CN102206592B

CN102206592B - 一种防治油茶病害的生防放线菌菌株及其应用

Info

Publication number: CN102206592B
Application number: CN2011100070547A
Authority: CN
Inventors: 周国英; 杨蕾; 李琳; 宋光桃; 李红军
Original assignee: Central South University of Forestry and Technology
Current assignee: HAINAN KEDA FORESTRY CO., LTD.
Priority date: 2011-01-13
Filing date: 2011-01-13
Publication date: 2012-07-25
Anticipated expiration: 2031-01-13
Also published as: CN102206592A

Abstract

本发明公开了一种防治油茶病害的生防放线菌菌株及其应用方法。所述的菌株为球孢链霉菌球孢亚种CSUFTAC0906002，保藏编号为CCTCC M 2011012。该菌株发酵液与米糠混合，自然风干后碾碎制成原粉；添加40wt％原粉，38wt％高岭土，10wt％木质素磺酸钠，7wt％SDS，5wt％腐植酸制成菌剂；将菌剂稀释后直接以喷洒和灌根的方式用于防治油茶病害。该菌株对油茶主要病害均有防治作用，对多种病原真菌具有拮抗作用，而且具有对病原菌的作用方式多种多样、繁殖速度快等优点。尤其对油茶炭疽病菌抑制作用强，对油茶炭疽病的防治具有重要意义，具有良好的开发应用前景。

Description

一种防治油茶病害的生防放线菌菌株及其应用

技术领域：

本发明涉及植物保护领域，尤其涉及一种防治油茶主要病害的生防放线菌菌株及其应用，具体地说涉及一种高效防治油茶炭疽病的球孢链霉菌球孢亚种CSUFTAC0906002及应用。

技术背景：

油茶(Camellia oleifera)是我国特有的食用油料树种，亦是世界四大木本油料树种之一，已有2000多年的利用和栽培历史。它适应性广，抗逆性强，适种于广大的红壤丘陵低地区。主要生长在南方，以湖南、江西、广西为主，其中湖南省是国内最大的油茶产地和最大的茶油消费区。油茶全身都是宝，具有很高的经济价值。据统计，油茶面积在10万亩以上的县有130个，30万亩以上的县有56个，50万亩以上的县有19个。年产茶油1.3～1.5亿公斤，是二亿多人口的主要食用油来源。目前全国有油茶林400万公顷，占全国木本食用油料面积的80％以上，常年产油15万吨。目前，油茶的病害种类繁多，其危害程度也愈发严重。每年因病害而造成的经济损失难以估计，其中油茶炭疽病是一种常见的油茶病害。

油茶炭疽病是由胶胞炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)侵染引起的一种毁灭性病害，是我国油茶产区的主要病害之一，发生普遍，引起严重落果、落蕾、落叶、枝枯，甚至整株衰亡。病害落果率通常在20％左右，严重时40％以上。据浙江省的资料，由于油茶炭疽病，严重病区发病率高达80％，病树的平均存果率比无病树降低了63.3％。

当前对油茶炭疽病的防治主要通过种植抗性品种和化学防治来控制，但有害生物抗性问题日益严重，且化学农药残留造成严重的危害，如造成残毒、污染环境，对人体健康、生态环境造成了很大的威胁，不利于油茶产业生产的可持续发展。因此寻找一种经济、安全、有效的防治措施是当务之急。放线菌广泛存在于不同的自然生态环境里，土壤是放线菌习居的良好场所。许多放线菌能够产生抗生素，具有良好的抑制植物病原菌生长和促进植物生长作用。土壤拮抗放线菌具有环境友好、拮抗作用良好、作用效果持久、针对性强等优点，是很有开发和应用潜力的生防菌。

从根际土壤中分离筛选获得对油茶炭疽病菌具有拮抗作用的生防菌株，对油茶炭疽病的防治具有重要的意义，但目前相关技术仍旧很薄弱甚至空白，至今20多年能有效防治油茶炭疽病病的拮抗放线菌未见报道。

发明内容：

本发明的目的是提供一种高效防治油茶幼林病害的球孢链霉菌球孢亚种球孢变种CSUFTAC0906002，球孢链霉菌球孢亚种球孢变种CSUFTAC0906002是一种从植株根际土壤中分离筛选获得对油茶多种主要病害具有广谱拮抗作用的生防放线菌菌株，对油茶幼林病害的防治及促进油茶苗木生长具有重要意义。

本发明另一个目的是提供所述高效防治油茶炭疽病的球孢链霉菌球孢亚种球孢变种CSUFTAC0906002在防治油茶病害方面的多种应用。

本发明的技术方案是提供一种高效防治油茶炭疽病的球孢链霉菌球孢亚种球孢变种CSUFTAC0906002，在PDA固体培养基上菌株菌落干燥、表面不光滑，有突起，菌落边缘不整齐，浅灰色。孢子丝非螺旋形，长枝条状。孢子卵圆形、球形、长圆形，表面光滑。基丝无色，有时背面微黄色。气丝较少，气丝秸草色、乳脂色或微黄秸草色。该菌株已于2011年1月10日在中国典型培养物保藏中心进行了保藏，名称为：球孢链霉菌球孢亚种CSUFTAC0906002，(Streptomyces globixporus supsp.globisporus)CSUFTAC0906002；保藏编号为：CCTCC NO：M 2011012。

本发明所述高效防治油茶病害的球孢链霉菌球孢亚种CSUFTAC0906002通过平板对峙试验筛选获得。

本发明还提供了所述高效防治油茶病害的球孢链霉菌球孢亚种CSUFTAC0906002在防治油茶主要病害上的应用，并且可以用于制备防治植物病害的制剂。

所述的植物主要病害包括：油茶炭疽病、油茶叶枯病、油茶半边疯病、油茶茶饼病、油茶根腐病、油茶软腐病、柑橘炭疽病、荷花玉兰炭疽病、杉木炭疽病。该菌株尤其在油茶炭疽病和油茶叶枯病上防治效果显著。

所述的防治油茶病害的制剂的制备过程如下：

(1)先将菌液发酵：发酵条件为：接种量为10％，装液量100mL/300mL，初始pH7.0，温度25～30℃，发酵时间168h；发酵培养基为：酵母粉0.5％，葡萄糖1％，磷酸二氢钾0.1％，氯化钠0.1％，碳酸钙0.3％，pH自然；

(2)将米糠与发酵液混合，自然风干后碾碎制成原粉；添加40wt％原粉，38wt％高岭土，10wt％木质素磺酸钠，7wt％SDS，5wt％腐植酸制成制剂。

所述的米糠进一步粉碎，过30-80目细筛；将发酵液与米糠混合，混合的比例按照质量∶体积为1∶0.5-2进行。

所述的米糠优选过80目筛，米糠与发酵液混合比例优选按照质量∶体积为1∶2进行。

所述的菌剂还可以经过稀释后，直接以喷洒和灌根的方式用于防治油茶病害。所述的菌剂稀释100-1000倍。

本发明的有益效果是：

(1)球孢链霉菌球孢亚种CSUFTAC0906002，对油茶主要病害均有防治作用，对多种病原真菌具有拮抗作用，而且具有对病原菌的作用方式多种多样、繁殖速度快等优点，尤其对油茶炭疽病菌抑制作用强，对油茶炭疽病的防治具有重要意义；在植物病害生物防治中所起到的作用非常重要；

(2)该种菌株培养条件简单，容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。

附图说明：

图1为球孢链霉菌球孢亚种CSUFTAC0906002菌株菌落形态图；

图2为球孢链霉菌球孢亚种CSUFTAC0906002菌株菌丝形态图；

图3为球孢链霉菌球孢亚种CSUFTAC0906002菌株对油茶炭疽病菌的平板对峙拮抗作用图；

图4为球孢链霉菌球孢亚种CSUFTAC0906002菌液发酵后活性组分液质联用图。

具体实施方式：

本发明提供球孢链霉菌球孢亚种CSUFTAC0906002新菌株，其展现出对油茶炭疽病具有较强的拮抗活性。

本发明的新菌株分离自园林植物根基土壤。

本发明的球孢链霉菌球孢亚种CSUFTAC0906002，在PDA固体培养基上菌株菌落干燥、表面不光滑，有突起，菌落边缘不整齐，有褶皱，浅灰色。孢子丝非螺旋形，长枝条状。孢子多，卵圆形、球形、长圆形，表面光滑。基丝无色，有时背面微黄色。气丝较少，气丝秸草色、乳脂色或微黄秸草色。在高氏1号培养基上生长较慢，孢子较少，菌落浅灰色。菌株的生化反应：明胶液化慢。牛奶胨化。淀粉水解快。硝酸盐还原。不产生类黑色素酪氨酸酶和H2S。利用葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、麦芽糖、甘露糖、鼠李糖、淀粉、甘油、甘露醇、柠檬酸钠；不利用蔗糖、乳糖、棉子糖。不利用亚硝酸盐作为氮源。下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明，而不会限制本发明。

实施例1 CSUFTAC0906002的分离、筛选及鉴定

取土样，采用常规法进行分离、纯化和保存。我们从土壤中共分理出14株放线菌，用平板对峙法，初筛到6株抑菌直径大于5mm的菌株，再用摇瓶复筛，得到抑制菌丝生长的菌株。最终确定CSUFTAC0906002的拮抗作用最强。

筛选到的菌株经过形态学观察，生理生化实验以及分子生物学鉴定，最终确定该菌为球孢链霉菌球孢亚种。

本发明球孢链霉菌球孢亚种CSUFTAC0906002菌株菌落和菌丝形态图见图1和图2。

实施例2 CSUFTAC0906002的抗菌谱测定

采用对峙培养法。将打好直径为6mm的病原菌菌饼放于平板中央，然后用接菌环蘸取待测菌悬浮液等距离(距平板中央3cm)点接拮抗菌，放于培养箱中28℃黑暗培养，4d后观察记录抑菌带的有无及大小，共重复3次。结果见表1。

表1 CSUFTAC0906002菌株对10种供试病原菌的拮抗作用

球孢链霉菌球孢亚种CSUFTAC0906002菌株对油茶炭疽病菌的平板对峙拮抗作用见图3。

实施例3 CSUFTAC0906002发酵液、培养滤液抗菌活性测定

用CSUFTAC0906002发酵液、培养滤液进一步对参与初筛实验的10种病原菌进行抑菌效果测定。实验结果表明，CSUFTAC0906002用高氏1号和PDA培养液培养后，CSUFTAC0906002对10种病原菌抑菌效果无明显差异。测定结果(表2)表明，发酵液对10种病原菌抑菌活性存在差异；而培养滤液对这些菌抑菌效果较弱，仅对油茶炭疽病菌有一定抑制效果，抑制率为34.7％。发酵液对油茶炭疽病菌、油茶根腐病菌、油茶软腐病菌的抑制率可达80％以上，对油茶半边疯病菌、油茶茶饼病菌以及柑橘炭疽病菌、合欢玉兰炭疽病菌等抑制率可达50％左右。

表2 CSUFTAC0906002发酵液、培养滤液对10种供试病原菌的拮抗作用

实施例4 CSUFTAC0906002发酵工艺优化及稳定性

最佳发酵培养基为：酵母粉0.5％，葡萄糖1％，磷酸二氢钾0.1％，氯化钠0.1％，碳酸钙0.3％，pH自然。菌株最优发酵条件为：初始pH7.0，温度25～30℃，发酵时间168h，最适接种量为10％，装液量100mL/300mL。在此条件下，菌体干重为1.9376mg，抑菌率达96.7％。

CSUFTAC0906002对酸碱处理有一定的耐受性，在pH为12条件下，仍可保87.1％的抑菌率；在pH为1的条件下，抑菌率为40％。由此证明，CSUFTAC0906002在碱性环境下仍能保持高的稳定性，在强酸性条件下有一定稳定性，而对高温条件的稳定性较弱。实验证明，该菌株对紫外线不具稳定性。经传代10次后，该菌株的抑菌活性仍可达83.7％，说明其遗传稳定。

实施例5 CSUFTAC0906002活性成分分析

发酵液预处理方法：将600ml液体发酵4天后的发酵液用1mol/L的草酸调节pH至3，室温下静置3小时，用1mol/L NaOH调pH为7。10000r/min离心10min，离心后弃上清取菌体沉淀。菌体沉淀用200ml 0.85％无菌生理盐水悬浮，置于4℃冰箱静置过夜。将处理后的发酵液进行细胞超声破碎，破碎条件为450w，破碎5s，间歇3s，累积15min。

菌株发酵液经预处理后，用正丁醇进行萃取时，得到的有机相抑菌活性最高。并且抑菌活性不受pH值的影响。抑菌活性在90％以上。

捷克八溶剂系统和pH纸层析结果表明，发酵液中主要杀菌成分属于碱性水溶性抗生素类物质。

将抑菌活性物质初提物用高效液相色谱(HPLC)进行活性组分的分离纯化，将分离到的各组分进行生物活性测定，确定抑菌活性强的组分进行下一步分析。

分离出的两个活性组分经液质联用分析后，综合相关文献及图谱，确定其分子两位388和402(见图4)。

实施例6 CSUFTAC0906002生防菌剂研制

将米糠与发酵液混合，自然风干后碾碎制成原粉备用。将买回的米糠经粉碎机进一步粉碎，再依次过30目、50目、80目细筛。将发酵液与以上三类米糠混合，混合的比例按照(质量∶体积)1∶2、1∶1、1∶0.5进行。结果表明按1∶2的比例与80目筛米糠混合后的菌剂原粉的效果最好。

配方优化结果表明，添加40％原粉，38％高岭土，10％木质素磺酸钠，7％SDS，5％腐植酸为菌剂最优配方。此配方下菌剂的润湿性、分散性、悬浮性都可达最佳水平。菌剂成品中活菌数为2.13×10¹⁰cfu/g，抑菌率达94.3％。经测定，菌剂的货架保存期较长，保存6个月后抑菌率仍可达78.8％。

CSUFTAC0906002生防菌剂的林间使用方法及效果

一、盆栽实验

(一)方法：对两年的油茶苗进行盆栽实验。取上述拮抗菌CSUFTAC0906002制备好的菌剂，分别用无菌水稀释100倍、500倍和1000倍。菌剂各浓度稀释液，采用灌根的接种方法进行防治试验。

(1)预防效果的测定：灌撒拮抗菌菌剂，每株灌根100ml。保湿培养24h后，喷洒接种浓度10⁷cfu/mL的胶孢炭疽孢子悬浮液。

(2)治疗效果的测定：先喷洒接种与上相同浓度胶孢炭疽孢子悬浮液，保湿24h，再施用拮抗菌菌剂。

以无菌水和75％多菌灵500倍稀释液作为对照，25℃保湿条件下培养，统计病情指数。每处理5株，重复3次。共需幼苗：4×5×3×2＝120株

病情分级标准：0级，未发病；I级，病斑面积占叶片总面积1/5以下；II级，病斑面积占叶片面积1/5～1/2；III级，病斑面积占叶片总面积1/2～3/4；IV级，病斑面积占叶片面积3/4以上。

病情指数＝∑(病级片数×代表数值)/总片数×发病最重级代表值×100％

防治效果＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100％

二、苗圃试验

(一)试验处理设计

试验处理A(空白对照)：喷洒清水、清水灌根处理；

试验处理B(防效测定)：用清水稀释100倍的上述拮抗菌CSUFTAC0906002的生防菌剂喷洒、灌根处理。

试验处理C(防效测定)：用清水稀释500倍的上述拮抗菌CSUFTAC0906002的生防菌剂喷洒、灌根处理。

试验处理D(防效测定)：用清水稀释1000倍的上述拮抗菌CSUFTAC0906002的生防菌剂喷洒、灌根处理。

试验处理E(化学农药防效测定)：用75％ 500倍的多菌灵喷洒、灌根处理。

每个处理重复3次。试验采用随机区组设计，每小区10株，小区间设保护行。共需幼苗：10×3×5＝150株。随机选择2个苗圃做平行的试验处理。

(二)试验实施

2010年8月22日开始第一次喷洒、灌根处理。喷洒处理同时，采用灌根器用稀释菌剂进行灌根处理，50～100mL/棵。2010年9月7日进行第二次喷洒、灌根处理。以此类推，每15天施用菌剂一次，合计共施用5次。

(三)防效调查

调查方法：是第一次处理前进行一次病情指数调查，第二次处理前进行第二次调查，并在最后一次处理后10d分别再进行一次调查。共调查6次。

每小区随机调查5株，合计每组处理共调查15株，每株调查所有叶片，调查病叶的严重度，记载病情指数，最终计算防治效果。

防治效果(％)＝(空白对照病情指数一处理区病情指数)/空白对照病情指数×100％

盆栽试验结果表明，CSUFTAC0906002对油茶炭疽病的防治效果均很良好，可达70％以上，使该病害的发生率和病情指数均降低。CSUFTAC0906002生防菌剂对油茶叶枯病的盆栽防治效果表明，CSUFTAC0906002对叶枯病有一定防治效果，但不如对炭疽病的效果显著，可达40％左右。

田间苗圃实验表明，CSUFTAC0906002不仅可以有效防治各种病害对油茶幼苗的侵害，还可以促进油茶苗木的生长，增强苗木的抗性。

表3 CSUFTAC0906002生防菌剂对油茶炭疽病的盆栽防治效果

表4 CSUFTAC0906002生防菌剂对油茶叶枯病的盆栽防治效果

表5 CSUFTAC0906002生防菌剂对油茶苗生长的影响

Claims

1.一种防治油茶病害的生防放线菌菌株，其特征在于，所述的菌株为球孢链霉菌球孢亚种(Streptomyces globisporussubsp.globisporus)CSUFTAC0906002，保藏编号为CCTCC M 2011012。

2.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述的油茶病害是：油茶炭疽病、油茶叶枯病、油茶半边疯病、油茶茶饼病、油茶根腐病、油茶软腐病。

3.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述的油茶病害为油茶炭疽病和油茶叶枯病。

4.权利要求1-3任一项所述的菌株的应用方法，其特征在于，应用于防治油茶病害；所述的油茶病害是：油茶炭疽病、油茶叶枯病、油茶半边疯病、油茶茶饼病、油茶根腐病、油茶软腐病。

5.根据权利要求4所述的应用方法，其特征在于，所述的菌株用于制备防治油茶病害的制剂。

6.根据权利要求5所述的应用方法，其特征在于，所述的防治油茶病害的制剂的制备过程如下：

(1)先将菌株发酵：发酵条件为：接种量为10％，装液量100mL/300m L，初始pH7.0，温度25～30℃，发酵时间168h；发酵培养基为：酵母粉0.5％，葡萄糖1％，磷酸二氢钾0.1％，氯化钠0.1％，碳酸钙0.3％，pH自然；

(2)菌剂制备：将米糠与发酵液混合，自然风干后碾碎制成原粉；添加40wt％原粉，38wt％高岭土，10wt％木质素磺酸钠，7wt％SDS，5wt％腐植酸制成制剂。

7.根据权利要求6所述的应用方法，其特征在于，所述的米糠进一步粉碎，过30-80目筛；将米糠与发酵液混合，混合的比例按照质量∶体积为1∶0.5-2进行。

8.根据权利要求7所述的应用方法，其特征在于，所述的米糠过80目筛，米糠与发酵液混合比例按照质量∶体积为1∶2进行。

9.权利要求6所述方法制备的菌剂的应用方法，其特征在于，所述菌剂经过稀释后，以喷洒和灌根的方式用于防治油茶病害。

10.根据权利要求9所述的应用方法，其特征在于，所述的菌剂稀释100-1000倍。