TWI379003B - - Google Patents
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Description
九、發明說明: 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種即使於培養開始時的培養基中存在乳 酸的條件下亦可生產γ-胺基丁酸(以下稱為「GABA」)之屬 於乳酸桿菌屬(lactobacillus)之乳酸菌,進而係關於使用該 乳酸桿菌之含γ-胺基丁酸培養物之製造方法。 【先前技術】 GABΑ係因具有降低血壓作用、利尿作用、精神安定作 用等生理效果,而目前受到關注之胺基酸,但含GABA食 品僅限於一部分蔬菜及茶、米等,而且GABA之含量亦較 少,故現提出有若干利用GABA醱酵性乳酸菌之GABA製 造方法(例如,參照曰本專利文獻1〜3)。至於該等生產 GABA之乳酸菌,已知有希氏乳酸桿菌(Lactobacillus hilgardii)、乳酸乳球菌乳脂亞種(Lactococcus lactis subsp. Cremoris)、乳酸乳球菌乳酸亞種(Lactococcus lactis subsp. Lactis)、路黃腸球菌(Enterococcus casseliflavus)、短乳桿 菌(Lactobacillus brevis)、胚芽乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum)、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)等, 其具有藉由脫碳酸反應而由L-麩胺酸或L-麩胺酸鹽生產 GABA之能力。 但是,培養該等乳酸菌,因必須將乳清粉(whey powder)、脱脂乳、酪蛋白、蛋白脒等高價成分作為培養 基,故自成本方面考慮生產性欠佳(例如,參照日本專利 文獻1或4)。又,以酸或者以酶、麴分解作為廉價材料之 118872.doc 1379003 醬油麴及麵質(gluten)麴,且利用鲢醯胺酸酶將所溶出的 麩醯胺轉化成麩胺酸,並以上述麩胺酸作為培養基之情形 肖’於中和時所產生的食鹽及酶分解時作為環保二案:添 加的食鹽,會抑制乳酸菌生產GABA。關於耐鹽性生產 GABA之乳酸g,亦有若干報告,但⑽靖酵之最佳食 鹽濃度為12.5〜18%,屬於濃度極高之鹽(例如,參照曰本 專利文獻5 )。若考慮推行意圖減鹽的飲食生活以避免患上 # 生活習慣病,則含高鹽之食品或調味料並不理想。又, GABA具有所期待之降低血壓作用,但若將其與高濃度食 鹽組合,則會失去其本來的意義。 根據以上所述,於利用乳酸菌生產GABA時,較理想的 是以低鹽狀態下分解使用如麴及麩質之價廉材料,但於低 鹽下會出現野生菌造成污染之問題。污染係於培養初始階 段產生,其結果導致產生乙醇或者使{)11降低,使可生產 GABA之乳酸菌的生長受到抑制,而無法獲得充分量之目 • 標GABA。防止該等於低鹽下由野生菌所導致之污染的方 法,有利用通常用作食品防腐劑之乙醇、醋酸、乳酸的方 法,然而乙醇、醋酸雖然可抑制污染菌,但亦會抑制生產 GABA之乳酸菌。另一方面,乳酸菌因自身會產生乳酸, 故對乳酸的耐受性較其他細菌更高。 因此’人們考慮將乳酸用作防腐劑,但若於食鹽存在下 開始培養時添加乳酸,則生產Gaba之乳酸菌無法生長、 或者所生長者無法進行GAB A生產,導致出現新問題。 【專利文獻1】曰本專利特開2000-210075號公報 118872.doc 1379003 【專利文獻2】曰本專利特開2004-215529號公報 【專利文獻3】曰本專利特開2〇〇5_1〇2559號公報 【專利文獻4】曰本專利第3426157號公報 【專利文獻5】曰本專利第27〇4493號公報 【發明内容】 [發明所欲解決之問題] 本發明之課題在於提供,於培養開始時的培養基中共存 φ 有乳酸與食鹽的條件下可生產GABA之乳酸菌、以及含 GAB A培養物之製造方法。 [解決澤題之技術手段] 本發明者們為解決上述課題而反覆進行努力研究,結果 發現:自醬曝中分離出即使於自培養開始時共存有乳酸與 食鹽的狀態下亦可生產〇舰之乳酸菌,並可藉由利用該 乳酸菌解決上述問題,從而完成本發明。 即’本發明係關於以下(丨)〜(4)。 • ⑴一種屬於乳酸桿菌屬之乳酸菌,其可於培養開始時的 培養基中共存有乳酸及食鹽的條件下,生產γ_胺基丁酸。 ⑺-種屬於乳酸桿㈣之乳酸g,其可於培養開始時的 培養基中共存有1〜4%之乳酸、及8〜12%之食鹽的條件下, 生產γ-胺基丁酸。 (3) 如上述⑴或⑺項之乳酸菌’其中乳酸菌係凝乳酸桿 菌。 (4) 一種含γ_胺基丁酸培養物之製造方法,其特徵在於: 將上述⑴至(3)巾任-項之乳酸菌接種於含有l•麵胺酸及/ I18872.doc 或其鹽類之培養基中,進行培養。 [發明之效果] 根據本發明,可提供一種使用廉價材料,不抑制野性菌 之醱酵而穩定生產GABA之方法。 【實施方式】 以下,詳細說明本發明。 本發明之乳酸菌,係屬於乳酸桿菌屬之菌株,例如可使 用自醬醪中分離出之乳酸菌。本發明之乳酸菌,於培養開 始時的培養基中共存有乳酸與食鹽的條件下,具有生產 GABA之能力,可於共存有1〜4%之乳酸及8〜12%之食鹽的 條件下生產GABA ^該乳酸菌,較好的是凝乳酸桿菌,例 如凝乳酸桿菌KG34株及凝乳酸桿菌KG43株等。 凝乳酸桿菌KG34株,係於2006年2月7日移交獨立行政 法人製品評價技術基盤機構(NITE)專利微生物寄存中心 (NPMD)(郵政編碼292-0818日本國千葉縣木更津市上總鐮 足2-5-8)進行國内寄存(受託碼號NITE P-177)(BCRC 9103 49),且於2006年9月1曰移交至基於布達佩斯條約進 行國際寄存管理(受託號碼NITE BP-177)(BCRC 910349)。 又,凝乳酸桿菌KG43株,係於2007年1月31日移交至獨 立行政法人製品評價技術基盤機構(NITE)曰本專利微生物 寄存中心(NPMD)(郵政編碼292-0818曰本國千葉県木更津 市上總鐮足2-5-8),基於布達佩斯條約進行國際寄存(收件 號碼 NITE ABP-309)(BCRC 910350)。 將乳酸菌自醬醪中分離,係採用如下之方法。即,將25 g 118872.doc 醬醪進行鐵胃處理,將所獲得液汁適量加入到置於杜罕氏 醱酵管(Durham tube)内之 MRS-SOYTONE 培養基(5.5% MRS肉湯、0.5% bactosoyt0ne、〇_5%麩胺酸鈉、8%食鹽、 5%食品添加用乳酸pH 5.1)中,於3〇°C下進行靜置培養。 以MRS-SO YTONE培養基將確認於杜罕氏醱酵管中有氣體 產生的培養液加以適當稀釋,進而將其塗佈於MRS-SOYTONE複月旨培養基上’置於AnaeroPack-kenki(三菱氣 體化學股份有限公司)中以30°C培養7天。將所獲得單株菌 再次接種到内置杜罕氏醱酵管的MRS-SOYTONE培養基 中,選取確認有氣體產生之菌。 以上述方法分離〖034、〖043、81、〖031、^:064、尺0-18-4、KG4-14-1株之7種株菌。於該等7株菌·中,調查 KG34、KG43兩株之細菌學性質,將其結果示於表1。作為 比較對照,亦記載有作為凝乳酸桿菌標準菌之凝乳酸桿菌 DSMZ20253的資料。已知,標準菌凝乳酸桿菌DSMZ20253 不具有麩胺酸脫碳酸能力,因而無法生產GABA。 118872.doc 10· 1379003 [表i]
KG-34 KG-43 菌凝乳酸桿菌 DSMZ20253 1.糖的醱酵性 葡萄糖(glucose) + + + 半乳糖(galactose) + + + 山梨糖(sorbose) - - - 蔗糖(sucrose) - - - 麥芽糖(maltose) _ - 纖維二糖 + + + (cellobiose) 海藻糖(trehalose) - - - 乳糖(lactose) - - + 蜜二糖(melibiose) - 昼 棉子糖(raffmose) - - 松三糖 (melezitose) 木糖(xylose) + + + D-阿拉伯糖 (D-arabinose) L-阿拉伯糖 + + + (L-arabinose) 核糖(ribose) + + + 鼠李糖(rhamnose) - - W 果糖(fructose) + + + 甘油(glycerol) - - - - 赤蘚糖醇 (erythritol) 核糖醇(ribitol) - - - 甘露醇(mannitol) - - - 山梨醇(sorbitol) - - - 木糖醇(xylitol) - - - 肌醇(inositol) - - - D-葡萄糖胺 + + + (glucosamine) N-乙醯基-D-葡萄 糖胺(N-acetyl-D- + + + glucosamine) 苦杏仁素 4- (amygdalin) 七葉苦(esculin) - - - 118872.doc -11 1379003
2.生長溫度(°C) 5 15 20 25 30 37 40 45 + + + + + W W + + + + + + + + 3.耐鹽性(%) 5 + + + 10 + + + 11 + + + 12 + + W 13 + + - 14 W W - 15 - - - 16 - - - 4.初始pH值 4 + + - 5 + + + 6 + + + 7 + + + 8 - - - 9 - - - 5.脫碳酸能力 麵胺酸(glutamic + + acid) 天冬醯胺酸 (asparaginic acid) - - 離胺酸(lysine) - - - 鳥胺酸(ornithine) + - + 6.其他 由葡萄糖 產生氣體 - - - 運動性 - - - 乳酸旋光性 D D D 由精胺酸 生成氨氣 - - - 抱子 - - - 過氧化氫酶 (catalase) - - 細胞壁‘之 二胺基庚二酸 無 無 無 * w:雖弱但為+ 又,依以下方法判定本發明之乳酸菌凝乳酸桿菌 KG34、KG43、SI、KG31、KG64、KG-18-4、KG4-14-1 株 118872.doc •12· 1379003 培養基中共存有0〜4%之乳酸及0〜12%之食鹽的條件下,亦 可生產GABA。 本發明之含GABA之培養物之製造方法,係將具有上述 性質之乳酸菌接種於含有L-麩胺酸及/或其鹽類的培養基 中加以培養,製造含GABA之培養物的方法。本發明所使 用之乳酸菌,係使用自醬醪中分離培養再進行繼代培養 者,可直接使用醬醪中所含之同種乳酸菌,或者重新將其 φ 分離後使用。又,可使用冷凍乾燥菌體、冷凍保存株、以 及液體培養液中之任意者。 為了生產GAB A,本發明所使用之培養基中必須含有麩 胺酸(glutamic acid)。培養基中所含有之麩胺酸,較好的 是作為化學上之一種胺基酸的L_麩胺酸,亦可使用具有用 於調味料用途的食品添加物之麩胺酸或麩胺酸鈉、其他麩 胺酸鹽、進而以酸或酶使食品蛋白質水解而獲得之麩胺酸 中之任意者。又,亦可直接使用調味料、水產加工品、蕃 • 茄等含游離麩胺酸之食品。再者,於須獲得含有更多量 GABA之培養物之情形日夺,必須使用含有更多量麵胺酸的 培養基。 又,為使乳酸菌生長,本發明所使用之培養基,除上述 Μ胺酸以外,較好的是含有:葡萄糖、果糖、麥芽糖等糖 質,或酵科取物、肉萃取物等含維生素或礦物質的食 品、或含有麴及麴消化物等中之丨種以上。進而,亦可使 用乳化劑或穩定劑、pH調整劑等食品添加物。至於培養基 中可使用之麴以及德消化物,彻^ π _ t ·14· 118872.doc 1379003 濾紙、濾布等通常之食品加工 過遽,亦可使用石夕藻土或纖用之騎、過濾設備進行 劑。濃縮步驟中,除可使用真^活性炭等食品用助遽 館爸'冷《縮機等設備《外:=用= 農缩機、蒸 由有一::::喷:乾::步:,的是,籍 了獲得㈣A含量更高之培養==·進而’為
採用液體層析法等方法。 ID卜’亦可 3猎由以如此方式 ^ ^ %脣物,而獲得含 。Α之液狀或粉末狀食品,藉由將該等添加入各種食品 ,者進行二次加卫’可容易地獲#gaba經增強之調味: :飲料食品。藉由二次加工’可使其含有賦形劑、甜味 料、增黏劑、蛋白質、R、脂質、多糖類、糖質、鹽類等 通常食品中所使用之成分。 再者,所獲得之培養物或加入有培養物之調味液、以及 飲食品中之GABA含量的測定,可使用高速液體層析儀、 胺基S文測疋儀等分析儀器’或使用有酶之分析試劑等進 行0 以下,舉出實施例更詳細地說明本發明,但本發明並不 限定於任何該等實施例。 [實施例] (實施例1) <乳酸菌之獲得> 自各種酿酵食品中適量取樣被檢試料’適量加入到内置 118872.doc -16 · 1379003 杜罕氏醱酵管(〇111*1^11111^6)之1^1^-80丫1'€^£培養基(5.5% MRS肉湯、0.5% bactosoytone、0.5%楚胺酸納、8%食鹽' 5%食品添加用乳酸pH 5.1)中,於30°C下進行靜置培養。 以MRS-SOYTONE培養基將確認於杜罕氏醱酵管内有氣體 產生之培養液進行適當稀釋,進而將其塗佈於MRS-SOYTONE填脂培養基上,置於AnaeroPack Kenki(三菱氣 體化學股份有限公司)中以30°C培養7天。將所獲得之單株 菌再次接種到内置杜罕氏醱酵管之MRS-SOYTONE培養基 中,對確認有氣體產生之樣品進行GABA測定◊再者,依 RAPD法對自同一分離源中所分離出的菌進行個體識別, 而不重複選擇同一種菌。以日立南速胺基酸分析計L-8800 測定GAGA。由其結果可判明’ KG34、KG43、S1、 KG31、KG64、KG-18-4、KG4-14-1 株可生產 GABA。再 者,KG34株、KG43株之生理學性質示於表1,KG34株、 KG43株的16S rDNA序列示於序列號1及2。KG34株與 KG43株之16S rDNA序列係100%—致。 (實施例2) <耐鹽性、耐乳酸性之確認> 使用以内置杜罕氏醱酵管的MRS-Soytone培養基(5.5% MRS 肉湯、0.5% Soytone、0.5%麵胺酸納、pH 5.1)為基 礎,且將食鹽含量變為8%及12%、食添用乳酸含量變為 0%、1 %及4%之而成之培養基,確認於培養開始時之培養 基中存在有食鹽及乳酸的條件下,KG34、KG43、S1 ' KG3 1、KG64、KG-18-4 ' KG4-14-1 株之 GABA 生產性。
118872.doc • 17· 1379003 又,此時,將其與中所周知之生產GAB A之乳酸菌進行比 較,結果示於表2。 [表2]
i 乳酸0% 乳酸1% 轧酸4% 食鹽8% 食鹽12% 食鹽8% 食鹽12% 食鹽8% 食鹽12% 希氏乳酸桿菌NBRC 15886 X X X X X X 乳酸乳球諸乳脂亞種NBRC 100676 Δ Δ X X X X 乳酸乳球菌乳酸亞種NBRC 12007 △ Δ X X X X 酪黃腸球菌NBRC 100478 Δ Δ X X X X 克弗爾乳酸桿gNBRC 15888 Δ Δ X X X X 短乳桿菌IAM1082 Δ Δ Δ Δ X X 短乳桿glAM 1318 △ Δ Δ X X X 短乳桿glAM 10075 △ Δ Δ X X X 短乳桿菌NBRC3345 △ Δ X X X X 短乳桿菌NBRC3960 Δ △ X X X X 短乳桿菌NBRC 12005 △ ώ X X X X 短乳桿菌NBRC丨2520 Δ X X X X 短乳桿菌NBRC丨3109 △ Δ X X X y 短乳桿菌NBRC 13110 △ Δ X X X X 胚芽乳酸桿菌NBRC 12006 Δ △ X X X X 胚芽乳酸桿菌NBRC 12519 Δ △ X X X X 嗜熱鏈球菌NBRC 13957 Δ Δ X X X X 凝乳酸桿菌KG-34 〇 0 〇 〇 〇 〇 凝乳酸桿菌KG43 〇 〇 〇 〇 〇 〇 凝乳酸桿菌S1 〇 Δ 0 Δ 〇 〇 凝乳酸桿SKG-31 〇 0 0 0 0 △ 凝乳酸桿菌KG-64 〇 0 0 0 0 △ 凝乳酸桿菌KG-18-4 Δ Δ 0 〇 0 △ 凝乳酸桿菌KG-14-1 〇 〇 〇 〇 〇 Δ :乳酸桿1 : GABA生產 La.:乳酸乳球 △:生長但不生產GABA E.:腸球菌 x :不生長 S.:鏈球菌 (實施例3) <含GAB A培養物(調味液)之製造方法> 於70 g小麥麵質及100 g醬油麴中加入160 ml溫水,進而 添加5 ml無名假絲酵母菌(Candida famata)km-1 (FERM P-8897)經36小時通氣攪拌培養之培養液(培養基組成:葡 萄糖6%、酵母萃取物1%、磷酸二氫鉀0.1%、硫酸鎂 0.1%、pH 5.5、培養溫度30°C)作為麩醯胺酸酶,於50°C下 進行24小時的麩質分解以及藉由分解而產生的麩胺酸向麩 醢胺之變換。以終濃度成為8%之方式於所獲得之分解物 •18- 118872.doc 1379003 中添加食鹽’進而以终濃度成為1%之方式添加食品添加 用乳酸,然後降溫至3〇〇c,以A致成為1〇6個/mi之方式將 凝乳酸桿菌KG34株及KG43株進行接種,—面於贼下穩 錢拌7天…面進行培養。對所獲得之培養物進行過 ;慮’而獲得澄清之液體。接種有&(}34株的培養液之^^ 含量為13_0 mg/„u’接種有KG43株的培養液之gaba含量 為19.5 mg/ml。以作為對照之中所周知之gaba生產菌短 • 乳桿菌NBRC3345進行同樣之試驗,但最終所獲得之澄清 液之GABA濃度為2.〇mg/mi,無法生產充分之Gaba。 以上詳細說明或參照特定實施態樣說明了本發明,但該 業者應清楚,在不脫離本發明之精神及範圍内可進行各種 變更或修正。 本申請案係基於2006年2月21曰提出申請之日本專利申 請案(曰本專利特願2〇〇6_〇43836)者,將其内容引用於此作 為參照。可引用全文作為此處所引用*之全部參照。 • [產業上之可利用性] 根據本發明,可提供一種使用廉價材料’不抑制野性菌 之酿酵而穩定生產GABA之方法。 【圖式簡單說明】 圖1係表示凝乳酸桿菌KG34、KG43、SI、KG31、 KG64、KG-18-4、KG4-14-1株之分子系統樹。 118872.doc 1379003 序列表 <110>龜甲萬股份有限公司 <120〉具有γΗ)安基丁酸生產能力之乳酸菌 <130> <140>096106231 <141>2007-02-16 <15〇> UP 2006-043836 <151> 2006-02-21 <160> 2 <170> Patent In version 3.3
<210> 1 <211> 1526 <212> DNA <213〉乳酸菌屬KG34 (NITE BP-177)(BCRC 910349) <400> 1
gttteatcct ggctcanac gaaogctgec ggcgteccta ataeatecaa gtcgcacgca €0 oaaocgttaa cctgatcctg cttgcaeitg &cgttaatES aogtgagtgs oggeogggtg 120 agtaeoao^t geetaaooaa ocotcesfoe £eeeataaD〇 ttt^ea&aoa caeeotaata 180 ccecatagtt tato^cgaoo tootg^togo aataataaag acggottcgg ct^tcacttc 240 figgacagace ogoggc^ot taectafttc gtsecataaa ggcoteeeea ee〇§atgata 300 cgtaeccgac ctgagagect aatcecccac BttgggBetg agaceeegcc caaectecta 360 cgaaggfinc oagtaeggaa tcttedeo&a teeaegcaae tcteatecag oaaoeceeee 420 tgagtgaaea aeeitttcge ctoetaaaac eotgttettg gagaaeaacc ZggggtHV 480 taaotettat ooootteaog gtatccaaoo eeaaaeooao ggotaaotao iteooaeoag 540 ccgcggtaat acgtsggtgg oaagocttft oo^atttat t^gogtaea gcgago^oag 600 gcgfftttttt aagtetgatg tgaaagcctt cggcttaacc gaagaagggo ateagaaact 660 gagaegcttg ageacagaae agcaaaptge aactccattt ftagcgrtga fiatccgtege 720 tetat収aac aecaccacU £ceaas:B;cgK otttct时tc tgttactc时辟t坊ggctc 7B0 eaae^tatee eeagogaaoa geattagate oooteetagt ocataooeta aaoeateaat 940 gctaaEtgtt ggageetttQ ogooQttcaB tgoteo^ect aac£〇att9a eoattgogoc 900 tgcseafftao eaoogoaaee tteaaaotoa aageaattsa mgggwtt e^oaacoggt 960 ggagcatgtc ^tttaattc^ aagcaacgcg aagaaeetta ccag^tettg aeatcctttg 1020 accgct^tcg a丨时acegtt tcccottces eecce丨丨cefftKtS cettetteto 1080 gtcaect域t gt6gtg时at sttgccttee gt如egCMc g时ctcaecc ctt«teacta 1140 ettgccagca tttaetteeg oactctaete afactecogg teaoaaacoe csseaaggtg 1200 fggatgsoet oaaatoaeca teooooteat eaooteggot aoaeaogtio taoaateeto 1260 gCgacaaoga (tagcgc^e cgcgagggtt agctaatct。taaaaaccea tctcagttc丨 1320 gattgcasge tffeaactcfe eteeat£aac ccuaatcec tattaateeo csetcftfeat 1380 googcggtga atcGEttccc eeeccttfta cacacceccc rtcacacoet gagagtttgt 1440 aacaoocaaa eooeffteeee oaaooottoe eeeseotago ogtotaaeet ££ga〇aeatK 1500 attggggtga agtc^taaca aggtaa 1526
<210> 2 <211> 1526 <212〉 DNA <213〉乳酸菌屬KG43 fNlTEABP_309)(BCRC 910350) 118872.doc 1379003 <40〇> 2 gtttfatcct ggotCBggtc faac^ctc^c ggcgtgcctt atacetecaa £tc(cacgca €0 Gaaocgttaq cctgatcctg cttgcaggtg acgtt&Atgg nagtgBgtgg cg£ecgggt£ 120 agtaeo抑st gggtaaooaa ccotg^Bgci gc^eataaco ttteeseaoa gasectaata 180
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Claims (1)
1379003 • 第096106231號專利申請案 t 中文申請專利範圍替換本(101 十、申請專利範圍: 1. 一種乳酸菌,.其為凝乳酸桿菌 KG34株(BCRC 910349),其可於培養開始時之培養基 -·. 中、共存有乳酸及食鹽之條件下,生產γ-胺基丁酸。 2. 一種乳酸菌,其為凝乳酸桿菌 KG43株(BCRC 9103 50),其可於培養開始時之培養基 中、共存有乳酸及食鹽之條件下,生產γ-胺基丁酸。 3. 一種乳酸菌,其為凝乳酸桿菌(lacioftaci/Zw·? • KG34株(BCRC 910349),其可於培養開始時之培養基 中、共存有1〜4%乳酸、8〜12%食鹽之條件下,生產γ-胺 基丁酸。 4. 一種乳酸菌,其為凝乳酸桿菌(ZacioftaciZ/w KG43株(BCRC 910350),其可於培養開始時之培養基 中、共存有1〜4%乳酸、8〜12%食鹽之條件下,生產γ-胺 基丁酸。 5. 一種含γ-胺基丁酸之培養物之製造方法,其特徵在於·· 將如請求項1至4中任一項之乳酸菌接種於含L-麩胺酸及/ 或其鹽類之培養基中進行培養。 118872-1010801.doc
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