CN115125179A - 产雷帕霉素的基因工程菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种产雷帕霉素的基因工程菌及其应用。所述基因工程菌为过表达RapI基因的吸水链霉菌亚种(Streptomyces hygroscopicus subsp.hygroscopicus)。本发明在吸水链霉菌中过表达编码C39甲基转移酶的基因RapI，构建产雷帕霉素的基因工程菌，显著提高了雷帕霉素的产量，有效提高了生产效率，成本较低，适于工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种产雷帕霉素的基因工程菌及其应用。
背景技术
雷帕霉素(RAPA，rapamycin)，又名西罗莫司，分子式C51H79NO13，分子量为914.17，结构如下式所示。
雷帕霉素是一种新型大环内酯类免疫抑制剂，为白色固体结晶，易溶解于有机溶剂，极微溶于水。雷帕霉素在1975年就从复活岛上的土壤中被发现。因为雷帕霉素的分子结构十分复杂，所以很难用化学合成法获取，目前主要是通过生物发酵法生产。目前对提高雷帕霉素产量的研究包括：1、通过物理或化学诱变，产生突变菌株，一般诱变后的产量都会比出发菌株高一些 (Huiyan Geng,Huanhuan Liu,et al.World J MicrobiolBiotechnol.2017,33:101)； 2、Kuscer E等人通过过表达生物合成基因簇中的正调控基因rapG能够使雷帕霉素产量提高约34％(从120mg/L提高至160mg/L)；过表达rapH能够使雷帕霉素产量提高约50％(从120mg/L提高至180mg/L)(Kuscer E,Coates N,Challis I,Gregory M,Wilkinson B,Sheridan R,
H.J Bacteriol.2007, 189:4756-4763)；3、Young Ji Yoo等人通过敲除可能的负调控基因RapR/S能够使雷帕霉素的产量提高137％左右(从7.3mg/L提高至17.3mg/L，Yoo Y J, Hwang J Y,Shin H L,Cui H,Lee J,Yoon Y.JInd Microbiol Biotechnol.2015,42:125-135)。但目前这些研究中雷帕霉素的产量都还比较低，不具备工业应用的价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中缺少雷帕霉素高产菌株的不足，提供一种产雷帕霉素的基因工程菌及其制备方法和应用。利用本发明所述基因工程菌，能显著提高雷帕霉素的产量，成本较低，适于工业化生产。
在对雷帕霉素合成途径的研究中，发明人发现在参与雷帕霉素生物合成的基因中，不同基因进行调控的途径、顺序并不相同，这些调控基因的活力大小和促进代谢流流向雷帕霉素最终合成所发挥的作用也是不同的。发明人意外发现在过表达RapI基因的雷帕霉素产生菌中，雷帕霉素产量显著提高。
本发明通过以下技术方案解决上述技术问题。
本发明的第一方面提供一种产雷帕霉素的基因工程菌，所述基因工程菌为过表达RapI基因的吸水链霉菌亚种(Streptomyces hygroscopicus subsp. hygroscopicus)。
在本发明一较佳实施方案中，所述吸水链霉菌亚种为ATCC29253。
在本发明一较佳实施方案中，所述RapI基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在本发明一较佳实施方案中，所述RapI基因整合在重组表达载体上，或者整合在吸水链霉菌亚种的基因组上。
当所述RapI基因整合在重组表达载体上时，所述RapI基因的拷贝数优选为1。
在本发明一较佳实施方案中，所述重组表达载体的骨架质粒可为 pSET152。
在本发明一具体实施方案中，所述RapI基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明的第二方面提供一种制备如第一方面所述的基因工程菌的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)构建RapI基因过表达的重组表达载体；
(2)将构建的重组表达载体转化到吸水链霉菌亚种中。
本发明的第三方面提供一种制备雷帕霉素的方法，包括：将如第一方面所述的基因工程菌在发酵培养基中进行发酵培养，从发酵液中获得雷帕霉素。
较佳地，所述发酵培养基为含甘油的发酵培养基，其优选包括：2-3％葡萄糖、2-2.5％棉籽饼粉、0.5-0.8％酵母浸粉、1-1.8％L-赖氨酸盐酸盐、0.05- 0.2％磷酸氢二钾、0.05-0.2％磷酸二氢钾、0.2-1％氯化钠、总浓度为0.5-2.5％的甘油和0.1mL/100mL的微量元素液；所述百分比为各组分占培养基的质量体积百分比(g/mL)；所述发酵培养基的pH为4.6-5.5。
更佳地，所述发酵培养基包括：2.5％葡萄糖、2.1％棉籽饼粉、0.6％酵母浸粉、1.5％L-赖氨酸盐酸盐、0.1％磷酸氢二钾、0.1％磷酸二氢钾、0.5％氯化钠、总浓度为1.5-2％的甘油和0.1mL/100mL的微量元素液；所述百分比为各组分占培养基的质量体积百分比(g/mL)；所述发酵培养基的pH为4.8- 5.0；例如4.6。
所述方法中，所述发酵培养的温度可以优选为28-32℃；和/或，所述发酵培养的时间可以优选为7-12天；和/或，所述发酵培养的转速可以优选为 180-250rpm。
较佳地，所述发酵培养的温度为30℃；和/或，所述发酵培养的时间为 10天；和/或，所述发酵培养的转速为200rpm。
在本发明一些实施方案中，所述方法还包括先将所述基因工程菌接种于种子培养基中进行种子培养，得到培养物，然后将培养物转接至发酵培养基。
较佳地，所述种子培养基包括：2-2.5％纯黄豆粉、0.5-0.8％酵母浸粉、 1.5-2.5％葡萄糖、0.5-0.8％L-赖氨酸盐酸盐；所述百分比为各组分占培养基的质量体积百分比(g/mL)；所述种子培养基的pH为6.5-7.5；和/或，所述转接的接种量为8-12％。
更佳地，所述种子培养基包括：2.1％纯黄豆粉、0.6％酵母浸粉、2％葡萄糖、0.6％L-赖氨酸盐酸盐；所述百分比为各组分占培养基的质量体积百分比 (g/mL)；所述种子培养基的pH为7.0；和/或，所述转接的接种量为10％。
在本发明一些实施方案中，所述种子培养为分级种子培养，包括：将所述基因工程菌接种于一级种子瓶进行一级扩大培养，将一级扩大培养的培养物转接至二级种子瓶中进行二级扩大培养，得到培养物。
较佳地，所述一级扩大培养的温度为20-32℃；所述一级扩大培养的时间为2-5天；所述一级扩大培养的转速为180-240rpm；和/或，所述二级扩大培养的温度为28-32℃；所述二级扩大培养的时间为18-30h；所述二级扩大培养的转速为180-240rpm。
更佳地，所述一级扩大培养的温度为30℃；所述一级扩大培养的时间为 3天；所述一级扩大培养的转速为200rpm；和/或，所述二级扩大培养的温度为30℃；所述二级扩大培养的时间为24h；所述二级扩大培养的转速为 200rpm。
通过补料以及控制培养的pH范围，可进一步提高雷帕霉素产量。
本发明中，培养基各组成成分均为本领域常规，可通过商购渠道获得，相应市售产品均可用于本发明。例如培养基中所使用的可溶性淀粉可以是购于湖州展望药业有限公司，所用纯黄豆粉可以是购于嘉祥永胜食品有限公司，所用棉籽饼粉可以是购于北京鸿润宝顺科技有限公司等。
本发明的第四方面提供如第一方面所述的基因工程菌在制备雷帕霉素中的应用。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明在吸水链霉菌中过表达编码C39甲基转移酶的基因RapI，构建产雷帕霉素的基因工程菌，显著提高了雷帕霉素的产量，有效提高了生产效率，成本较低，适于工业化生产。
附图说明
图1为构建的质粒pSET152-RapI图谱。
图2为基因工程菌RAP-RapI的HPLC图谱。
图3为S.hygroscopicus ATCC 29253的HPLC图谱。
图4为过表达后修饰基因的雷帕霉素产量。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例中使用的培养基如表1-3所示。
表1平板培养基(与斜面培养基组分及配比相同)
表2种子培养基
表3发酵培养基
实施例使用的出发菌株均为吸水链霉菌菌株ATCC 29253。
以下实施例中重组载体的构建方法和菌株的转化方法可为本领域常规技术。
实施例1
将如SEQ ID NO:1所示的RapI基因(氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)从吸水链霉菌菌株ATCC 29253的合成基因簇中敲除后构建工程菌株 RAP-△RapI(按本领域常规方法构建)，经稀释后均匀涂布在平板培养基上， 15d左右长出单菌落并产生灰色的孢子，将单菌落挑至斜面培养基，30℃培养约15天左右，斜面产生孢子，孢子呈灰黑色。刮取适量的孢子接种于种子瓶中，30℃，200rpm培养3天，以10％接种量接种于发酵培养基，30℃， 200rpm培养7天，经HPLC检测发酵液中雷帕霉素产量，经发酵验证，没有检测到雷帕霉素。
实施例2
将如SEQ ID NO:1所示的RapI基因与质粒pSET152构建RapI单拷贝过表达重组载体RAP-RapI(如图1所示)，转化至出发菌株吸水链霉菌菌株 ATCC 29253中，得到工程菌。构建重组载体过程中扩增RapI基因时所使用的引物序列如表4所示。
表4引物序列
将工程菌RAP-RapI经稀释后均匀涂布在平板培养基上，10d左右长出单菌落并产生黑色的孢子，将单菌落挑至斜面培养基，30℃培养约7天左右，斜面产生丰厚的孢子，用接种铲刮取时感到质地较硬。刮取适量的孢子接种于种子瓶中，30℃，200rpm培养3天，以10％接种量接种于发酵培养基， 30℃，200rpm培养7天，如图2所示，经HPLC检测，发酵液中雷帕霉素产量，发酵单位达到321.6mg/L。由此可见，通过过表达基因RapI，可显著提高雷帕霉素的产量，较野生型提高了50％。
实施例3
刮取适量实施例2得到的工程菌RAP-RapI的孢子接种于种子瓶中， 30℃，200rpm培养3天，以5％接种量接种于二级种子瓶(100ml/750ml)， 30℃，200rpm培养24h，以3％接种量转接至5L发酵罐中，将pH控制在 4.8左右，并在75h开始流动补加甘油(作为补充碳源)，甘油总浓度维持在 2％左右，培养10天，雷帕霉素的发酵单位达到1400mg/L。由此可见，通过利用5L发酵罐进行实时控制参数，雷帕霉素的产量比摇瓶中提高了约 77％。
实施例4
敲除负调控基因RapR/S获得的工程菌RAP-△RapR/S的雷帕霉素的产量并没有提高，在RAP-△RapR/S工程菌中导入RapI基因后，经稀释后均匀涂布在平板培养基上，生长周期与对照菌株相比，缩短为10天左右，单菌落长出并产孢后，挑至斜面培养基，30℃培养约8天左右，斜面产生孢子，孢子呈黑色。刮取适量的孢子接种于种子瓶中，30℃，200rpm培养3天，以10％接种量接种于发酵培养基，30℃，200rpm培养7天，经HPLC检测发酵液中雷帕霉素产量，雷帕霉素的产量为220mg/L。由此可见，过表达 RapI基因对雷帕霉素产量的提高不受敲除负调控基因RapR/S的影响。
实施例5
刮取适量实施例2得到的工程菌RAP-RapI的孢子接种于种子瓶中， 30℃，200rpm培养3天，以5％接种量接种于二级种子瓶(100mL/750mL)， 30℃，200rpm培养24h，以3％接种量转接至5L发酵罐中，控制pH在4.6 左右，并在75h开始流动补加甘油(作为补充碳源)，甘油总浓度维持在2％左右，培养10天，雷帕霉素的发酵单位为1130mg/L。
实施例6
刮取适量实施例2得到的工程菌RAP-RapI的孢子接种于种子瓶中， 30℃，200rpm培养3天，以5％接种量接种于二级种子瓶(100mL/750mL)， 30℃，200rpm培养24h，以3％接种量转接至5L发酵罐中，控制pH在5.0 左右，并在75h开始流动补加甘油(作为补充碳源)，甘油总浓度维持在2％左右，培养10天，雷帕霉素的发酵单位为1020mg/L。
实施例7
刮取适量实施例2得到的工程菌RAP-RapI的孢子接种于种子瓶中， 30℃，200rpm培养3天，以5％接种量接种于二级种子瓶(100ml/750ml)， 30℃，200rpm培养24h，以3％接种量转接至5L发酵罐中，控制pH在4.8 左右，并在75h开始流动补加甘油(作为补充碳源)，甘油总浓度维持在0.5％左右，培养10天，雷帕霉素的发酵单位为996mg/L。
实施例8
刮取适量实施例2得到的工程菌RAP-RapI的孢子接种于种子瓶中， 30℃，200rpm培养3天，以5％接种量接种于二级种子瓶(100ml/750ml)， 30℃，200rpm培养24h，以3％接种量转接至5L发酵罐中，控制pH在4.8 左右，并在75h开始流动补加甘油(作为补充碳源)，甘油总浓度维持在1.5％左右，培养10天，雷帕霉素的发酵单位为1077mg/L。
对比例1
将吸水链霉菌(S.hygroscopicus)ATCC 29253菌株经稀释后均匀涂布在平板培养基上，15d左右长出单菌落并产生黑色的孢子，将单菌落挑至斜面培养基，30℃培养约15天左右，斜面产生孢子。刮取适量的孢子接种于种子摇瓶中，30℃，200rpm培养3天，以10％接种量接种于发酵培养基，30℃， 200rpm培养7天，如图3所示，经HPLC检测发酵液中雷帕霉素产量，发酵单位为136mg/L，导入空质粒对菌体的产量不会造成影响。
对比例2
刮取适量的S.hygroscopicus ATCC 29253孢子接种于种子瓶中，30℃， 200rpm培养3天，以5％接种量接种于二级种子瓶(100ml/750ml)，30℃， 200rpm培养24h，以3％接种量转接至5L发酵罐中，控制pH在4.8左右，并在75h开始流动补加甘油(作为补充碳源)，培养9天，雷帕霉素的发酵单位为350mg/L。显著低于实施例3中的产量。
对比例3
将导入pSET152空质粒的菌株RAP-pSET152经稀释后均匀涂布在平板培养基上，15d左右长出单菌落并产生黑色的孢子，将单菌落挑至斜面培养基，30℃培养约15天左右，斜面产生孢子，孢子呈灰黑色。刮取适量的孢子接种于种子瓶中，30℃，200rpm培养3天，以10％接种量接种于发酵培养基，30℃，200rpm培养7天，经HPLC检测发酵液中雷帕霉素产量，发酵单位为136mg/L，导入空质粒对菌体的产量不会造成影响。
对比例4
针对后修饰基因RapI、RapJ、RapM、RapN、RapQ和RapO分别构建单拷贝过表达工程菌，按照实施例2进行培养，得到的雷帕霉素产量如图4所示(WT为原始菌株吸水链霉菌菌株ATCC 29253)，其中RapO的过表达抑制菌体生长，未显示在图中。
从图中可知，过表达RapM、RapN和RapQ基因并未提高雷帕霉素产量，而过表达RapI和RapJ基因可以提高雷帕霉素产量。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海医药工业研究院
中国医药工业研究总院
<120> 产雷帕霉素的基因工程菌及其应用
<130> P21012099C
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 783
<212> DNA
<213> Streptomyces hygroscopicus
<400> 1
gtgagcgcgt ccgtgcagac catcaagctg ccgtacggca gaccgtcggc ccacgtcaac 60
ccgggcgagg cgcagttcct ctaccaggag atcttcgccg agcggtgcta cttgcggcgc 120
ggccttgagc tgcgagcggg tgacgtggtc ttcgacgtcg gcgcgaacat cggcatgttc 180
tcgctcttcg cccacctgga gtgccccgat gtcacggtgc acgccttcga gccggcgccg 240
gtgccgtacg ccgcgctcag ggccaatgcc gagcggtacg ccatcgcggg ccggttcgag 300
cagtgcgcgg tctcggacgt ggccggccgc ggcaagatga cgttctacac ggataccacg 360
atgatgtcgg gcttccaccc ggatccggcg acccgcgcgg agctgctgcg caggctcgcc 420
atcaacggcg ggtacagtgc cgaggccgcc gaccggatgc tggccgagct gccggacacc 480
agccaggtga tcgagacgtc cgtcgtacgc ctctccgacg tcatcgcgga gcggggcatc 540
acctcgatcg gactgctcaa gatcgatgtg gagaagaacg agcggcatgt gatggccggg 600
atcgacgcgg gcgactggcc gcgcatccgc caggtcgtca ccgaggtgca cgacatcgac 660
ggcaggctcg acgaggtcct cacactgctg cgcgggcagg gcttcacggt cctcagcgag 720
caggagccgc tcttcgccgg caccgacatc taccaggtcg tcgcccgccg cggggacgcc 780
tga 783
<210> 2
<211> 260
<212> PRT
<213> Streptomyces hygroscopicus
<400> 2
Val Ser Ala Ser Val Gln Thr Ile Lys Leu Pro Tyr Gly Arg Pro Ser
1 5 10 15
Ala His Val Asn Pro Gly Glu Ala Gln Phe Leu Tyr Gln Glu Ile Phe
20 25 30
Ala Glu Arg Cys Tyr Leu Arg Arg Gly Leu Glu Leu Arg Ala Gly Asp
35 40 45
Val Val Phe Asp Val Gly Ala Asn Ile Gly Met Phe Ser Leu Phe Ala
50 55 60
His Leu Glu Cys Pro Asp Val Thr Val His Ala Phe Glu Pro Ala Pro
65 70 75 80
Val Pro Tyr Ala Ala Leu Arg Ala Asn Ala Glu Arg Tyr Ala Ile Ala
85 90 95
Gly Arg Phe Glu Gln Cys Ala Val Ser Asp Val Ala Gly Arg Gly Lys
100 105 110
Met Thr Phe Tyr Thr Asp Thr Thr Met Met Ser Gly Phe His Pro Asp
115 120 125
Pro Ala Thr Arg Ala Glu Leu Leu Arg Arg Leu Ala Ile Asn Gly Gly
130 135 140
Tyr Ser Ala Glu Ala Ala Asp Arg Met Leu Ala Glu Leu Pro Asp Thr
145 150 155 160
Ser Gln Val Ile Glu Thr Ser Val Val Arg Leu Ser Asp Val Ile Ala
165 170 175
Glu Arg Gly Ile Thr Ser Ile Gly Leu Leu Lys Ile Asp Val Glu Lys
180 185 190
Asn Glu Arg His Val Met Ala Gly Ile Asp Ala Gly Asp Trp Pro Arg
195 200 205
Ile Arg Gln Val Val Thr Glu Val His Asp Ile Asp Gly Arg Leu Asp
210 215 220
Glu Val Leu Thr Leu Leu Arg Gly Gln Gly Phe Thr Val Leu Ser Glu
225 230 235 240
Gln Glu Pro Leu Phe Ala Gly Thr Asp Ile Tyr Gln Val Val Ala Arg
245 250 255
Arg Gly Asp Ala
260
<210> 3
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RapI-R
<400> 3
aaccactcca caggaggacc catatgtcac ctggggagcg gagtga 46
<210> 4
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RapI-F
<400> 4
tggaaagacg acaaaacttt ggcgcgccta gccgcagaag ccacggga 48
Claims (10)
1.一种产雷帕霉素的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为过表达RapI基因的吸水链霉菌亚种(Streptomyces hygroscopicus subsp.hygroscopicus)。
2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述吸水链霉菌亚种为ATCC 29253；
和/或，所述RapI基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.如权利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，所述RapI基因整合在重组表达载体上，所述RapI基因的拷贝数优选为1；
较佳地，所述重组表达载体的骨架质粒为pSET152。
4.如权利要求1-3任一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述RapI基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
5.一种制备如权利要求1-4任一项所述的基因工程菌的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)构建RapI基因过表达的重组表达载体；
(2)将构建的重组表达载体转化到吸水链霉菌亚种中。
6.一种制备雷帕霉素的方法，其特征在于，包括：将如权利要求1-4任一项所述的基因工程菌在发酵培养基中进行发酵培养，从发酵液中获得雷帕霉素；
较佳地，所述发酵培养基为含甘油的发酵培养基，其优选包括：2-3％葡萄糖、2-2.5％棉籽饼粉、0.5-0.8％酵母浸粉、1-1.8％L-赖氨酸盐酸盐、0.05-0.2％磷酸氢二钾、0.05-0.2％磷酸二氢钾、0.2-1％氯化钠、总浓度为0.5-2.5％的甘油和0.1mL/100mL的微量元素液；所述百分比为各组分占培养基的质量体积百分比(g/mL)；所述发酵培养基的pH为4.6-5.5；
更佳地，所述发酵培养基包括：2.5％葡萄糖、2.1％棉籽饼粉、0.6％酵母浸粉、1.5％L-赖氨酸盐酸盐、0.1％磷酸氢二钾、0.1％磷酸二氢钾、0.5％氯化钠、总浓度为1.5-2％的甘油和0.1mL/100mL的微量元素液；所述百分比为各组分占培养基的质量体积百分比(g/mL)；所述发酵培养基的pH为4.8-5.0例如4.6。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的温度为28-32℃；和/或，所述发酵培养的时间为7-12天；和/或，所述发酵培养的转速为180-250rpm；
较佳地，所述发酵培养的温度为30℃；和/或，所述发酵培养的时间为10天；和/或，所述发酵培养的转速为200rpm。
8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，还包括先将所述基因工程菌接种于种子培养基中进行种子培养，得到培养物，然后将培养物转接至发酵培养基；
较佳地，所述种子培养基包括：2-2.5％纯黄豆粉、0.5-0.8％酵母浸粉、1.5-2.5％葡萄糖、0.5-0.8％L-赖氨酸盐酸盐；所述百分比为各组分占培养基的质量体积百分比(g/mL)；所述种子培养基的pH为6.5-7.5；和/或，所述转接的接种量为8-12％；
更佳地，所述种子培养基包括：2.1％纯黄豆粉、0.6％酵母浸粉、2％葡萄糖、0.6％L-赖氨酸盐酸盐；所述百分比为各组分占培养基的质量体积百分比(g/mL)；所述种子培养基的pH为7.0；和/或，所述转接的接种量为10％。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述种子培养为分级种子培养，包括：将所述基因工程菌接种于一级种子瓶进行一级扩大培养，将一级扩大培养的培养物转接至二级种子瓶中进行二级扩大培养，得到培养物；
较佳地，所述一级扩大培养的温度为20-32℃；所述一级扩大培养的时间为2-5天；所述一级扩大培养的转速为180-240rpm；和/或，所述二级扩大培养的温度为28-32℃；所述二级扩大培养的时间为18-30h；所述二级扩大培养的转速为180-240rpm；
更佳地，所述一级扩大培养的温度为30℃；所述一级扩大培养的时间为3天；所述一级扩大培养的转速为200rpm；和/或，所述二级扩大培养的温度为30℃；所述二级扩大培养的时间为24h；所述二级扩大培养的转速为200rpm。
10.如权利要求1-4任一项所述的基因工程菌在制备雷帕霉素中的应用。
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