TW200811288A - Lactic acid bacterium capable of producing gamma-aminobutyric acid - Google Patents

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200811288 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種即使於培養開始時的培養基中存在乳 酸的條件下亦可生產γ-胺基丁酸（以下稱為「GABA」）之屬 於乳酸桿菌屬（lactobacillus)之乳酸菌，進而係關於使用該 乳酸桿菌之含γ-胺基丁酸培養物之製造方法。 【先前技術】 GABA係因具有降低血壓作用、利尿作用、精神安定作 用等生理效果，而目前受到關注之胺基酸，但含GABA食 品僅限於一部分蔬菜及茶、米等，而且GABA之含量亦較 少，故現提出有若干利用GABA醱酵性乳酸菌之GABA製 造方法（例如，參照曰本專利文獻1〜3)。至於該等生產 GABA之乳酸菌，已知有希氏乳酸桿菌（Lactobacillus hilgardii)、乳酸乳球菌乳月旨亞種（1^(：1:〇〇〇(^118 13〇1^81^3卩· Cremoris)、乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactis subsp· Lactis)、赂黃腸球菌（£11161>000(：(：1180&88611；0&¥113)、短乳桿 菌（Lactobacillus brevis)、胚芽乳酸桿菌（Lactobacillus plantarum)、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus)等， 其具有藉由脫碳酸反應而由L-麩胺酸或L-麩胺酸鹽生產 GABA之能力。 但是，培養該等乳酸菌，因必須將乳清粉（whey powder)、脫月旨乳、酪蛋白、蛋白月東等高價成分作為培養 基，故自成本方面考慮生產性欠佳（例如，參照日本專利 文獻1或4)。又，以酸或者以酶、麴分解作為廉價材料之 118872.doc 200811288 醬油麴及麩質（gluten)麴’且利用麩醯胺酸 ^騎所溶出的 麩醯胺轉化成麵胺酸，並以上述麩胺酸作為 Μ &養基之情形 時，於中和時所產生的食鹽及酶分解時作為環保方案而添 加的食鹽，會抑制乳酸菌生產GABA。關於耐鹽性生產 GABA之乳酸菌，亦有若干報告，但GABA醱酵之最佳食 鹽濃度為12·5〜18%，屬於濃度極高之鹽（例如，灸 ^ Φ \ \ \ tj 專利文獻5 )。若考慮推行意圖減鹽的飲食生活以避免串上 生活習慣病，則含高鹽之食品或調味料並不理想。又， GABA具有所期待之降低血壓作用，但若將其與高濃度食 鹽組合，則會失去其本來的意義。 根據以上所述，於利用乳酸菌生產GABA時，較理想的 是以低鹽狀態下分解使用如麴及麩質之價廉材料，但於低 鹽下會出現野生菌造成污染之問題。污染係於培養初始階 段產生，其結果導致產生乙醇或者使pH降低，使可生產 GABA之乳酸菌的生長受到抑制，而無法獲得充分量之目 標GABA。防止該等於低鹽下由野生菌所導致之污染的方 法’有利用通常用作食品防腐劑之乙醇、醋酸、乳酸的方 法，然而乙醇、醋酸雖然可抑制污染菌，但亦會抑制生產 GABA之乳酸菌。另一方面，乳酸菌因自身會產生乳酸， 故對乳酸的耐受性較其他細菌更高。 因此，人們考慮將乳酸用作防腐劑，但若於食鹽存在下 開始培養時添加乳酸，則生產GABA之乳酸菌無法生長、 或者所生長者無法進行GABA生產，導致出現新問題。 【專利文獻1】日本專利特開2000-210075號公報 118872.doc 200811288 【專利文獻2】曰本專利特開2〇〇本215529號公報 【專利文獻3】日本專利特開2005-1025 59號公報 【專利文獻4】曰本專利第3426157號公報 【專科文獻5】日本專利第2 7 0 4 4 9 3號公報 【發明内容】 [發明所欲解決之問題] 本發明之課題在於提供，於培養開始時的培養基中共存

有乳酸與食鹽的條件下可生產GABA之乳酸菌、以及含 GABA培養物之製造方法。 [解決課題之技術手段] 本發明者們為解決上述課題而反覆進行努力研究，鈐果 發現：自醬醪中分離出即使於自培養開始時共存有乳酸與 食鹽的狀態下亦可生產GABA之乳酸菌，並可藉由利用該 乳酸菌解決上述問題，從而完成本發明。 即，本發明係關於以下（1)〜(4)。 (1)一種屬於乳酸桿菌屬之乳酸菌，其可於培養開始時的 培養基中共存有乳酸及食鹽的條件下，生產γ_胺基丁酸。 (勾一種屬於乳酸桿菌屬之乳酸菌，其可於培養&開始7夺的 培養基中共存有1〜4%之乳酸、及8〜12%之食鹽的條件下， 生產γ_胺基丁酸。 (3)如上述⑴或⑺項之乳酸g，其中乳酸㈣凝乳酸桿 (4)一種含γ_胺基丁酸培養物之製造方法，其特徵在於： 將上述（1)至(3)中任一項之乳酸菌接種於含有L-楚胺酸及/ 118872.doc 200811288 或其鹽類之培養基中，進行培養。 [發明之效果] 根據本發明，可提供一種使用廉價材料，不抑制野性菌 之酸酵而穩定生產GABA之方法。 【實施方式】 以下，詳細說明本發明。 本發明之乳酸菌，係屬於乳酸桿菌屬之菌株，例如可使 用自4 _中分離出之乳酸菌。本發明之乳酸菌，於培養開 始時的培養基中共存有乳酸與食鹽的條件下，具有生產 GABA之能力，可於共存有卜4%之乳酸及8〜12%之食鹽的 條件下生產GABA。該乳酸菌，較好的是凝乳酸桿菌，例 如滅乳酸桿函KG34株及凝乳酸桿菌KG43株等。 凝乳酸桿菌KG34株，係於2006年2月7曰移交獨立行政 法人製品評價技術基盤機構（NITE)專利微生物寄存中心 (NPMD)(郵政編碼292_0818曰本國千葉縣木更津市上總鐮 足2-5-8)進行國内寄存（受託碼號mTE p_177)(bcrc 910349) ’且於2006年9月1日移交至基於布達佩斯條約進 行國際寄存管理（受託號碼Μ1Έ BP_177)(BCRC 91〇349)。 又，凝乳酸桿菌KG43株，係於2007年1月31日移交至獨 立行政法人製品評價技術基盤機構（NITE)曰本專利微生物 寄存中心（NPMD)(郵政編碼292-0818曰本國千葉県木更津 市上總錄足2 - 5 - 8)，基於布達佩斯條約進行國際寄存（收件 號碼 NITE ABP-309)(BCRC 910350)。 將乳酸菌自醬醪中分離，係採用如下之方法。即，將25 g 118872.doc 200811288 醬醪進行鐵胃處理，將所獲得液汁適量加入到置於杜罕氏 醱酵管（Durham tube)内之 MRS-SOYTONE 培養基（5.5% MRS 肉湯、0.5%5&〇1;〇8〇71:〇116、0,5%麩胺酸納、8%食鹽、 5%食品添加用乳酸pH 5.1)中，於3(TC下進行靜置培養。 以MRS-SOYTONE培養基將確認於杜罕氏醱酵管中有氣體 產生的培養液加以適當稀釋，進而將其塗佈於MRS-SOYTONE瓊月旨培養基上，置於AnaeroPack*kenki(三菱氣 體化學股份有限公司）中以30°C培養7天。將所獲得單株菌 再次接種到内置杜罕氏醱酵管的MRS-SOYTONE培養基 中，選取確認有氣體產生之菌。 以上述方 &*·Κ03 4、Κ043、81、Κ031、Κ064、Κ0-18-4、KG4-14-1株之7種株菌。於該等7株皆中，調查 KG34、KG43兩株之細菌學性質，將其結果示於表1。作為 比較對照，亦記載有作為凝乳酸桿菌標準菌之凝乳酸桿菌 DSMZ20253的資料。已知，標準菌凝乳酸桿菌DSMZ20253 不具有麩胺酸脫碳酸能力，因而無法生產GABA。 118872.doc 10- 200811288 [表l]

KG-34 KG-43 菌凝乳酸桿菌 DSMZ20253 1.糖的醱酵性 葡萄糖(glucose) + + + 半乳糖(galactose) + + + 山梨糖(sorbose) - - 一 蔗糖(sucrose) - - - 麥芽糖(maltose) - - - 纖維二糖 (cellobiose) + + + 海藻糖(trehalose) - - - 乳糖(lactose) - + 蜜二糖(melibiose) - - - 棉子糠(raffmose) - - - 松三糖 (melezitose) - - - 木糖(xylose) D-阿拉伯糖 + + + (D-arabinose) L-阿拉伯糖 (L-arabinose) + + + 核糖(ribose) + + + 鼠李糖(riiamnose) - - W 果糖(fructose) + + + 甘油(glycerol) - - - 赤蘚糖醇 (erythritol) - - - 核糖醇(ribitol) - - - 甘露醇(mannitol) - - - 山梨醇(sorbitol) - - 麵 木糖醇(xylitol) - - - 肌醇(inositol) - - - D-葡萄糖胺 (glucosamine) N-乙酿基-D-匍萄 + + + 糖胺（N-acetyl-D-glucosamine) + + + 苦杏仁素 (amygdalin) - - + 七葉苦(esculin) - - - 118872.doc -11 - 200811288

2·生長溫度〇C) 5 - - - 15 - W - 20 + W + 25 + + + 30 + + + 37 + + + 40 + - + 45 - - - 3·耐鹽性(％) 5 + + + 10 + + + 11 + + + 12 + + W 13 + + - 14 W W - 15 - - - 16 - - - 4.初始pH值 4 + + - 5 + + + 6 + + + 7 + + + 8 - - - 9 - _ - 5·脫碳酸能力 麵胺酸(glutamic + + acid) 天冬醯胺酸 (asparaginic acid) 離胺酸(lysine) - - - 鳥胺酸(ornithine) + - + 6.其他 由葡萄糖 產生氣體 運動性 - - 乳酸旋光性 D D D 由精胺酸 生成氨氣 孢子 - - 過氧化氫酶 (catalase) 細胞壁4之 二胺基庚二酸 無 無 無 *w :雖弱但為+ 又，依以下方法判定本發明之乳酸菌凝乳酸桿菌 KG34、KG43、SI、KG31、KG64、KG-18-4、KG4-14-1 株 118872.doc -12- 200811288 之16SrDNA(16SrDNA基因）之全鹼基序列。 將乳酸菌凝乳酸桿菌KG34、KG43、SI、KG31、 KG64、KG-18-4、KG4-14-1株植菌於 MRS-Soytone培養基 (MRS 肉湯 5.5%，Soytone 0.5%，NaCl 8%，麩胺酸鈉 0.5%，pH 5.1)中，以30°C培養4天。於基因組DNA之提取 中，使用Gen-TORUKUNTM(酵母用）（Takara生物股份有限 公司（TaKaRa Bio Inc.))。以提取的基因組DNA為模板，依 PCR法將16S rDNA的全部區域分成3部分進行放大。將各 片斷進行定序，藉由連接組合而獲得全區域之序列。温控 循環機，係使用Takara溫控循環機MP ; DNA定序儀，係使 用ABI稜鏡377DNA定序儀（Applied Biosystems公司）。將所 獲得之各16S rDNA之鹼基序列揭示於序列號1及2中。 對所獲得之16S rDNA之鹼基序列中之認為與本菌有親 緣關係之種進行同源性檢索，使用本菌與親緣種之16S rDNA的鹼基序列，藉由鄰接法製作分子系統樹，以研究 本菌的親緣種以及歸屬分類群。以NCBI BLAST進行檢索 之結果為：本菌與凝乳酸桿菌之16S rDNA序列顯示有最高 之同源性（約99.5%)，系統樹亦形成與凝乳酸桿菌相同之 叢集（cluster)。根據該結果可判斷，本菌係凝乳酸桿菌。 所製作之系統樹示於圖1。 本發明之乳酸菌，具有於無食鹽及乳酸之存在下由L-麩 胺酸或L-麩胺酸鹽生產GAB A的能力，但於培養開始時之 培養基中共存有1〜4%之乳酸及8〜12%之食鹽的條件下，亦 可生產GABA(參照實施例2)。又，除培養開始時之外，於 118872.doc -13- 200811288 培養基中共存有0〜4%之乳酸及〇〜12%之食鹽的條件下，亦 可生產GABA。 本發明之含GABA之培養物之製造方法，係將具有上述 性質之乳酸菌接種於含有L-麩胺酸及/或其鹽類的培養基 中加以培養，製造含GABA之培養物的方法。本發明所使 用之乳酸菌’係使用自醬醪中分離培養再進行繼代培養 ' 者，可直接使用醬醪中所含之同種乳酸菌，或者重新將其 _ 分離後使用。又，可使用冷凍乾燥菌體、冷凍保存株、以 及液體培養液中之任意者。 為了生產GABA，本發明所使用之培養基中必須含有麩 ^酸（glutamic acidp培養基中所含有之麩胺酸，較好的 是作為化學上之一種胺基酸的^麵胺酸，亦可使用具有用 於调味料用途的食品添加物之楚胺酸或麵胺酸納、其他麵 胺酸鹽、進而以酸或酶使食品蛋白質水解而獲得之麵胺酸 中之任意者。又，亦可直接使用調味料、水產加工品、蕃 • 兹等含游離麵胺酸之食品。再者，於須獲得含有更多量 GABA之培養物之情形時，必入 、便用3有更多篁楚胺酸的 又，為使乳酸菌生長，本笋明 虹心办 不&明所使用之培養基，除上述 麩胺&L以外，較好的是含有： , 匈糖、果糖、麥芽糖等糖 貝或酵母卒取物、肉萃取物擘人铋a ^ .^ ^ 物專3維生素或礦物質的食 。口或含有麴及麴消化物等中之】種以上 用乳化劑或穩定劑、pH調整 "了使 中可栘田+私 ^寻K 〇口添加物。至於培養基 中了使用之麴以及麴消 例如可列舉··將小麥、大 118872.doc -14. 200811288 麥、黑麥、燕麥、麥片、藜麥、粟、稗、泰、米、玉米等 穀類，大豆、小豆、菜豆、羽扇豆…只豆、小扁豆等 豆類中之1種或2種以上原料進行改質處理，再使其與麵菌 相互作用而生成者，或者使麴菌酶作用而生成之蛋白質水 解物。較好的是，醬油、„、味嗜、豆類等蛋白質水解 本發明之礼酸菌之接種，係將上述具有gabA生產能力 的凝乳酸桿g置於含麩胺酸源、食鹽、及糖源之培養基 中，以25〜35°C、48〜96小時、初始阳為4 〇〜7〇之條件進 ^培養所獲得之種乳酸g，以_於本培養之培養基容 Ϊ，以1/1000〜1/10容量程度進行接種。 *於本發明中’可詩培養之裝置，可進行清洗或加熱殺 菌處理，若可用於食品製造，則較好的是製成無論大小或 材貝均難以混入雜菌之德：& 士矣、生 , ^ 囷之何生構仏。根據乳酸菌的細菌學性 質（參照表1)，培養條件之培養溫度為2g〜贼、較好的是 Μ〜说，其初始pH較好的是4〇〜7〇。關於培養時間，2 須進行充分時間之培養’以將L麵胺酸及/或其鹽類等麵 胺酸源轉化為目標GABA濃度，例如較好的是Μ週。 以如此方式’可獲得具有廣泛用途的含gaba之培養物 作為加工食品等之原材料。例如，以本發明方法而獲得之 合GABA培養物可直接添加於各種調味料錢食物中 GABA增強原料。 Ύ 又’亦可藉由遷搾、滿：索 曲 慮浪縮、乾燥等處理步騾， 一步提高GAB A含量進杆刹田 ^丄 丁利用。作為上述過濾步驟，可使 II8872.doc -15· 200811288 用遽紙、遽布等通當之合σ 4 丁 m 、承之艮口口加工用之壓榨、 過濾、，亦可使用石夕藻土或纖維素、活性 ^又備進行 劑：濃縮步驟中，除可使用真空壤、縮機二助:慮 餾釜、冷凍濃縮機等設備以外，。、·’ 、蒸 培養物中水分蒸發之方法。又，乾=:早純藉由加熱使 祀诛步騾，較好 _ 由有效且衛生之方法進行喷霧乾燥或冷;東乾燥。進：： 了獲付GABA含量更高之培養物，除上述步驟 可 採用液體層析法等方法。 亦了 可藉由以如此方式處理含〇繼之培養物，而獲得人 GABA之液狀或粉末狀食品， 备 赤去、隹—, 田竹该4添加入各種食品 =::二:人加工’可容易地獲得⑽八經增強之調味料 或飲料食品n次加卫，可使其含有卿劑、料 料、增點劑、蛋白質、肽'脂質、多糖類、類等 通常食品巾所使用之成分。 -類4 再者’所獲得之培養物或加人有培養物之調味液、以及 飲食品中之GABA含量的測定’可使用高速液體層析儀、 胺基酸測定儀等分析儀器，或使用有酶之分析試劑等進 行。 ' 牛出實施例更詳細地說明本發明，但本發明並不 限定於任何該等實施例。 [實施例] (實施例1) <乳酸菌之獲得> 種曝酵食品中適量取樣被檢試料，適量加入到内置 118872.doc -16 - 200811288 杜罕氏醱酵管（Durham tube)之MRS-SOYTONE培養基（5·5% MRS 肉湯、0.5% bactosoytone、0.5%麩胺酸鈉、8%食鹽、 5%食品添加用乳酸pH 5.1)中，於30°C下進行靜置培養。 以MRS-SOYTONE培養基將確認於杜罕氏醱酵管内有氣體 產生之培養液進行適當稀釋，進而將其塗佈於MRS_ SOYTONE瓊脂培養基上，置於AnaeroPack Kenki(三菱氣 體化學股份有限公司）中以30°C培養7天。將所獲得之單株 菌再次接種到内置杜罕氏醱酵管之MRS-SOYTONE培養基 中，對確認有氣體產生之樣品進行GABA測定。再者，依 RAPD法對自同一分離源中所分離出的菌進行個體識別， 而不重複選擇同一種菌。以日立高速胺基酸分析計L _ 8 8 〇 〇 測定GAGA。由其結果可判明，KG34、KG43、S1、 KG31、KG64、KG-18-4、KG4-14-1株可生產 GABA。再 者，KG34株、KG43株之生理學性質示於表1，KG34株、 KG43株的16S rDNA序列示於序列號1及2。KG34株與 KG43株之16S rDNA序列係100%—致。 (實施例2) <耐鹽性、耐乳酸性之確認> 使用以内置杜罕氏醱酵管的MRS-Soytone培養基（5.5% MRS肉湯、0.5% Soytone、0.5%麩胺酸鈉、pH 5.1)為基 礎，且將食鹽含量變為8%及12%、食添用乳酸含量變為 0%、1 %及4%之而成之培養基，確認於培養開始時之培養 基中存在有食鹽及乳酸的條件下，KG34、KG43、S1、 KG31、KG64、KG-18-4、KG4-14-1 株之 GABA 生產性。 118872.doc •17、 200811288 又，此時，將其與中所周知之生產GABA之乳酸菌進行比 較，結果示於表2。 [表2] 菌 乳酸0% 乳酸1% 乳酸4% ~食鹽8% 食鹽12% ¥鹽8% 食鹽12% 食鹽8% 食鹽12%

希氏乳酸桿菌NBRC 15886 X 乳酸乳球菌乳脂亞種NBRC 100676 Δ 乳酸乳球菌乳酸亞種NBRC 12007 Δ 酪黃腸球菌NBRC 100478 Δ 克弗爾乳酸桿菌NBRC 15888 △ 短乳桿菌IAM 1082 Δ 短乳桿菌IAM1318 △ 短乳桿菌IAM 10075 Δ 短乳桿菌NBRC 3345 Δ 短乳桿菌NBRC 3960 Δ 短乳桿菌NBRC 12005 Δ 短乳桿菌NBRC 12520 Δ 短乳桿菌NBRC 13109 Δ 短乳桿菌NBRC 13110 Δ 胚芽乳酸桿菌NBRC 12006 Δ 胚芽乳酸桿菌NBRC 12519 Δ 嗜熱鏈球菌NBRC 13957 Δ

〇 0 〇 〇 〇 0 〇 〇 〇 〇 〇 〇 〇 Δ 〇 Δ 0 〇 〇 0 〇 〇 〇 △ 〇 0 〇 〇 〇 Δ Δ Δ 〇 〇 〇 Δ 〇 〇 〇 〇 〇 △ 凝乳酸桿菌KG-34 凝乳酸桿菌KG-43 凝乳酸桿菌S1 凝乳酸桿菌KG-31 凝乳酸桿菌KG-64 凝乳酸桿菌KG-18-4 凝乳酸桿菌KG-M-1 *L.:乳酸桿菌 **〇 : GABA生產 La.:乳酸乳球 △:生長但不生產GABA E.:腸球菌 X :不生長 S.:鏈球菌 (實施例3)

<含GABA培養物（調味液）之製造方法> 於70 g小麥麩質及1 00 g醬油麴中加入160 ml溫水，進而 添加5 ml無名假絲酵母菌（Candida famata)km-1 (FERM P-8897)經36小時通氣攪拌培養之培養液（培養基組成：葡 萄糖6%、酵母萃取物1%、磷酸二氫鉀0.1%、硫酸鎂 0.1%、pH 5.5、培養溫度30°C)作為麩醯胺酸酶，於50X下 進行24小時的麩質分解以及藉由分解而產生的麩胺酸向麩 醯胺之變換。以終濃度成為8%之方式於所獲得之分解物 -18- 118872.doc 200811288 中添加食鹽，進而以終濃度成為1%之方式添加食品添加 用乳酸，然後降溫至30°C，以大致成為1〇6個/ml之方式將 凝乳酸桿菌KG34株及KG43株進行接種，一面於30°C下穩 定攪拌7天，一面進行培養。對所獲得之培養物進行過 濾，而獲得澄清之液體。接種有KG34株的培養液之GABA 含量為13.〇11^/1111，接種有1(：043株的培養液之0人6八含量 為19.5 mg/ml。以作為對照之中所周知之GABA生產菌短 乳桿菌NBRC3345進行同樣之試驗，但最終所獲得之澄清 液之GABA濃度為2.0 mg/ml，無法生產充分之GABA。 以上詳細說明或參照特定實施態樣說明了本發明，但該 業者應清楚，在不脫離本發明之精神及範圍内可進行各種 變更或修正。 本申請案係基於2006年2月21曰提出申請之日本專利申 請案（日本專利特願2006-043836)者，將其内容引用於此作 為參照。可引用全文作為此處所引用#之全部參照。 [產業上之可利用性] 根據本發明，可提供一種使用廉價材料，不抑制野性菌 之醱酵而穩定生產GABA之方法。 【圖式簡單說明】 圖1係表示凝乳酸桿菌KG34、KG43、SI、KG31、 KG64、KG-18-4、KG4-14-1株之分子系統樹。 118872.doc -19- 200811288 序列表 <110〉龜甲萬股份有限公司 <120〉具有γ-胺基丁酸生產能力之乳酸菌 <13〇> <140>096106231 <141>2007-02-16 <150> JP 2005-043836 <151 > 2006-02-21 <160> 2 <170> Patent In vorsion 3.3

<2tO> 彳 <211> 1526 <2t2> ONA <213〉乳酸菌屬KG34 (N丨TE BP—177)(BCRC910349)

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<210> 2 <211> 1526 <2I2> DNA <213> 乳酸菌屬KG43 (ΝΠΈ ABP-309)iBCRC 910350) li8872.doc 200811288 ^ttfatect ^ctcaggee f&acfct^c ggcgtcccta Ataeat^caa etcccftegca 60 caaocett«« cctgutccts cttgc^ggtg acgttaatgg 120 astaooaQSt ^taaooae coate&acc^ ^ggataaco tttEe»aaeo gnuoUztU 180

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Claims (1)

1. 200811288 十、申請專利範圍： 1· 屬，其可於培養開始時 之條件下，生產γ-胺基 一種乳酸菌，其係屬於乳酸桿菌 之培養基中、共存有乳酸及食鹽 丁酸。 2. -種乳酸菌’其係屬於乳酸桿菌屬，其可於培養開始時 之培養基中、共存有1〜4%乳酸、8〜12%食鹽之條件下^ 生產γ-胺基丁酸。 3·如請求項1或2之乳酸菌，其中乳酸菌為凝乳酸桿菌 {Lactobacillus rennini、。 4· 種含γ-胺基丁酸之培養物之製造方法，其特徵在於： 等如明求項1至3中任一項之乳酸菌接種於含l·麵胺酸及/ 或其鹽類之培養基中進行培養。

   118a72.doc