CN113234635B - 一种用于防治辣椒立枯病的复合微生物菌剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于防治辣椒立枯病的复合微生物菌剂，所述菌剂包含娄彻氏链霉菌ACCC19748、长枝木霉ACCC32522和恶臭假单胞菌ACCC BCBKL 0060；本发明涉及的复合微生物菌剂对辣椒立枯病防治效果优良，有效降低了辣椒立枯病的发病率，并且具有一定的生根壮苗作用。

Description

一种用于防治辣椒立枯病的复合微生物菌剂
技术领域
本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及一种用于防治辣椒立枯病的复合微生物菌剂。
背景技术
我国是辣椒的种植大国，全国各地均有栽培。随着加工辣椒栽培面积的扩大和栽培方式的多样化，病害问题日趋复杂和严重，导致辣椒减产和品质变劣从而限制了辣椒产业的可持续发展。辣椒受侵染的病害种类多，危害大。据不完全统计，全世界已知辣椒病害有60余种，中国有40余种，造成严重损失的有10余种。辣椒苗期主要有立枯病、猝倒病、菌核病、白绢病及生理性沤根。
辣椒立枯病是由立枯丝核菌(Rizoctonia solani)侵染引起的一种重要苗期土传病害，一般发生在辣椒真叶出现以后、开花结果以前，严重时也能使种子腐烂。幼苗白天萎蔫，夜间恢复，反复几天以后，枯萎死亡。茎基部生椭圆形、暗褐色病斑，略凹陷，扩大到茎基部周围，病部收缩干枯，叶色变黄凋萎，根变褐腐烂，直至全株死亡，由于本病发生在木栓化以后，一般不倒伏，立枯病因此而得名，湿度高时，病部生褐色稀疏的蛛网状霉(此可与猝倒病区别)。
近年来，随着辣椒种植面积的扩大、复种指数的提高，辣椒立枯病的发生和危害日益加重，一般田块死株率为15％～20％，严重时高达70％以上，常造成毁种重播，严重制约了蔬菜产业发展。目前蔬菜立枯病的防治一般采用霉灵、代森锌、五氯硝基苯等化学农药。农药、化肥的使用，虽然大幅度提高了农作物产量，满足了对农产品数量的要求，但同时带来农副产品有害物质超标、质量下降、生态破坏和环境污染等问题，严重影响了食物安全和人类自身健康。所以寻找抗性风险低、环境相容性好的生防菌剂已经成为防治辣椒立枯病的一条重要途径。现有菌剂多为广谱抑菌菌剂，针对辣椒立枯病的效果不佳或不稳定。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种用于防治辣椒立枯病的复合微生物菌剂。
本发明的技术方案如下：
一种用于防治辣椒立枯病的复合微生物菌剂，所述菌剂包含娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)ACCC19748、长枝木霉ACCC32522(Trichoderma longibrachiatum)和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)ACCC BCBKL 0060；
所述娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)ACCC19748、长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)ACCC32522和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)ACCC BCBKL 0060均购自中国农业微生物菌种保藏管理中心。
根据本发明优选的，上述复合微生物菌剂，按重量份计包括娄彻氏链霉菌20～30份、长枝木霉20～30份、恶臭假单胞菌10～20份。
根据本发明优选的，所述娄彻氏链霉菌、长枝木霉、恶臭假单胞菌的质量比为20:20:20。
根据本发明优选的，上述复合微生物菌剂每克含有有效活菌数≥35亿个。
上述复合微生物菌剂的制备方法，包括步骤如下：
(1)将娄彻氏链霉菌ACCC19748接种于改良高氏一号固体养基，在25～35℃条件下培养36～48h，加入无菌水调整孢子浓度到108个/mL，然后按5～10wt％接种于固体发酵培养基A中，在25～38℃培养4～6天，制得含有娄彻氏链霉菌ACCC19748有效活菌数20～50亿/g的固体菌剂A；
(2)将长枝木霉ACCC32522接种于PDA固体培养基，在30～35℃条件下固体培养30～50h，加入无菌水调整孢子浓度到108个/mL，然后按7～15wt％的接种量将长枝木霉接种于固体培养基B中，在25～35℃培养5～7天，制得含有长枝木霉ACCC32522有效活菌数10～30亿/g的固体菌剂B；
(3)将恶臭假单胞菌ACCC BCBKL 0060接种于LB液体培养基，在25～30℃条件下，经摇瓶培养24～36h，制得液体种子，将制得的液体种子按照体积分数5％～10％接种于液体发酵培养基C中，调控pH值至6.5～7.5、通气比为1:(0.5～1)、转速150～250转/分，在23～33℃培养24～36h，制得菌液，将菌液与麦饭石按质量比1:1混合经闪蒸干燥制得含有恶臭假单胞菌ACCC BCBKL 0060有效活菌数50～80亿/g的固体菌剂C，所述麦饭石的目数为400～600目；
(4)将固体菌剂A、固体菌剂B和固体菌剂C混合均匀，制得复合微生物菌剂。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中的固体培养基A的重量组份包括如下：
芦苇末400～600份，马铃薯粉100～300份，豆饼粉400～700份，葡萄糖200～300份，甘油20～50份，磷酸二氢钾5～10份，MgSO4·7H2O 4～6份，水800～1000份，pH 5.5～6.5。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中的固体培养基B的重量组份包括如下：
麸皮粉200～400份，玉米面500～700份，稻壳粉200～300份，牛粪100～200份，蛭石200～300份，过磷酸钙10～15份，水1000～1700份，pH 6.0～6.5。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中的液体培养基C的每升组分如下：
玉米粉10～15g，葡萄糖5～10g，海藻粉5～10g，鱼粉10～15g，氯化钠5～10g，硫酸镁0.1～0.25g，硫酸锰0.1～0.25g，硝酸钾1～2g，硫酸亚铁0.1～0.2g，碳酸钙0.5～1g余量水，调整pH值6.5～7.5。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中，按重量份计将固体菌剂A 20～30份、固体菌剂B20～30份和固体菌剂C10～20份混合均匀，制得复合微生物菌剂。
进一步优选的，所述步骤(4)中，按重量份计将固体菌剂A 20份、固体菌剂B 20份和固体菌剂C 20份混合均匀，制得复合微生物菌剂。
上述复合微生物菌剂应用于防治辣椒立枯病和/或增加辣椒的产量。
上述改良高氏一号固体培养基、LB液体培养基和PDA固体培养基均为本领域常用培养基，改良高氏一号固体培养基组分如下：
硝酸钾1g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.5g，硫酸亚铁0.01g，氯化钠0.5g，可溶性淀粉20g，琼脂15g，加热溶解于1000ml蒸馏水中，分装灭菌；
LB液体培养基组分如下：
酵母膏5g，蛋白胨10g，NaCl 10g，加蒸馏水至1000ml，用NaOH和HCl调节pH7.0～7.2，分装灭菌；
PDA固体培养基组分如下：
马铃薯汁1000ml，葡萄糖20g，琼脂20g，溶化后分装灭菌。
有益效果
本发明涉及的复合微生菌剂可以有效防治辣椒立枯病，适应性强，效果稳定，同时还可以刺激作物生长，有效改善辣椒的品质，增加了种植户的经济收益；同时还可以调整土壤菌群平衡，改善土壤环境，促进氮磷钾的利用率。
具体实施方法
下面结合实施例对本发明做进一步阐述，但本发明所保护的范围不限于此。
实施例中未详加说明的内容均按本领域现有技术。
微生物材料来源
实施例中所述娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)ACCC19748、娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)ACCC41433、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)ACCC32522、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)ACCC31615、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)ACCC BCBKL 0060和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)ACCC19237均购自中国农业微生物菌种保藏管理中心。
实施例1
防治辣椒立枯病的复合微生物菌剂的制备方法，步骤如下：
(1)将娄彻氏链霉菌ACCC19748接种于改良高氏一号固体养基，在30℃条件下培养48h，加入无菌水调整孢子浓度到108个/mL，然后按7wt％接种于固体发酵培养基A中，在30℃培养5天，制得含有娄彻氏链霉菌ACCC19748有效活菌数40亿/g的固体菌剂A；
(2)将长枝木霉ACCC32522接种于PDA固体培养基，在33℃条件下固体培养48h，加入无菌水调整孢子浓度到108个/mL，然后按10wt％的接种量将长枝木霉接种于固体培养基B中，在30℃培养7天，制得含有长枝木霉ACCC32522有效活菌数30亿/g的固体菌剂B；
(3)将恶臭假单胞菌ACCC BCBKL 0060接种于LB液体培养基，在28℃条件下，经摇瓶培养24h，制得液体种子，将制得的液体种子按体积分数7％接种量接种于液体发酵培养基C中，调控pH值至7.0、通气比为1:0.75、转速180转/分，在30℃培养36h，制得菌液，将菌液与麦饭石按质量比1:1混合闪蒸干燥制得含有恶臭假单胞菌ACCC BCBKL 0060有效活菌数60亿/g的固体菌剂C，所述麦饭石的目数为400目；
(4)取20重量份步骤(1)制得的固体菌剂A、20重量份步骤(2)制得的固体菌剂B、10重量份步骤(3)制得的固体菌剂C进行混合，制得复合微生物菌剂。
所述固体培养基A的重量组份包括如下：
芦苇末60kg，马铃薯粉20kg，豆饼粉60kg，葡萄糖20kg，甘油2kg，磷酸二氢钾1kg，MgSO4·7H2O 0.5kg份，水90kg份，pH 6.0。
所述固体培养基B的重量组份包括如下：
麸皮粉30kg，玉米面50kg，稻壳粉30kg，牛粪20kg份，蛭石20kg，过磷酸钙1kg，水140kg份，pH 6.0。
所述液体培养基C的每升组分如下：
玉米粉10g，葡萄糖8g，海藻粉6g，鱼粉15g，氯化钠7g，硫酸镁0.1g，硫酸锰0.25g，硝酸钾2g，硫酸亚铁0.1g，碳酸钙1g，余量水，调整pH值7.0。
经检测每克复合微生物菌剂含有：娄彻氏链霉菌ACCC19748有效活菌数16亿/g、长枝木霉ACCC32522有效活菌数12亿/g、恶臭假单胞菌ACCC BCBKL 0060有效活菌数12亿/g，总有效活菌数40亿/g
实施例2
采用如实施例1所述的方法，不同之处在于，按重量份计将步骤(4)中固体菌剂A30份、固体菌剂B 20份、固体菌剂C10混合。
制得的用于防治辣椒立枯病的复合微生物菌剂中，每克复合微生物菌剂含有：娄彻氏链霉菌ACCC19748有效活菌数20亿/g、长枝木霉ACCC32522有效活菌数10亿/g、恶臭假单胞菌ACCC BCBKL 0060有效活菌数10亿/g，总有效活菌数40亿/g
实施例3
采用如实施例1所述的方法，不同之处在于，按重量份计将步骤(4)中固体菌剂A30份、固体菌剂B 30份、固体菌剂C10份混合。
制得的用于防治辣椒立枯病的复合微生物菌剂中，每克复合微生物菌剂含有：娄彻氏链霉菌ACCC19748有效活菌数17亿/g、长枝木霉ACCC32522有效活菌数12亿/g、恶臭假单胞菌ACCC BCBKL 0060有效活菌数8.5亿/g，总有效活菌数37.5亿/g
实施例4
采用如实施例1所述的方法，不同之处在于，按重量份计将步骤(4)中固体菌剂A30份、固体菌剂B 30份、固体菌剂C 20份混合。
制得的用于防治辣椒立枯病的复合微生物菌剂中，每克复合微生物菌剂含有：娄彻氏链霉菌ACCC19748有效活菌数15亿/g、长枝木霉ACCC32522有效活菌数11亿/g、恶臭假单胞菌ACCC BCBKL 0060有效活菌数15亿/g，总有效活菌数41亿/g
实施例5
采用如实施例1所述的方法，不同之处在于，按重量份计将步骤(4)中固体菌剂A20份、固体菌剂B 20份、固体菌剂C 20份混合。
制得的用于防治辣椒立枯病的复合微生物菌剂中，每克复合微生物菌剂含有：娄彻氏链霉菌ACCC19748有效活菌数13亿/g、长枝木霉ACCC32522有效活菌数10亿/g、恶臭假单胞菌ACCC BCBKL 0060有效活菌数20亿/g，总有效活菌数43亿/g
对比例1
与实施例5不同之处在于所述复合微生物菌剂中不添加娄彻氏链霉菌ACCC19748。
对比例2
与实施例5不同之处在于所述复合微生物菌剂中不添加长枝木霉ACCC32522。
对比例3
与实施例5不同之处在于所述复合微生物菌剂中不添加恶臭假单胞菌ACCC BCBKL0060。
对比例4
与实施例5不同之处在于所述复合微生物菌剂中不添加娄彻氏链霉菌ACCC19748而是添加同样方法制备的，有效活菌数相同的娄彻氏链霉菌ACCC41433。
对比例5
与实施例5不同之处在于所述复合微生物菌剂中不添加长枝木霉ACCC32522而是添加同样方法制备的，有效活菌数相同的长枝木霉ACCC31615。
对比例6
与实施例5不同之处在于所述复合微生物菌剂中不添加加恶臭假单胞菌ACCCBCBKL 0060而是添加同样方法制备的，有效活菌数相同的恶臭假单胞菌ACCC19237。
应用例
将实施例1-5与对比例1-6制备的复合微生物菌剂在江苏淮安辣椒立枯病较为严重的蔬菜大棚进行效果验证，分别应用种植辣椒、番茄和黄瓜。复合微生物菌剂与苗土按重量份1:50的比例混合均匀，每亩菌剂用量20kg，不施菌剂做空白组对照。育苗65天后随机选取5点，每点2m2对发病率进行统计(发病率＝立枯病发病株数/总统计株数×100％)，辣椒立枯病发病率统计结果见表1，辣椒形态学指标统计结果见表2，辣椒统计产量结果见表3，番茄立枯病发病率统计结果见表4。黄瓜立枯病发病率统计结果见表5。
表1辣椒抗立枯病效果分析表
Figure BDA0003094001390000061
表2辣椒形态学指标分析表
Figure BDA0003094001390000062
表3辣椒产量分析表
Figure BDA0003094001390000063
表4番茄抗立枯病效果分析表
Figure BDA0003094001390000071
表5黄瓜抗立枯病效果分析表
Figure BDA0003094001390000072
由上述实验结果可以看出，本发明涉及的复合微生物菌剂对辣椒立枯病防治效果优良，有效降低了辣椒立枯病的发病率，并且具有一定的生根壮苗作用；复合微生物菌剂的菌种组成与其他菌种组成的复合微生物菌剂相比，产生一定的协同作用；本发明涉及的复合微生物菌剂对防治辣椒立枯病的作用最显著，具有一定的特异性，对防治番茄立枯病的作用效果一般，对黄瓜立枯病的作用效果几乎没有，可能是因为引起辣椒立枯病的病原菌与引起番茄立枯病及黄瓜立枯病的病原菌不同；也有可能是因为本发明涉及复合微生物菌剂在不同植物根部的富集代谢情况不同所产生的效果不同；也有可能是因为本发明涉及复合微生物菌剂在不同植物的内生情况不同造成植物抗病能力的差异。
由表1与表4及表5中对比例5与对比例2及对比例6与对比例3使用效果的发病率可以看出，并不是简单的微生物组成种类越多，所起的作用效果越好，而是需要特定组合的微生物种类组成才可以产生一定的协同作用。

Claims (6)

1.一种用于防治辣椒立枯病的复合微生物菌剂，其特征在于，所述菌剂包含娄彻氏链霉菌ACCC19748、长枝木霉ACCC32522和恶臭假单胞菌ACCC BCBKL 0060；
所述复合微生物菌剂，按重量份计包括娄彻氏链霉菌20～30份、长枝木霉20～30份、恶臭假单胞菌10～20份；
所述复合微生物菌剂每克含有有效活菌数≥35亿个。
2.如权利要求1所述的复合微生物菌剂，其特征在于，所述娄彻氏链霉菌、长枝木霉、恶臭假单胞菌的质量比为20:20:20。
3.权利要求1-2任一项所述的复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将娄彻氏链霉菌ACCC19748接种于改良高氏一号固体养基，在25～35℃条件下培养36～48h，加入无菌水调整孢子浓度到108个/mL，然后按5~10 wt %接种于固体发酵培养基A中，在25～38℃培养4～6天，制得含有娄彻氏链霉菌ACCC19748有效活菌数20～50亿/g的固体菌剂A；
（2）将长枝木霉ACCC32522接种于PDA固体培养基，在30～35℃条件下固体培养30～50h，加入无菌水调整孢子浓度到108个/mL，然后按7~15wt%的接种量将长枝木霉接种于固体培养基B中，在25～35℃培养5~7天，制得含有长枝木霉ACCC32522有效活菌数10～30亿/g的固体菌剂B；
（3）将恶臭假单胞菌ACCC BCBKL 0060接种于LB液体培养基，在25～30℃条件下，经摇瓶培养24～36h，制得液体种子，将制得的液体种子按体积分数5%~10%接种于液体发酵培养基C中，调控pH值至6.5～7.5、通气比为1:(0.5～1)、转速150～250转/分，在23～33℃培养24～36h，制得菌液，将菌液与麦饭石按质量比1:1混合闪蒸干燥制得含有恶臭假单胞菌ACCC BCBKL 0060有效活菌数50～80亿/g的固体菌剂C，所述麦饭石的目数为400-600目；
（4）将固体菌剂A、固体菌剂B和固体菌剂C混合均匀，制得复合微生物菌剂；
所述步骤（1）中的固体培养基A的重量组份包括如下：
芦苇末400～600份，马铃薯粉100～300份，豆饼粉400～700份，葡萄糖200～300份，甘油20～50份，磷酸二氢钾5～10份，MgSO4·7H2O 4～6份，水800～1000份，pH 5.5~6.5；
所述步骤（2）中的固体培养基B的重量组份包括如下：
麸皮粉200～400份，玉米面500～700份，稻壳粉200～300份，牛粪100～200份，蛭石200～300份，过磷酸钙10～15份，水1000～1700份，pH 6.0~6.5；
所述步骤（3）中的液体培养基C的每升组分如下：
玉米粉10～15g，葡萄糖5～10g，海藻粉 5～10g，鱼粉 10～15g，氯化钠5～10g，硫酸镁0.1～0.25g，硫酸锰0.1～0.25g，硝酸钾1～2g，硫酸亚铁0.1～0.2g，碳酸钙0.5～1g余量水，调整pH值6.5～7.5。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中，按重量份计将固体菌剂A 20～30份、固体菌剂B 20～30份和固体菌剂C 10～20份混合均匀，制得复合微生物菌剂。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中，按重量份计将固体菌剂A 20份、固体菌剂B 20份和固体菌剂C 20份混合均匀，制得复合微生物菌剂。
6.权利要求1-2任一项所述复合微生物菌剂应用于防治辣椒立枯病和/或增加辣椒的产量。
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