g”)swrA ^-細胞之菌落形成單位(“cfu”)數將為至少1×10⁷cfu/g或至少1×10⁸cfu/g、或至少1×10⁹cfu/g、或至少2×10⁹cfu/g、或至少3×10⁹cfu/g、或至少4×10⁹cfu/g、或至少5×10⁹cfu/g、或至少6×10⁹cfu/g、或至少7×10⁹cfu/g、或者至少8×10¹⁰cfu/g、或至少8.5×10¹⁰cfu/g、或至少9×10¹⁰cfu/g、或至少9.5×10¹⁰cfu/g、或至少1×10¹¹cfu/g、或至少2×10¹¹cfu/g、或至少3×10¹¹ cfu/g、或至少4×10¹¹cfu/g、或至少5×10¹¹cfu/g、或至少6×10¹¹cfu/g、或至少7×10¹¹cfu/g、或至少8×10¹¹cfu/g、或至少9×10¹¹cfu/g、或至少1×10¹²cfu/g、或至少1×10¹³cfu/g、或至少1×10¹⁴cfu/g。

於其它實施例中，在本發明之組成物和方法中，該swrA ^-細胞之總量係以swrA ^-細胞在全部組成物中之相對或實際乾重為基礎。於一些實施例中，在本發明之組成物和方法中，該swrA ^-細胞之總量係以該組成物中該swrA ^-細胞之cfu/克為基礎。

於一些實施例中，經由以包含枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌或其突變體之組成物處理植物所增進之抗非生物性逆境性為營養缺乏。營養缺乏的一種實例為缺乏土壤養分，諸如鉀、磷酸鹽和鐵。

本文所使用之術語“非生物性逆境”之常規意義為非存活因素對特定環境中之存活生物體的負面影響，因此，關於植物方面係指非存活因素在特定環境中對植物之負面影響。非存活因素(變量)以明顯的方式影響環境偏離其正常的變化範圍以不利地影響植物族群之性能或植物之個別生理。雖然生物性逆境包括存活干擾，諸如真菌或害蟲，非生物性逆境因素可為自然發生或是人為的，且包括溫度、乾燥土壤、滲透逆境、乾旱、鹽或營養缺乏，所有這些均可能對受影響區域之植物造成傷害(參照，例如Bianco Carmen and Defez Roberto(2011)之表2。Soil Bacteria Support and Protect Plants Against Abiotic Stresses、Abiotic Stress in Plants-Mechanisms and Adaptations，Prof.Arun Shanker(Ed.)、ISBN：978-953-307-394-1，InTech，其可從http：//www.intechopen.com/books/abiotic-stress-in-plants-mechanisms-andadaptations/soil-bacteria-support-and-protect-plants-against-abiotic-stresses取得。在此背景下，於一些實施例中，重金屬毒性被排除在引起非生物性逆境之逆境因素外。

本文所使用之術語“養分缺乏”係指當植物生長在養分缺乏的條件下時造成營養匱乏之營養缺乏。因此，術語“增進抗養分缺乏性”係指本文所考慮之細菌(或含有這些細菌之組成物)提供植物營養，以減少或消除養分缺乏，從而減少或消除非生物性逆境的能力(參見Lunde et al,Climate Change：Global Risks,Challenges and Decisions,IOP Conf.Series：Earth and Environmental Science 6(2009)372029,doi：10.1088/1755-1307/6/7/372029,IOP Publishing)。該增進之對由養分缺乏何造成之逆境的抗性係由細菌溶解土壤養分，諸如鉀、磷酸鹽或鐵，使他們可被植物吸收的能力造成。在經改善之鐵可利用性的情況中，咸信其可利用性的改善係由本發明中所使用之細菌製造含鐵細胞(siderophore)所造成，該含鐵細胞可轉而與鐵複合，從而使其可被植物吸收。這類供植物吸收之可利用性在本文中亦稱為“生物可利用性”。根據本發明，“提高之生物可利用性”意指所增進或 提高之一或多種土壤養分之吸收量係以可測量或顯著的量超越在相同條件下，但不施用本發明之組成物時被植物吸收之相同養分的量。吸收可經由收穫及分析植物組織來測量。根據本發明，當與適當之對照組相比較時，較佳地，該生物可利用性係增進至少0.5%、或至少1%、或至少2%、或至少4%、或至少5%、或至少10%。

於一些實施例中，本發明中所使用之菌株和組成物係在種植前施用並可被稱為土壤接種劑。種植前施用可改善土壤養分之生物可利用性和/或增進種植在預處理過之土壤中的植物之產量和/或生長和/或活力。於特定實施例中係在種植前至少約一天、或在種植前至少約二天、或在種植前至少約三天、或在種植前至少約四天、或在種植前至少約五天、或在種植前至少約六天、或在種植前至少約七天、或在種植前至少約八天、或在種植前至少約九天、或在種植前至少約十天、或在種植前至少約11天、或在種植前至少約12天、或在種植前至少約13天、或在種植前至少約14天、或在種植前至少約2.5週天、或在種植前至少約三週將菌株及組成物施用在土壤或盆栽培養基。

於一些實施例中，本發明所使用之菌株和組成物可增進土壤養分。本文所使用之術語“土壤養分”係指就土壤所包含之可用的植物養分水準而言的土壤條件。經由增進土壤養分，本發明可增進這些植物養分的可利用性。植物養分包括氮(N)、磷(P)、鉀(K)、鈣(Ca )、硫(S)、鎂(Mg)、矽(Si)、硼(B)、氯(Cl)、錳(Mn)、鐵(Fe)、鋅(Zn)、銅(Cu)、鉬(Mo)、鎳(Ni)、硒(Se)和鈉(Na)。

當返回土壤時有機物質可提供土壤養分和有機碳。此有機碳改善土壤和作物植物的健康。為了利用存在於有機物質中之植物養分必須進行生物降解以將其分解成較簡單的化合物。於一實施例中，當本發明之菌株和組成物被施用在土壤時可促進生物降解的過程。此有機物質之生物降解過程和土壤中有機碳之富集亦提供土壤保水穩定性。

於一實施例中，本發明之菌株和組成物促進以水解酶生物降解有機物質。該水解酶可為能分別催化蛋白質、纖維素、木聚醣之水解作用的蛋白酶、纖維素酶或木聚醣酶。於一些實施例中，該纖維素酶為內切葡聚醣酶，而木聚醣酶為內切木聚醣酶。內切葡聚醣酶及內切木聚醣酶分別將纖維素及木聚醣多醣內之內部鍵裂解，而外切葡聚醣酶及外切木聚醣酶係將多醣暴露端附近(例如離開端點2至4個單位)的鍵裂解。

於某些實施例中，該增進土壤養分之方法進一步包含在土壤中施用有機物質。有機物質可為堆肥、動物廢物或任何其他有機碳來源之形式。

於一些其它實施例中，經由以包含枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌或其突變體之組成物處理植物來增進之抗非生物性逆境性為抗鹽逆境性。抗鹽逆境之實例為鹽 耐受性或抗旱性。

本文所使用之術語“鹽耐受性”之一般含義係指植物對鹽濃度之抗性。因此，“增進植物之鹽耐受抗性”一詞意指當植物暴露於較植物平常之生理上可接受之鹽濃度為高的鹽濃度時，植物承受或耐受鹽濃度(在其環境中，諸如在土壤或水中)的能力增進/改善。

術語“耐旱性”在本文中亦以其一般含義使用，其係指植物即使暴露在乾旱條件下仍能維持良好的水平衡和膨脹度，從而避免逆境及其後果的能力。因此，“增進植物之抗旱性”係指當植物暴露於其中植物無法接受其保持水平衡和膨脹度一般所需之水量的條件下時，植物保持良好的水平衡和膨脹度的能力被增進/改善。

術語“鹽逆境”係指植物暴露於偏離各植物之最佳離子強度的離子強度。通常，該離子強度偏離各植物之最佳離子強度在於其為各別植物之最佳離子強度的約1.2倍或更高，或低於最佳離子強度。於一些實施例中，該離子強度偏離各植物之最佳離子強度在於其為各別植物之最佳離子強度的約1.5倍或更高，或低於最佳離子強度。於一些實施例中，該離子強度偏離各植物之最佳離子強度2倍，包括2.5倍。於一些實施例中，該離子強度為各別植物之最佳離子強度之約3倍或更高，或低於最佳離子強度。於一些實施例中，該離子強度偏離最佳離子強度3.5倍，包括4倍。於一些實施例中，該離子強度為各別植物之最佳離子強度之約5倍或更高，或低於最佳離子強 度。鹽逆境可能係由一或多種之氯化鈉、氯化鉀、氯化鋰、氯化鎂及氯化鈣的濃度引起，其偏離各別鹽之最佳濃度約1.5倍或更多。

於一些實施例中，該氯化鈉、氯化鉀、氯化鋰、氯化鎂和/或氯化鈣之濃度偏離各別植物之各別鹽的最佳濃度約1.5倍或更多。於一些實施例中，該氯化鈉、氯化鉀、氯化鋰、氯化鎂和/或氯化鈣之濃度偏離各別植物之各別鹽的最佳濃度約2倍或更多，包括2.5倍或3倍。於一些實施例中，該氯化鈉、氯化鉀、氯化鋰、氯化鎂和/或氯化鈣之濃度偏離各別植物之各別鹽的最佳濃度約4倍或更多。

於一些實施例中，最佳之離子強度係藉由已知之離子強度範圍界定，其中指定之植物顯示出最佳之活力、生長、生物量之製造或任何其它如以下說明之合適參數。同樣地，該一或多種之氯化鈉、氯化鉀、氯化鋰、氯化鎂及氯化鈣的最佳濃度可能已知係由一定之範圍界定，其中指定之植物顯示出最佳之活力、生長、生物量之製造或任何其它如以下說明之合適參數。在這類實施例中，鹽逆境可能藉由超過這類範圍之上限值或低於各別範圍之下限值約1.2倍或更多的離子強度界定。上述係關於最佳之離子強度或鹽濃度之說明，比照適用於其他方面。於一些實施例中，抗鹽性可能經由將所欲植物暴露於具有提高之鹽濃度的水中來驗證(亦見實例部分)。灌溉土壤之水的鹽濃度可有效地以水中溶解之鹽(重量/重量)的百萬分 率表示。淡水之鹽濃度通常低於1,000ppm；微鹹水之鹽濃度通常為1,000ppm至3,000ppm；適度含鹽水之鹽濃度通常為3,000ppm至10,000ppm；高度含鹽水之鹽濃度通常為10,000ppm至35,000ppm；而海水之鹽濃度通常為35000ppm。

植物之增進的抗鹽逆境性(即，鹽耐受性或抗旱性)可藉由本技藝中可使用之任何所需方法來分析。通常，將所欲植物之特性與參考物相比較。這類參考物可為被保持在相同或可比擬之條件下的對應植物，除了該植物未被暴露在包含枯草芽孢桿菌或短小芽孢桿菌之組成物外。於一些實施例中，可使用進一步之參考物以考慮鹽逆境之效果。這類進一步之參考物可為對應於所欲植物之植物，其被保持在相同或可比擬之條件下，除了該植物未被暴露在誘導鹽逆境的條件下。因此，作為這類進一步之參考物的植物通常被保持在其中該植物被暴露於已知可被各別植物品種良好地耐受的鹽水準之下。

鹽逆境本身通常以滲透逆境表現，導致植物細胞中之體內平衡和離子分佈受干擾。這類鹽度或乾旱逆境可能會引起功能和結構性蛋白質變性。結果，可將細胞逆境傳信途徑及細胞逆境反應活化，諸如製造逆境蛋白、上調抗氧化劑、累積相容性溶質及遏止生長。

植物之抗鹽逆境性或其他抗非生物性逆境性(諸如抗養分缺乏性)指標之實例為植物之生長速度。植物之生長速度可藉由，例如監測在一段時間內之植株高度 、植物之根長度或幼芽長度來評估。植物之抗非生物性逆境性指標的另一實例為植物的發育。在這方面，可以，例如經由評估植物達到不同的發育階段需要多長時間來進行。一般而言，在這方面，植物之抗非生物性逆境性指標的一種實例為植物生命力。植物生命力亦在幾個面向中表明，其中有些為可視外觀，舉幾個實例，例如：葉子顏色、果實顏色及外觀、死亡基生葉之量和/或葉片範圍、植株重量、植株高度、植株倒伏範圍、分蘗數目、強度及生產力、穗的長度、根系範圍、根的強度、結瘤範圍(尤其是根瘤菌結瘤)、發芽時間點、出苗、開花、籽粒成熟和/或老化、蛋白質含量、糖含量、千粒重、發芽百分比、出苗百分比、幼苗生長、幼苗高度、根長度或根和幼芽生物量(亦見實例章節，其中係使用根或幼芽之大小和重量來評估水稻植株之抗鹽逆境性)。本文所使用之術語“生物量”係指植物之總重量。在生物量之定義內，可將植物之一或多個部分的生物量加以區分，其量可包括下列之任何一或多項：地上部分，諸如，但不限於幼芽生物量、種子生物量及葉生物量；地上可收穫部分，諸如，但不限於幼芽生物量、種子生物量及葉生物量；地下部分，諸如，但不限於根生物量；植被生物量，諸如根生物量或幼芽生物量；生殖器官；及繁殖芽，諸如種子。

另一植物之抗非生物性逆境性指標之實例為作物產量。“作物”及“果實”被理解為是在收穫後被進一步利用之任何植物產品，例如果實之適當意義，蔬菜、 堅果、穀物、種子、木材(例如在造林植物的情況中)或花(例如在園藝植物、觀賞植物的情況中)。在一般基礎上，作物和果實可為植物所產生之具經濟價值的任何物。而植物之另一抗非生物性逆境性的實例的指標為該植物對生物性逆境因素之耐受性或抗性。於一些實施例中，幼苗存活可作為植物之抗非生物性逆境性指標的另一實例。當需要時可分析植物之抗非生物性逆境性的任一這類指標，不論是單獨或數種指標彼此組合。

在這方面，植物(諸如農業、造林和/或觀賞植物)之“增進的產量”係指各別植物所增加之產物產量係以可測量之量超越該植物同樣暴露於非生物性逆境(包括乾旱或缺乏養分)，但不施用本發明之組成物時所製造之相同產物的產量。於一些實施例中，與在類似或相同之非生物性逆境條件下的未經處理之對應植物相比較時，具有增強之抗非生物性逆境性的植物產量係增進約0.5%或以上。於一些實施例中，具有增強之抗非生物性逆境性的植物之產量在非生物性逆境條件下增進至少約1%。於一些實施例中，在非生物性逆境的條件下產量增進至少約2%，諸如至少約4%。於一些實施例中，在非生物性逆境的條件下產量增進至少約5%。於一些實施例中，與在非生物性逆境條件下之合適對照組相比較，該產量增進至少約10%。

所欲植物之抗旱性(因此，相對於培養在同等條件下之對照植物，其抗旱性增進)亦可經由以枯草芽 孢桿菌或短小芽孢桿菌之組成物處理該植物一段合適的時間，然後停止或減少澆水，再確定何種植物(以枯草芽孢桿菌、或短小芽孢桿菌之組成物處理的植物、或對照組)最後瓦解。另外，抗旱性可經由讓植物循環通過重複之水逆境(即不灌溉的植物)和足量水之循環，並評估何種植物最後瓦解來測定。

如上文所說明者，在本發明之方法中，包含枯草芽孢桿菌和/或短小芽孢桿菌之組成物可施用於很多種農業和/或園藝作物，包括那些長成以用於種子、製造、景觀美化者及那些長成以用於生產種子者。可施用該組成物之代表性植物包括，但不限於下列者：芸苔屬蔬菜、鱗莖類蔬菜、穀物、柑橘、棉花、瓜類、果菜類、葉菜類、豆類、油籽作物、花生、仁果類果實、根類蔬菜、塊根類蔬菜、球莖類蔬菜、核果類果實、煙草、草莓和其他漿果，及各種觀賞植物。

在本發明之背景中所使用之組成物可以能分別將枯草芽孢桿菌和/或短小芽孢桿菌維持在至少為實質上可存活形式之任何形式使用和/或提供。該組成物可施用於植物之表面、植物部分之表面、果實、植物附近、果實附近、包含該植物或果實之區域、或包含該植物部分之區域。

該組成物可以葉面噴灑劑、種子/根/塊根/塊莖/鱗莖/球莖/短枝處理劑和/或土壤處理劑之形式投予。該組成物可在種植前、種植期間或種植後被施用於種子/ 根/塊根/塊莖/鱗莖/球莖/短枝。當作為種子處理劑時，本發明之組成物根據該種子之大小以約1×10²至約1×10¹⁰菌落形成單位(“cfu”)/種子之速率施用。於一些實施例中，本發明之組成物根據該種子之大小以約1×10²至約1×10⁹cfu/種子之速率施用。於一些實施例中，本發明之組成物根據該種子之大小以約1×10²至約1×10⁸cfu/種子之速率施用。於一些實施例中，本發明之組成物根據該種子之大小以約1×10²至約1×10⁷cfu/種子之速率施用。於一些實施例中，根據種子之大小，該施用速率為約1×10³至約1×10⁸cfu/種子。於一些實施例中，根據種子之大小，該施用速率為約1×10³至約1×10⁷cfu/種子之速率施用。於一些實施例中，根據種子之大小，該施用速率為約1×10³至約1×10⁶cfu/種子之速率施用。於一些實施例中，根據種子之大小，該施用速率為約1×10⁴至約1×10⁷cfu/種子之速率施用。當作為土壤處理劑時，本發明之組成物可以土壤表面浸液之形式、戳入、注射和/或施用在犁溝，或與灌溉水混合施用。土壤浸液處理劑(其可在種植時、播種期間或播種後、或移栽後，以及植物生長的任何階段施用)之施用速率為每英畝約4×10⁷至約8×10¹⁴cfu、或每英畝約4×10⁹至約8×10¹³cfu、或每英畝約4×10¹¹至約8×10¹²cfu、或每英畝約2×10¹²至約6×10¹³cfu、或每英畝約2×10¹²至約3×10¹³cfu。於一些實施例中，該施用速率為每英畝約1×10¹²至約6×10¹²cfu、或每英畝約1×10¹³至約6×10¹³cfu。於一些實施例中，土壤浸液處理劑(其可 在種植時、播種期間或播種後、或移栽後、及植物生長的任何階段施用)之施用速率通常為每英畝約4×10¹¹至約8×10¹²cfu。於其它實施例中，該施用速率為每英畝約1×10¹²至約6×10¹²cfu。再於其它實施例中，該施用速率為每英畝約6×10¹²至約8×10¹²cfu。於其它實施例中，該施用速率為每英畝至少約1×10⁸、每英畝至少約1×10⁹、每英畝至少約1×10¹⁰、每英畝至少約1×10¹¹、每英畝至少約1×10¹²、或每英畝至少約1×10¹³。在種植時，犁溝處理劑之施用速率為每1000列英呎約2.5×10¹⁰至約5×10¹¹cfu。於一些實施例中，該施用速率為每1000列英呎約6×10¹⁰至約4×10¹¹cfu。於其他實施例中，該施用速率為每1000列英呎約3.5×10¹¹至每1000列英呎約5×10¹¹cfu。再於其它實施例中，在種植時，犁溝處理劑之施用速率為每1000列英呎至少約1×10⁹cfu、每1000列英呎至少約1×10¹⁰cfu、每1000列英呎至少約1×10¹¹cfu、或每1000列英呎至少約1×10¹²cfu。

該組成物亦可經製備以用於以熏蒸劑之形式在戶外以及室內兩處施用，例如在封閉的環境中，諸如温室、動物穀倉或棚屋、人類住所及其他建築物。熟習本技藝之人士將察知用於製備這類熏蒸劑(例如成霧濃縮劑及煙霧產生劑)之各種方法。成霧濃縮劑一般為用於透過成霧機施用以創建可分佈在整個封閉和/或開放環境之細水霧的液體調和物。這類成霧濃縮劑可使用已知之技術製備以使其能透過成霧機施用。煙霧產生劑(其一般為粉末調 和物)係經燃燒來創建煙霧熏蒸劑。這類煙霧產生劑亦可使用已知之技術製備。

於一根據本發明之方法中，該組成物可以多種不同的方式施用。在小規模施用方面，可使用背負式槽、手持杖、噴霧瓶或氣溶膠罐。在稍大規模施用方面，可使用具有吊桿之拖拉機牽引設備、拖拉機牽引水霧送風機、配備用於噴灑或成霧噴霧機的飛機或直升機。小規模施用固體調和物可以多種不同的方式完成，其實例有：直接從容器搖動產品或藉由人力驅動之肥料撒佈機以重力施用。大規模施固體調和物可藉由重力給料拖拉機牽引施用器或類似設備完成。

於一些實施例中，該含有枯草芽孢桿菌和/或短小芽孢桿菌之組成物可在將植物從一個位置移植到另一個位置(諸如從溫室或溫床移至田野)之前、期間和/或之後不久施用。於另一實例中，該組成物可在苗從土壤或其它生長基質(諸如蛭石)冒出後不久施用。再於另一實例中，該組成物可在水栽培植物生長之任何時間施用。因此，根據本發明之方法，該組成物可在植物之生命週期間的任何所需時間施用。於一些其它實施例中，本發明之組成物係在任何所需之發育階段期間，每隔約1小時、約5小時、約10小時、約24小時、約2天、約3天、約4天、約5天、約1週、約10天、約兩週、約三週、約1個月或更長的時間施用在植物和/或植物部分兩次。於一些實施例中，本發明之組成物係在任何所需之發育階段期 間，每隔約1小時、約5小時、約10小時、約24小時、約2天、約3天、約4天、約5天、約1週、約10天、約兩週、約三週、約1個月或更長的時間施用在植物和/或植物部分兩次以上，例如3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多次。若需要時可改變每次施用之間的間隔時間。

本發明進一步提供進一步包含至少一種除了swrA ^-細胞外之其它活性成分或作用劑之任何本發明的組成物。這類其它活性成分或作用劑可為化學品或其他細菌菌株。合適之活性成分或作用劑的實例包括，但不限於除草劑、殺真菌劑、殺菌劑、殺蟲劑、殺線蟲劑、殺蟎劑、植物生長調節劑、植物生長刺激劑、肥料及彼等之組合。

本發明進一步提供孢子形成細菌(諸如枯草芽孢桿菌)或進一步包含配製惰性劑或其它配製成分之本發明組成物的任一者，該配製惰性劑或其它配製成分為，諸如多醣(澱粉、麥芽糊精、甲基纖維素、蛋白質、諸如乳清蛋白、肽、樹膠)、糖類(乳糖、海藻糖、蔗糖)、脂類(卵磷脂、植物油、礦物油)、鹽類(氯化鈉、碳酸鈣、檸檬酸鈉)及矽酸鹽(黏土、無定形二氧化矽、氣相/沉澱之二氧化矽、矽酸鹽)。於一些實施例中(諸如那些其中該組成物係施用於土壤中者)，本發明之組成物包含載體，諸如水或礦物質或有機物質，諸如促進該組成物併入土壤中的泥炭。於一些實施例中(諸如那些其中該組成物係用於處理種子，或作為根浸液者)，該載體為促 進該組成物黏附於種子或根的結合劑或黏附劑。於另一其中該組成物係作為種子處理劑之實施例中，該配製成分為著色劑。於其它組成物中，該配製成分為防腐劑。

本發明之組成物可包含添加在包含細胞、不含細胞之製劑或代謝物之組成物中的配製惰性劑，以改善效力、穩定性及易用性和/或促進加工、包裝和終端施用。這類配製惰性劑和成分可包括載體、穩定劑、養分或物理性能改質劑，其可單獨添加或組合添加。於一些實施例中，該載體可包括液體物質，諸如水、油及其他有機或無機溶劑和固體物質，諸如經由生物衍生或化學合成之礦物質、聚合物或聚合複合物。於一些實施例中，該載體為促進該組成物黏附於植物部分(諸如種子或根)之結合劑或黏附劑。見，例如Taylor,A.G.,et al.,"Concepts and Technologies of Selected Seed Treatments" Annu.Rev.Phytopathol.28：321-339(1990)。該穩定劑可包括防結塊劑、抗氧化劑、乾燥劑、保護劑或防腐劑。該養分可包括碳、氮和磷來源，諸如糖、多醣、油、蛋白質、胺基酸、脂肪酸及磷酸鹽。該物理性能改質劑可包括填充劑、潤濕劑、增稠劑、pH改質劑、流變改質劑、分散劑、佐劑、表面活性劑、抗凍劑或著色劑。於一些實施例中，該包含細胞、無細胞製劑或經由發酵產生之代謝物的組成物可在無任何其他配製製劑，加有或不加有作為稀釋劑之水下直接使用。於一些實施例中，該配製惰性劑係在將發酵液濃縮後，及乾燥期間和/或乾燥後添加。

本專利說明書中對於先前發表之文件的列舉或討論不應被視為承認該文件為本技藝術狀態之一部分，或為普遍之一般知識。

說明性地描述於此之本發明可在缺乏未具體描述於此之任何元素、限制下適當地實行。因此，例如，術語“包含”、“包括”、“含有”，等應被擴大解讀，而無限制。除非上下文另外清楚指明，單數型，諸如“一(a)”、“一(an)”、或“該”包括複數指稱。除非另外指明，在一系列元素之前的術語“至少”被理解為係指該系列中的每個元素。例如，術語“至少一”及“...中之至少一”包括，例如一、兩、三、四、五或更多個元素。高於或低於所述之範圍的輕微變化可用於實質上取得與在該範圍內之數值的相同結果。此外，除非另外指明，所揭露之範圍係欲為一連續範圍，包括在最小值和最大值之間的每個數值。

此外，本文所使用之術語及措詞係用作描述而非限制，且這類術語及措詞並不欲排除所顯示及描述之特性或其部分的任何同等項，但在本發明所主張專利之範圍內可能進行各種修改是被公認的。因此，應理解，雖然本發明已藉由示範性實施例及可選擇之特性被具體揭露，本文之揭露內容中體現之本發明的修改和變化可為熟習本技藝之人士所採用，且這類修改和變化被認為係在本發明的範圍內。

本文中已廣泛且概略地描述本發明。每一落 在概括之揭露內容內的較狹小形式及亞屬分組亦形成一部分之本發明。這包括從該類型除去任何標的物之限制性條款或消極限制的本發明概括描述，無論該被删除之材料是否被具體列舉於此。

其它實施例係在所附之申請專利範圍內。此外，當本發明之特性或觀點係就馬庫西群組(Markush group)描述時，熟習本技藝之人士將可察知本發明亦就該馬庫西群組的個別成員或小組成員被描寫。

為了使本發明能被容易地理解並投入實際效果，現將藉著下列非限制性實例說明特殊實施例，這些非限制性實例僅用於說明。

[實例] 實例1：藉由枯草芽孢桿菌增進抗鹽逆境性

進行第一項研究以分析以SERENADE®浸濕之水稻幼苗被灌溉鹽時是否可見到植物生長提升。

步驟：

將三個水稻種子，品種RM401，播種在充滿Profile Greens Grade的2.5”盆子中。每個種子接受(為本文所使用之示範性發酵產品/組成物形式)2毫升之64盎司/英畝的市售SERENADE®(總體積100毫升之11.2%)或水。將盆子依浸濕處理組放置在靠近沒有洞的平坦單位中，並在溫室中生長。在實驗持續期間以濃度100 ppm N之20-20-20肥料灌溉植物並將灌溉水準維持在約為盆子高度的一半。播種14天後，每一浸濕處理組(水或SERENADE® 64盎司/英畝)取10盆接受60mM鹽之灌溉。每週更換平坦單位中之水兩次並在鹽處理開始後14天內為植物評級。收穫植物，令其乾燥。收集根和幼芽重量。

結果：

以SERENADE SOIL®處理並以60mM之鹽灌溉14天的水稻植物看起來高於在鹽逆境下，以水處理的植物(第1圖)。以SERENADE SOIL®處理並以60mM之鹽灌溉14天的水稻植株之根看起來長於在鹽逆境下，以水處理的植物(第2圖)。在依上述相同之方式進行的另一實驗中，以SERENADE ASO®處理並以60mM之鹽灌溉14天之植物的根和幼芽的重量顯著高於以水處理之植物的重量。見第5圖。因此，此結果顯示枯草芽孢桿菌QST713之組成物/發酵產物可增進植物之抗鹽逆境性(鹽逆境耐受性)。

實例2：藉由短小芽孢桿菌增進抗鹽逆境性

進行第二項研究以分析以SONATA®浸濕之水稻幼苗被灌溉鹽時是否可見到植物生長提升。在這項研究中，亦比較以SONATA®處理及以SERENADE®處理植物的效力。

步驟：

將三個水稻種子，品種RM401，播種在充滿Profile Greens Grade的2.5”盆子中。每個種子接受(為本文所使用之示範性發酵產品/組成物形式)2毫升之64盎司/英畝的市售SONATA®或SERENADE®(總體積為100毫升，佔11.2%，以cfus/植株標準化)或水。將陶盆放置在靠近浸濕處理組之無孔單位中，並在溫室中生長。在實驗持續期間以濃度100ppm N之20-20-20肥料灌溉植物並將灌溉水準維持在約為陶盆高度的一半。播種14天後，每一浸濕處理組(水或SERENADE® 64盎司/英畝)中有10盆接受鹽濃度為60mM鹽之灌溉。每週更換單位中之水兩次並在鹽處理開始後14天內評定植物的等級。收穫植物，並使其乾燥。收集根和幼芽重量。

結果：

以SONATA®處理並以濃度為60mM之鹽灌溉14天的水稻植物看起來高於在鹽逆境下，以水處理的植物(第3圖)。分别以SONATA®程SERENADE SOIL®處理並以濃度為60mM之鹽灌溉14天的水稻植株之根看起來長於在鹽逆境下，以水處理的植物(第4圖)。第5圖顯示出以SERENADE ASO®處理之植物及以水處理之植物以毫克計之根和幼芽的乾燥重量。以SERENADE ASO®處理之植物的幼芽和根二者之乾燥重量均顯著高於以水處理 的植物。因此，此結果顯示短小芽孢桿菌ST2808之組成物/發酵產物可增進植物之抗鹽逆境性(鹽逆境耐受性)。

實例3：增進抗旱逆境性

鹽耐受性被普遍接受用來模擬耐旱性，因此可歸結出顯示鹽耐受性之植物亦將具耐旱姓。因此，上述實驗亦指出枯草芽胞桿菌QST713及短小芽孢桿菌ST2808亦增進植物之抗旱性。

抗旱性亦可依下述進行測定。

將植物，諸如水稻種子，品種RM401播種在充滿Profile Greens Grade的2.5”陶盆中。每個種子接受2毫升，比率為64盎司/英畝之市售SONATA®或SERENADE®(總體積100毫升之11.2%)或水。將盆子依浸濕處理組放置在没有洞之平坦單位中，並在溫室中生長。在實驗持續期間以100ppm N之20-20-20肥料灌溉植物並將灌溉水準維持在約為盆子高度的一半。播種14天後，每一浸濕處理組(水或SERENADE® 64盎司/英畝)取10盆停止或減少澆水，並測定最後崩壞之植株為何。根據上述結果，預期以SONATA®或SERENADE®處理之植物將在僅接受水之植物後崩壞。

另一可用於測定耐旱性之典型方案為使植物循環通過反復之水逆境(即，不灌溉植物)和足夠之水循環週期並評估最後崩壞之植株為何。例如，停止澆水直到 經SONATA®或SERENADE®處理之植物於再次澆水的時點顯示出危難的跡象。評估在實驗結束後何種植株最後崩壞或看起來更健康。根據上述結果，亦預期在實驗結束後當與僅以水處理的植物相比較時，以SONATA®或SERENADE®處理之植物將在僅接受水的植物之後崩壞，或看起來較健康。

實例4：用於測定枯草芽孢桿菌增溶磷酸鹽之養分增溶性能的分析

將細菌菌株(AQ30002和AQ713)之新鮮培養物生長在含有NBRIY培養基(葡萄糖10克/升、Ca₃(PO₄)₂ 5克/升、(NH₄)₂SO₄ 0.1克/升、NaCl 0.2克/升、MgSO₄×7 H₂O 0.25克/升、KCl 0.2克/升、MgCl₂×6 H₂O 5克/升、FeSO₄×7 H₂O 0.002克/升)之搖瓶中。將燒瓶培育在30℃下，並在200rpm下一邊搖動至多14天。培養7和14天後，使用分光光度計，藉由比色法，在660nm處測定並使用空白培養基作為對照組以測定培養肉湯之上清液中的可溶性鉀之濃度。從第6圖可以看出，兩種菌株在NBRIY培養基中提供較在空白培養基中顯著為高的可溶性磷酸鹽水準(第6A圖由AQ713增溶磷酸鹽，第6B圖由AQ30002增溶磷酸鹽)。

實例5：用於測定枯草芽孢桿菌A之養分增溶性能的分析-製造含鐵細胞以改善鐵之可利用性

根據Pérez-Miranda et al.O-CAS,a fast and universal method for siderophore detection.J.Microbiol.Methods 70：127-131,2007，使用覆蓋CAS瓊脂法將細菌菌株(AQ30002和AQ713)之新鮮培養物接種在鉻天青S(CAS)瓊脂盤上。將該瓊脂盤在30℃下培育至多7天。目視檢查瓊脂盤之顏色從藍色變成橙色，這指出含鐵細胞的製造。AQ30002和AQ713菌落造成顏色變化，指出該兩種菌株具有作為土壤接種物，提供足夠之含鐵細胞製造以改善之鐵可利用性的效用。

實例6：用於測定增進土壤養分水準之內切葡聚醣酶、內切木聚醣酶及蛋白酶活性之分析

分別使用輔以1%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、1%木聚醣及1% AZO-酪蛋白之營養瓊脂來測量內切葡聚醣酶、內切木聚醣酶及蛋白酶活性。首先將AQ30002及AQ713細菌菌株生長在來自Hardy診斷公司之營養瓊脂盤上並在30℃下培育一整夜。然後，將單一菌落轉移到輔以基質(CMC-Na、木聚醣、AZO-酪蛋白)之培養盤中間。然後，將培養盤在30℃下培育2-7天。若培育期結束時可見到一個透明區，則將酶活性記錄為陽性。

將AQ30002和AQ713菌落在輔以基質之培養盤上培育可以各基質產生一透明區。內切葡聚醣酶和內切木聚醣酶分別水解纖維素和木聚醣(此兩者均為存在於植物細胞壁中之多醣)。這些水解活性加上蛋白酶活性可允 許AQ713和AQ30002促進存在於土壤中的有機物質轉化成可被生長中之植物利用的養分。

植物之根亦擠出許多有機物質至根之表面上。不希望受限於任何理論，如AQ713及AQ30002之定居於根者可使用該擠出物作為沿根部生長之能量來源，並同時透過酶的作用從有機物質釋出礦物質以供植物吸收。

<110> Bayer CropScience LP GUILHABERT-GOYA,Magalie ZHU,Hong

<120> 增進植物之抗非生物性逆境性之方法

<130> 252-US

<150> 61/696,046

<151> 2012-08-31

<150> 61/715,780

<151> 2012-10-18

<150> 61/792,355

<151> 2013-03-15

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 351

<212> DNA

<213> 枯草芽孢桿菌

<400> 1

<210> 2

<211> 117

<212> PRT

<213> 枯草芽孢桿菌

<400> 2

<210> 3

<211> 350

<212> DNA

<213> 枯草芽孢桿菌

<400> 3

<210> 4

<211> 351

<212> DNA

<213> 枯草芽孢桿菌

<400> 4

<210> 5

<211> 351

<212> DNA

<213> 解澱粉芽孢桿菌

<400> 5

<210> 6

<211> 351

<212> DNA

<213> 短小芽孢桿菌

<400> 6

<210> 7

<211> 351

<212> DNA

<213> 枯草芽孢桿菌

<220>

<221> misc_feature

<222> (345)..(345)

<223> n為a,c,g，或t

<400> 7

<210> 8

<211> 351

<212> DNA

<213> 短小芽孢桿菌

<400> 8

<210> 9

<211> 351

<212> DNA

<213> 萎縮芽孢桿菌

<400> 9

<210> 10

<211> 351

<212> DNA

<213> 地衣芽孢桿菌

<400> 10

<210> 11

<211> 672

<212> DNA

<213> 枯草芽孢桿菌

<400> 11

<210> 12

<211> 1791

<212> DNA

<213> 枯草芽孢桿菌

<400> 12

<210> 13

<211> 138

<212> DNA

<213> 枯草芽孢桿菌

<400> 13

Claims (24)

1. 一種增進植物之抗非生物性逆境性之方法，該方法包含將包含短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)或枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)之組成物施用於植物、植物之一部分和/或該植物或植物部分周圍的區域。
2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該抗非生物性逆境性為抗鹽逆境性或對養分缺乏之抗性。
3. 如申請專利範圍第2項之方法，其中該抗鹽逆境性為鹽耐受性或抗旱性之一。
4. 如申請專利範圍第2項之方法，其中對養分缺乏之抗性的增進係藉由養分增溶或藉由刺激植物在該植物或植物部分周圍區域之土壤中製造含鐵細胞(siderophore)。
5. 如申請專利範圍第4項之方法，其中該養分增溶可改善養分之生物利用度至少約5%。
6. 如申請專利範圍第4項之方法，其中該養分增溶係選自以下群組：由含鐵細胞結合作用引起之鉀增溶、磷酸鹽增溶或鐵增溶、及彼等之組合。
7. 如申請專利範圍第6項之方法，其中在該施用之前係先鑑定該土壤具有低濃度之選自以下群組之一或多種土壤養分：鉀、磷酸鹽及鐵。
8. 如申請專利範圍第1至7項中任一項之方法，其中該短小芽孢桿菌為短小芽孢桿菌QST 2808，或選自以下群組之枯草芽孢桿菌：枯草芽孢桿菌QST713、枯草芽孢桿菌QST30002、枯草芽孢桿菌QST30004、短小芽孢桿 菌QST 2808之突變體、枯草芽胞桿菌QST713、枯草芽孢桿菌QST30002之突變體、枯草芽孢桿菌QST30004之突變體、及彼等之組合。
9. 如申請專利範圍第1至7項中任一項之方法，其中該組成物包含在swrA基因中具有突變之枯草芽孢桿菌QST713細胞且該具有突變之細胞占該組成物中之總細菌細胞的至少3.5%。
10. 如申請專利範圍第9項之方法，其中該具有突變之細胞在起始密碼子中包含至少一個核酸鹼基對變化和/或在該swrA基因中包含至少一個核酸鹼基對插入或缺失。
11. 如申請專利範圍第10項之方法，其中在該swrA基因中之插入或缺失係發生在SEQ ID NO.1之位置26-34處的一或多個鹼基對。
12. 如申請專利範圍第9項之方法，其中該具有突變之細胞係選自以下群組：分別以登錄編號NRRL B-50421和NRRL B-50455存放之菌株QST30002及菌株QST30004。
13. 如申請專利範圍第1至7項中任一項之方法，其中該組成物進一步包含至少一種載體。
14. 如申請專利範圍第1至7項中任一項之方法，其進一步包含對該組成物施用至少一種其他活性成分。
15. 如申請專利範圍第14項之方法，其中該活性成分為化學物質或其他菌株。
16. 如申請專利範圍第14項之方法，其中該活性成分係選自以下群組：植物生長調節劑、植物生長刺激劑、肥料、及彼等之組合。
17. 如申請專利範圍第1至7項中任一項之方法，其中該植物部分係選自以下群組：種子、果實、根、球莖、塊根、鳞莖及塊莖。
18. 如申請專利範圍第1至7項中任一項之方法，其中該方法包含將組成物施用在土壤。
19. 如申請專利範圍第18項之方法，其中該組成物係在植物或植物部分與土壤接觸之前、期間或之後施用。
20. 如申請專利範圍第19項之方法，其中該組成物係在種植前至少約五天施用。
21. 如申請專利範圍第1至7項中任一項之方法，其中該組成物為一種選自以下群組之組成物：液體、可濕性粉末、顆粒、可流動性及微量包封。
22. 如申請專利範圍第1至7項中任一項之方法，其中該植物係選自以下群組：樹、草本植物、灌木、草、藤、蕨、苔蘚和綠藻類、單子葉植物及雙子葉植物。
23. 如申請專利範圍第17項之方法，其中該組成物係以每一種子至少約1×10⁶cfu之比率施用。
24. 如申請專利範圍第18項之方法，其中該組成物係以每英畝約4×10⁷至約8×10¹⁴cfu之比率施用。