WO2018105722A1 - 植物共生微生物群の選抜方法、及び微生物混合物 - Google Patents

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WO2018105722A1
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世吾 小野
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積水化学工業株式会社
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/22—Bacillus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
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    • A01G7/00—Botany in general
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
    • A01G7/00—Botany in general
    • A01G7/06—Treatment of growing trees or plants, e.g. for preventing decay of wood, for tingeing flowers or wood, for prolonging the life of plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
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    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to a method for selecting a plant symbiotic microorganism group that enables growth of a plant under environmental stress and / or disease stress, and salt stress that is symbiotic with a plant selected from the natural world using the method.
  • the present invention relates to a microbial mixture that enables growth of a plant body underneath, and a microbial mixture that is selected from the natural world using the method and that allows the growth of the plant body under high osmotic stress by coexisting with the plant body. .
  • This application is based on US patent application 62/431443 filed on December 8, 2016, US patent application 62/434427 filed on December 15, 2016, and US filed on January 23, 2017. Claims priority based on patent application 62/449118, US patent application 62/449122 filed January 23, 2017, and US patent application 62/488069 filed April 21, 2017. , The contents of which are incorporated herein.
  • rhizobia symbiotic to legume roots convert nitrogen in the atmosphere into nitrogen compounds that can be used by the plant. This nitrogen fixation by the rhizobia allows legumes to grow even in soils that are low in fertilizer.
  • symbiotic microorganisms that have actions to enhance immunity of plants, promote growth, compensate for nutrient deficiencies, and enhance resistance to various environmental stresses. Therefore, attempts have been made to use such symbiotic microorganisms to allow plants to grow even in harsh environments such as soils lacking essential nutrients and soils with high salt concentrations.
  • Patent Document 1 discloses that microorganisms extracted from nature are attached to the roots of sterile duckweed (Spirodela polyrrhiza) and cultured in a liquid medium together with the sterile duckweed.
  • a method is disclosed. By using a duckweed plant as a support for culturing microorganisms, microorganisms that could not be separated and obtained by a conventional method of separating microorganisms directly from a sample collected from nature by a plate culture method can be obtained.
  • a method for examining whether or not it is useful is performed. For example, when finding a symbiotic microorganism capable of growing a plant under a specific environmental stress, the plant is inoculated with a microorganism isolated from nature and allowed to grow for a certain period of time under environmental stress.
  • the desired useful symbiotic microorganism can be obtained by recovering the microorganism from the plant that has grown.
  • microorganisms are useful only when they are in the state of a specific microorganism mixture, but it is very difficult and laborious to investigate the usefulness by experimenting with combinations of many microorganisms. . Moreover, not all the microorganisms necessary for exhibiting usefulness may be isolated.
  • the present invention provides a method for selecting a plant symbiotic microorganism group capable of growing a plant body under environmental stress (non-biological stress) and / or disease stress (biological stress), A microbial mixture selected from the natural world using the method and symbiotic with the plant body to enable the growth of the plant body under salt stress, and a microbial mixture selected from the natural world using the method.
  • An object of the present invention is to provide a microbial mixture that enables growth of a plant under drought stress.
  • the method for selecting a plant symbiotic microorganism group, the method for growing a plant body, and the mixture of microorganisms according to the present invention are the following [1] to [22].
  • [1] One or a plurality of plants are grown for a certain period in a state of being partially immersed in a solution containing a microorganism mixture under environmental stress and / or disease stress, and then attached to the growing plant.
  • a method for selecting a plant symbiotic microorganism group A method for selecting a plant symbiotic microorganism group.
  • [2] The method for selecting a plant symbiotic microorganism group according to [1], wherein a cycle including the following step (1) is repeated at least once after the first selection step: After the first selection process, (1) One or a plurality of plants are grown for a certain period in a state of being partially immersed in a solution containing the selected microorganism under the stress, and then attached to the growing plant. A step of collecting microorganisms and selecting them as a plant symbiotic microorganism group capable of growing a plant body under the stress. [3] The method for selecting a plant symbiotic microorganism group according to [2], wherein the strength of the stress in the step (1) is sequentially increased every time the cycle is repeated.
  • the microorganism in the solution in which at least a part of the plant body is immersed is a microorganism extracted from one or more samples collected from nature
  • a method for growing a plant body comprising: [16]
  • the growing step comprises The method for growing a plant according to the above [15], which is a step of transplanting a plant having the plant symbiotic microorganism group attached to a root to the soil after being hydroponically cultivated under aseptic conditions and allowing the plant to grow under the stress.
  • a microorganism mixture comprising Bacillus pumilus CRCO-3 strain having 16S rDNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, and allowing the plant body to grow under salt stress in symbiosis with the plant body.
  • the abundance ratio of Bacillus pumilus CRCO-1 strain is 70 to 90%, the abundance ratio of Bacillus pumilus CRCO-2 strain is 5 to 20%, and the abundance ratio of Bacillus pumilus CRCO-3 strain is 1 to 15 %, The microorganism mixture according to the above [19].
  • Bacillus cereus CRCO-4 strain having 16S rDNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 6, Bacillus cereus CRCO-5 strain having 16S rDNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 7, A microbial mixture comprising symbiosis and allowing growth of a plant under high osmotic stress by symbiosis with the plant.
  • a plant symbiotic microorganism group that is symbiotic to a plant body and enables the growth of the plant body under environmental stress and / or disease stress can be selected as a group. it can.
  • the microbial mixture according to the present invention can improve the salt tolerance or high osmotic pressure resistance of the symbiotic plant body, the microbial mixture is inoculated into the plant body and allowed to coexist in a high salt concentration environment. Or the growth property in a dry environment can be improved.
  • ⁇ Method for selecting plant symbiotic microorganisms> In the method for selecting a plant symbiotic microorganism group according to the present invention, one or a plurality of plant bodies were grown for a certain period in a state of being partially immersed in a solution containing a microbial mixture under environmental stress and / or disease stress. Then, it has the 1st selection process of collect
  • the method for selecting a plant symbiotic microorganism group according to the present invention is different from the method of inoculating a plant body by combining a plurality of microorganisms isolated in advance and finding a combination that enables the growth of the plant body under stress. Since a symbiotic microorganism group consisting of a combination that enables the growth of a plant body under stress is directly recovered from a mixture of a plurality of types of microorganisms, a useful symbiotic microorganism group can be selected relatively easily.
  • the microorganism constituting the microorganism mixture to be inoculated into the plant body in the first selection step is not particularly limited, and may be a microorganism extracted from a sample collected from the natural world and collected from an artificial environment. It may be a microorganism extracted from the prepared sample.
  • the microorganism inoculated into the plant body is preferably a microorganism extracted from a sample collected from the natural world. Examples of the sample collected from the natural world include soil such as forests, wetlands, plains, cultivated land, paddy fields, etc .; water and bottom mud such as seas, rivers, lakes, and hot springs; or animals and plants. Examples of samples collected from an artificial environment include samples collected from food factories, sewerage treatment facilities, waste treatment facilities, hospitals, and the like. Extraction of microorganisms from these samples can be performed by a conventional method.
  • the microorganism mixture inoculated into the plant body may be a mixture of microorganisms extracted from one type of sample or a mixture of microorganisms extracted from two or more types of samples.
  • the microorganisms extracted from a sample are inoculated into a plant in a state of being suspended in a solution, the microorganisms extracted from two or more types of samples are brought into contact with the plant by a single operation. be able to.
  • microorganisms may be extracted for each soil to prepare a suspension, and each may be separately contacted with a plant body. It may be suspended in a solution and contacted with the plant at the same time.
  • the soil may be mixed in advance, microorganisms may be extracted from the soil mixture to prepare a suspension, and the suspension may be contacted with the plant. .
  • the plant body By contacting the plant body with a mixture of microorganisms derived from multiple types of samples, the labor required for selection of the plant symbiotic microorganism group can be suppressed, and a microorganism group having a higher symbiotic effect can be easily obtained. I can expect.
  • the microorganism to be inoculated into the plant body in the first selection step may be a microorganism that has been subjected to a mutation treatment on an already isolated microorganism.
  • Mutation treatment includes, for example, treatment with energy rays such as ultraviolet rays, X-rays and gamma rays, treatment with mutagen such as ethyl methanesulfonate (EMS), N-methyl-N-nitrosoguanidine (NTG), nitrous acid, etc. Can be mentioned.
  • a microorganism mixture is contained in a solution in which a plant body is immersed (hereinafter sometimes referred to as “immersion solution”). Inoculation of a microbial mixture into a plant is not performed in a solid medium such as a flat plate medium but in an aqueous medium having a high degree of freedom of movement of microorganisms.
  • immersion solution a solution in which a plant body is immersed
  • a useful group of microorganisms that enable the growth of the plant body below can easily coexist in or on the surface of the plant body.
  • the “microorganism group” means a group composed of two or more kinds of microorganisms.
  • the group of plant symbiotic microorganisms selected in the present invention may be a group consisting of two or more microorganisms having different genus species, or may be a group of microorganisms consisting of two or more strains belonging to the same species.
  • a plant symbiotic microorganism group in order to inoculate a plant body with a microorganism, at least a part of the plant body is immersed in a dipping solution containing a microorganism mixture.
  • the plant part to be immersed in the immersion solution may be a part that can grow as long as the immersed plant body is free from environmental stress and disease stress. For example, roots, stems, leaves, underground stems Or any other part.
  • the dipping solution is preferably liquid fertilizer containing various nutrients inoculated from the roots.
  • the root part of the plant body is supported by a solid support such as rock wool, agar medium, soil, etc., and a hydroponics container that immerses the lower part of the root in liquid fertilizer, and the microbial mixture is added to the liquid fertilizer.
  • composition of the liquid fertilizer to be used can be suitably adjusted according to the biological species of the plant body to grow.
  • MS Middle-Skoog
  • B5 Garborg's B5
  • White medium or a modified medium thereof can be used.
  • the plant species used in the method for selecting a plant symbiotic microorganism group according to the present invention is not particularly limited, and any kind of plant can be used.
  • a useful symbiotic microorganism group is likely to vary depending on the type of plant, it is preferable to use a plant that is desired to be able to grow under a target stress. For example, when there is a crop to be cultivated in an area where salt damage is severe, the plant symbiotic microorganism group selection method according to the present invention is performed using the crop.
  • the plant used in the method for selecting a plant symbiotic microorganism group according to the present invention is aseptically cultivated.
  • seed sterilization can be performed by conventional methods such as a method of immersing in a sodium hypochlorite solution or a method using chlorine gas.
  • one plant body is immersed in an immersion solution containing one microorganism (an immersion solution containing a microorganism placed in one container).
  • an immersion solution containing a microorganism placed in one container.
  • the number of plants immersed in one immersion solution is preferably 8 or more, more preferably 24 or more, still more preferably 48 or more, and still more preferably 96 or more.
  • the plant body to be used is an aquatic plant or a plant that can be hydroponically cultivated
  • the roots of a large number of plant bodies can be immersed in a sufficient amount of the immersion solution, so that the symbiotic microorganism group can be selected more efficiently. be able to.
  • the environmental stress means various stresses that a plant receives from the outside world.
  • Examples of environmental stress include salt stress (stress due to salt concentration that is too high), drought stress (high osmotic pressure stress), nutrition stress (stress due to lack of necessary nutrients and excess), and low temperature stress (including freezing stress).
  • Examples of nutritional stress include iron (Fe), manganese (Mn), boron (B), zinc (Zn), nickel (Ni), molybdenum (Mo), nitrogen (N), phosphorus (P), and potassium (K). ), Calcium (Ca), magnesium (Mg), sulfur (S), and other stresses due to lack of nutrient components essential for the growth of plants.
  • Other environmental stresses include, for example, stress due to the presence of toxic substances including aluminum stress, which is a problem mainly in acidic soil.
  • examples of the disease stress include biological stress caused by pathogenic bacteria, pests and the like.
  • salt stress can be applied to the plant to be grown.
  • aluminum ion concentration of the dipping solution aluminum stress can be applied to the plant to be grown.
  • the drought stress is mainly caused by the high osmotic pressure state due to drying
  • the plant body is grown in the high osmotic pressure state by increasing the concentration of polyethylene glycol (PEG), mannitol, sucrose, etc. in the soaking solution.
  • PEG polyethylene glycol
  • mannitol mannitol
  • sucrose etc.
  • drought stress can be applied.
  • nutrient deficiency stress can be applied to the plant to be grown by reducing or not including the content of the essential nutrients from the soaking solution.
  • low temperature stress and high temperature stress can be applied to the plant to be grown by controlling the environmental temperature at which the plant is grown.
  • the intensity of disease stress can be increased by increasing the amount of pathogenic bacteria and pests that infect the plant body.
  • the stress applied to the plant body to be grown may be only one kind or a combination of two or more kinds.
  • salt stress and drought stress can be applied to the plant at the same time, and both salt resistance and drought stress resistance can be applied to the plant.
  • a symbiotic microorganism group that can be imparted can be selected.
  • the combination of stress is not particularly limited, and two or more kinds of environmental stress may be combined, or environmental stress and disease stress may be combined.
  • the strength of environmental stress and disease stress is that the plants cannot withstand normal growth under aseptic conditions.
  • the strength is preferably such that the phenotype has some influence on the phenotype. More preferably, the strength is such that the growth of the plant itself is difficult under aseptic conditions. More specifically, the strength of the stress is preferably a strength at which the growth rate of plants of the same species is 0% or more and less than 50% in aseptic conditions, and a strength at which the growth rate is 0% or more and 30% or less It is more preferable.
  • the microorganisms are symbiotic to the plant body in an appropriate combination by growing in a dipping solution containing a microorganism mixture for a certain period of time.
  • the growing period is not particularly limited, and may be a period sufficient for the influence of stress to appear in the plant body, and can be appropriately determined in consideration of the type of plant body, the type of stress, and the like.
  • the growth period under stress can be 3 days to 1 month, preferably 7 to 21 days.
  • a sterile plant cannot grow normally, but when an appropriate symbiotic microorganism group is formed in the plant, the plant tends to grow by the action of these microorganisms.
  • plants that are capable of growing and plants that are obviously less affected by stress when grown for a period of time in a dipping solution containing a microbial mixture under stress The body is symbiotic with a group of plant symbiotic microorganisms that allow the plant body to grow under the stress. Therefore, microorganisms attached to the plant growing after a certain period of growth are collected, and these are selected as a group of plant symbiotic microorganisms that enable the growth of the plant under stress.
  • Recovery of microorganisms from plants can be performed by a conventional method. Moreover, the collection
  • the plant symbiotic microorganism group selected in the first selection step is preferably one that can be cultivated in a microorganism culture medium generally used for culturing microorganisms because of its excellent handleability.
  • the microorganism culture medium include LB (Luria-Bertani) medium, TBS (TrypticpSoy Broth) medium, malt extract medium, oatmeal medium, YM (Yeast Malt peptone) medium, YPD (Yeast Peptone D-Glucose) medium.
  • NB nutrient broth medium, R2A medium, PGY medium, GYMP medium (glucose 1%, yeast extract 0.5%, malt extract 0.3%, peptone 0.5%, pH 6.0), MRS (de Man -Rogosa-Sharpe) medium, PSA (Potato Sucrose Agar) medium, SWS (Seawater Starch Agar) medium and the like.
  • a cycle including the following step (1) is repeated at least once.
  • the “selected microorganism” in the step (1) is a group of plant symbiotic microorganisms selected in the first selection step.
  • the “selected microorganism” in step (1) is a group of plant symbiotic microorganisms selected in step (1) of the previous round.
  • the “selected microorganism” in the first round of step (1) is a group of plant symbiotic microorganisms selected in the first selection step
  • the second round of steps (1 ) “Selected microorganisms” is a group of plant symbiotic microorganisms selected in step (1) of the first round
  • “selected microorganisms” in step (1) of the third round are processes of the second round ( This is a group of plant symbiotic microorganisms selected in 1).
  • the microorganism selected in the first selection step is usually a mixture composed of a plurality of types of microorganisms. Many of the microorganisms contained in the microorganism have not been identified or are difficult-to-cultivate microorganisms, and the type of culture medium for culturing microorganisms is unknown. For this reason, when the microorganisms are cultured in one type of microorganism culture medium, microorganisms with an inappropriate nutritional composition of the medium may fall off, and as a result, the obtained culture may be subjected to a target stress. In many cases, the ability to grow plants is impaired.
  • the selected microorganisms are cultured in two or more types of microorganism culture media for a certain period, respectively, and then obtained from each microorganism culture media. It is preferable to prepare a mixture of various cultures as a culture of a plant symbiotic microorganism group that enables the growth of plants under the stress. That is, in the method for selecting a plant symbiotic microorganism group according to the present invention, after the first selection step, the selected microorganisms are cultured in two or more types of microorganism culture media for a certain period, and then each microorganism culture is performed.
  • a first culturing step of preparing a mixture of cultures obtained from a culture medium as a culture of a plant symbiotic microorganism group capable of growing a plant body under the stress Microorganisms selected by culturing in a plurality of microorganism culture media having different nutritional compositions, and using a mixture of all microorganisms grown in each microorganism culture medium as a culture of selected plant symbiotic microorganisms.
  • cultivation process can be reduced notably.
  • a plant symbiotic microorganism group that is symbiotic to the plant body and enables the growth of the plant body under environmental stress and / or disease stress, It can be selected as a group and can be efficiently propagated.
  • the microbial culture medium for culturing the plant symbiotic microorganism group selected in the selection step can be appropriately selected from among microbial culture media generally used for culturing microorganisms. .
  • the microorganism culture medium the same medium as described above can be used.
  • microorganisms constituting the selected microorganism group can be cultivated in a microorganism culture medium generally used for culturing microorganisms.
  • a plant mixture is inoculated with a microorganism mixture in which all microorganisms cultured for a certain period in a plurality of microorganism culture media are mixed, and the inoculated plant body is subjected to the same conditions as in the first selection step. Check if it can grow.
  • one or a plurality of plants are grown for a certain period of time in a state where they are partially immersed in a solution containing a microorganism mixture obtained by mixing cultures obtained from a plurality of microorganism culture media under environmental stress.
  • a solution containing a microorganism mixture obtained by mixing cultures obtained from a plurality of microorganism culture media under environmental stress.
  • all the microorganisms which comprise the target plant symbiotic microorganism group can be cultured with the some culture medium for microorganisms used in the culture
  • Microorganisms adhering to the growing plant body are collected and selected as a plant symbiotic microorganism group that enables the plant body to grow under stress.
  • the types and abundance ratios of the microorganisms constituting the selected plant symbiotic microorganism group can be further optimized. It is possible to select a plant symbiotic microorganism group having a more excellent symbiotic effect for helping the growth of plant bodies. Specifically, after the first culture step, a cycle including the following steps (1 ′) and (2 ′) is repeated at least once. (1 ') One or a plurality of plants are grown for a certain period in a state where they are partially immersed in a solution containing a culture of the plant symbiotic microorganism group under the stress.
  • the “culture of plant symbiotic microorganisms” in the step (1 ′) is a culture of plant symbiotic microorganisms prepared in the first culture step.
  • the “culture of plant symbiotic microorganisms” in the step (1 ′) is the plant symbiotic microorganisms prepared in the last round (2 ′). It is a culture.
  • the “culture of plant symbiotic microorganisms” in step (1 ′) of the first round is a culture of plant symbiotic microorganisms prepared in the first culture step.
  • “culture of plant symbiotic microorganisms” in the second round (1 ′) step is a culture of plant symbiotic microorganisms prepared in the first round (2 ′).
  • the “culture of plant symbiotic microorganisms” in step 1 ′) is a culture of plant symbiotic microorganisms prepared in step (2 ′) of the second round.
  • the type and number of plant bodies to be used, the part in the plant body to be immersed in the immersion solution containing microorganisms, the type of stress, the period and conditions for growing the plant body Etc. can be performed in the same manner as in the first selection step.
  • each type of microorganism culture medium may be contained in a different immersion solution and allowed to coexist with the plant body.
  • Microorganisms grown in various types of microorganism culture media may be contained in one soaking solution to coexist with the plant body.
  • the strength of stress when growing a plant body may be the same as that in the first selection step, but is preferably stronger than that in the first selection step. .
  • the cycle is repeated twice (two rounds) or more, it is preferable that the strength of stress in the step (1) or (1 ′) is increased sequentially each time the cycle is repeated.
  • the first selection process is more effective than the case where the first selection process is performed with the target stress intensity.
  • the first selection step is performed under a salt stress of 1% by mass
  • the step (1) or the step (1 ′) in the cycle of the first round is performed under 1.5% by mass of salt stress
  • the step (1) or the step (1 ′) in the cycle of the second round Is carried out under a salt stress of 2.0% by mass, the target plant symbiotic microorganism group can be selected efficiently.
  • the cycle may have other steps in addition to the step (1) or in addition to the steps (1 ') and (2').
  • the solution used for washing the microorganism is not particularly limited, and may be a culture solution used for culture in the step (1) or the step (1 ′), and a buffer solution such as a sodium phosphate buffer solution. It may be.
  • the type of stress applied to the plant body in each cycle is changed, or stress is applied. May be added.
  • salt stress may be applied in the first cycle, and drying stress may be applied in the second cycle thereafter.
  • salt stress may be applied in the first cycle, and both salt stress and drought stress may be applied in the second cycle thereafter.
  • the plant symbiotic microorganism group capable of imparting resistance to a plurality of stresses can also be selected by repeatedly performing the method for selecting a plant symbiotic microorganism group according to the present invention while changing the type of stress.
  • a plant symbiotic microorganism group capable of imparting resistance to both salt stress and drought stress can be selected as follows. First, the method for selecting plant symbiotic microorganisms according to the present invention is performed using a dipping solution with an increased salt concentration to select a group of plant symbiotic microorganisms that can impart salt tolerance.
  • the plant symbiotic microorganism group selection method is performed on the plant body to which the selected plant symbiotic microorganism group is attached using an immersion solution in which both the concentration of PEG and the like and the salt concentration are increased.
  • the symbiotic microorganism group which can provide both salt tolerance and drought stress tolerance can be selected.
  • the microbial mixture that is contacted with the plant only under the initial salt stress and the microbial mixture that is subsequently contacted with the plant under both salt and drought stress may be the same, but in different samples It may be a microbial mixture extracted from
  • the selected plant body may be a plant body that shows a specific phenotype and does not grow.
  • the selected plant body may be a plant body that shows a specific phenotype and does not grow.
  • phenotypes such as large leaves, early maturation, and increased yield of fruits and the like.
  • the first selection step, the step (1), or the In the step (1 ′) by collecting microorganisms only from plants exhibiting the target phenotype, a plant symbiotic microorganism group capable of growing the plant exhibiting the specific phenotype under salt stress is selected. be able to.
  • the stress tolerance of the plant body can be remarkably improved by causing the plant body symbiosis with the plant symbiotic microorganism group selected by the plant symbiotic microorganism group selection method according to the present invention. That is, a plant can be grown under stress in a state where the selected plant symbiotic microorganism group is attached to the root.
  • the selected plant symbiotic microorganism group is preferably attached to the root.
  • the plant symbiotic microorganism group may be symbiotic when growing not only the same type of plant as the plant used in the selection step but also a different type of plant under stress.
  • cultivation under stress of the plant body after symbiosis with the plant symbiotic microorganism group may be performed by hydroponics, or may be cultivated in soil or the like.
  • a plant body to which a plant symbiotic microorganism group selected at the root is attached can be transplanted to soil and grown under stress.
  • the first microbial mixture according to the present invention enables the growth of a plant under symbiosis with a plant, and has a 16S rDNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • Bacillus pumilus CRCO-3 having 16S rDNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 Containing strains.
  • a microbial mixture containing these three strains is obtained from soil by the method for selecting a plant symbiotic microorganism group according to the present invention as a plant symbiotic group that enables the growth of a plant body under salt stress by symbiosis with the plant body. Selected.
  • Bacillus pumilus CRCO-1 and Bacillus pumilus CRCO-2 strains the results of BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) Search of the base sequence of 16S ⁇ ⁇ rDNA showed no 100% match, and Bacillus pumilus No .: KF923448.1) all had a sequence homology of 99% or more, so it was confirmed that both were new strains of Bacillus pumilus.
  • the Bacillus pumilus CRCO-3 strain was found to be a known strain of Bacillus pumilus because the base sequence of 16S rDNA was 100% identical to that of Bacillus pumilus (accession number: KF923448.1).
  • Bacillus pumilus is a microorganism generally present in soil.
  • the Bacillus pumilus CRCO-1 strain and the Bacillus pumilus CRCO-2 strain had a sequence homology of 99% or more in the base sequence of 16S rDNA. Therefore, the uncultured Bacillus registered in NCBI (National Center for Biotechnology Information) sp. (Accession number: HM152710.1).
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • the abundance ratio (microbe number ratio) of the Bacillus pumilus CRCO-1 strain, Bacillus pumilus CRCO-2 strain, and Bacillus pumilus CRCO-3 strain in the first microorganism mixture according to the present invention is not particularly limited.
  • the abundance ratio of Bacillus pumilus CRCO-1 in the first microorganism mixture according to the present invention is preferably 70 to 90%, more preferably 75 to 85%.
  • the abundance ratio of Bacillus pumilus CRCO-2 in the first microorganism mixture according to the present invention is preferably 5 to 20%, and more preferably 5 to 15%.
  • the abundance ratio of Bacillus pumilus CRCO-3 in the microorganism mixture according to the present invention is preferably 1 to 15%, more preferably 1 to 10%.
  • the first microorganism mixture according to the present invention may contain other microorganisms as long as the effect of increasing the salt tolerance by symbiosis with the plant body is not impaired.
  • the total abundance ratio of Bacillus pumilus CRCO-1 strain, Bacillus pumilus CRCO-2 strain and Bacillus pumilus CRCO-3 strain in the entire first microbial mixture according to the present invention is preferably 50% or more, and more than 80%. More preferably, 90% or more is even more preferable.
  • the first microorganism mixture according to the present invention is particularly preferably a mixture consisting only of Bacillus pumilus CRCO-1 strain, Bacillus pumilus CRCO-2 strain, and Bacillus pumilus CRCO-3 strain.
  • the second microbial mixture according to the present invention enables the growth of a plant body under high osmotic stress by symbiosis with the plant body, and contains 16S rDNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 6.
  • the microbial mixture containing these two strains is a plant symbiotic microorganism according to the present invention as a group of plant symbiotic fungi that allows symbiosis with the plant body and enables the growth of the plant body under high osmotic stress by 20% PEG. Selected from the soil by group selection method.
  • Bacillus cereus CRCO-4 and Bacillus cereus CRCO-5 strains were found to be 100% identical as a result of BLAST search on the base sequence of 16S rDNA, and had a sequence homology of 99% or more with known strains of Bacillus cereus Therefore, it is speculated that both are new strains of Bacillus cereus.
  • the abundance ratio (microbe number ratio) of the Bacillus cereus CRCO-4 and Bacillus cereus CRCO-5 strains in the second microbial mixture according to the present invention is not particularly limited.
  • the abundance ratio of Bacillus cereus CRCO-4 in the second microorganism mixture according to the present invention is preferably 80 to 95%, more preferably 85 to 95%.
  • the abundance ratio of Bacillus cereus CRCO-5 in the second microbial mixture according to the present invention is preferably 5 to 20%, more preferably 5 to 15%.
  • the second microorganism mixture according to the present invention may contain other microorganisms as long as the effect of increasing the osmotic pressure resistance by coexisting with the plant body is not impaired.
  • the ratio of the sum of Bacillus cilcereus CRCO-4 and Bacillus cereus CRCO-5 in the second microbial mixture according to the present invention is preferably 50% or more, more preferably 80% or more, and 90% or more. Even more preferred.
  • a mixture consisting only of Bacillus cereus CRCO-4 strain and Bacillus cereus CRCO-5 strain is particularly preferable.
  • Sucrose-containing MS agar medium medium with 0.5% (w / v) sucrose and 0.9% (w / v) agar added to MS medium
  • a pot for growing the plant body was produced.
  • a plurality of the pots were installed in eight containers each containing sucrose-containing MS medium (liquid medium obtained by adding 0.5% (w / v) sucrose to MS medium).
  • Arabidopsis seeds (Col-0) were purchased from LEHLE (Round Rock, TX, USA). The seeds were sterilized by stirring for 1 minute while immersed in 1% hypochlorous acid, and then hypochlorous acid was removed by centrifugation. The seeds treated with hypochlorous acid were washed with sterilized water three times, then sown on the top of the pot, and stored at 4 ° C. for 24 hours in the dark.
  • FIG. 1 schematically shows the time of sowing of the pot (left figure) and the state in which the plant has grown (right figure). After emergence, the plant root (4a) grew through the solid medium and penetrated the bottom of the pot.
  • the plant cultivated in the pot in which the sodium chloride concentration of the sucrose-containing MS medium in which the roots of Arabidopsis thaliana were immersed was 0.5% by mass was the plant cultivated in the pot in which the sodium chloride concentration was 0% by mass. Like the body, all were able to grow normally in appearance. On the other hand, only a part of the plants could grow in the pot in which the sodium chloride concentration of the sucrose-containing MS medium in which the roots were immersed was 1.0% by mass or more. Specifically, the plant that could grow at a sodium chloride concentration of 1.0% by mass was 25.0%, and the plant that could grow at a sodium chloride concentration of 1.5% by mass was 16.7%.
  • Example 1 Using Arabidopsis thaliana, a group of plant symbiotic microorganisms having a symbiotic effect for enhancing salt tolerance was selected from microorganisms extracted from soil.
  • ⁇ Preparation of microorganism suspension 1 g of soil collected at Coyote Ridge (Fort Collins, CO, USA), Colorado, USA was suspended in a buffer solution, sufficiently stirred, and used as a microorganism suspension.
  • ⁇ Hydroculture of plants> A plurality of the pots were prepared in the same manner as in Reference Example 1, and all the pots were placed in one container containing sucrose-containing MS medium (liquid medium obtained by adding 0.5% (w / v) sucrose to MS medium). . Each pot was set so that the bottom surface was immersed in the sucrose-containing MS medium, but the top surface was not immersed. Seeds were sown on top of these pots and grown for 14 days in an incubator with long-day conditions of 25 ° C., 16 hours light period and 8 hours dark period.
  • sucrose-containing MS medium liquid medium obtained by adding 0.5% (w / v) sucrose to MS medium.
  • ⁇ Microbial culture (first culture step)> 20 ⁇ L of the microorganism recovery solution was subjected to shaking culture (200 rpm) overnight at 30 ° C. in 2 mL of two types of media. The number of microorganisms in the culture broth after culturing was 10 7 CFU or more. A mixture of the obtained cultures was used as a microorganism mixed solution.
  • roots were collected from the growing plants and homogenized to prepare a microorganism collection solution.
  • step (2) in the first round ⁇ Culture of microorganisms (step (2) in the first round)>
  • the microorganism collection solution prepared in the first round (1) step was cultured in two types of media, and the resulting cultures were mixed to obtain a microbial mixed solution. It was.
  • a plant symbiotic group capable of growing a plant body under salt stress can be selected from a microorganism mixture in soil, and the constituent microorganisms can be removed. It was able to culture without.
  • Example 2 The microorganisms constituting the plant symbiotic fungal group (microorganism mixture) capable of growing the plant body under the salt stress selected in Example 1 were identified. Specifically, for a plant symbiotic fungus group (microorganism mixture) that enables the growth of a plant body under a selected salt stress, genomic DNA is recovered and 16S rDNA is identified, whereby the plant symbiotic fungus group is identified. Were identified.
  • ⁇ Recovery of genomic DNA from microbial mixture> In the same manner as in ⁇ Recovering microorganisms from growing plants>, roots are recovered from plants growing under salt stress with a salt concentration of 3.0% by mass, and homogenized to recover microorganisms. Was prepared. Bacteria were collected from the microorganism collection solution, and genomic DNA was obtained from a part of the collected bacteria using GenElute Bacterial Genomic DNA kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA).
  • 16S rDNA was amplified by PCR using a forward primer (5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3 ', SEQ ID NO: 4) and reverse primer (5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3', SEQ ID NO: 5) did.
  • the temperature condition of PCR is 95 ° C for 3 minutes, followed by 30 cycles of 95 ° C for 30 seconds denaturation step, 50 ° C for 30 seconds annealing step, 72 ° C for 1 minute 30 seconds extension step. After performing the cycle, the test was finally performed under the condition of adding an extension reaction at 72 ° C. for 5 minutes.
  • the resulting PCR product was confirmed by 1.2% agarose gel electrophoresis and extracted from the gel using a QIAquick gel extraction kit (Quiagen, Germantown, MD, USA).
  • the extracted PCR product was inserted into a plasmid using TOPO-TA cloning kit (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), and transformed into E. coli. Thirty E. coli colonies cultured overnight on ampicillin-containing LB plate medium were randomly picked, transplanted to ampicillin-containing LB liquid medium, and cultured.
  • the plasmid was purified from E. coli cultured using QIAprep spin miniprep kit (Quiagen).
  • the purified plasmid was subjected to a Thermalcycle reaction using BigDye terminator v3.1 Cycle sequence kit (Life Technologies), and the base sequence of 16S rDNA incorporated into the plasmid was determined with a DNA sequencer (ABI 3130xL). .
  • 16S rDNA As a result of nucleotide sequence analysis of 16S rDNA, three types of 16S rDNA (CRCO-1, CRCO-2 and CRCO-3 strains) were identified.
  • NCBI BLAST search was performed for each of the 3 types of 16S rDNA base sequences that were determined.
  • CRCO-1 strain was sequence homologous with Uncultured Bacillus sp. (Accession number: HM152710.1). Is 99.93%, Bacillus pumilus (accession number: KF923448.1) has a sequence homology of 99.87%, and CRCO-2 strain has a sequence homology with Uncultured Bacillus sp. (Accession number: HM152710.1).
  • Bacillus pumilus (accession number: KF923448.1) has a sequence homology of 99.80%
  • the CRCO-3 strain has a sequence homology with Bacillus pumilus (accession number: KF923448.1).
  • KF923448.1 accession number: 87.18
  • the CRCO-1 strain and the CRCO-2 strain are new strains of Bacillus pumilus
  • the CRCO-3 strain is a known strain of Bacillus pumilus.
  • the plant symbiotic fungal group consists of a new strain of Bacillus pumilus, CRCO-1 and CRCO-2, and a known strain of Bacillus pumilus, CRCO-3 (accession number: KF923448.1). I understood.
  • Bacillus pumilus CRCO-1 strain was 82.1%
  • Bacillus pumilus The CRCO-2 strain was 10.7%
  • Bacillus pumilus COCRCO-3 strain was 7.1%.
  • a plant body hydroponically cultivated in a pot for 14 days was prepared in the same manner as in the above ⁇ Hydroculture of plant body>.
  • a sterilized 5M sodium chloride aqueous solution is added to the sucrose-containing MS medium soaking the bottom of the pot so that the final concentration of sodium chloride is 3.0% by mass, and further ⁇ Recovering genomic DNA from the microorganism mixture> A part of the cells recovered in (1) was added. Thereafter, the pot was cultured for 14 days. After 14 days of culture under salt stress, 3.1% of the plants were dead and 15.6% of the plants were dying, while the remaining plants were growing. In addition, all dead plants became white leaves when they withered.
  • Example 3 Using Arabidopsis thaliana, a group of plant symbiotic microorganisms having a symbiotic effect for enhancing tolerance to high osmotic pressure was selected from microorganisms extracted from soil.
  • ⁇ Preparation of microorganism suspension 1 g of soil collected at Coyote Ridge (Fort Collins, CO, USA), Colorado, USA was suspended in a buffer solution, sufficiently stirred, and used as a microorganism suspension.
  • ⁇ Hydroculture of plants> A plurality of the pots were prepared in the same manner as in Reference Example 1, and all the pots were placed in one container containing sucrose-containing MS medium (liquid medium obtained by adding 0.5% (w / v) sucrose to MS medium). . Each pot was set so that the bottom surface was immersed in the sucrose-containing MS medium, but the top surface was not immersed. Seeds were sown on top of these pots and grown for 14 days in an incubator with long-day conditions of 25 ° C., 16 hours light period and 8 hours dark period.
  • sucrose-containing MS medium liquid medium obtained by adding 0.5% (w / v) sucrose to MS medium.
  • ⁇ Microbial culture (first culture step)> 20 ⁇ L of the microorganism recovery solution was subjected to shaking culture (200 rpm) overnight at 30 ° C. in 2 mL of two types of media. The number of microorganisms in the culture broth after culturing was 10 7 CFU or more. A mixture of the obtained cultures was used as a microorganism mixed solution.
  • Bacteria were collected from this microorganism collection solution, and genomic DNA was obtained from a part of the collected bacteria using GenElute Bacterial Genomic DNA kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). By recovering genomic DNA from this microorganism recovery solution and identifying 16S rDNA, the microorganisms that constitute the plant symbiotic fungi (microorganism mixture) that enable the growth of plants under high-concentration PEG stress were identified. .
  • 16S rDNA was amplified by PCR using the recovered genomic DNA as a template, and the base sequence of 16S rDNA of the obtained PCR product was determined.
  • two types of 16S rDNA (CRCO-4 strain and CRCO-5 strain) were identified.
  • NCBI BLAST search was performed on the 16S rDNA base sequences of both strains, the CRCO-4 strain had a sequence homology of 99.74% with Bacillus cereus partial 16S rRNA gene, strain M87 (accession number: LN890173).
  • the CRCO-5 strain had a sequence homology of 99.61% with Bacillus cereus partial 16S rRNA gene, strain L68 (accession number: LN890064). From these results, it was found that the CRCO-4 strain and the CRCO-5 strain were Bacillus cereus. That is, it was found that the plant symbiotic group consists of a new strain of Bacillus cereus, the CRCO-4 strain and the CRCO-5 strain.
  • Bacillus cereus CRCO-4 strain was 90%, and Bacillus cereus CRCO- 5 shares were 10%.

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Abstract

本発明は、環境ストレス及び／又は病害ストレスの下での植物体の生育を可能とする植物共生微生物群の選抜方法、及び当該方法を用いて自然界から選抜された、植物体と共生して環境ストレス及び／又は病害ストレスの下での植物体の生育を可能とする微生物混合物を提供する。すなわち、１又は複数の植物体を、環境ストレス及び／又は病害ストレスの下、微生物混合物を含む溶液に部分的に浸漬させた状態で一定期間生育させた後、生育している植物体に付着している微生物を回収して、前記ストレス下での植物体の生育を可能とする植物共生微生物群として選抜する第１選抜工程と、を有する、植物共生微生物群の選抜方法である。

Description

植物共生微生物群の選抜方法、及び微生物混合物
　本発明は、環境ストレス及び／又は病害ストレスの下での植物体の生育を可能とする植物共生微生物群の選抜方法、当該方法を用いて自然界から選抜された、植物体と共生して塩ストレス下での植物体の生育を可能とする微生物混合物、及び当該方法を用いて自然界から選抜された、植物体と共生して高浸透圧ストレス下での植物体の生育を可能とする微生物混合物に関する。
　本願は、２０１６年１２月８日に出願された米国特許出願６２／４３１４４３号、２０１６年１２月１５日に出願された米国特許出願６２／４３４４２７号、２０１７年１月２３日に出願された米国特許出願６２／４４９１１８号、２０１７年１月２３日に出願された米国特許出願６２／４４９１２２号、及び２０１７年４月２１日に出願された米国特許出願６２／４８８０６９号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　微生物の中には、植物と共生し、その生育を助ける働きをするものがある。例えば、マメ科植物の根に共生する根粒菌は、大気中の窒素を植物が利用可能な窒素化合物に変換する。この根粒菌による窒素固定により、マメ科植物は肥料分の少ない土壌でも生育が可能となる。近年、植物体の免疫を高めたり、生育を促進したり、栄養素の欠乏を補ったり、様々な環境ストレスに対する耐性を高めたりする作用を有する共生微生物があることがわかってきた。そこで、このような共生微生物を利用し、必須栄養素が欠乏している土壌や塩濃度の高い土壌等の厳しい環境下でも植物の生育を可能にしようという試みがなされている。
　土壌等の自然界には数多の微生物が存在しており、植物と共生可能な有用な微生物も多く存在していることが期待される。しかしながら、多くの微生物は、汎用されている培地等では培養が困難な、いわゆる難培養性微生物であるため、一般的に行われている平板培養法によっては、自然界の極一部の微生物しか分離できず、その有用性を調べることができない。そこで、難培養性微生物を自然界から分離する方法として、例えば、特許文献１には、自然界から抽出された微生物を無菌ウキクサ（Spirodela polyrrhiza）の根に付着させ、当該無菌ウキクサと共に液体培地にて培養する方法が開示されている。ウキクサ科植物を微生物培養のための支持体として用いることにより、自然界から採取された試料から直接、平板培養法により微生物を分離する従来の方法では分離取得できなかった微生物も取得できる。
特開２００９－１９５１２４号公報
　自然界から植物の生育に有用な微生物を見つけるためには、従来は、まず、自然界から微生物を単離した後、有用か否かを調べる方法により行われる。例えば、特定の環境ストレス下での植物体の生育を可能とする共生微生物を見つける場合には、自然界から単離された微生物を植物体に接種し、環境ストレス下で一定期間生育させる。生育できた植物体から微生物を回収することにより、目的の有用共生微生物が得られる。
　しかしながら、微生物の中には、特定の微生物混合物の状態ではじめて有用性を発揮するものがあるが、多数の微生物の組み合わせをそれぞれ実験して有用性を調べるのは労力が多く非常に困難である。また、有用性を発揮するための必要な微生物が全て単離できていない場合もある。
　上記現状に鑑み、本発明は、環境ストレス（非生物学的ストレス）及び／又は病害ストレス（生物学的ストレス）の下での植物体の生育を可能とする植物共生微生物群の選抜方法、当該方法を用いて自然界から選抜された、植物体と共生して塩ストレス下での植物体の生育を可能とする微生物混合物、及び当該方法を用いて自然界から選抜された、植物体と共生して乾燥ストレス下での植物体の生育を可能とする微生物混合物を提供することを目的とする。
　本発明に係る植物共生微生物群の選抜方法、植物体の生育方法、及び微生物混合物は、下記［１］～［２２］である。
［１］　１又は複数の植物体を、環境ストレス及び／又は病害ストレスの下、微生物混合物を含む溶液に部分的に浸漬させた状態で一定期間生育させた後、生育している植物体に付着している微生物を回収して、前記ストレス下での植物体の生育を可能とする植物共生微生物群として選抜する第１選抜工程、
を有する、植物共生微生物群の選抜方法。
［２］　前記第１選抜工程の後、下記（１）工程を含むサイクルを少なくとも１回繰り返す、前記［１］の植物共生微生物群の選抜方法：
前記第１選抜工程の後、
（１）　１又は複数の植物体を、前記ストレス下、前記選抜された微生物を含む溶液に部分的に浸漬させた状態で一定期間生育させた後、生育している植物体に付着している微生物を回収して、前記ストレス下での植物体の生育を可能とする植物共生微生物群として選抜する工程。
［３］　前記工程（１）における前記ストレスの強度を、前記サイクルを繰り返すごとに順次強くする、前記［２］の植物共生微生物群の選抜方法。
［４］　前記サイクルを２回以上繰り返す場合に、前記工程（１）における前記ストレスの種類を、前記サイクルを繰り返すごとに順次追加する、前記［２］又は［３］の植物共生微生物群の選抜方法。
［５］　前記第１選抜工程の後、前記選抜された微生物を、２種以上の微生物培養用培地中でそれぞれ一定期間培養した後、各微生物培養用培地から得られた培養物を混合したものを、前記ストレス下での植物体の生育を可能とする植物共生微生物群の培養物として調製する第１培養工程と、
を有する、前記［１］の植物共生微生物群の選抜方法。
［６］　前記第１培養工程の後、下記（１’）工程及び（２’）工程を含むサイクルを少なくとも１回繰り返す、前記［５］の植物共生微生物群の選抜方法。
（１’）１又は複数の植物体を、前記ストレス下、前記植物共生微生物群の培養物を含む溶液に部分的に浸漬させた状態で一定期間生育させた後、生育している植物体に付着している微生物を回収して、前記ストレス下での植物体の生育を可能とする植物共生微生物群として選抜する工程と、
（２’）前記（１’）工程において選抜された微生物を、２種以上の微生物培養用培地中でそれぞれ一定期間培養した後、各微生物培養用培地から得られた培養物を混合したものを、前記ストレス下での植物体の生育を可能とする植物共生微生物群の培養物として調製する工程。
［７］　前記（１’）工程における前記ストレスの強度を、前記サイクルを繰り返すごとに順次強くする、前記［６］の植物共生微生物群の選抜方法。
［８］　前記サイクルを２回以上繰り返す場合に、前記（１’）工程における前記ストレスの種類を、前記サイクルを繰り返すごとに順次追加する、前記［６］又は［７］の植物共生微生物群の選抜方法。
［９］　前記ストレスの強度が、無菌状態では植物体の生育率が５０％未満となる強度である、前記［１］～［８］のいずれかの植物共生微生物群の選抜方法。
［１０］　前記第１選抜工程、前記（１）工程、又は前記（１’）工程において、前記微生物を含む溶液に、植物体の根を浸漬させる、前記［２］又は［６］の植物共生微生物群の選抜方法。
［１１］　前記環境ストレスが、塩ストレス、乾燥ストレス、栄養ストレス、低温ストレス、又は高温ストレスであり、前記病害ストレスが、病原菌によるストレス又は病害虫によるストレスである、前記［１］～［１０］のいずれかの植物共生微生物群の選抜方法。
［１２］　前記環境ストレスが、塩ストレス、高浸透圧ストレス、栄養ストレス、低温ストレス、及び高温ストレスからなる群より選択される２種以上である、前記［１］～［１０］のいずれかの植物共生微生物群の選抜方法。
［１３］　前記第１選抜工程において、植物体の少なくとも一部を浸漬させる溶液中の微生物が、自然界から採取された１種又は２種以上の試料から抽出された微生物である、前記［１］～［１２］のいずれかの植物共生微生物群の選抜方法。
［１４］　前記試料が土壌である、前記［１３］の植物共生微生物群の選抜方法。
［１５］　前記［１］～［１４］のいずれかの植物共生微生物群の選抜方法により選抜された植物共生微生物群を根に付着させた状態で、前記ストレス下で植物体を生育させる生育工程と、
を有する、植物体の生育方法。
［１６］　前記生育工程が、
　無菌状態で水耕栽培した後、根に前記植物共生微生物群を付着させた植物体を、土壌へ移植し、前記ストレス下で生育させる工程である、前記［１５］の植物体の生育方法。
［１７］　前記［１］～［１６］のいずれかの植物共生微生物群の選抜方法により選抜された植物共生微生物群。
［１８］　前記［１］～［１６］のいずれかの植物共生微生物群の選抜方法により選抜された植物共生微生物群から単離された１種以上の微生物。
［１９］　配列番号１で表される塩基配列からなる16S rDNAを有するBacillus pumilus CRCO-1株と、
　配列番号２で表される塩基配列からなる16S rDNAを有するBacillus pumilus CRCO-2株と、
　配列番号３で表される塩基配列からなる16S rDNAを有するBacillus pumilus CRCO-3株と
を含有し、植物体と共生して塩ストレス下での植物体の生育を可能とする、微生物混合物。
［２０］　Bacillus pumilus CRCO-1株の存在比率が７０～９０％であり、Bacillus pumilus CRCO-2株の存在比率が５～２０％であり、Bacillus pumilus CRCO-3株の存在比率が１～１５％である、前記［１９］の微生物混合物。
［２１］　配列番号６で表される塩基配列からなる16S rDNAを有するBacillus cereus CRCO-4株と、
　配列番号７で表される塩基配列からなる16S rDNAを有するBacillus cereus CRCO-5株と、
を含有する、植物体と共生して高浸透圧ストレス下での植物体の生育を可能とする、微生物混合物。
［２２］　Bacillus cereus CRCO-4株の存在比率が８０～９５％であり、Bacillus cereus CRCO-5株の存在比率が５～２０％である、前記［２１］の微生物混合物。
　本発明に係る植物共生微生物群の選抜方法により、植物体に共生し、環境ストレス及び／又は病害ストレスの下での植物体の生育を可能とする植物共生微生物群を、集団として選抜することができる。
　また、本発明に係る微生物混合物は、共生する植物体の耐塩性又は高浸透圧耐性を向上させることができるため、当該微生物混合物を植物体に接種させて共生させることにより、高塩濃度環境下又は乾燥環境下における生育性を高めることができる。
参考例１において、種子３を播種した状態のポット１（左図）と、植物体４が成長した状態のポット１（右図）を模式的に示した図である。
＜植物共生微生物群の選抜方法＞
　本発明に係る植物共生微生物群の選抜方法は、１又は複数の植物体を、環境ストレス及び／又は病害ストレスの下、微生物混合物を含む溶液に部分的に浸漬させた状態で一定期間生育させた後、生育している植物体に付着している微生物を回収して、前記ストレス下での植物体の生育を可能とする植物共生微生物群として選抜する第１選抜工程を有する。本発明に係る植物共生微生物群の選抜方法では、予め単離された複数の微生物を組み合わせて植物体に接種して、ストレス下における植物体の生育を可能にする組み合わせを見つける方法とは異なり、複数種類の微生物の混合物から、ストレス下における植物体の生育を可能にする組み合わせからなる共生微生物群を直接回収するため、有用な共生微生物群を比較的容易に選抜することができる。
　前記第１選抜工程において植物体に接種させる微生物混合物を構成する微生物は、特に限定されるものではなく、自然界から採取された試料から抽出された微生物であってもよく、人工的な環境から採取された試料から抽出された微生物であってもよい。本発明においては、植物体に接種させる微生物は、自然界から採取された試料から抽出された微生物であることが好ましい。自然界から採取された試料としては、例えば、森林、湿地帯、平原、耕作地、水田等の土壌；海、河川、湖沼、温泉等の水や底泥；又は、動植物等が挙げられる。人工的な環境から採取された試料としては、例えば、食品工場、下水道処理施設、ごみ処理施設、病院等から採取された試料が挙げられる。これらの試料からの微生物の抽出は、常法により行うことができる。
　本発明において植物体に接種させる微生物混合物は、１種類の試料から抽出された微生物の混合物であってもよく、２種類以上の試料から抽出された微生物の混合物であってもよい。本発明においては、試料から抽出された微生物を溶液に懸濁させた状態で植物体に接種させるため、２種類以上の試料から抽出された微生物を１度の操作でまとめて植物体に接触させることができる。例えば、５種類の土壌を試料とする場合に、土壌ごとに微生物を抽出して懸濁液を調製し、それぞれを別個に植物体に接触させてもよく、土壌ごとに抽出した微生物を１の溶液に懸濁して、同時に植物体に接触させてもよく、土壌を予め混合し、土壌混合物から微生物を抽出して懸濁液を調製し、当該懸濁液を植物体に接触させてもよい。複数種類の試料に由来する微生物を混合した状態で植物体に接触させることにより、植物共生微生物群の選抜に要する労力を抑えることができ、より共生効果の高い微生物群が得られやすくなることが期待できる。
　前記第１選抜工程において植物体に接種させる微生物は、既に単離されている微生物に対して変異処理が施された微生物であってもよい。変異処理としては、例えば、紫外線やＸ線、ガンマ線等のエネルギー線による処理や、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）、Ｎ－メチル－Ｎ－ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、亜硝酸等の変異原による処理等が挙げられる。本発明に係る植物共生微生物群の選抜方法を用いることにより、変異処理が施された微生物から有用な植物共生微生物群を容易に選抜することができる。
　本発明に係る植物共生微生物群の選抜方法においては、植物体を浸漬させる溶液（以下、「浸漬用溶液」ということがある。）に微生物混合物を含有させる。植物体への微生物混合物の接種を、平板培地等の固体培地中ではなく、微生物の移動の自由度が高い水性媒体中で行うことにより、様々な組み合わせの微生物群が形成されやすくなる結果、ストレス下での植物体の生育を可能とする有用な微生物群が植物体中又はその表面に共生しやすくなる。なお、「微生物群」は、２種以上の微生物からなる群を意味する。本発明において選抜される植物共生微生物群は、属種の異なる２種以上の微生物からなる群であってもよく、同一の種に属する２種以上の株からなる微生物群であってもよい。
　本発明に係る植物共生微生物群の選抜方法においては、植物体に微生物を接種させるために、植物体の少なくとも一部分を、微生物混合物を含む浸漬用溶液に浸漬させる。浸漬用溶液に浸漬させる植物体の部分は、浸漬させた状態の植物体が、環境ストレス及び病害ストレスがない状態であれば生育可能な部分であればよく、例えば、根、茎、葉、地下茎等のいずれの部分であってもよい。
　本発明においては、植物体の生育に対する影響が比較的少ないことから、植物体の根のみを、微生物混合物を含む浸漬用溶液に浸漬させることが好ましい。この場合、浸漬用溶液は、根から接種させる各種栄養分を含有する液肥であることが好ましい。例えば、植物体の根の付け根部分を、ロックウール、寒天培地、土壌等の固体支持体で支持させ、根の下の部分を液肥に浸漬させる水耕栽培容器を使用し、液肥に微生物混合物を含有させることにより、根の部分のみを微生物混合物を含む浸漬用溶液に浸漬させた状態で植物体を生育させることができる。使用する液肥の組成は、生育させる植物体の生物種に応じて適宜調節することができる。例えば、ＭＳ（Murashige-Skoog）培地、Ｂ５（Gamborg's B5）培地、Ｗｈｉｔｅ培地、又はこれらの改変培地等を用いることができる。
　本発明に係る植物共生微生物群の選抜方法において用いられる植物体の生物種は、特に限定されるものではなく、どのような種類の植物であっても用いることができる。特に、有用な共生微生物群は、植物の種類によって異なる可能性が高いため、目的のストレス下での生育を可能にしたい植物を用いることが好ましい。例えば、塩害のひどい地域において栽培したい作物がある場合には、当該作物を用いて本発明に係る植物共生微生物群の選抜方法を行う。
　本発明に係る植物共生微生物群の選抜方法において用いられる植物体は、無菌的に栽培されたものであることが好ましい。例えば、滅菌処理した種子を無菌的な環境下で栽培された植物体を用いることにより、植物体からの微生物の持ち込みを防止することができる。種子の滅菌処理は、次亜塩素酸ナトリウム溶液に浸漬させる方法や、塩素ガスを用いる方法等の常法により行うことができる。
　本発明に係る植物共生微生物群の選抜方法においては、一の微生物を含有させた浸漬用溶液（一の容器に入れた微生物を含有させた浸漬用溶液）に、１本の植物体を浸漬させてもよいが、複数の植物体を浸漬させることが好ましい。複数の植物体に、微生物の移動自由度が高い状態で同時に接種させることにより、微生物が植物体と共生する機会が増え、有用な微生物群の選抜を効率よく行うことができる。本発明においては、一の浸漬用溶液に浸漬させる植物体の数は、８以上が好ましく、２４以上がより好ましく、４８以上がさらに好ましく、９６以上がよりさらに好ましい。用いる植物体が、水生植物や水耕栽培可能な植物の場合には、充分量の浸漬用溶液に多数の植物体の根を浸漬させることができるため、共生微生物群の選抜をより効率よく行うことができる。
　本発明及び本願明細書において、環境ストレスとは、植物が外界から受ける様々なストレスを意味する。環境ストレスとしては、例えば、塩ストレス（高すぎる塩濃度によるストレス）、乾燥ストレス（高浸透圧ストレス）、栄養ストレス（必要な栄養素の欠乏や過多によるストレス）、低温ストレス（凍結ストレスを含む。）、及び高温ストレス等が挙げられる。栄養ストレスとしては、例えば、鉄（Ｆｅ）、マンガン（Ｍｎ）、ホウ素（Ｂ）、亜鉛（Ｚｎ）、ニッケル（Ｎｉ）、モリブデン（Ｍｏ）、窒素（Ｎ）、リン（Ｐ）、カリウム（Ｋ）、カルシウム（Ｃａ）、マグネシウム（Ｍｇ）、硫黄（Ｓ）等の植物の生育に必須の栄養成分の欠乏によるストレスが挙げられる。その他の環境ストレスとしては、例えば、主に酸性土壌で問題になるアルミニウムストレスをはじめとする有毒物質の存在によるストレスが挙げられる。また、本発明及び本願明細書において、病害ストレスとしては、例えば、病原菌、病害虫等による生物的ストレスが挙げられる。
　例えば、微生物混合物を含む浸漬用溶液の塩濃度を高くすることにより、生育させる植物体に塩ストレスをかけることができる。同様に、当該浸漬用溶液のアルミニウムイオン濃度を高くすることにより、生育させる植物体にアルミニウムストレスをかけることができる。また、乾燥ストレスは主に乾燥による高浸透圧状態により引き起こされるため、当該浸漬用溶液のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、マンニトール、スクロース等の濃度を高くして高浸透圧状態で植物体を生育することにより、乾燥ストレスをかけることができる。逆に、当該浸漬用溶液から必須栄養成分の含有量を低減させる、又は含有させないことにより、生育させる植物体に栄養欠乏ストレスをかけることができる。その他、植物体の生育を行う環境温度を制御することにより、生育させる植物体に低温ストレスや高温ストレスをかけることができる。また、植物体に感染させる病原菌や病害虫の量を多くすることにより、病害ストレスの強度を強めることもできる。
　本発明に係る植物共生微生物群の選抜方法において、生育させる植物体にかけるストレスは、１種類のみであってもよく、２種類以上を組み合わせてもよい。例えば、ＰＥＧ等の濃度と塩濃度の両方を高めた浸漬用溶液を使用することにより、植物体に塩ストレスと乾燥ストレスを同時にかけることができ、植物体に耐塩性と乾燥ストレス耐性の両方を付与できる共生微生物群を選抜することができる。ストレスの組み合わせは特に限定されるものではなく、２種類以上の環境ストレスを組み合わせてもよく、環境ストレスと病害ストレスを組み合わせてもよい。
　ストレス下での植物体の生育を可能とする植物共生微生物群を効率よく選抜するために、環境ストレスや病害ストレスの強度は、無菌的な条件では植物体の正常な生育ができずに枯れてしまうなど、表現型に対して何等かの影響がでる程度の強度であることが好ましく、無菌的な条件では植物体の生育自体が困難な強度であることがより好ましい。より具体的には、ストレスの強度を、無菌状態では同じ生物種の植物体の生育率が０％以上５０％未満となる強度とすることが好ましく、０％以上３０％以下となる強度とすることがより好ましい。ストレスの強度をこのような範囲にすることにより、共生により目的のストレス耐性を付与できる共生微生物群の選抜をより効率よく行うことができる。
　環境ストレス及び／又は病害ストレスの下、微生物混合物を含む浸漬用溶液に浸漬させた状態で一定期間生育させることにより、微生物を適切な組み合わせで植物体に共生させる。生育させる期間は特に限定されるものではなく、ストレスの影響が植物体にあらわれるために充分な期間であればよく、植物体の種類やストレスの種類等を考慮して適宜決定することができる。例えば、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）を使用する場合、ストレス下での生育期間を３日～１ヶ月、好ましくは７～２１日間とすることができる。
　ストレス下では、無菌状態の植物体は正常には生育できないが、植物体に適切な共生微生物群が形成されると、それらの微生物の働きにより、当該植物体は生育し易くなる。つまり、ストレス下、微生物混合物を含む浸漬用溶液に浸漬させた状態で一定期間生育させた場合に、生育が可能となっている植物体や他の植物体よりも明らかにストレスの影響が小さい植物体には、当該ストレス下での植物体の生育を可能とする植物共生微生物群が共生している。そこで、一定期間生育後に生育している植物体に付着している微生物を回収し、これらをストレス下での植物体の生育を可能とする植物共生微生物群として選抜する。植物体からの微生物の回収は、常法により行うことができる。また、生育している植物体からの微生物の回収は、植物体ごとにそれぞれ別個に回収してもよく、全て纏めて回収してもよい。
　前記第１選抜工程により選抜された植物共生微生物群は、取扱い性に優れることから、一般的に微生物の培養に用いられる微生物培養用培地中で培養可能なものが好ましい。当該微生物培養用培地としては、例えば、ＬＢ（Luria-Bertani）培地、ＴＢＳ（Tryptic Soy Broth）培地、麦芽エキス培地、オートミール培地、ＹＭ（Yeast Malt peptone）培地、ＹＰＤ（Yeast Peptone D-Glucose）培地、ＮＢ（nutrient broth）培地、Ｒ２Ａ培地、ＰＧＹ培地、ＧＹＭＰ培地（グルコース １％、酵母エキス ０．５％、麦芽エキス ０．３％、ペプトン ０．５％、ｐＨ６．０）、ＭＲＳ（de Man-Rogosa-Sharpe）培地、ＰＳＡ（Potato Sucrose Agar）培地、ＳＷＳ（Seawater Starch Agar）培地等が挙げられる。
　また、ストレス下で植物体に共生させる選抜工程を繰り返すことにより、選抜される植物共生微生物群の構成する微生物の種類や存在比をより最適化することができ、ストレス下での植物体の生育を助ける共生効果がより優れた植物共生微生物群を選抜することができる。具体的には、前記第１選抜工程の後、下記（１）工程を含むサイクルを少なくとも１回繰り返す。
（１）１又は複数の植物体を、ストレス下、前記選抜された微生物を含む溶液に部分的に浸漬させた状態で一定期間生育させた後、生育している植物体に付着している微生物を回収して、ストレス下での植物体の生育を可能とする植物共生微生物群として選抜する工程。
　前記サイクルを１回のみ行う場合、工程（１）における「選抜された微生物」は、前記第１選抜工程において選抜された植物共生微生物群である。前記サイクルを２回（２ラウンド）以上繰り返す場合には、工程（１）における「選抜された微生物」は、前回のラウンドの工程（１）において選抜された植物共生微生物群である。例えば、前記サイクルを３回繰り返す場合には、１ラウンド目の工程（１）における「選抜された微生物」は第１選抜工程において選抜された植物共生微生物群であり、２ラウンド目の工程（１）における「選抜された微生物」は１ラウンド目の工程（１）において選抜された植物共生微生物群であり、３ラウンド目の工程（１）における「選抜された微生物」は２ラウンド目の工程（１）において選抜された植物共生微生物群である。
　前記第１選抜工程において選抜された微生物は、通常は複数の種類の微生物からなる混合物である。当該微生物に含まれている微生物の多くは同定されていないか、難培養性微生物であり、培養可能な微生物培養用培地の種類は不明である。このため、当該微生物を１種類の微生物培養用培地で培養した場合には、当該培地の栄養組成が不適切な微生物が脱落してしまう結果、得られた培養物から、目的のストレス下での植物体の生育を可能とする能力が損なわれてしまう場合が多い。そこで、本発明では、第１培養工程として、第１選抜工程の後、選抜された微生物を、２種以上の微生物培養用培地中でそれぞれ一定期間培養した後、各微生物培養用培地から得られた培養物を混合したものを、前記ストレス下での植物体の生育を可能とする植物共生微生物群の培養物として調製することが好ましい。すなわち、本発明に係る植物共生微生物群の選抜方法は、前記第１選抜工程の後、前記選抜された微生物を、２種以上の微生物培養用培地中でそれぞれ一定期間培養した後、各微生物培養用培地から得られた培養物を混合したものを、前記ストレス下での植物体の生育を可能とする植物共生微生物群の培養物として調製する第１培養工程と、を有することが好ましい。栄養組成の異なる複数の微生物培養用培地で培養し、各微生物培養用培地で増殖させた微生物を全て混合した微生物混合物を選抜された植物共生微生物群の培養物とすることにより、選抜された微生物群を構成する１種又は２種以上の微生物が培養工程で脱落してしまうリスクを顕著に低減させることができる。前記第１選抜工程の後、前記第１培養工程とを有することにより、植物体に共生し、環境ストレス及び／又は病害ストレスの下での植物体の生育を可能とする植物共生微生物群を、集団として選抜し、かつ効率的に増殖させることができる。
　培養工程において、選抜工程で選抜された植物共生微生物群を培養するための微生物培養用培地としては、一般的に微生物の培養に用いられる微生物培養用培地の中から適宜選択して用いることができる。当該微生物培養用培地としては、前記と同様の培地を用いることができる。一般的に微生物の培養に用いられる微生物培養用培地を用いることにより、選抜された微生物群を構成する微生物として、一般的に微生物の培養に用いられる微生物培養用培地中で培養可能なものがより選択的に選抜されるため、目的のストレス下での植物体の生育を可能とする能力を備える植物共生微生物群のうち、より取扱い性に優れる植物共生微生物群を選抜できる。
　また、培養後、微生物の増殖が確認された場合であっても、前記第１選抜工程において選抜された微生物混合物に含まれていた微生物のうち、ストレス下での植物体の生育を可能とするために必要な全ての種類の微生物が、前記第１培養工程において培養可能であったかどうかを確認するために、再度、選抜工程を行うことが好ましい。具体的には、複数の微生物培養用培地中で一定期間培養された微生物を全て混合した微生物混合物を植物体に接種させ、この接種させた植物体が、前記第１選抜工程と同様の条件で生育可能かどうかを確認する。すなわち、１又は複数の植物体を、環境ストレス下、複数の微生物培養用培地から得られた培養物を混合した微生物混合物を含む溶液に部分的に浸漬させた状態で一定期間生育させる。当該植物体が生育した場合には、培養工程において使用した複数の微生物培養用培地により、目的の植物共生微生物群を構成する微生物の全てが培養可能であるといえる。生育している植物体に付着している微生物は回収され、ストレス下での植物体の生育を可能とする植物共生微生物群として選抜される。
　また、ストレス下で植物体に共生させる選抜工程とその後の培養工程とを繰り返すことにより、選抜される植物共生微生物群の構成する微生物の種類や存在比をより最適化することができ、ストレス下での植物体の生育を助ける共生効果がより優れた植物共生微生物群を選抜することができる。具体的には、前記第１培養工程の後、下記（１’）工程及び（２’）工程を含むサイクルを少なくとも１回繰り返す。
（１’）１又は複数の植物体を、前記ストレス下、前記植物共生微生物群の培養物を含む溶液に部分的に浸漬させた状態で一定期間生育させた後、生育している植物体に付着している微生物を回収して、前記ストレス下での植物体の生育を可能とする植物共生微生物群として選抜する工程と、
（２’）前記（１’）工程において選抜された微生物を、２種以上の微生物培養用培地中でそれぞれ一定期間培養した後、各微生物培養用培地から得られた培養物を混合したものを、前記ストレス下での植物体の生育を可能とする植物共生微生物群の培養物として調製する工程。
　前記サイクルを１回のみ行う場合、（１’）工程における「植物共生微生物群の培養物」は、前記第１培養工程において調製された植物共生微生物群の培養物である。前記サイクルを２回（２ラウンド）以上繰り返す場合には、（１’）工程における「植物共生微生物群の培養物」は、前回のラウンドの（２’）工程において調製された植物共生微生物群の培養物である。例えば、前記サイクルを３回繰り返す場合には、１ラウンド目の（１’）工程における「植物共生微生物群の培養物」は、前記第１培養工程において調製された植物共生微生物群の培養物であり、２ラウンド目の（１’）工程における「植物共生微生物群の培養物」は１ラウンド目の（２’）工程において調製された植物共生微生物群の培養物であり、３ラウンド目の（１’）工程における「植物共生微生物群の培養物」は２ラウンド目の（２’）工程において調製された植物共生微生物群の培養物である。
　前記（１）工程又は前記（１’）工程において、使用する植物体の種類や数、微生物を含む浸漬用溶液に浸漬させる植物体中の部位、ストレスの種類、植物体を生育させる期間や条件等は、前記第１選抜工程と同様にして行うことができる。また、前記（２’）工程において複数種類の微生物培養用培地で増殖させた場合、微生物培養用培地の種類ごとにそれぞれ別の浸漬用溶液に含有させて植物体に共生させてもよく、複数種類の微生物培養用培地で増殖させた微生物を一の浸漬用溶液に含有させて植物体に共生させてもよい。
　前記（１）工程又は前記（１’）工程において、植物体を生育させる際のストレスの強度は、前記第１選抜工程と同じとしてもよいが、前記第１選抜工程よりも強くすることが好ましい。同様に、前記サイクルを２回（２ラウンド）以上繰り返す場合には、工程（１）又は（１’）工程におけるストレスの強度を、前記サイクルを繰り返すごとに順次強くすることが好ましい。特定のストレス強度のストレス下での生育を可能とする植物共生微生物群の選抜を目的とする場合に、前記第１選抜工程を当該目的のストレス強度で行う場合よりも、前記第１選抜工程のストレス強度は比較的弱くし、前記サイクルを繰り返して最終的に所望のストレス強度で選抜工程を行うようにするほうが、目的のストレス下での生育を可能とする植物共生微生物群をより効率よく選抜することができる。例えば、最終的に２質量％食塩濃度の塩ストレス下での生育を可能とする植物共生微生物群の選抜を目的とする場合、前記第１選抜工程を１質量％の塩ストレス下で行い、次いで、１ラウンド目のサイクルにおける前記工程（１）又は前記（１’）工程を１．５質量％の塩ストレス下で行い、２ラウンド目のサイクルにおける前記工程（１）又は前記（１’）工程を２．０質量％の塩ストレス下で行うことによって、効率よく目的の植物共生微生物群を選抜できる。
　前記サイクルは、（１）工程に加えて、又は（１’）工程及び（２’）工程に加えて、他の工程を有していてもよい。例えば、前記（１）工程又は前記（１’）工程の前に、前回のラウンドで選抜された微生物を洗浄する工程を有していてもよい。微生物の洗浄に用いる溶液は特に限定されるものではなく、前記（１）工程又は前記（１’）工程において培養に用いる培養液であってもよく、リン酸ナトリウム緩衝液等のような緩衝液であってもよい。
　前記（１）工程を含むサイクルを繰り返す場合、又は前記（１’）工程及び（２’）工程を含むサイクルを繰り返す場合には、各サイクルにおいて植物体に与えるストレスの種類を変えたり、ストレスを追加してもよい。例えば、１回目のサイクルでは塩ストレスをかけ、その後の２回目のサイクルでは乾燥ストレスをかけてもよい。また、１回目のサイクルでは塩ストレスをかけ、その後の２回目のサイクルでは塩ストレスと乾燥ストレスの両方をかけてもよい。複数のストレスを同時に、又はサイクルごとにそれぞれかけることにより、複数のストレスに対する耐性を付与できる植物共生微生物群を選抜できる。
　複数のストレスに対する耐性を付与できる植物共生微生物群は、本発明に係る植物共生微生物群の選抜方法を、ストレスの種類を変えて重ねて実施することにより選抜することもできる。例えば、塩ストレスと乾燥ストレスの両方に対して耐性を付与できる植物共生微生物群は、次のようにして選抜できる。まず、塩濃度を高めた浸漬用溶液を用いて本発明に係る植物共生微生物群の選抜方法を行い、耐塩性を付与できる植物共生微生物群を選抜する。次いで、選抜された植物共生微生物群を付着させた植物体に対して、ＰＥＧ等の濃度と塩濃度の両方を高めた浸漬用溶液を用いて本発明に係る植物共生微生物群の選抜方法を行うことによって、耐塩性と乾燥ストレス耐性の両方を付与できる共生微生物群を選抜することができる。最初の塩ストレスのみの下で植物体に接触させる微生物混合物と、その後に行う塩ストレスと乾燥ストレスの両方の下で植物体に接触させる微生物混合物は、同じものであってもよく、別の試料から抽出された微生物混合物であってもよい。
　本発明に係る植物共生微生物群の選抜方法において、選抜される植物体を、単に生育しているものではなく、特定の表現型を示して生育している植物体としてもよい。例えば、塩ストレス下では、葉が大きくなったり、成熟が早くなったり、果実等の収量が多くなる等の表現型を示す植物体がある。そこで、本発明に係る植物共生微生物群の選抜方法を用いて塩ストレス下での生育を可能とする植物共生微生物群を選抜する際に、前記第１選抜工程、前記（１）工程、又は前記（１’）工程において、目的の表現型を示す植物体のみから微生物を回収することにより、塩ストレス下で当該特定の表現型を示す植物体の生育を可能とする植物共生微生物群を選抜することができる。
　本発明に係る植物共生微生物群の選抜方法により選抜された植物共生微生物群を、植物体に共生させることにより、植物体のストレス耐性を顕著に改善することができる。すなわち、選抜された植物共生微生物群を根に付着させた状態で、ストレス下で植物体を生育させることができる。本発明においては、植物体への接触と共生が比較的容易であることから、選抜された植物共生微生物群は、根に付着させることが好ましい。また、植物共生微生物群は、選抜工程で使用した植物体と同種の植物体のみならず、異種の植物体をストレス下で生育させる際に共生させてもよい。また、植物共生微生物群を共生させた後の植物体のストレス下での栽培は、水耕栽培で行ってもよく、土壌等で栽培してもよい。例えば、無菌状態で水耕栽培した後、根に選抜された植物共生微生物群を付着させた植物体を、土壌へ移植し、ストレス下で生育させることができる。
＜耐塩性共生微生物群＞
　本発明に係る第１の微生物混合物は、植物体と共生して塩ストレス下での植物体の生育を可能とするものであり、配列番号１で表される塩基配列からなる16S rDNAを有するBacillus pumilus CRCO-1株と、配列番号２で表される塩基配列からなる16S rDNAを有するBacillus pumilus CRCO-2株と、配列番号３で表される塩基配列からなる16S rDNAを有するBacillus pumilus CRCO-3株とを含有する。これらの３株を含有する微生物混合物は、植物体と共生して塩ストレス下での植物体の生育を可能とする植物共生菌群として、本発明に係る植物共生微生物群の選抜方法により土壌より選抜された。
　Bacillus pumilus CRCO-1株とBacillus pumilus CRCO-2株は、16S rDNAの塩基配列のBLAST（Basic Local Alignment Search Tool） Searchの検索の結果、１００％一致した微生物はなく、かつ、Bacillus pumilus（アクセッション番号：KF923448.1）との配列相同性がいずれも９９％以上であったことから、いずれもBacillus pumilusの新規株であることが確認された。また、Bacillus pumilus CRCO-3株は、16S rDNAの塩基配列がBacillus pumilus（アクセッション番号：KF923448.1）と１００％一致しており、Bacillus pumilusの既知株であることが判明した。Bacillus pumilusは、一般的に土壌に存在している微生物である。なお、Bacillus pumilus CRCO-1株とBacillus pumilus CRCO-2株は、16S rDNAの塩基配列における配列相同性が９９％以上であったことから、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）に登録されたUncultured Bacillus sp.（アクセッション番号：HM152710.1）の近縁種と推察された。なお、当該微生物は難培養性微生物として遺伝子だけが知られていたものである。
　本発明に係る第１の微生物混合物におけるBacillus pumilus CRCO-1株とBacillus pumilus CRCO-2株とBacillus pumilus CRCO-3株との存在比（微生物数比）としては、特に限定されるものではない。本発明に係る第１の微生物混合物におけるBacillus pumilus CRCO-1株の存在比としては、７０～９０％が好ましく、７５～８５％がより好ましい。本発明に係る第１の微生物混合物におけるBacillus pumilus CRCO-2株の存在比としては、５～２０％が好ましく、５～１５％がより好ましい。本発明に係る微生物混合物におけるBacillus pumilus CRCO-3株の存在比としては、１～１５％が好ましく、１～１０％がより好ましい。
　本発明に係る第１の微生物混合物は、植物体に共生して耐塩性を高める効果を損なわない範囲において、他の微生物を含有していてもよい。本発明に係る第１の微生物混合物全体に占める、Bacillus pumilus CRCO-1株とBacillus pumilus CRCO-2株とBacillus pumilus CRCO-3株の総和の存在比は、５０％以上が好ましく、８０％以上がより好ましく、９０％以上がよりさらに好ましい。本発明に係る第１の微生物混合物としては、Bacillus pumilus CRCO-1株とBacillus pumilus CRCO-2株とBacillus pumilus CRCO-3株のみからなるものが特に好ましい。
＜高浸透圧耐性共生微生物群＞
　本発明に係る第２の微生物混合物は、植物体と共生して高浸透圧ストレス下での植物体の生育を可能とするものであり、配列番号６で表される塩基配列からなる16S rDNAを有するBacillus cereus CRCO-4株と、配列番号７で表される塩基配列からなる16S rDNAを有するBacillus cereus CRCO-5株とを含有する。これらの２株を含有する微生物混合物は、植物体と共生して、２０％ＰＥＧによる高浸透圧ストレス下での植物体の生育を可能とする植物共生菌群として、本発明に係る植物共生微生物群の選抜方法により土壌より選抜された。
　Bacillus cereus CRCO-4株とBacillus cereus CRCO-5株は、16S rDNAの塩基配列のBLAST Searchの検索の結果、１００％一致した微生物はなく、Bacillus cereusの公知株との配列相同性が９９％以上であったことから、いずれもBacillus cereusの新規株と推察される。
　本発明に係る第２の微生物混合物におけるBacillus cereus CRCO-4株とBacillus cereus CRCO-5株との存在比（微生物数比）としては、特に限定されるものではない。本発明に係る第２の微生物混合物におけるBacillus cereus CRCO-4株の存在比としては、８０～９５％が好ましく、８５～９５％がより好ましい。本発明に係る第２の微生物混合物におけるBacillus cereus CRCO-5株の存在比としては、５～２０％が好ましく、５～１５％がより好ましい。
　本発明に係る第２の微生物混合物は、植物体に共生して高浸透圧耐性を高める効果を損なわない範囲において、他の微生物を含有していてもよい。本発明に係る第２の微生物混合物全体に占める、Bacillus cereus CRCO-4株とBacillus cereus CRCO-5株の総和の存在比は、５０％以上が好ましく、８０％以上がより好ましく、９０％以上がよりさらに好ましい。本発明に係る第２の微生物混合物としては、Bacillus cereus CRCO-4株とBacillus cereus CRCO-5株のみからなるものが特に好ましい。
　以下、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
［参考例１］
　シロイヌナズナの塩ストレス耐性を調べた。
＜ポットの作成＞
　天面と底面が開口した円柱状のポットに、スクロース含有ＭＳ寒天培地（ＭＳ培地に０．５％（ｗ／ｖ）スクロースと０．９％（ｗ／ｖ）アガーを加えた培地）を注入して固めることにより、植物体を育成するためのポットを作製した。当該ポットを、スクロース含有ＭＳ培地（ＭＳ培地に０．５％（ｗ／ｖ）スクロースを加えた液体培地）を入れた８つの容器にそれぞれ複数個ずつ設置した。
＜植物体の水耕栽培＞
　シロイヌナズナの種子（Col-0）は、LEHLE社(Round Rock, TX, USA)より購入した。種子は、１％次亜塩素酸に浸漬させた状態で１分間撹拌をすることによって表面を滅菌した後、遠心分離処理により次亜塩素酸を除いた。次亜塩素酸処理後の種子は、滅菌水にて３回水洗した後、前記ポットの上部に播種して、４℃で２４時間暗所にて保存した。
　次いで、各ポットを、底面はスクロース含有ＭＳ培地に浸っているが天面は浸っていない状態となるように設置し、各ポットに播種された種子を、２５℃、明期１６時間と暗期８時間の長日条件のインキュベーター内で１４日間育成した。インキュベーター内での育成開始から約３～４日後に出芽した。図１に、ポットの播種時（左図）と植物体が成長した状態（右図）を模式的に示した。出芽後に、植物の根（４ａ）は固形培地を貫通して生長し、ポットの底を突き抜けた。
＜シロイヌナズナの塩ストレス耐性の確認＞　
　１４日間水耕栽培後に、ポットを入れた８つの容器のうち、６つの容器に対して、容器内のスクロース含有ＭＳ培地に塩化ナトリウムの最終濃度が０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、又は３．０質量％となるようにそれぞれ滅菌済の５Ｍ　塩化ナトリウム水溶液を添加した。８つの容器のうちの残りの２つの容器には、塩化ナトリウム水溶液は添加しなかった（塩化ナトリウムの最終濃度が０質量％）。その後、当該ポットを１４日間培養した。
　この結果、シロイヌナズナの根が浸っているスクロース含有ＭＳ培地の塩化ナトリウム濃度が０．５質量％であったポットに栽培した植物体は、塩化ナトリウム濃度が０質量％であったポットに栽培した植物体と同様に、いずれも外観上正常に生育できた。これに対して、根が浸っているスクロース含有ＭＳ培地の塩化ナトリウム濃度が１．０質量％以上であったポットでは、一部の植物体しか生育できなかった。具体的には、塩化ナトリウム濃度が１．０質量％では生育できた植物体は２５．０％であり、塩化ナトリウム濃度が１．５質量％では生育できた植物体は１６．７％であり、塩化ナトリウム濃度が２．０質量％では生育できた植物体は１個もなく、塩化ナトリウム濃度が２．５質量％では生育できた植物体は８．３％であり、塩化ナトリウム濃度が３．０質量％では生育できた植物体は１個もなかった。これらの結果から、シロイヌナズナでは、食塩濃度が１．０質量％以上で塩ストレスがかかることがわかった。
［実施例１］
　シロイヌナズナを用い、土壌から抽出された微生物から、耐塩性を高める共生効果を有する植物共生微生物群を選抜した。
＜微生物懸濁液の調製＞
　アメリカ合衆国コロラド州のCoyote Ridge(Fort Collins, CO, USA)にて採取された土壌１ｇを、緩衝液で懸濁し、十分に撹拌し、微生物懸濁液として用いた。
＜植物体の水耕栽培＞
　参考例１と同様にして、前記ポットを複数個用意し、スクロース含有ＭＳ培地（ＭＳ培地に０．５％（ｗ／ｖ）スクロースを加えた液体培地）を入れた１つの容器に全て設置した。各ポットは、底面はスクロース含有ＭＳ培地に浸っているが天面は浸っていない状態となるように設置した。これらのポットの上部に種子を播種し、２５℃、明期１６時間と暗期８時間の長日条件のインキュベーター内で１４日間育成した。
＜塩ストレス及び微生物の接種（第１選抜工程）＞　
　１４日間水耕栽培後に、当該ポットの底面を浸したスクロース含有ＭＳ培地に、塩化ナトリウムの最終濃度が１質量％となるように滅菌済の５Ｍ　塩化ナトリウム水溶液を添加し、さらに１００μＬの微生物懸濁液を添加した。その後、当該ポットを１４日間培養した。
＜生育している植物体からの微生物の回収＞
　塩ストレス下での１４日間の培養後、生育している植物体の根と地上部（葉と茎）を切断し、根を回収し、ホモジナイズして微生物回収溶液とした。
＜微生物の培養（第１培養工程）＞
　２０μＬの当該微生物回収溶液を２ｍＬの２種類の培地にて、３０℃で一晩、振とう培養（２００ｒｐｍ）を行った。培養後の培養液中の微生物数は、いずれも１０７ＣＦＵ以上であった。得られた各培養物を混合したものを、微生物混合液とした。
＜塩ストレス及び微生物の接種（１ラウンド目の（１）工程）＞　
　前記＜植物体の水耕栽培＞と同様にして、ポットにて１４日間水耕栽培した植物体を用意した。当該ポットの底面を浸したスクロース含有ＭＳ培地に、塩化ナトリウムの最終濃度が１．５質量％となるように滅菌済の５Ｍ　塩化ナトリウム水溶液を添加し、さらに第１培養工程で調製した微生物混合液を１００μＬ添加した。その後、当該ポットを１４日間培養した。
　塩ストレス下での１４日間の培養後、６．３％の植物体が生育しており、３３．３％の植物体が死にかけており、６０．４％の植物体が死んで（完全に枯れて）いた。
　前記第１選抜工程と同様にして、生育している植物体から根を回収し、ホモジナイズして微生物回収溶液を調製した。
＜微生物の培養（１ラウンド目の（２）工程）＞
　前記第１培養工程と同様にして、１ラウンド目の（１）工程で調製した微生物回収溶液を２種類の培地にてそれぞれ培養し、得られた各培養物を混合したものを、微生物混合液とした。
＜塩ストレス及び微生物の接種（２ラウンド目の（１）工程）＞
　ポットの底面を浸したスクロース含有ＭＳ培地の塩化ナトリウムの最終濃度を１．５質量％に代えて３．０質量％としたこと、及び当該スクロース含有ＭＳ培地に添加する微生物回収液を、第１培養工程で調製した微生物回収溶液に代えて１ラウンド目の（２）工程で調製した微生物混合液を用いた以外は、１ラウンド目の（１）工程と同様にして、ポットにて１４日間水耕栽培した植物体を塩ストレス下での１４日間の培養し、生育している植物体から根を回収し、ホモジナイズして微生物回収溶液を調製した。
　塩ストレス下での１４日間の培養後、１％の植物体が生育しており、２０．８％の植物体が死にかけており、７８．１％の植物体が死んでいた。
　これらの結果から、食塩濃度が１．５又は３．０質量％の塩ストレス下で生育していた植物体に共生していた微生物混合物により、シロイヌナズナ等の植物の塩ストレス下での植物体の生育が可能となったことが明らかとなった。すなわち、本発明に係る植物共生微生物群の選抜方法により、土壌中の微生物混合物から、塩ストレス下での植物体の生育を可能とする植物共生菌群を選抜でき、構成する微生物を脱落させることなく培養できた。
［実施例２］
　実施例１において選抜された塩ストレス下での植物体の生育を可能とする植物共生菌群（微生物混合物）を構成する微生物を同定した。具体的には、選抜された塩ストレス下での植物体の生育を可能とする植物共生菌群（微生物混合物）について、ゲノムＤＮＡを回収し、16S rDNAを同定することにより、当該植物共生菌群を構成する微生物を同定した。
＜微生物混合物からゲノムＤＮＡの回収＞
　前記＜生育している植物体からの微生物の回収＞と同様にして、食塩濃度が３．０質量％の塩ストレス下で生育していた植物体から根を回収し、ホモジナイズして微生物回収溶液を調製した。この微生物回収溶液から菌体を回収し、回収した菌体の一部からゲノムＤＮＡを、GenElute Bacterial Genomic DNA kit（Sigma-Aldrich、St. Louis, MO, USA）を用いて得た。
＜16S rDNAの同定＞
　回収されたゲノムＤＮＡを鋳型とし、フォワードプライマー（5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’、配列番号４）とリバースプライマー（5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’、配列番号５）を用いて、16S rDNAをＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲの温度条件は、９５℃、３分間の加熱工程後、９５℃、３０秒間の変性工程、５０℃、３０秒間のアニーリング工程、及び７２℃、１分３０秒間の伸長工程からなるサイクルを３０サイクル行った後、最後に７２℃、５分間の伸長反応を加える条件で行った。得られたＰＣＲ産物を、１．２％のアガロースゲル電気泳動により確認し、QIAquick gel extraction kit (Quiagen, Germantown, MD, USA)を用いてゲルから抽出した。抽出されたＰＣＲ産物を、TOPO-TA cloning kit (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)を用いてプラスミド中に挿入し、大腸菌に形質転換を行った。アンピシリン含有ＬＢ平板培地上で一晩培養した大腸菌コロニーをランダムに３０個取り、アンピシリン含有ＬＢ液体培地に移植して培養した。QIAprep spin miniprep kit (Quiagen)を用いて培養された大腸菌からプラスミドを精製した。精製されたプラスミドに対して、BigDye terminator v3.1 Cycle sequence kit (Life Techonologies)を用いたThermalcycle反応を行い、DNAシークエンサー(ABI 3130xL)にて当該プラスミドに組み込まれた16S rDNAの塩基配列を決定した。
　16S rDNAの塩基配列解析の結果、３種類の16S rDNA（CRCO-1株、CRCO-2株、及びCRCO-3株）が同定された。
　配列が決定された３種類の16S rDNAの塩基配列についてそれぞれNCBI BLAST検索を行ったところ、３種類のうち、CRCO-1株はUncultured Bacillus sp.（アクセッション番号：HM152710.1）と配列相同性が９９．９３％、Bacillus pumilus（アクセッション番号：KF923448.1）と配列相同性が９９．８７％であり、CRCO-2株はUncultured Bacillus sp.（アクセッション番号：HM152710.1）と配列相同性が９９．８７％、Bacillus pumilus（アクセッション番号：KF923448.1）と配列相同性が９９．８０％であり、CRCO-3株はBacillus pumilus（アクセッション番号：KF923448.1）と配列相同性が１００％であった。これらの結果から、CRCO-1株及びCRCO-2株はBacillus pumilusの新規株であり、CRCO-3株はBacillus pumilusの既知株であることがわかった。つまり、当該植物共生菌群は、Bacillus pumilusの新規株であるCRCO-1株及びCRCO-2株と、Bacillus pumilusの既知株であるCRCO-3株（アクセッション番号：KF923448.1）からなることがわかった。
　また、同定した３０個の形質転換体に挿入されていた16S rDNAの割合から、これら３種類の微生物の存在比を調べたところ、Bacillus pumilus CRCO-1株は８２．１％であり、Bacillus pumilus CRCO-2株は１０．７％であり、Bacillus pumilus CRCO-3株は７．１％であった。
＜同定した微生物混合物の耐塩性を高める共生効果＞
　前記＜植物体の水耕栽培＞と同様にして、ポットにて１４日間水耕栽培した植物体を用意した。当該ポットの底面を浸したスクロース含有ＭＳ培地に、塩化ナトリウムの最終濃度が３．０質量％となるように滅菌済の５Ｍ　塩化ナトリウム水溶液を添加し、さらに前記＜微生物混合物からゲノムＤＮＡの回収＞において回収した菌体の一部を添加した。その後、当該ポットを１４日間培養した。
　塩ストレス下での１４日間の培養後、３．１％の植物体が死んでおり、１５．６％の植物体が死にかけていたが、残りの植物体は生育していた。また、死んだ植物体は、いずれも枯れる際に白い葉となっていた。
［実施例３］
　シロイヌナズナを用い、土壌から抽出された微生物から、高浸透圧耐性を高める共生効果を有する植物共生微生物群を選抜した。
＜微生物懸濁液の調製＞
　アメリカ合衆国コロラド州のCoyote Ridge(Fort Collins, CO, USA)にて採取された土壌１ｇを、緩衝液で懸濁し、十分に撹拌し、微生物懸濁液として用いた。
＜植物体の水耕栽培＞
　参考例１と同様にして、前記ポットを複数個用意し、スクロース含有ＭＳ培地（ＭＳ培地に０．５％（ｗ／ｖ）スクロースを加えた液体培地）を入れた１つの容器に全て設置した。各ポットは、底面はスクロース含有ＭＳ培地に浸っているが天面は浸っていない状態となるように設置した。これらのポットの上部に種子を播種し、２５℃、明期１６時間と暗期８時間の長日条件のインキュベーター内で１４日間育成した。
＜高濃度ＰＥＧストレス及び微生物の接種（第１選抜工程）＞　
　１４日間水耕栽培後に、当該ポットの底面を浸したスクロース含有ＭＳ培地に、ＰＥＧの最終濃度が２０質量％となるように滅菌済の高濃度ＰＥＧ水溶液を添加し、さらに１００μＬの微生物懸濁液を添加した。その後、当該ポットを１４日間培養した。
＜生育している植物体からの微生物の回収＞
　高濃度ＰＥＧストレス下での１４日間の培養後、生育している植物体の根と地上部（葉と茎）を切断し、根を回収し、ホモジナイズして微生物回収溶液とした。なお、微生物懸濁液を添加せずに高濃度ＰＥＧストレス下で１４日間培養したシロイヌナズナでは、全ての植物体が死んでしまった。
＜微生物の培養（第１培養工程）＞
　２０μＬの当該微生物回収溶液を２ｍＬの２種類の培地にて、３０℃で一晩、振とう培養（２００ｒｐｍ）を行った。培養後の培養液中の微生物数は、いずれも１０７ＣＦＵ以上であった。得られた各培養物を混合したものを、微生物混合液とした。
＜高濃度ＰＥＧストレス及び微生物の接種（１ラウンド目の（１）工程）＞　
　前記＜植物体の水耕栽培＞と同様にして、ポットにて１４日間水耕栽培した植物体を用意した。当該ポットの底面を浸したスクロース含有ＭＳ培地に、ＰＥＧの最終濃度が２０質量％となるように滅菌済の高濃度ＰＥＧ水溶液を添加し、さらに第１培養工程で調製した微生物混合液を１００μＬ添加した。その後、当該ポットを１４日間培養した。
＜微生物混合物からゲノムＤＮＡの回収＞
　高濃度ＰＥＧストレス下での１４日間の培養後、前記＜生育している植物体からの微生物の回収＞と同様にして、高濃度ＰＥＧストレス下で生育していた植物体から根を回収し、ホモジナイズして微生物回収溶液を調製した。
　この微生物回収溶液から菌体を回収し、回収した菌体の一部からゲノムＤＮＡを、GenElute Bacterial Genomic DNA kit（Sigma-Aldrich、St. Louis, MO, USA）を用いて得た。この微生物回収溶液から、ゲノムＤＮＡを回収し、16S rDNAを同定することにより、高濃度ＰＥＧストレス下での植物体の生育を可能とする植物共生菌群（微生物混合物）を構成する微生物を同定した。
＜16S rDNAの同定＞
　実施例２と同様にして、回収されたゲノムＤＮＡを鋳型として、16S rDNAをＰＣＲにより増幅し、得られたＰＣＲ産物の16S rDNAの塩基配列を決定した。この結果、２種類の16S rDNA（CRCO-4株及びCRCO-5株）が同定された。両株の16S rDNAの塩基配列についてそれぞれNCBI BLAST検索を行ったところ、CRCO-4株はBacillus cereus partial 16S rRNA gene, strain M87（アクセッション番号：LN890173）と配列相同性が９９．７４％であり、CRCO-5株はBacillus cereus partial 16S rRNA gene, strain L68（アクセッション番号：LN890064）と配列相同性が９９．６１％であった。これらの結果から、CRCO-4株及びCRCO-5株はBacillus cereusであることがわかった。つまり、当該植物共生菌群は、Bacillus cereusの新規株であるCRCO-4株及びCRCO-5株からなることがわかった。
　また、同定した３０個の形質転換体に挿入されていた16S rDNAの割合から、これら２種類の微生物の存在比を調べたところ、Bacillus cereus CRCO-4株は９０％であり、Bacillus cereus CRCO-5株は１０％であった。
　１…ポット、２…スクロース含有ＭＳ寒天培地、３…種子、４…植物体、４ａ…根。

Claims (22)

  1. 　１又は複数の植物体を、環境ストレス及び／又は病害ストレスの下、微生物混合物を含む溶液に部分的に浸漬させた状態で一定期間生育させた後、生育している植物体に付着している微生物を回収して、前記ストレス下での植物体の生育を可能とする植物共生微生物群として選抜する第１選抜工程、
    を有する、植物共生微生物群の選抜方法。
  2. 　前記第１選抜工程の後、下記（１）工程を含むサイクルを少なくとも１回繰り返す、請求項１に記載の植物共生微生物群の選抜方法：
    （１）１又は複数の植物体を、前記ストレス下、前記選抜された微生物を含む溶液に部分的に浸漬させた状態で一定期間生育させた後、生育している植物体に付着している微生物を回収して、前記ストレス下での植物体の生育を可能とする植物共生微生物群として選抜する工程。
  3. 　前記工程（１）における前記ストレスの強度を、前記サイクルを繰り返すごとに順次強くする、請求項２に記載の植物共生微生物群の選抜方法。
  4. 　前記サイクルを２回以上繰り返す場合に、前記工程（１）における前記ストレスの種類を、前記サイクルを繰り返すごとに順次追加する、請求項２又は３に記載の植物共生微生物群の選抜方法。
  5. 　前記第１選抜工程の後、前記選抜された微生物を、２種以上の微生物培養用培地中でそれぞれ一定期間培養した後、各微生物培養用培地から得られた培養物を混合したものを、前記ストレス下での植物体の生育を可能とする植物共生微生物群の培養物として調製する第１培養工程と、
    を有する、請求項１に記載の植物共生微生物群の選抜方法。
  6. 　前記第１培養工程の後、下記（１’）工程及び（２’）工程を含むサイクルを少なくとも１回繰り返す、請求項５に記載の植物共生微生物群の選抜方法。
    （１’）１又は複数の植物体を、前記ストレス下、前記植物共生微生物群の培養物を含む溶液に部分的に浸漬させた状態で一定期間生育させた後、生育している植物体に付着している微生物を回収して、前記ストレス下での植物体の生育を可能とする植物共生微生物群として選抜する工程と、
    （２’）前記（１’）工程において選抜された微生物を、２種以上の微生物培養用培地中でそれぞれ一定期間培養した後、各微生物培養用培地から得られた培養物を混合したものを、前記ストレス下での植物体の生育を可能とする植物共生微生物群の培養物として調製する工程。
  7. 　前記（１’）工程における前記ストレスの強度を、前記サイクルを繰り返すごとに順次強くする、請求項６に記載の植物共生微生物群の選抜方法。
  8. 　前記サイクルを２回以上繰り返す場合に、前記（１’）工程における前記ストレスの種類を、前記サイクルを繰り返すごとに順次追加する、請求項６又は７に記載の植物共生微生物群の選抜方法。
  9. 　前記ストレスの強度が、無菌状態では植物体の生育率が５０％未満となる強度である、請求項１～８のいずれか一項に記載の植物共生微生物群の選抜方法。
  10. 　前記第１選抜工程、前記（１）工程、又は前記（１’）工程において、前記微生物を含む溶液に、植物体の根を浸漬させる、請求項２又は６に記載の植物共生微生物群の選抜方法。
  11. 　前記環境ストレスが、塩ストレス、高浸透圧ストレス、栄養ストレス、低温ストレス、又は高温ストレスであり、前記病害ストレスが、病原菌によるストレス又は病害虫によるストレスである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の植物共生微生物群の選抜方法。
  12. 　前記環境ストレスが、塩ストレス、高浸透圧ストレス、栄養ストレス、低温ストレス、及び高温ストレスからなる群より選択される２種以上である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の植物共生微生物群の選抜方法。
  13. 　前記第１選抜工程において、植物体の少なくとも一部を浸漬させる溶液中の微生物が、自然界から採取された１種又は２種以上の試料から抽出された微生物である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の植物共生微生物群の選抜方法。
  14. 　前記試料が土壌である、請求項１３に記載の植物共生微生物群の選抜方法。
  15. 　請求項１～１４のいずれか一項に記載の植物共生微生物群の選抜方法により選抜された植物共生微生物群を根に付着させた状態で、前記ストレス下で植物体を生育させる生育工程と、
    を有する、植物体の生育方法。
  16. 　前記生育工程が、
    無菌状態で水耕栽培した後、根に前記植物共生微生物群を付着させた植物体を、土壌へ移植し、前記ストレス下で生育させる工程である、請求項１５に記載の植物体の生育方法。
  17. 　請求項１～１６のいずれか一項に記載の植物共生微生物群の選抜方法により選抜された植物共生微生物群。
  18. 　請求項１～１６のいずれか一項に記載の植物共生微生物群の選抜方法により選抜された植物共生微生物群から単離された１種以上の微生物。
  19. 　配列番号１で表される塩基配列からなる16S rDNAを有するBacillus pumilus CRCO-1株と、
    　配列番号２で表される塩基配列からなる16S rDNAを有するBacillus pumilus CRCO-2株と、
    　配列番号３で表される塩基配列からなる16S rDNAを有するBacillus pumilus CRCO-3株と
    を含有する、植物体と共生して塩ストレス下での植物体の生育を可能とする、微生物混合物。
  20. 　Bacillus pumilus CRCO-1株の存在比率が７０～９０％であり、Bacillus pumilus CRCO-2株の存在比率が５～２０％であり、Bacillus pumilus CRCO-3株の存在比率が１～１５％である、請求項１９に記載の微生物混合物。
  21. 　配列番号６で表される塩基配列からなる16S rDNAを有するBacillus cereus CRCO-4株と、
    　配列番号７で表される塩基配列からなる16S rDNAを有するBacillus cereus CRCO-5株と、
    を含有する、植物体と共生して高浸透圧ストレス下での植物体の生育を可能とする、微生物混合物。
  22. 　Bacillus cereus CRCO-4株の存在比率が８０～９５％であり、Bacillus cereus CRCO-5株の存在比率が５～２０％である、請求項２１に記載の微生物混合物。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115537349A (zh) * 2022-06-20 2022-12-30 天津科技大学 一株秸秆降解菌及应用

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11759655B2 (en) * 2017-10-26 2023-09-19 Varian Medical Systems International Ag Method and apparatus for using a multi-layer multi-leaf collimation system

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009195124A (ja) * 2008-02-19 2009-09-03 Univ Of Yamanashi 難培養性微生物の培養方法
WO2012125050A1 (en) * 2011-03-17 2012-09-20 Biodiscovery New Zealand Limited Screening methods
JP2015528296A (ja) * 2012-08-31 2015-09-28 バイエル・クロツプサイエンス・エル・ピー 植物の非生物的ストレス抵抗性を高める方法
JP2015530093A (ja) * 2012-09-19 2015-10-15 バイオディスカバリー・ニュージーランド・リミテッド 植物に有益な特性を付与する微生物のスクリーニング方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009195124A (ja) * 2008-02-19 2009-09-03 Univ Of Yamanashi 難培養性微生物の培養方法
WO2012125050A1 (en) * 2011-03-17 2012-09-20 Biodiscovery New Zealand Limited Screening methods
JP2015528296A (ja) * 2012-08-31 2015-09-28 バイエル・クロツプサイエンス・エル・ピー 植物の非生物的ストレス抵抗性を高める方法
JP2015530093A (ja) * 2012-09-19 2015-10-15 バイオディスカバリー・ニュージーランド・リミテッド 植物に有益な特性を付与する微生物のスクリーニング方法

Non-Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DAMODARAN, T. ET AL.: "Rhizosphere and endophytic bacteria for induction of salt tolerance in gladiolus grown in sodic soils", JOURNAL OF PLANT INTERACTIONS, vol. 9, no. 1, 2 January 2014 (2014-01-02), pages 577 - 584, XP055508971 *
DATABASE nucleotide [O] 13 March 2013 (2013-03-13), "Bacillus pumilus strain CSR-B-2 16S ribosomal RNA gene, partial sequence", XP055508981, retrieved from ncbi Database accession no. JQ768236 *
KAMILOVA, F. ET AL.: "Enrichment for enhanced competitive plant root tip colonizers selects for a new class of biocontrol bacteria", ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, vol. 7, no. 11, 6 September 2005 (2005-09-06), pages 1809 - 1817, XP002727629 *
KANG, S. M. ET AL.: "Plant growth-promoting rhizobacteria reduce adverse effects of salinity and osmotic stress by regulating phytohormones and antioxidants in Cucumis sativus", JOURNAL OF PLANT INTERACTIONS, vol. 9, no. 1, 2014, pages 673 - 682, XP055508965 *
KUIPER, I. ET AL.: "Selection of a plant-bacterium pair as a novel tool for rhizostimulation of polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteria", MOLECULAR PLANT-MICROBE INTERACTIONS, vol. 14, no. 10, October 2001 (2001-10-01), pages 1197 - 1205, XP002463660 *
KUMAR, M. ET AL.: "Synergistic effect of pseudomonas putida and bacillus amyloliquefaciens ameliorates drought stress in chickpea (Cicer arietinum L.)", PLANT SIGNALING & BEHAVIOR, vol. 11, no. 1, 2 January 2016 (2016-01-02), pages 1 - 9, XP055508993 *
MARASCO, R. ET AL.: "A drought resistance-promoting microbiome is selected by root system under desert farming", PLOS ONE, vol. 7, no. 10, 31 October 2012 (2012-10-31), pages 1 - 14, XP055508975 *
NAVEED, M. ET AL.: "Increased drought stress resilience of maize through endophytic colonization by burkholderia phytofirmans PsJN and enterobacter sp.FD17", ENVIRONMENTAL AND EXPERIMENTAL BOTANY, vol. 97, 2014, pages 30 - 39, XP028769414 *
SWENSON, W. ET AL.: "Artificial ecosystem selection", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, vol. 97, no. 16, 1 August 2000 (2000-08-01), pages 9110 - 9114, XP055363966 *
TIWARI, S. ET AL.: "Salt-tolerant rhizobacteria-mediated induced tolerance in wheat (Triticum aestivum) and chemical diversity in rhizosphere enhance plant growth", BIOLOGY AND FERTILITY OF SOILS, vol. 47, no. 8, 9 July 2011 (2011-07-09), pages 907 - 916, XP019966746 *
VERSLUES, P. E. ET AL.: "Methods and concepts in quantifying resistance to drought, salt and freezing, abiotic stresses that affect plant water status", THE PLANT JOURNAL, vol. 45, no. 4, February 2006 (2006-02-01), pages 523 - 539, XP055509004 *
WANG, C. J. ET AL.: "Induction of drought tolerance in cucumber plants by a consortium of three plant growth-promoting rhizobacterium strains", PLOS ONE, vol. 7, no. 12, 28 December 2012 (2012-12-28), pages 1 - 10, XP055508977 *
WANG, S. ET AL.: "Survey of plant drought-resistance promoting bacteria from populus euphratica tree living in arid area", INDIAN J. MICROBIOL., vol. 54, no. 4, 13 June 2014 (2014-06-13), pages 419 - 426, XP035404041 *
ZHANG, Y. T. ET AL.: "Isolation and identification of drought-tolerant bacteria from xerophtes", SHIPIN KEXUE, vol. 33, no. 5, 2012, pages 124 - 128 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115537349A (zh) * 2022-06-20 2022-12-30 天津科技大学 一株秸秆降解菌及应用
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