CN106212507B - 二甲基三硫醚在防治芒果炭疽病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物病害的防治，具体公开了挥发性化合物二甲基三硫醚在防治芒果炭疽病中的应用。本发明首次发现了二甲基三硫醚在防治芒果炭疽病中的应用。二甲基三硫醚可以在密闭环境中不接触水果而通过气体的作用来抑制芒果炭疽菌菌丝生长、孢子萌发及防治芒果炭疽病等芒果果实上主要的贮藏期病害，由于二甲基三硫醚本身极易挥发，熏蒸处理后残留在芒果表皮的二甲基三硫醚在常温下很容易挥发从而减少了对芒果品质的影响和对人体健康的危害。另外，本发明确定了对芒果炭疽病有抑制作用和防治效果的二甲基三硫醚的使用浓度，与现有的保鲜药剂相比，具有对防病效果好，低残留的优点，因此具有很强的开发应用前景。

Description

二甲基三硫醚在防治芒果炭疽病中的应用

技术领域

本发明涉及植物病害的防治，具体地说，涉及挥发性化合物二甲基三硫醚在防治芒果炭疽病中的应用。

背景技术

炭疽菌属(Colletotrichum Corda)真菌是一类全球性分布的植物病原菌，尤其是在热带、亚热带引起谷类、水果、蔬菜等多种作物采收前或采收后炭疽病发生，导致很大的经济损失。芒果是我国很具特色的热带水果，在我国主产于海南、广西、云南、四川、广东、福建及贵州等地，而芒果炭疽病是芒果生产上的主要病害之一，严重影响了芒果的产量和商品价值。目前对芒果炭疽病主要采用化学药剂防控，且生产中防治炭疽病的化学药剂多为单作用位点的内吸性杀菌剂。长期大量滥用单一的化学农药，病原菌很容易产生抗药性，而且还会引发食品安全、环境污染等问题。

挥发性化合物是一类低分子量(<300Da)、在常温常压下易蒸发的化合物。近年来，人们发现微生物或植物产生的挥发性化合物可以抑制或促进其他生物的生长和代谢，并且已发现了很多可以防治植物病虫害、促进植物生长等可提高作物产量的化合物。迄今为止，已经从微生物产生的代谢产物中鉴定出很多挥发性化合物，但还有很多挥发性化合物未能得到结构鉴定，其生物学功能也尚处于初级研究阶段。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供二甲基三硫醚在防治芒果炭疽病中的应用。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供了二甲基三硫醚在防治植物炭疽病中的应用。

进一步地，所述植物为芒果。尤其表现为二甲基三硫醚在防治芒果采后炭疽病中的应用。

本发明通过试验研究发现，二甲基三硫醚可以在密闭环境中不接触水果而通过气体的作用来抑制芒果炭疽菌菌丝生长、孢子萌发及防治芒果炭疽病等芒果果实上主要的贮藏期病害，由于二甲基三硫醚本身极易挥发，熏蒸处理后残留在芒果表皮的二甲基三硫醚在常温下很容易挥发从而减少了对芒果品质的影响和对人体健康的危害。

应用时，利用二甲基三硫醚对采后的芒果进行熏蒸处理。本发明进一步通过试验研究确定了对芒果炭疽病有抑制作用和防治效果的二甲基三硫醚的使用浓度为10～1000μL/L。与现有的保鲜药剂相比，应用上述浓度对芒果进行熏蒸，具有防病效果好，低残留的优点。

基于此，本发明还提供了二甲基三硫醚在制备防治植物炭疽病的药剂中的应用。具体的制备方法可采用本发明常规技术手段，本发明不对此另作限定。可选的，可利用二甲基三硫醚直接制备熏蒸剂，或利用其制备熏蒸剂的前体物质。

第二方面，本发明对二甲基三硫醚新应用的发现，来源于日常试验中对球孢链霉菌的培养及对其培养物的研究。因而，本发明还进一步提供一种球孢链霉菌在防治芒果炭疽病中的应用。具体表现为，利用所述球孢链霉菌制备二甲基三硫醚。

所述球孢链霉菌为球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)JK-1，已于2010年4月20日在湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保存中心(CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCC NO：M2010093(曾被记载于授权公告号为CN101845412B中国专利文献中)。

本发明通过试验发现，该菌在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)和马铃薯蔗糖琼脂培养基(PSA)上产生的挥发性物质无显著抑菌活性，而在NA培养基和LB培养基上可产生具有杀菌活性的挥发性化合物。采用气相色谱/质谱联用(GC/MS)分析鉴定了不同培养基上球孢链霉菌产生的挥发性物质成分，共鉴定出15种挥发性有机化合物。通过比较分析发现，不同培养基上产生的挥发性化合物成分存在显著差异，人工合成了8种特殊的化合物进行了抑菌活性及防病效果测定，结果发现二甲基三硫醚抑菌活性最强，可明显抑制芒果炭疽菌的菌丝生长和芒果炭疽病的发生，且可杀死病原菌分生孢子。二甲基三硫醚对芒果采后炭疽病有较好抑制作用和防病效果，可进一步研究将其开发为熏蒸剂来防治芒果采后炭疽病。

其中，LB培养基(Luria-Bertani固体培养基)的成分及制备方法如下：酵母提取物10g，胰蛋白胨5g，NaCl 10g，琼脂粉15g，蒸馏水1L，pH7.2。加热搅拌溶解后，分装灭菌。

NA培养基(营养肉汁琼脂Nutrient Agar，NA)的成分及制备方法如下：牛肉浸膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂粉15g，蒸馏水1L，pH7.2。加热搅拌溶解后，分装灭菌。

将LB培养基和NA培养基分别装入容积为500mL带有硅胶塞的玻璃瓶中，在培养基凝固前加入玻璃瓶中，100mL/瓶，常规湿热灭菌后备用。

所述球孢链霉菌的最适生长温度范围25℃～28℃。pH范围为6.0～8.0。培养时，用移液器分别吸取1mL的球孢链霉菌菌液加入到不同培养基中，以无菌风吹干培养基表面的水分，置于25℃～28℃条件下培养10～14d后，即可分离得到二甲基三硫醚。

本发明的有益效果在于：

本发明首次发现了二甲基三硫醚在防治芒果炭疽病中的应用。二甲基三硫醚可以在密闭环境中不接触水果而通过气体的作用来抑制芒果炭疽菌菌丝生长、孢子萌发及防治芒果炭疽病等芒果果实上主要的贮藏期病害，由于二甲基三硫醚本身极易挥发，熏蒸处理后残留在芒果表皮的二甲基三硫醚在常温下很容易挥发从而减少了对芒果品质的影响和对人体健康的危害。另外，本发明确定了对芒果炭疽病有抑制作用和防治效果的二甲基三硫醚的使用浓度，与现有的保鲜药剂相比，具有对防病效果好，低残留的优点，因此具有很强的开发应用前景。

附图说明

图1为球孢链霉菌在不同培养上产生的挥发性物质对芒果炭疽菌的抑菌活性；其中，(A)NA培养基，(B)LB固体培养基；(C)PDA培养基；(D)PSA培养基。

图2为人工合成的挥发性化合物对芒果炭疽病菌菌丝生长的抑制作用；其中，(A)10μL/L的二甲基三硫醚；(B)10μL/L的二甲基二硫醚；(C)100μL/L苯乙酮；(D)1000μL/Lα-蒎烯；(E)1000μL/L3-蒈烯；(F)1000μL/L苯乙醇；(G)1000μL/L月桂烯；(H)对照。

图3为二甲基三硫醚对芒果胶胞炭疽菌分生孢子存活的影响，利用二乙酸荧光素(FDA)和碘化丙啶(PI)染色，活细胞发黄绿色荧光，死细胞发红色荧光。芒果胶胞炭疽菌分生孢子在10μL/L二甲基三硫醚处理24h后，荧光显微镜下(A)和自然光下(B)的显微照片。图中标尺为10μm。

图4为二甲基三硫醚对芒果炭疽病的防治效果；其中，(A)1000μL/L的二甲基三硫醚熏蒸处理；(B)100μL/L的二甲基三硫醚熏蒸处理；(C)无菌水处理对照。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

本实施例用于说明不同培养基对球孢链霉菌JK-1产生挥发性物质抑菌活性的影响。

球孢链霉菌无菌水悬浮液的制备：先将甘油保存的菌液划线接种于PDA培养基上，25℃培养7-10天，用无菌水洗下菌体，置于10mL无菌离心管，12000rpm离心10min，加入无菌水配制成10⁷cfu/mL的菌液。

球孢链霉菌JK-1挥发性物质抑菌活性的测定方法：在直径15cm，高3cm的大培养皿底部(总体积约500mL)放置四个没有盖的小培养皿底(直径6cm，高1.5cm)。其中2个小培养皿盛5mL左右的PDA培养基，并在培养皿中央接种直径5mm的炭疽菌菌丝块。另外2个小培养皿分别盛5mL左右的待测培养基(LB，NA，PDA，PSA)，并在培养基表面涂上球孢链霉菌无菌水悬浮液，在无菌操作台吹干后盖上大培养皿盖，并用封口膜密封，以不涂球孢链霉菌JK-1的培养皿为对照。在25℃的条件下培养至对照小培养皿中菌丝长满后，测量菌落直径并计算抑菌率。结果如图1所示，NA和LB培养基上产生的挥发性物质对芒果炭疽菌的抑制率分别为98.7％和65.1％，显著高于PSA和PDA培养基上产生的挥发性物质的抑菌活性(P＝0.05)。

实施例2

将不同培养基(LB、NA、PSA、PDA)分别装入容积为250mL带有橡胶塞的玻璃瓶中，在培养基凝固前加入玻璃瓶中，100mL/瓶，常规湿热灭菌后备用。按照上述方法配制球孢链霉菌菌液，用移液器分别吸取1mL的链霉菌菌液加入到不同培养基中，以无菌风吹干培养基表面的水分，以不接球孢链霉菌的培养基为对照。置于25℃-28℃条件下培养14d后，采用顶空固相微萃取气相色谱质谱联用(SPME-GC/MS)分析鉴定不同培养基产生的挥发性物质的成分。置于25℃-28℃条件下培养14d后的球孢链霉菌培养物，在40℃下平衡15min，通过隔垫插入己活化好的SPME萃取头，推出纤维头，顶空吸附40min后，插入GC-MS进样口解析5min。GC/MS操作条件：Agilent 6890N型气相色谱仪,气相色谱条件:程序升温，起始温度40℃，保持12min，以3℃/min升至108℃，保持2min，再以5℃/min升至250℃，保持5min，进样量1.0μL，进样口温度250℃，检测器温度(FID)250℃。Agilent 5975B质谱仪，质谱条件:离子源温度230e，四极杆温度150℃，离子化方式EI，电子能量70eV，质量范围为25-550AMU/sec。

结果表明，球孢链霉菌在不同培养基上培养14天后产生的挥发性物质成分如下(表1)，这些化合物分别属于烷烃、烯烃、醇类、酮类、酯类、硫化物等。链霉菌在不同培养基上均可以产生较多的土臭素，相对含量介于1％-8％之间。二甲基三硫醚，二甲基二硫醚，苯乙醇，苯乙酮，月桂烯、香橙烯等化合物只在某一种或几种培养基中检测到。由于链霉菌在NA和LB上培养产生的挥发性物质有很强的抑菌活性而PDA和PSA无抑菌活性，据此推测这些NA和LB中产生但是PDA和PSA中不产生的化合物可能是具有抑菌活性的化合物，因此选择人工合成这些比较特殊的化合物来做抑菌活性的测定。

表1顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用分析鉴定球孢链霉菌产生的挥发性物质

注：表中化合物不包括培养基对照鉴定出的挥发性化合物

实施例3

本实施例用于说明人工合成的挥发性化合物对芒果炭疽菌的抑制作用。

从球孢链霉菌鉴定出的挥发性化合物如表1所示，均从美国sigma公司订购。在直径15cm，高3cm的大培养皿中放置四个没有盖的小培养皿底；其中三个小培养皿盛5mL左右的PDA培养基，并在培养皿中央接种直径5mm的芒果炭疽菌菌丝块，另外一个小培养皿放置一片边长1cm的正方形的无菌滤纸片，在滤纸片上分别添加人工合成的挥发性化合物，立即将大培养皿用封口膜密封。每个化合物分别设4个不同浓度处理，化合物的相对含量分别为1μL/L，10μL/L，100μL/L，1000μL/L，以添加等量的无菌水为对照，每处理3个重复。在25℃的恒温条件下培养5d后，测量各小培养皿中菌落直径并计算抑制率。结果表明，测定了8种人工的挥发性化合物对芒果炭疽病菌的抑菌活性，发现二甲基三硫醚、二甲基二硫醚和苯乙酮具有较强的抑菌活性(表2，图2)，10μL/L的二甲基二硫醚、二甲基三硫醚和100μL/L的苯乙酮均能完全抑制芒果炭疽菌的菌丝生长，其中二甲基三硫醚抑菌活性最强(表2)。3-蒈烯、月桂烯、十四烷烃3种化合物只有在高浓度的情况下(1000μL/L)才对芒果炭疽菌有一定的抑菌活性，其他化合物对芒果炭疽菌无显著抑菌活性。

表2人工合成的挥发性化合物对芒果炭疽菌菌丝生长的影响

实施例4

本实施例用于说明二甲基三硫醚熏蒸对芒果炭疽菌分生孢子存活的影响。

在直径15cm，高3cm的大培养皿中放置四个没有盖的小培养皿底；其中三个小培养皿盛5mL左右的PDA培养基，并在培养基上铺玻璃纸，玻璃纸上涂布芒果炭疽菌分生孢子液，另外一个小培养皿放置一片边长1cm的正方形的无菌滤纸片，在滤纸片上分别添加不同浓度的二甲基三硫醚，立即将大培养皿用封口膜密封。二甲基三硫醚设3个不同浓度处理，相对含量分别为10μL/L，100μL/L，1000μL/L，以添加等量的无菌水为对照，每处理3个重复。在25℃的恒温条件下熏蒸24h后，收集不同处理的芒果炭疽菌分生孢子。分别将芒果炭疽病菌的分生孢子液(1×10⁶孢子/mL)与1/2体积的二乙酸荧光素(FDA，1mg/mL)和碘化丙啶(PI,0.018mg/mL)混合，在荧光显微镜下观察统计炭疽菌的孢子存活率。能够存活的孢子发黄绿色荧光，死亡的孢子发红色荧光。结果表明，二甲基三硫醚熏蒸处理后，大部分孢子发红色荧光，表明大部分孢子死亡(图3)。

实施例5

本实施例用于说明二甲基三硫醚对自然发病的芒果采后病害的防治效果。

从果园采摘颜色、大小一致芒果果实，用无菌水清洗干净，晾干后置于干燥器中的横隔上，在干燥器的底部加入挥发性化合物，立即盖上盖子并用封口膜密封。二甲基三硫醚设3个不同浓度处理，化合物的相对含量分别为10μL/L，100μL/L，1000μL/L，以添加等量的无菌水为对照，每处理3个重复。置于25℃熏蒸5d后，打开干燥器的盖子，让挥发性化合物挥发后，重新放入新的干燥器中继续观察，在处理后第10d统计果实发病率。结果发现100μL/L二甲基三硫醚对芒果采后炭疽病具有明显的防病效果，防效可达77.8％。1000μL/L二甲基三硫醚对芒果采后炭疽病的防效为94.4％(图4)。本研究结果表明，挥发性化合物二甲基三硫醚通过熏蒸作用可以有效的抑制芒果炭疽病的发生，具有开发成为防治贮藏期病害的熏蒸剂的潜能。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (6)

1.二甲基三硫醚在防治芒果炭疽病中的应用，其特征在于，利用二甲基三硫醚对采后的芒果进行熏蒸处理。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述熏蒸处理中，二甲基三硫醚的浓度为10～1000μL/L。

3.二甲基三硫醚在制备防治芒果炭疽病的药剂中的应用，其特征在于，利用二甲基三硫醚制备熏蒸剂或其前体物质。

4.球孢链霉菌在防治芒果炭疽病中的应用，其特征在于，将球孢链霉菌在NA培养基中培养，收集培养物中的二甲基三硫醚。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述培养条件为25℃-28℃，光照培养10～14d。

6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述球孢链霉菌为球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)JK-1，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2010093。