WO2007097374A1 - γ-アミノ酪酸生産能を有する乳酸菌 - Google Patents

γ-アミノ酪酸生産能を有する乳酸菌 Download PDF

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Yoshiki Hanya
Itsuo Sato
Ryo Shimojo
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    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus

Definitions

  • the present invention relates to a lactic acid bacterium belonging to the genus Lactobacillus, which can produce y-aminobutyric acid (hereinafter referred to as "GABA") even under conditions where lactic acid is present in the medium at the start of the culture, and further using the same.
  • GABA y-aminobutyric acid
  • the present invention relates to a method for producing a culture containing ⁇ -aminobutyric acid.
  • GABA is an amino acid that is currently attracting attention because of its physiological effects such as blood pressure lowering action, diuretic action, and tranquilizing action, but foods containing GABA are limited to some vegetables, tea, rice, etc. Because of its low content, GA BA production method using GABA-fermenting lactic acid bacteria has been proposed several times (see, for example, Patent Documents 1 to 3).
  • GABAA-producing lactic acid bacteria include Lactobacillus 'Hilgardi, Ratatococcus', Lactis 'Subspecies' Cremolis, Ratatococcus 'Lactis' Subspecies Lacteis, Enterococcus 'Casery Flabus, Lactobacillus' brevis, Lactobacillus plantarum, Streptococcus 'Samophilus is known, and has the ability to produce GABA from L-glutamic acid or L-glutamate by decarboxylation.
  • Patent Document 1 JP 2000-210075 A
  • Patent Document 2 JP-A-2004-215529
  • Patent Document 3 Japanese Patent Laid-Open No. 2005-102559
  • Patent Document 4 Japanese Patent No. 3426157
  • Patent Document 5 Japanese Patent No. 2704493
  • An object of the present invention is to provide a lactic acid bacterium capable of producing GABA under conditions where lactic acid and salt coexist in the medium at the start of culture, and to provide a method for producing a culture containing GABA. It is in.
  • the present invention relates to the following (1) to (4).
  • a lactic acid bacterium belonging to the genus Lactobacillus that can produce ⁇ -aminobutyric acid under the condition that 1 to 4% lactic acid and 8 to 12% sodium chloride coexist in the culture medium at the start of culture.
  • ⁇ -aminobutyric acid containing characterized in that the lactic acid bacterium according to any one of the above (1) to (3) is inoculated into a medium containing L glutamic acid and Z or a salt thereof, and cultured.
  • a method for producing a culture characterized in that the lactic acid bacterium according to any one of the above (1) to (3) is inoculated into a medium containing L glutamic acid and Z or a salt thereof, and cultured.
  • FIG. 1 shows Lactobacillus reni-KG34, KG43, Sl, KG31, KG64, KG-18
  • the lactic acid bacterium according to the present invention is a strain belonging to the genus Lactobacillus, and for example, a lactic acid bacterium with isolated soy sauce mash can be used.
  • the lactic acid bacterium of the present invention has the ability to produce GABA under conditions where lactic acid and salt coexist in the culture medium at the start of culture, and under conditions where lactic acid coexists with 1 to 4% and sodium chloride with 8 to 12%. GABA can be produced.
  • the lactic acid bacterium is Lactobacillus reni-KG, for example, Lactobacillus reni-KG 34 strain or Lactobacillus reni-KG43 strain.
  • Lactobacillus renii-KG34 strain is incorporated into the National Institute of Technology and Evaluation (NITE) Patent Microorganisms Depositary Center (NPMD) (zip code 292— 0818 Kisarazu Kisarazu, Kazusa Kamashisa 2-5-8) Deposited domestically on February 7, 2006 (Accession Number NITE P—177) and transferred to an international deposit on September 1, 2006 under the Budapest Treaty (Accession Number NITE BP—177).
  • NITE National Institute of Technology and Evaluation
  • NITE Product Evaluation Technology Foundation
  • NPMD Patent Deposit Microorganism Depositary Center
  • Lactic acid bacteria are isolated from soy sauce moromi by the following method. That is, 25 g of soy sauce moromi was treated with a stomacher, and the resulting juice was placed in a MRS-SOYTONE medium (5.5% MRS broth, 0.5% butatosoton, 0.5% sodium glutamate, 8% salt, Add an appropriate amount to 5% food-added lactic acid pH 5.1) and incubate at 30 ° C.
  • MRS-SOYTONE medium 5.5% MRS broth, 0.5% butatosoton, 0.5% sodium glutamate, 8% salt
  • the culture medium in which the generation of gas is confirmed in the Durham tube is appropriately diluted with MRS-SOYTONE medium, and further applied to MRS-SOYTONE agar medium, and put in Aneropack Kenki (Mitsubishi Gas Chemical Co., Ltd.) 30 Incubate at ° C for 7 days. The resulting single colony is again inoculated into the MRS-SOYTONE medium containing the Durham tube, and the bacteria that have been confirmed to generate gas are selected.
  • Lactobacillus lactobacilli of the present invention Lactobacillus lactobacilli of the present invention. Renini KG3 4, KG43, Sl, KG31, KG6 4, KG-18-4, KG4-14-1 16S rDNA (16S rDNA gene) of the entire nucleotide sequence was determined by the following method.
  • Gen Torukun TM for yeast
  • Gen Torukun TM for yeast
  • Takara Thermal Cycler MP was used for the thermal cycler
  • ABI Prism 377DNA Sequencer (Applied Biosystems) was used for the DNA sequencer.
  • the nucleotide sequences of the obtained 16S rDNAs are shown in SEQ ID NOs: 1 and 2, respectively.
  • the obtained 16S rDNA nucleotide sequence was searched for homology with species considered to be closely related to the present bacterium, and the 16S rDNA nucleotide sequence with the related species was used to determine the molecular system And examined related species and belonging taxon.
  • this strain showed the highest homology (about 99.5%) with the 16S rDNA sequence of Ratatobacillus renii, and formed the same cluster as Lactobacillus renii in the phylogenetic tree. From this result, this bacterium was determined to be Ratatobacillus renii.
  • the produced strain is shown in Fig. 1.
  • the lactic acid bacterium of the present invention has the ability to produce L-glutamic acid or dartrate strength GABA in the absence of sodium chloride or lactic acid.
  • 1- 4% lactic acid and 8- GABA can be produced even in the presence of 12% sodium chloride (see Example 2).
  • GABA can be produced under conditions where 0 to 4% lactic acid and 0 to 12% dietary salt coexist in the medium except at the beginning of the culture.
  • the method for producing a GABA-containing culture of the present invention comprises inoculating and culturing a lactic acid bacterium having the above properties in a medium containing L-glutamic acid and Z or a salt thereof to produce a culture containing GABA.
  • the lactic acid bacteria used in the present invention are isolated and cultured from soy sauce moromi and subcultured, but the same type of lactic acid bacteria contained in soy sauce moromi may be used as is or newly isolated. It may be.
  • freeze-dried cells Either a cryopreserved strain or a liquid culture solution may be used.
  • the medium used in the present invention must contain glutamic acid in order to produce GABA.
  • the glutamic acid contained in the medium is preferably L-glutamic acid, which is a kind of amino acid, but it is a food additive with a use as a seasoning, such as glutamic acid, sodium glutamate, other glutamates, Any of glutamic acids obtained by hydrolyzing food proteins with acids or enzymes may be used.
  • foods containing free glutamic acid such as seasonings, marine products, and tomatoes may be used as they are.
  • the medium used in the present invention contains sugars such as glucose, fructose and maltose, and vitamins and minerals such as yeast extract and meat extract in addition to the aforementioned glutamic acid for the growth of lactic acid bacteria. It is preferable to contain one or more foods or potatoes and potato digests. Furthermore, food additives such as emulsifiers, stabilizers and pH adjusters may be used. Examples of koji and koji digests that can be used in the medium include wheat, barley, rye, wheat, pressed wheat, quinoa, koji, koji, kaki, rice, corn, and other grains, soybeans, red beans, and beans.
  • Inoculation with lactic acid bacteria in the present invention involves the above-described GABA producing ability of Lactobacillus reni in a medium containing a glutamic acid source, sodium chloride, and a sugar source at 25 to 35 ° C, 48 to 96.
  • the seed lactic acid bacteria cultured at the initial pH 4.0 to 7.0 are inoculated to about 1 Ziooo to iZio volume with respect to the volume of the main culture medium.
  • an apparatus that can be used for culturing can be washed or heat-sterilized and has a hygienic structure that is free from contamination by germs, regardless of size and material, as long as it can be used for food production.
  • the culture condition is that the culture temperature is 20 to 40 ° C, preferably 25 to 35 ° C, and the initial pH is 4.0 to 7.0 because of the bacteriological properties of lactic acid bacteria (see Table 1).
  • target glutamate sources such as L-glutamic acid and Z or its salts are targeted. Although it is necessary to carry out for a sufficient period so that it can convert to GABA density
  • a GABA-containing culture having a wide range of uses as a raw material for processed foods and the like can be obtained.
  • the GABA-containing culture obtained by the method of the present invention can be used as a GABA-enhancing raw material as it is added to various seasonings and foods and drinks.
  • the GABA content can be further increased by processing steps such as pressing, filtration, concentration, and drying, and then used for IJ.
  • the filtration step can be performed using normal food processing squeezing and filter equipment using filter paper, filter cloth, etc., and food filter aids such as diatomaceous earth, cellulose, and activated carbon can be used.
  • equipment such as a vacuum concentrator, a vacuum concentrator, a distillation still, and a freeze concentrator can be used, and a method of simply evaporating water in the culture by heating can be used.
  • the drying step it is preferable to perform spray drying or freeze drying by an efficient and hygienic method.
  • a method such as liquid chromatography can be used in addition to the above steps.
  • liquid or powdery foods containing GABA can be obtained, and these can be blended into various foods or subjected to secondary processing. Seasonings and foods and drinks with enhanced GABA can be easily obtained.
  • the components normally used in foods such as excipients, sweeteners, thickeners, proteins, peptides, lipids, polysaccharides, carbohydrates, and salts can be included.
  • the obtained culture, the seasoning liquid containing the culture, and the GABA content in the food and drink were measured using analytical instruments such as high performance liquid chromatography and amino acid measuring instruments, and enzymes.
  • the analysis can be performed using the analysis reagent used.
  • MRS-S OYTONE medium (5.5% MRS broth, 0.5% knot soyton, 0.5% sodium glutamate, 8% salt, 5%)
  • a suitable amount of lactic acid for food addition pH 5.1) was added and static culture was performed at 30 ° C.
  • the culture medium in which gas generation has been confirmed in the Durham tube is appropriately diluted with MRS-SOYTONE medium, then applied to MRS-SO YTONE agar medium, and placed in Aneropack Kenki (Mitsubishi Gas Chemical Co., Ltd.) 30 ° C. cultured for 7 days.
  • the obtained single colony was again inoculated into MRS-SOYTONE medium containing a Durham tube, and GABA was measured for a sample in which gas generation was confirmed.
  • Bacteria isolated from the same source were identified by the RAPD method so that the same bacteria were not selected more than once.
  • GABA was measured with Hitachi High Speed Amino Acid Analyzer L-8800.
  • KG34, KG43, Sl, KG31, KG64, KG-18-4, and KG4-14-1 were producing GABA.
  • the physiological properties of the KG34 and KG43 strains are shown in Table 1, and the 16S rDNA sequences of the KG34 and KG43 strains are shown in SEQ ID NOs: 1 and 2.
  • the 16S rDNA sequences of strains KG34 and KG43 were 100% correct.
  • MRS Soytone medium with Durham tube (5.5% MRS broth, 0.5% Soytone, 0.5% sodium glutamate, pH 5.1), 8% and 12% salt, dietary lactic acid KG34, KG43, Sl, KG31, KG64, KG— in the presence of dietary salt and acidity S in the medium at the start of culture, using medium with 0%, 1% and 4% The GABA productivity of 18-4 and KG4-14-1 strains was confirmed. Table 2 shows the results of comparison with known GABA-producing lactobacilli.
  • La. 1 act is subs p. Cremori s NBRC 100b lb
  • La. Lactis s s K K K Kubsp.lac t is NBRC 12007
  • Cultivation solution of Candida famata km-1 (FERM P—8897) for 36 hours with aeration and stirring (medium composition: glucose 6) %, Yeast extract 1%, phosphate 1% rhodium phosphate 0.1%, magnesium sulfate 0.1%, ⁇ 5.5, culture temperature 30. Add 5ml of C) 50. Degradation of gnoretene and conversion of glutamine produced by degradation to glutamic acid for 24 hours were carried out with C.

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Abstract

　本発明は、培養開始時の培地中に乳酸と食塩が共存する条件下でもγ-アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を生産することができる乳酸菌、並びにＧＡＢＡを含有する培養物の製造方法を提供する。具体的には、培養開始時の培地中に乳酸と食塩が共存する条件下でもＧＡＢＡ生産能を有する乳酸菌ラクトバチルス・レニニを醤油諸味から単離し、この乳酸菌をＬ－グルタミン酸および／またはその塩類を含有する培地に接種し、培養を行うことにより、ＧＡＢＡ含有培養物を得ることができる。

Description

明 細 書
7 -ァミノ酪酸生産能を有する乳酸菌
技術分野
[0001] 本発明は、培養開始時の培地中に乳酸が存在する条件下でも y -ァミノ酪酸 (以下 「GABA」という）を生産することができるラクトバチルス属に属する乳酸菌、さらにこれ を用いた γ -ァミノ酪酸を含有する培養物の製造方法に関する。
背景技術
[0002] GABAは血圧降下作用、利尿作用、精神安定作用などの生理効果があることから 、現在注目されているアミノ酸であるが、 GABAを含む食品は一部の野菜やお茶、 米などに限られており、含量も少ないことから、 GABA発酵性乳酸菌を利用した GA BA製造方法力 Sいくつカゝ提案されている (例えば、特許文献 1〜3参照)。これら GAB A生産乳酸菌としては、ラクトバチルス 'ヒルガルディ、ラタトコッカス'ラクテイス 'サブ スピーシーズ 'クレモリス、ラタトコッカス'ラクテイス'サブスピーシーズ ·ラクテイス、ェ ンテロコッカス'カゼリフラバス、ラクトバチルス 'ブレビス、ラクトバチルス ·プランタラム 、ストレプトコッカス 'サ一モフィラスなどが知られており、 L—グルタミン酸もしくは L グルタミン酸塩から、脱炭酸反応により GABAを生産する能力を持っている。
[0003] しかし、これらの乳酸菌はホエーパウダー、脱脂乳、カゼイン、ペプトンなどの高価 な成分を培地に必要とし、コスト面力 の生産性が良くない (例えば、特許文献 1また は 4参照)。また、安価な材料である醤油麹やダルテンを酸で分解あるいは酵素、麹 で分解し、溶出したグルタミンをダルタミナーゼによりグルタミン酸に変換させたものを 培地とする場合は、中和で発生する食塩や酵素分解時に汚染対策として添加する 食塩が乳酸菌の GABA生産を阻害してしまう。耐塩性 GABA生産乳酸菌も 、くつか 報告されているが、 GABA発酵至適食塩濃度が 12. 5〜18%と非常に高塩である（ 例えば、特許文献 5参照)。生活習慣病にならないよう、減塩を心がける食生活が推 進されていることを考えると、高食塩含有食品や調味料は望ましいものではない。ま た、 GABAには血圧降下作用を期待する面があり、これと高濃度食塩を組み合わせ ることは本来の意味を失ってしまう。 [0004] 以上のことから、乳酸菌による GABA生産には麹やダルテンのような安価な材料を 低塩で分解して使用することが理想的ではあるが、低塩では野生菌による汚染が問 題となる。汚染は培養初期の段階で起こり、その結果アルコールが生産されたり PH が低下してしまうと、 GABA生産乳酸菌の生育が阻害され、目的の GABAが充分量 得られない。これら低塩での野生菌による汚染を防ぐための手段として、食品の防腐 剤として一般によく利用されるエタノール、酢酸、乳酸を利用する方法がある力 エタ ノール、酢酸は汚染菌も抑制するが GABA生産乳酸菌も抑制してしまう。一方、乳酸 菌は自ら乳酸を作るため、乳酸に対して他の菌よりも耐性が高い。
[0005] そこで、我々は乳酸を防腐剤として利用することを考えたが、食塩存在下で培養開 始時に乳酸を添加すると GABA生産乳酸菌は生育できない、あるいは生育するもの の GABA生産を行わなくなってしまうことが新たな問題として浮上した。
[0006] 特許文献 1：特開 2000— 210075号公報
特許文献 2 :特開 2004— 215529号公報
特許文献 3 :特開 2005— 102559号公報
特許文献 4：特許第 3426157号公報
特許文献 5：特許第 2704493号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 本発明の課題は、培養開始時の培地中に乳酸と食塩が共存する条件下で GABA 生産が可能な乳酸菌を提供すること、並びに GABAを含有する培養物の製造方法 を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明者等は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、培養開始時 力 乳酸と食塩が共存する状態でも GABAを生産することができる乳酸菌を醤油諸 味から単離し、これを利用することで問題を解決できることを見出し、本発明を完成し た。
すなわち、本発明は以下の（1)〜 (4)に関する。
(1)培養開始時の培地中に乳酸と食塩が共存する条件下で γ -ァミノ酪酸を生産す ることができるラクトバチルス属に属する乳酸菌。
(2)培養開始時の培地中に乳酸が 1〜4%、食塩が 8〜12%共存する条件下で γ - ァミノ酪酸を生産することができるラクトバチルス属に属する乳酸菌。
(3)乳酸菌がラクトバチルス ·レニ- (Lactobacillus rennini)である上記（1)または (2)記載の乳酸菌。
(4)上記（1)〜（3)のいずれか 1項に記載の乳酸菌を L グルタミン酸および Zまた はその塩類を含有する培地に接種し、培養を行うことを特徴とする γ -ァミノ酪酸含有 培養物の製造方法。
発明の効果
[0009] 本発明によれば、安価な材料を用い、野性菌に発酵を阻害されることなぐ安定に GABAを生産する方法を提供することができる。
図面の簡単な説明
[0010] [図 1]図 1は、ラクトバチルス'レニ- KG34、 KG43、 Sl、 KG31、 KG64、 KG— 18
4、 KG4— 14 1株の分子系統榭を示す。
発明を実施するための最良の形態
[0011] 以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る乳酸菌は、ラクトバチルス属に属する菌株であり、例えば、醤油諸味 力も単離された乳酸菌を用いることができる。本発明の乳酸菌は、培養開始時の培 地中に乳酸と食塩が共存する条件下で GABAを生産する能力を有し、乳酸が 1〜4 %、食塩が 8〜 12%共存する条件下で GABAを生産することができる。この乳酸菌 は、ラクトバチルス'レニ-であることが好ましぐ例えば、ラクトバチルス'レニ- KG 34株やラクトバチルス .レニ- KG43株などが挙げられる。
ラクトバチルス ·レニ- KG34株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 (NITE )特許微生物寄託センター (NPMD) (郵便番号 292— 0818 日本国千葉県木更津 巿かずさ鎌足 2— 5— 8)に、 2006年 2月 7日付にて国内寄託され (受託番号 NITE P— 177)、 2006年 9月 1日付にてブダペスト条約に基づき国際寄託に移管されてい る（受託番号 NITE BP— 177)。
また、ラ外バチルス ·レニ- KG43株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ NITE)特許微生物寄託センター（NPMD) (郵便番号 292— 0818 日本国千葉県 木更津巿かずさ鎌足 2— 5— 8)に、 2007年 1月 31日付にてブダペスト条約に基づき 国際寄託されている（受領番号 NITE ABP— 309)。
[0012] 乳酸菌を醤油諸味から単離するのは、次のような方法による。すなわち、醤油諸味 25gをストマッカ一処理し、得られた液汁をダーラム管を入れた MRS - SOYTONE 培地（5. 5%MRSブロス、 0. 5%バタトソィトン、 0. 5%グルタミン酸ナトリウム、 8% 食塩、 5%食添用乳酸 pH5. 1)に適量加え、 30°Cで静置培養を行う。ダーラム管 にガスの発生が確認された培養液を MRS— SOYTONE培地で適当に希釈し、さら にそれを MRS - SOYTONE寒天培地に塗布し、ァネロパック ·ケンキ（三菱ガス化 学株式会社）にいれ 30°Cで 7日間培養する。得られたシングルコロニーを再度ダーラ ム管を入れた MRS - SOYTONE培地に接種し、ガス発生が確認された菌を選抜 する。
[0013] 上記の方法で KG34、 KG43、 Sl、 KG31、 KG64、 KG— 18— 4、 KG4— 14— 1 株の 7株を単離した。これら 7株のうち、 KG34、 KG43両株の菌学的性質を調べ、そ の結果を表 1に示した。比較対照としてラクトバチルス'レニ-の標準菌であるラタトバ チルス.レニ- DSMZ20253のデータも記載した。標準菌ラタトバチルス'レニ- DSMZ20253はグルタミン酸の脱炭酸能を持たず、 GABAを生産しないことがわか る。
[0014] [表 1]
Figure imgf000006_0001
、本発明の乳酸菌ラクトバチルス .レニニ KG34、 KG43、 Sl、 KG31、 KG6 4、KG— 18— 4、KG4— 14— 1株の 16S rDNA(16S rDNA遺伝子）の全塩基 配列を以下の方法で決定した。
乳酸菌ラクトバチルス'レニ- KG34、 KG43、 Sl、 KG31、 KG64、 KG— 18— 4 、 KG4— 14— 1株を MRS— Soytone培地（MRS broth 5. 5%, Soytone 0. 5 %, NaCl 8%,グルタミン酸ナトリウム 0. 5%, pH5. 1)に植菌し、 30°Cで 4日間 培養した。ゲノム DNAの抽出には Genとるくん™ (酵母用）（タカラバイオ株式会社） を使用した。抽出したゲノム DNAを铸型として PCR法により 16S rDNAの全領域を 3本に分けて増幅した。それぞれの断片をシークェンスし、つなぎ合わせることで全 領域の配列を得た。サーマルサイクラ一にはタカラ サーマルサイクラ一 MPを、 D NAシークェンサ一には ABIプリズム 377DNAシークェンサ一（アプライドバイオシス テム社)を使用した。得られたそれぞれの 16S rDNAの塩基配列を配列番号 1およ び 2に示した。
[0016] 得られた 16S rDNAの塩基配列カゝら本菌と近縁と考えられる種の相同性検索を 行い、近縁種との 16S rDNAの塩基配列を用いて近隣結合法により分子系統榭を 作製し、本菌の近縁種および帰属分類群の検討を行った。 NCBI BLASTで検索 の結果、本菌はラタトバチルス'レニ-の 16S rDNA配列と最も高い相同性 (約 99. 5%)を示し、系統樹でもラクトバチルス'レニ-と同じクラスターを形成した。この結果 より、本菌はラタトバチルス'レニ-と判断された。作製した系統榭は図 1に示した。
[0017] 本発明の乳酸菌は食塩や乳酸が非存在下で L グルタミン酸もしくはし ダルタミ ン酸塩力 GABAを生産する能力を有する力 培養開始時の培地中に 1〜4%の乳 酸と 8〜 12%の食塩が共存する条件下でも GABAを生産することができる（実施例 2 参照)。また、培養開始時以外においては、培地中に 0〜4%の乳酸と 0〜12%の食 塩が共存する条件下で GABAを生産することができる。
[0018] 本発明の GABA含有培養物の製造方法は、 L—グルタミン酸および Zまたはその 塩類を含有する培地に、上記性質を有する乳酸菌を接種'培養し、 GABAを含有す る培養物を製造する方法である。本発明で用いる乳酸菌は、醤油諸味から単離培養 され、継代培養されたものを用いるが、醤油諸味に含まれている同種の乳酸菌をそ のままで、あるいは、新たに単離して用いるようにしてもよい。また、凍結乾燥菌体、 凍結保存株、および、液体培養液のうちのいずれを使用しても良い。
[0019] 本発明で用いる培地は、 GABAを生産するため、グルタミン酸を含有して 、る必要 がある。培地中に含有させるグルタミン酸は、化学的にはアミノ酸の一種である Lーグ ルタミン酸が好ま 、が、調味料としての用途を持つ食品添加物であるグルタミン酸 やグルタミン酸ナトリウム、その他のグルタミン酸塩、さらに食品蛋白質を酸や酵素で 加水分解して得られるグルタミン酸のいずれを用いても構わない。また、調味料、水 産加工品、トマトなど、遊離グルタミン酸を含む食品をそのままで用いても構わない。 なお、より多量の GABAを含有した培養物を得る場合には、より多量のグルタミン酸 を含有する培地を用いることが必要である。
[0020] また、本発明で用いる培地は、乳酸菌の生育のために、上記したグルタミン酸の他 に、ブドウ糖、果糖、麦芽糖などの糖質や、酵母エキス、肉エキス等のビタミンやミネ ラルを含む食品、もしくは、麹および麹消化物などから 1つ以上を含有することが好ま しい。さらに、乳化剤や安定剤、 pH調整剤などの食品添加物を用いても構わない。 培地に用いることができる麹および麹消化物としては、例えば、小麦、大麦、ライ麦、 はと麦、押し麦、キヌァ、粟、稗、黍、米、とうもろこしなどの穀類、大豆、小豆、インゲ ン豆、ルーピン豆、ガラス豆、レンズ豆などの豆類のうちから 1つ、もしくは、 2つ以上 の原料を変性処理したものに麹菌を作用させたもの、あるいは、麹菌の酵素を作用さ せたタンパク加水分解物が挙げられる。望ましくは、しょうゆ、しょうゆ諸味、味噌、豆 類等のタンパク加水分解物等である。
[0021] 本発明における乳酸菌の接種は、上記した GABA生産能を有するラクトバチルス- レニ-を、グルタミン酸源、食塩、および、糖源を含む培地にて、 25〜35°C、 48〜9 6時間、初発 pH4. 0〜7. 0で培養した種乳酸菌を、本培養培地の容量に対して、 1 Ziooo〜iZio容程度接種して行う。
[0022] 本発明において、培養に使用できる装置は、洗浄や加熱殺菌を行うことができ、食 品の製造に使用できれば、大きさや材質を問わないが、雑菌が混入しにくい衛生的 な構造をしたものが望ましい。培養条件は、乳酸菌の菌学的性質 (表 1参照)より、培 養温度は 20〜40°C、好ましくは 25〜35°Cで、初発 pHは 4. 0〜7. 0が好ましい。培 養期間は、 L グルタミン酸および Zまたはその塩類などのグルタミン酸源を目標の GABA濃度にまで変換できるよう充分な期間行うことが必要とされるが、例えば、 1〜 4週間が好ましい。
[0023] このようにして、加工食品などの原材料として広 ヽ用途を持つ GABA含有培養物を 得ることができる。例えば、本発明の方法で得られる GABA含有培養物は、 GABA 増強原料として、そのまま各種の調味料や飲食物に添加して用いることも可能である
[0024] また、圧搾、濾過、濃縮、乾燥などの処理工程により GABA含有量をさらに高めて 禾 IJ用することもできる。上記濾過工程としては、濾紙、濾布などを用いた通常の食品 加工用の圧搾、濾過設備を使用して行うことができ、珪藻土やセルロース、活性炭な どの食品用濾過助剤を用いることができる。濃縮工程は、真空濃縮機、減圧濃縮機、 蒸留釜、凍結濃縮機などの設備を用いることができる他、単純に加熱により培養物中 の水分を蒸発させる方法を用いることができる。また、乾燥工程としては、噴霧乾燥や 凍結乾燥を効率的かつ衛生的な方法により行うことが好ましい。さらに、 GABAの含 有量をより高めた培養物を得るために、上記工程以外にも、液体クロマトグラフィーな どの方法を用いるようにすることもできる。
[0025] このように GABA含有培養物を処理することにより、 GAB Aを含有した液状または 粉末状の食品を得ることができ、これらを各種食品へ配合したり二次加工すること〖こ より、 GABAを増強した調味料や飲食物が容易に得られる。二次加工では、賦形剤 、甘味料、増粘剤、タンパク質、ペプチド、脂質、多糖類、糖質、塩類などの、通常食 品に用いられて 、る成分を含むことができる。
[0026] なお、得られた培養物や培養物を加えた調味液、および、飲食品中の GABAの含 有量の測定は、高速液体クロマトグラフィー、アミノ酸測定機等の分析機器や、酵素 を用いた分析試薬などを用いて行うことができる。
[0027] 以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明する力 本発明は、何らこれらに 限定されるものではない。
実施例
[0028] (実施例 1)
<乳酸菌の獲得 > 各種発酵食品から被験試料を適量サンプリングし、ダーラム管を入れた MRS— S OYTONE培地（5. 5%MRSブロス、 0. 5%ノ クトソィトン、 0. 5%グルタミン酸ナトリ ゥム、 8%食塩、 5%食添用乳酸 pH5. 1)に適量カ卩え、 30°Cで静置培養を行った。 ダーラム管にガスの発生が確認された培養液を MRS— SOYTONE培地で適当に 希釈し、さらにそれを MRS— SO YTONE寒天培地に塗布し、ァネロパック'ケンキ（ 三菱ガス化学株式会社）にいれ 30°Cで 7日間培養した。得られたシングルコロニーを 再度ダーラム管を入れた MRS - SOYTONE培地に接種し、ガス発生が確認された サンプルについて GABAを測定した。なお、同一分離源カゝら分離された菌は RAPD 法により固体識別を行い、同一菌を複数選択しないようにした。 GABAは日立高速 アミノ酸分析計 L— 8800にて測定した。その結果、 KG34、 KG43、 Sl、 KG31、 K G64、 KG— 18— 4、 KG4— 14— 1株が GABA生産していることが判明した。なお、 KG34株、 KG43株の生理学的性質は表 1に、 KG34株、 KG43株の 16S rDNA 配列は配列番号 1および 2に示した。 KG34株、 KG43株の 16S rDNA配列は 100 %—致していた。
[0029] (実施例 2)
<耐塩性、耐乳酸性の確認 >
ダーラム管を入れた MRS— Soytone培地（5. 5%MRSブロス、 0. 5%Soytone、 0. 5%グルタミン酸ナトリウム、 pH5. 1)を基本に、食塩を 8%および 12%、食添用 乳酸を 0%、 1%および 4%に変化させた培地を用いて、培養開始時の培地中に食 塩と孚 L酸力 S存在する条件での KG34、 KG43、 Sl、 KG31、 KG64、 KG— 18— 4、 KG4— 14— 1株の GABA生産性を確認した。また、その際、公知の GABA生産乳 酸菌との比較を行った結果を表 2に示した。
[0030] [表 2] 乳酸 0% ILKl% ?TK%
食塩 8% 食 12% "¾¾8% ^¾12% 食塩 8% 食塩 12%
L hilgardii NBRC 15886
La. 1 act is subs p. cremori s NBRC 100b lb
La. lactis s s K K K Kubsp. lac t is NBRC 12007
E. casselifla G G G G 1v - 4 - -us NBRC 100478
L, kefiri NBRC 361148 15888
L. brevis 層 1082
L. brevis JAM 1318
L brevis JAM 10075
ム brevis NBRC 3345
L. brevis NBRC 3960
L brevis NBRC 12005
L. brevis NBRC 12520
L brevis NBRC 13109
L brevis NBRC 13110
L. plant arum NBRC 12006
L. pi ant arum NBRC i25i9
S. thermophil s NBRC 13957
renim ι KG- 34 ΟΔ X
renin KG— 43
renin
reninii
renim ι
reninii
reninii
*し.： Lactobacillus GABA生産 ΔΔΛ 〇〇〇〇〇〇〇ΧΧΧΧΧΧΧ
La. 'Lactococcus 生育はするが、 GABA生産なし
E. -Enterococcus 生育しない
S. - Streptococcus
Δ 〇〇△〇〇〇〇 ΧΧΧΧΧΧΧΧΧ 〇〇 〇〇〇〇〇
(実施例 3)
〇〇〇△△△△ く GABA含有培養物 (調味液)の製造方法 >
小麦グノレテン 70gと醤油麹 lOOgに温水 160mlを加えて、さらにグルタミナーゼとし てキャンディダ'ファマタ（Candida famata) km - 1 (FERM P— 8897)の 36時間 通気撹拌培養した培養液 (培地組成：グルコース 6%、酵母エキス 1%、リン酸 1力リウ ム 0· 1%、硫酸マグネシウム 0· 1%、 ρΗ5· 5、培養温度 30。C)を 5ml添カ卩して 50。C で 24時間グノレテンの分解および分解により生じたグルタミンのグルタミン酸への変換 を行った。得られた分解物に終濃度 8%となるように食塩を加え、さらに終濃度 1%と なるように食添用乳酸をカ卩えた後、 30°Cにまで温度を下げ、ラクトバチノレス 'レニニ KG34株および KG43株をおおよそ 106個/ mlになるように接種し、 30°Cで 7日間 静かに撹拌しながら培養を行った。得られた培養物をろ過し、清澄な液を得た。 KG3 4株を接種した培養液の GABA含有量は 13. 0mgZml、 KG43株で 19. 5mg/ml であった。対照として公知の GABA生産菌ラタトバチルス 'ブレビス NBRC3345で同 様の試験を行った力 最終的に得られた清澄液の GABA濃度は 2. OmgZmlであり 、充分な GABA生産は行われなかった。
[0032] 本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲 を逸脱すること無く様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明ら かである。
本出願は、 2006年 2月 21日出願の日本特許出願 (特願 2006— 043836)に基づ くものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。ここに引用されるすべての参 照は全体として取り込まれる。
産業上の利用可能性
[0033] 本発明によれば、安価な材料を用い、野性菌に発酵を阻害されることなぐ安定に GABAを生産する方法を提供することができる。

Claims

請求の範囲
[1] 培養開始時の培地中に乳酸と食塩が共存する条件下で γ -ァミノ酪酸を生産するこ とができるラクトバチルス属に属する乳酸菌。
[2] 培養開始時の培地中に乳酸が 1〜4%、食塩が 8〜12%共存する条件下で γ -アミ ノ酪酸を生産することができるラクトバチルス属に属する乳酸菌。
[3] 乳酸菌がラクトバチルス ·レニ- (Lactocabillus rennini)である請求項 1または 2記載 の乳酸菌。
[4] 請求項 1〜3のいずれか 1項記載の乳酸菌を L グルタミン酸および Zまたはその塩 類を含有する培地に接種し、培養を行うことを特徴とする γ -ァミノ酪酸含有培養物 の製造方法。
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