KR20150122325A

KR20150122325A - 신규한 답토마이신 생산 균주 및 이를 이용한 답토마이신의 제조방법

Info

Publication number: KR20150122325A
Application number: KR1020140048166A
Authority: KR
Inventors: 서정우; 김병국; 서민정; 이경민; 김영우
Original assignee: 주식회사 종근당바이오
Priority date: 2014-04-22
Filing date: 2014-04-22
Publication date: 2015-11-02
Also published as: KR101601089B1

Abstract

본 발명은 답토마이신 생산능을 갖는 신규한 스트렙토마이세스(Streptomyces sp.) CKDBD 1100 균주(KCTC 12558BP)를 제공한다. 고농도의 데카노익산에 대한 내성을 갖는 본 발명의 스트렙토마이세스 속 CKDBD 1100 균주는 배양 시 전구체인 데카노익산 용액에 대한 저항성이 높아 최종적으로 야생주에 비해 현저히 향상된 답토마이신 생산성을 나타낸다. 고농도의 답토마이신에 대한 내성을 갖는 본 발명의 스트렙토마이세스 속 CKDBD 1100 균주는 배양 시 배양액에 축적되는 답토마이신에 대한 저항성이 높아 최종적으로 야생주에 비해 현저히 향상된 답토마이신 생산성을 나타낸다. 본 발명은 본 발명의 스트렙토마이세스 속 CKDBD 1100 균주를 이용한 답토마이신 생산방법을 제공한다. 본 발명은 스트렙토마이세스 속 CKDBD 1100 균주를 이용하여 생산성 향상 및 유연물질이 감소된 답토마이신 제조용 조성물을 제공함으로써 답토마이신 제조에 있어 원가 절감을 통한 경제성을 보장하므로 답토마이신 제조에 유리하게 사용된다.

Description

신규한 답토마이신 생산 균주 및 이를 이용한 답토마이신의 제조방법{Novel Strain Bacteria Producing Daptomycin and Preparing Method for Daptomycin Using the Same}

본 발명은 신규한 답토마이신 생산 균주 및 이를 이용한 답토마이신의 제조방법에 관한 것이다.

답토마이신은 메티실린 내성 스타필로코커스 아우레우스(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)나 반코마이신 내성 엔테로코카이(vancomycin-resistant Enterococci, VRE)를 포함하는 그람 양성 병원균에 효과적인 항생제이다(Clinical Infections Diseases, 38:P.1673-1681, 2004). 또한 답토마이신은 2003년 미국 식품의약국(Food and drug administration, FDA)으로부터 큐비신(Cubicin, Cubist Pharmaceuticals)이라는 제품명으로 그람 양성 병원균에 의해 발생되는 피부 감염 또는 피부 조직 감염의 치료제로 승인을 받았으며, 2006년에는 스타필로코커스 아우레우스와 메티실린 내성 스타필로코커스 아우레우스에 의해 발생되는 균혈증 또는 심내막염 치료제로 승인을 받았고 수요량도 증가 추세이다(Pharmacology, 81:P.79-91, 2008, African Journal of Biotechnology, 11:P.6241-6258, 2012).

스트렙토마이세스 로제오스포러스(Streptomyces roseosporus)는 2차 대사 산물로 13개의 아미노산과 하나의 지방산으로 구성되는 원형의 리포펩타이드 형태인 다양한 A21978C 유도체들을 생산한다(The Journal of Antibiotics, 40:P.761-777, 1987). 이 A21978C 유도체들 중 지방산이 결합하는 위치에 데카노익산이 결합된 구조가 답토마이신이며 이는 우수한 생물학적 활성을 가진다(The Journal of Antibiotics, 40:P.761-777, 1987).

답토마이신의 산업적 제조 공정은 효소에 의한 반합성법과 데카노익산 첨가를 통한 발효법으로 나뉜다. 효소에 의한 반합성법은 스트렙토마이세스 로제오스포러스로부터 A21978C를 생산하는 첫 번째 단계; 엑티노플라네스 우타헨시스(Actinoplanes utahensis)의 효소를 이용하여 탈아실화(deacylation) 반응을 시키는 두 번째 단계; 및 n-데카노일(n-decanoyl)기를 합성법으로 부착하는 세 번째 단계로 이루어진다(미국등록특허 제382,012호, Journal of Antibiotics, 41:P.1093-1105, 1988). 하지만 반합성법에 의한 답토마이신 제조는 공정이 매우 복잡하며 제조 단가가 높아 경제성이 낮다.

발효법에 의한 답토마이신의 제조는 스트렙토마이세스 로제오스포러스의 배양 시 전구체인 데카노익산 첨가를 통해 이루어진다(미국등록특허 제 4,885,243호). 따라서 발효법에 의한 답토마이신 제조 공정은 반합성법에 비해 단순하며 이에 따라 제조 기간이 단축되는 장점이 있다.

하지만 발효법으로 답토마이신을 생산할 경우 데카노익산이 스트렙토마이세스 로제오스포러스에 대해 강한 독성을 갖기 때문에 첨가 속도를 최소화하여야 하는 문제점이 있다(Journal of Biotechnology, 7:P.283-292, 1988). 이처럼 답토마이신 제조 시 전구체로 이용되는 데카노익산의 첨가 속도를 제한한다면 답토마이신 생산성 증가에는 한계가 있다. 이러한 문제점을 극복하기 위하여 데카노익산보다 독성이 낮은 데카날(decanal)이나 쿠페아 오일(cuphea oil)을 첨가하는 방법이 제안되었다(미국등록특허 제 8,313,922 B2호). 하지만 데카날은 데카노익산보다 고가로 산업적 이용에 한계가 있으며 쿠페아 오일은 천연 오일로 데카노익산 이외의 다른 지방산을 포함하고 있어 배양액 중 답토마이신 이외의 유연물질이 다량 생성되어 정제 과정의 비용이 상승하는 문제점이 있다.

한편, 답토마이신 제조용 균주에 관한 연구로 He-Ne 레이저와 NTG를 처리한 다음 데카노익산과 답토마이신에 대한 내성을 도입한 균주가 선발된 보고가 있지만 답토마이신 생산성이 약 600 mg/L로 낮아 산업적 가치가 낮다(Appl Biochem Biotechnol, 163:P.729-743, 2011). 디테르페노이드(diterpenoid) 항생제의 한 종류인 플루로뮤틸린(pleuromutilin)은 리보솜 서브유닛(ribosome subunit)의 펩티드기 전달효소(peptidyl transferase)에 결합하여 단백질 합성을 저해하는 물질로 이에 대한 내성을 도입한 균주가 개발되었지만 답토마이신 생산성은 80 mg/L로 여전히 낮은 수준이다(BioMed Research International, 2013). 또한, 스트렙토마이세스 로제오스포러스의 UV를 이용한 돌연변이 유발 결과, 약 2.5 g/L(7 L 발효조 배양)의 답토마이신 생산 균주를 개발한 특허가 있다(한국공개특허 제 10-2012-0058790호). 하지만 균주 개량 시 답토마이신 및 데카노익산에 대한 내성 도입이 없기 때문에 배양 과정 중 답토마이신 및 데카노익산에 의한 저해 문제가 해결되지 않았으며 답토마이신의 정제 공정 및 수율에 영향을 주는 배양액의 유연물질이 감소되지 않은 문제점이 있다. 따라서, 산업적으로 답토마이신을 제조하기 위해서는 발효법이 바람직하며 데카노익산 및 답토마이신에 대한 내성 도입을 통해 답토마이신의 생산성이 향상되고 유연물질이 감소되는 균주 및 이를 이용한 발효 공정 개발이 절실히 필요하다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 고농도의 데카노익산 및 답토마이신에 대한 내성을 가지고 동시에 답토마이신 생산성이 향상된 새로운 미생물을 개발하기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과, 토양으로부터 분리한 야생형 답토마이신 생산 균주에 돌연변이를 유도한 다음 고농도의 전구체(데카노익산) 및 생산물(답토마이신)에 대한 내성을 갖는 신규 균주를 선별하였고 이 변이주가 야생주와 비교하여 향상된 답토마이신 생산성을 갖는 것을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 향상된 답토마이신 생산능을 갖는 스트렙토마이세스 속 CKDBD 1100 균주(KCTC 12558BP)를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명의 균주를 이용하여 답토마이신을 생산하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명의 방법에 의해 생산된 답토마이신을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 균주를 포함하는 답토마이신 제조용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 답토마이신(daptomycin) 생산능을 갖는 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) CKDBD 1100 균주(KCTC 12558BP)를 제공한다.

본 발명자들은 고농도의 데카노익산 및 답토마이신에 대한 내성을 가지고 동시에 답토마이신 생산성이 향상된 새로운 미생물을 개발하기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과, 토양으로부터 분리한 야생형 답토마이신 생산 균주에 돌연변이를 유도한 다음 고농도의 전구체(데카노익산) 및 생산물(답토마이신)에 대한 내성을 갖는 신규 균주를 선별하였고 이 변이주가 야생주와 비교하여 향상된 답토마이신 생산성을 갖는 것을 규명하였다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 답토마이신을 생산하는 균주를 획득하기 위하여 한국 내 다양한 지역의 토양에서 시료를 채집하여 답토마이신을 생산하는 야생주를 분리한 다음, 돌연변이를 유도하여 변이주를 생산하고 이를 데카노익산 및 답토마이신의 농도가 최소억제농도(MIC)로부터 점진적으로 증가하는 배지에서 배양하여 내성이 증가한 균주를 선발하고 상기의 과정을 여러 번 반복하여 데카노익산; 10 mM 및 답토마이신; 3 g/L 이상의 농도에서도 생장하는 균주(CKDBD 1100 균주)를 선발하였다.

본 발명의 CKDBD 1100 균주는 16S rRNA 염기 서열 분석을 통하여 스트렙토마이세스 속 미생물로 동정되었으며 2014년 2월 19일자로 한국생명공학연구원 미생물자원센터(Korean Collection for Type Culture, KCTC)에 기탁하였고, 기탁번호 KCTC 12558BP를 부여받았다.

상기 야생주로부터 변이주를 제조하는 돌연변이 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용할 수 있으며, 예컨대 자외선 또는 X-선 조사 등과 같은 물리적 돌연변이원의 처리; 니트로소구아니딘(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin), 니트로젠 머스타드(nitrogen mustard) 및 메틸메탄 설포네이트(methylmethane sulfonate) 등과 같은 화학적 돌연변이원의 처리; 또는 DNA 재조합이나 P1 박테리오파아지(bacteriophage)를 매개로 한 형질도입 등의 방법을 이용할 수 있다.

본 발명의 스트렙토마이세스 속 CKDBD 1100 균주는 서열목록 제3서열의 16S rRNA 서열을 갖는다.

본 발명의 스트렙토마이세스 속 CKDBD 1100 균주는 고농도의 데카노익산 및 답토마이신에 내성을 가지며, 고농도의 데카노익산을 전구체로 이용하여 답토마이신을 생산하는 스트렙토마이세스 속 균주로서 야생균주와 비교하여 현저히 향상된 답토마이신 생산성을 가지고, 답토마이신 생산 과정에서 유연물질이 감소되는 특징을 나타낸다.

답토마이신 및 데카노익산은 균주의 생장을 저해하는 요소로 작용할 수 있으나 본 발명의 스트렙토마이세스 속 CKDBD 1100 균주는 고농도의 데카노익산 및 답토마이신에 내성을 가지기 때문에 배양 과정 중 답토마이신 및 데카노익산에 의한 생장저해를 억제하여 효과적으로 답토마이신을 생산할 수 있다. 이는 답토마이신 제조에 보다 우수한 경제성이 확보되었음을 의미한다.

본 발명에서 용어 “유연물질”은 답토마이신 생산 시 생성될 수 있는 불순물(출발물질, 중간물질, 부생성물, 분해생성물 등)을 의미한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 스트렙토마이세스 속 CKDBD 1100 균주는 야생형 스트렙토마이세스 속 균주와 비교하여 1.5배 내지 20배 증가된 답토마이신 생산능을 갖는다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 스트렙토마이세스 속 CKDBD 1100 균주는 야생형 스트렙토마이세스 속 균주와 비교하여 5배 내지 10배 증가된 답토마이신 생산능을 갖는다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 스트렙토마이세스 속 CKDBD 1100 균주는 균주 배양액 1 L 당 1-10 g의 답토마이신을 생산할 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 스트렙토마이세스 속 CKDBD 1100 균주는 균주 배양액 1 L 당 1.5-5 g의 답토마이신을 생산할 수 있다.

본 발명에 따르면, 본 발명 균주는 (1) 그람 양성, (2) 옅은 회색빛의 포자색, (3) 검붉은빛의 균사체 색상, (4) 0.5-1.0 cm의 콜로니(colony) 크기, (5) 둥근 융기형의 콜로니 모양 (6) 주름진 콜로니 표면 (7) 함몰된 형태의 콜로니 중앙부의 형태학적 특성을 가진다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 스트렙토마이세스 속 CKDBD 1100 균주를 이용한 답토마이신 발효방법을 제공한다.

상세하게는 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 답토마이신의 생산방법을 제공한다:

(a) 본 발명의 스트렙토마이세스 속 CKDBD 1100 균주를 배양시키는 단계; 및

(b) 상기 균주 또는 균주 배양액으로부터 답토마이신을 수득하는 단계.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)는 (ⅰ) 스트렙토마이세스 속 CKDBD 1100 균주를 콩가루, 덱스트린(dextrin), 소포제가 포함된 배지에서 종자 배양하는 단계; (ⅱ) 종자 증폭을 위해 상기 종자 배양액을 콩가루, 덱스트로스(dextrose), 덱스트린(dextrin), 탄산칼슘, 소포제가 포함된 발효조에서 전배양하는 단계; 및 (ⅲ) 답토마이신 생산을 위해 상기 전배양액을 효모 추출물, 콩가루, 탄산칼슘, 덱스트로스, 덱스트린, 소포제가 포함된 발효조에서 본배양하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 스트렙토마이세스 속 CKDBD 1100 균주의 종자 배양을 위한 배지는 콩가루 25 g/L, 덱스트린 25 g/L, 소포제 0.5 g/L를 포함하며, 발효조 전배양을 위한 배지는 콩가루 25 g/L, 덱스트로스 10 g/L, 덱스트린 60 g/L, 탄산칼슘 0.5 g/L, 소포제 0.5 g/L를 포함하고 발효조 본배양을 위한 배지는 효모 추출물 12.5 g/L, 콩가루 12.5 g/L, 탄산칼슘 0.2 g/L, 덱스트로스 10 g/L, 덱스트린 60 g/L, 소포제 0.5 g/L를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 답토마이신 생산을 위해 사용되는 배지 성분 및 첨가량은 당업계에 공지된 다양한 방법을 참고하여 당업자에 의해 결정될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 스트렙토마이세스 속 CKDBD 1100 균주를 이용하여 답토마이신을 배양하기 위한 배양 pH는 바람직하게는 pH 5-8이며, 보다 바람직하게는 pH 5.5-7.5이며, 보다 더 바람직하게는 pH 6.0-7.0이다. 답토마이신 발효를 위한 배양 온도 조건은 25-35℃이며 바람직하게는 28-32℃이다. 답토마이신 발효를 위한 용존 산소 조건은 20-80%이며 바람직하게는 30-70%이며 보다 바람직하게는 40-60%이다. 답토마이신 발효를 위한 교반 조건은 100-500 rpm이며 바람직하게는 100-400 rpm이며 더 바람직하게는 100-300 rpm이다. 답토마이신 발효를 위한 배양 시간 조건은 10-15일이며 바람직하게는 11-14일이며 더 바람직하게는 12-13일이다. 답토마이신 생산을 위한 배양 조건은 해당 기술 분야에 알려진 여러 가지 방법 혹은 균주, 배지 조성, 배양 규모 및 기타 고려사항에 따라 당업자의 실험에 의해 결정될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)에서 배양액에 데카노익산 용액을 첨가하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명에 따르면, 답토마이신 생산을 위해 첨가되는 데카노익산 용액은 오일류 및 유기용매 등에 데카노익산을 용해하여 조제한다. 데카노익산 용액의 조제는 해당 기술 분야에 알려진 여러 가지 방법 및 기타 고려사항에 따라 당업자의 실험에 의해 결정될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 답토마이신 생산을 위해 첨가되는 데카노익산 용액의 첨가 속도 조건은 0.1-1.0 mL/L시간이며, 바람직하게는 0.3-0.7 mL/L시간이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 데카노익산 용액의 첨가시점은 배양 시작 후 0시간 내지 50시간이고, 바람직하게는 10시간 내지 40시간이며, 보다 더 바람직하게는 20시간 내지 30시간이다.

하기 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 균주는 데카노익산 용액의 첨가 조건에 따라 생산성이 향상될 수 있다(표 6, 7 및 8 참조).

본 발명에서 규명한 데카오닉산 용액의 최적 첨가 조건에서 본 발명의 스트렙토마이세스 속 CKDBD 1100 균주는 야생주와 비교하여 현저히 향상된 답토마이신 생산능을 나타내며, 생산된 답토마이신의 순도 또한 야생주와 비교하여 현저히 높다.

상기 단계 (b)에서 스트렙토마이세스 속 CKDBD 1100 균주 또는 균주 배양액으로부터 답토마이신을 수득하는 단계는 당업계에 공지된 다양한 수득 방법을 이용하여 실시할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 스트렙토마이세스 속 CKDBD 1100 균주 배양물을 원심분리하여 배지 생등액과 균주를 분리한 다음, 배지 상등액에 적합한 추출용매를 첨가하여 답토마이신을 추출할 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 배지 상등액 뿐만 아니라 스트렙토마이세스 속 CKDBD 1100 균주 자체로부터 답토마이신을 수득할 수 있다. 예컨대, 스트렙토마이세스 속 CKDBD 1100 균주에 적합한 추출용매를 처리하여 답토마이신을 수득한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 생산된 답토마이신을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명의 스트렙토마이세스 속 CKDBD 1100 균주를 포함하는 답토마이신 제조용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 답토마이신 제조용 조성물에는 스트렙토마이세스 속 CKDBD 1100 균주, 균주 배양에 이용되는 다양한 종류의 배지 성분, 답토마이신 성분 및 답토마이신의 유연물질 등이 포함된다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 답토마이신 생산능을 갖는 신규한 스트렙토마이세스(Streptomyces sp.) CKDBD 1100 균주(KCTC 12558BP)를 제공한다.

(ⅱ) 고농도의 데카노익산에 대한 내성을 갖는 본 발명의 스트렙토마이세스 속 CKDBD 1100 균주는 배양 시 전구체인 데카노익산 용액에 대한 저항성이 높아 최종적으로 야생주에 비해 현저히 향상된 답토마이신 생산성을 나타낸다.

(ⅲ) 고농도의 답토마이신에 대한 내성을 갖는 본 발명의 스트렙토마이세스 속 CKDBD 1100 균주는 배양 시 배양액에 축적되는 답토마이신에 대한 저항성이 높아 최종적으로 야생주에 비해 현저히 향상된 답토마이신 생산성을 나타낸다.

(ⅳ) 본 발명은 본 발명의 스트렙토마이세스 속 CKDBD 1100 균주를 이용한 답토마이신 생산방법을 제공한다.

(ⅴ) 본 발명은 스트렙토마이세스 속 CKDBD 1100 균주를 이용하여 생산성 향상 및 유연물질이 감소된 답토마이신 제조용 조성물을 제공함으로써 답토마이신 제조에 있어 원가 절감을 통한 경제성을 보장하므로 답토마이신 제조에 유리하게 사용된다.

도 1은 CKDBD 1100 균주의 16s rRNA 염기 서열 분석 결과이며 이 균주가 속하는 스트렙토마이세스 속 균들에 대한 계통수를 나타낸 것이다.
도 2는 DW-0050 균주를 이용한 발효 배양액의 추출물을 고성능액체크로마토그래피/질량분석기로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 DW-0050 균주와 스트렙토마이세스 속 CKDBD 1100 균주를 최적화된 조건에서 발효한 배양액의 추출물을 고성능액체크로마토그래피로 분석한 결과이다. 이는 CKDBD 1100 균주의 답토마이신 생산성 증가 및 유연물질 감소를 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 스트렙토마이세스 속 DW-0050 균주의 분리

한국 내 다양한 지역의 토양에서 시료를 채집하여 멸균한 증류수에 토양 시료를 1:1로 혼합하였다. 침전물과 상층액을 분리시키기 위하여 정치 상태로 약 1시간 방치하였다. 분리된 상층액을 적정 농도로 희석한 다음, 희석액을 표 1의 DA 배지에 도말하여 28-32℃의 배양기에서 콜로니가 자랄 때까지 배양하였다. DA 배지에서 확인된 콜로니를 표 2의 DS 배지가 5 mL 첨가된 시험관에 접종 후 28-32℃, 220 rpm으로 20-30시간 동안 진동 배양하였다. 1 mL의 배양액은 표 3의 DM 배지에 접종하여 답토마이신 생산성 확인에 이용하고 나머지는 20% 글리세롤 용액과 동량 혼합하여 -70℃에서 동결 보관하였다.

상기 DS 배지의 배양액을 DM 배지가 20 mL 첨가된 100 mL 삼각플라스크에 1 mL 접종하여 5일간, 28-32℃에서 220 rpm으로 진동 배양하였다. 배양액을 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 획득된 상층액은 디스크 확산법(disc diffusion assay)을 통한 항균력 검증에 이용하였다. 검정균이 포함된 고체 배지에 디스크를 올리고 각각의 상층액을 접종하여 37℃에서 배양 후 검정균의 생장을 저해하는 정도(clear zone)가 우수한 균주를 선발하였다.

선발된 균주의 답토마이신 생산성은 고성능액체크로마토그래피 분석을 통해 확인하였다. 고성능액체크로마토그래피 분석을 위한 시료는 배양액을 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 획득한 상층액을 0.45 ㎛ 사이즈의 실린지 필터(syringe filter)로 여과 후 사용하였다. 고성능액체크로마토그래피 분석을 위한 이동상은 3차 증류수, 트리에틸아민(tryethylamine), 인산 및 아세토나이트릴(acetonitrile)을 포함한다. 유속은 1 mL/분이며 옥타데실실란이 결합된 실리카겔 컬럼(octadecylsilane linkage silica gel column)을 이용하여 분석하였다. 고성능액체크로마토그래피는 Waters 2695 모델을 이용하였으며 검출기는 Waters 2998 광다이오드 배열 검출기(photodiode array detector)를 사용하였다.

선발된 균주의 고성능액체크로마토그래피 분석 결과, DW-0007; 3 mg/L, DW-0046; 2 mg/L, DW-0050; 5 mg/L 및 DW-0071; 2 mg/L의 답토마이신 생산성을 확인하였다.

최종 선발된 DW-0050의 액체크로마토그래피/질량분석기를 통한 분자량 분석 결과, 답토마이신의 분자량 1,620이 확인되었다(도 3).

답토마이신 생산균 선발을 위해 사용된 DA 배지

성분	농도(g/L)
효모 추출물	4
맥아 추출물	10
덱스트로스	4
한천	20

답토마이신 생산균 선발을 위해 사용된 DS 배지

성분	농도(g/L)
콩가루	25
덱스트로스	25
SAG-471	0.5

답토마이신 생산균 선발을 위해 사용된 DM 배지

성분	농도(g/L)
덱스트린	60
덱스트로스	10
콩가루	20
탄산칼슘	1
옥살산	2
SAG-471	0.5

실시예 2: 스트렙토마이세스 속 DW-0050 균주를 이용하여 고농도의 데카노익산 및 답토마이신에 대한 내성을 갖는 변이주 선발

2-1. 데카노익산에 대한 내성을 갖는 변이주 선발

실시예 1에서 선발된 DW-0050 균주에 돌연변이원을 처리하여 데카노익산에 대한 내성을 갖는 균주를 선발하였다. 처리한 돌연변이원은 화학적 혹은 물리적 돌연변이원이며 주로 물리적 돌연변이원인 자외선 조사법을 이용하였다. -70℃에서 동결보관되어 있는 포자 현탁액을 멸균한 증류수로 10배 희석하여 교반하면서 자외선을 230 ㎼/cm²로 120초 동안 조사하였다. 표 2의 DS 배지에 데카노익산을 1 mM 농도로 첨가하여 빛을 차단한 다음 28-32℃, 220 rpm 조건에서 1-2일간 배양하였다. 배양액을 멸균한 증류수로 희석한 다음 개별 콜로니가 구별될 수 있도록 표 1의 DA 배지에 도말하였다. 28-32℃에서 8-12일간 배양 후 콜로니를 선발하고 DA 배지에서 증폭 과정을 거쳐 수확한 다음 데카노익산 내성 균주를 선발하였다.

2-2. 답토마이신에 대한 내성을 갖는 변이주 선발

실시예 2-1에서 선발된 데카노익산 내성 균주에 돌연변이원을 처리하여 답토마이신 내성 균주를 선발하였다. 처리한 돌연변이원은 화학적 혹은 물리적 돌연변이원이며 주로 화학적 돌연변이원인 니트로소구아니딘을 이용하였다. 대상 균주를 표 2의 DS 배지에 접종하여 28-32℃에서 초기 대수증식기인 16시간까지 배양하였다. 상기 배양액 5 mL을 취한 다음 원심분리하여 상등액을 버리고 증류수로 2회 세척 후 pH 6.5인 50 mM 인산칼륨 완충용액에 현탁시켰다. 이 세포현탁액 5 mL에 니트로소구아니딘을 최소 농도 1-2 mg/L가 되도록 첨가하고 28-32℃, 220 rpm 조건에서 1시간 동안 교반하였다. 교반 후 50 mM 인산칼륨 완충용액으로 2회 세척한 다음 개별의 콜로니가 구별될 수 있도록 희석하여 0.3 g/L의 답토마이신이 포함된 표 1의 DA 배지에 도말하였다. 28-32℃에서 8-12일 배양 후 콜로니를 선발하여 DA 배지에서 증폭 과정을 거쳐 수확한 다음 답토마이신 내성 균주를 선발하였다.

상기 변이주 선발 과정은 2-1의 데카노익산에 대한 내성이 도입된 균주에 2-2의 답토마이신에 대한 내성을 도입 후 다시 2-1의 데카노익산에 대한 내성을 도입하는 방식으로 데카노익산과 답토마이신에 대한 내성 도입을 각각 교대로 진행하였다. 변이주 선발 과정에서 첨가되는 데카노익산과 답토마이신의 적용 농도는 점진적으로 증가되었으며 최대 적용 농도는 각각 10 mM과 3 g/L이었다. 상기의 과정을 통하여 데카노익산과 답토마이신에 대해 우수한 내성을 가지는 46주의 변이주를 1차 선발하였다. 1차 선발된 46주의 변이주 중 야생주 DW-0050과 비교하여 답토마이신 생산성이 현저히 우수한 4주의 변이주를 2차 선발하였다.

실시예 3: 답토마이신 생산성이 향상된 스트렙토마이세스 속 CKDBD 1100 균주 선발

실시예 1에서 선발된 야생주 DW-0050과 실시예 2에서 최종 선발된 4주의 변이주에 대한 답토마이신 생산성 및 순도를 비교하였다. 발효조 배양을 위하여 상기의 과제의 해결 수단에 기술된 종자배양, 전배양 및 본배양의 배지 조성을 적용하였다. 종자배양은 500 mL의 삼각 플라스크에서 50 mL의 부피로 배양을 진행하였으며 배양 온도는 28-32℃, 교반 속도는 120 rpm으로 유지하여 20-30시간 동안 배양하였다. 전배양은 5 L의 발효조에서 2 L의 부피로 배양을 진행하였고 초기 교반 속도는 200 rpm, 배양 온도는 28-32℃, 용존 산소량은 40-60%로 유지하여 20-30시간 동안 배양하였다. 본배양은 5 L의 발효조에서 2 L의 부피로 배양을 진행하였으며 초기 교반 속도는 200 rpm, 배양 온도는 28-32℃, 용존 산소량은 40-60%, pH는 6-7로 유지하였다. 데카노익산 용액은 0.3-0.7 mL/L시간의 속도로 첨가였으며 배양은 12-13일간 진행하였다. 야생주와 변이주 각각에 대한 답토마이신 생산성 및 순도는 표 4와 같다. 가장 우수한 답토마이신 생산성 및 순도를 나타내는 DM-3302 균주를 스트렙토마이세스 속 CKDBD 1100 균주라 명명하였다.

야생주 DW-0050과 각각의 변이주에 대한 답토마이신 생산성 및 순도

균주명	PMV¹(%)	답토마이신(g/L)	순도(%)
DW-0050	9	0.3	30.3
DM-0803	20	1.2	45.7
DM-1504	29	1.8	52.4
DM-2610	29	2.3	63.3
DM-3302	32	2.6	65.7

¹ PMV : packed mycelium volume

실시예 4: 스트렙토마이세스 속 신규 균주의 동정

실시예 1과 실시예 2에서 선발된 균주의 16S rRNA의 염기 서열 분석은 솔젠트(주. SolGent)에 의뢰하여 진행하였다. 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석하기 위하여 DW-0050과 CKDBD 1100의 총 염색체 DNA를 주형으로 하고 세균의 16S rRNA 유전자 보존적 지역의 염기서열 16S-27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'; 서열목록 제1서열) 및 16S-1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3' 서열목록 제2서열)을 프라이머로 사용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하였다. 증폭된 PCR 산물을 정제한 다음 BigDye와 ABI(Applied, 미국)를 사용하여 염기서열을 결정하고, 이를 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 데이터 베이스와 Blast 프로그램으로 비교 분석하였다.

DW-0050 균주는 16S rRNA 서열 결정과 계통수 분석 결과, 스트렙토마이세스 속 균주로 확인되었다. 그리고 CKDBD 1100 균주의 16S rRNA 서열(서열목록 제3서열)을 결정하고, 이를 바탕으로 계통수 분석을 실시하였다. 분석된 염기서열은 총 1,400 bp이었으며, NCBI 탐색 결과 스트렙토마이세스 속 GZ23과 스트렙토마이세스 속 13CM4에서 99% 이상의 높은 상동성을 나타내었다. 따라서 선발된 CKDBD 1100 균주 또한 스트렙토마이세스 속 균주라는 결과를 확인하였다(도 1).

실시예 1과 실시예 2에서 선발된 균주의 형태학적 특징을 관찰하기 위하여 그람 염색 및 외형 관찰 등을 실시하였다. 각각의 균주를 멸균한 증류수로 희석 후 표 1의 DA 배지에 도말하여 생성되는 콜로니에 대한 그람 염색을 실시하였으며 콜로니의 크기, 모양 및 색상 등을 관찰하였다(표 5).

또한, DW-0050과 비교하여 변이주가 포함하는 세포막의 지방산 변화를 확인하고자 인지질 추출 및 분석을 진행하였다(Microbiology, 142:P.469-475, 1996). 분석 결과는 하기의 표 5에 나타내었다. CKDBD 1100 균주는 데카노익산에 대한 내성이 도입된 변이주이지만 C10(데카노익산) 함량의 변화는 미미하였다. 하지만, DW-0050 균주에 비해 CKDBD 1100 균주의 불포화 지방산 함량이 크게 증가한 것을 확인하였다.

DW-0050 균주와 CKDBD 1100 균주의 특징

성분	DW-0050	CKDBD 1100
그람 염색	양성	양성
포자 형성	양성	양성
포자 색상	흰색	옅은 회색
균사체 색상	옅은 노란색	검붉은색
콜로니 크기	0.5-1.0cm	0.5-1.0cm
콜로니 모양	둥근 융기형	둥근 융기형
콜로니 표면	주름	주름
콜로니 중앙부	함몰	함몰
C10(%)	1.24	1.36
불포화 지방산(%)	51.7	59.4
포화 지방산(%)	43.1	35.6

실시예 5: 데카노익산 용액의 첨가 시점에 따른 답토마이신 생산성 비교

발효조에서 데카노익산 용액의 첨가 시점에 따른 답토마이신 생산성 확인을 위하여 데카노익산 용액을 배양 후 0, 10, 20, 30, 40 및 50시간부터 배양 종료 시까지 각각 첨가하였다. 배지 조성 및 배양 조건은 상기의 실시 예 3과 동일하게 진행하였으며 첨가 속도는 0.3-0.7 mL/L시간이었고 결과는 아래의 표 6과 같다. 데카노익산 용액을 0시간 또는 10시간에 각각 첨가하였을 때, DW-0050 균주에서는 답토마이신이 생산되지 않았으나 CKDBD 1100 균주에서는 답토마이신이 생산되었다. DW-0050 균주의 배양 시 최적 첨가 시간은 40시간인 반면, CKDBD 1100 균주의 배양 시에는 최적 첨가 시간이 30시간이었다. 이는 CKDBD 1100 균주의 데카노익산에 대한 내성이 DW-0050 균주보다 증가되었음을 나타낸다.

데카노익산 용액의 첨가 시점에 따른 답토마이신 생산성

첨가 시점(배양 경과 시간)	답토마이신(g/L)
첨가 시점(배양 경과 시간)	DW-0050	CKDBD 1100
0	0.0	0.2
10	0.0	1.3
20	0.1	2.2
30	0.2	2.6
40	0.3	2.0
50	0.1	1.7

실시예 6: 데카노익산 용액의 첨가 속도에 따른 답토마이신 생산성 비교

데카노익산에 의한 저해로 데카노익산 용액의 첨가 속도는 균이 저해되지 않는 범위 내에서 엄격하게 조절되어야 하기 때문에 데카노익산 용액의 최적 첨가 속도가 확인되어야 한다. 데카노익산 용액은 배양 후 20-30시간부터 0.1-1.0 mL/L시간 범위로 첨가하였고 배지 조성 및 배양 조건은 상기의 실시예 3과 동일하게 진행하였다. 데카노익산 용액의 첨가 속도에 따른 답토마이신 생산성은 아래의 표 7과 같았다. 답토마이신의 전구체가 되는 데카노익산 용액의 첨가 속도가 빠를수록 답토마이신 생산성은 증가되지만 최대 생산성을 나타내는 첨가 속도 이상에서는 생산성이 감소되었다. 또한 DW-0050 균주와 CKDBD 1100 균주는 첨가 속도 0.1 mL/L시간과 0.5 mL/L시간에서 각각 최대의 답토마이신 생산성을 나타냈다. 이는 CKDBD 1100 균주의 데카노익산에 대한 내성이 DW-0050 균주보다 증가되었음을 나타낸다.

데카노익산 용액의 첨가 속도에 따른 답토마이신 생산성

첨가 속도(mL/L시간)	답토마이신(g/L)
첨가 속도(mL/L시간)	DW-0050	CKDBD 1100
0.1	0.2	2.0
0.3	0.1	2.2
0.5	0.0	2.6
0.7	0.0	2.1
1.0	0.0	1.5

실시예 7: 데카노익산 용액의 최적 첨가 조건에서 답토마이신 생산성 비교

실시예 1에서 선발된 DW-0050 균주와 실시예 2에서 선발된 CKDBD 1100 균주를 이용하여 데카노익산 용액의 최적 첨가 조건에서 답토마이신 발효를 실시하였다. 발효조 배양을 위하여 상기의 과제의 해결 수단에 기술된 종자배양, 전배양 및 본배양의 배지 조성을 적용하였다. 종자배양 및 전배양 조건은 실시예 3과 동일하며 본배양은 18 L의 발효조에서 11 L의 부피로 진행하였다. 본배양의 초기 교반 속도는 200 rpm, 배양 온도는 28-32℃, 용존 산소량은 40-60%, pH는 6-7로 유지하여 12-13일간 배양하였다. 데카노익산 용액의 첨가 시점 및 첨가 속도는 상기의 실시예 5와 6에서 확립된 최적 조건에 따라 30시간 및 0.5 mL/L시간으로 진행하였다. 표 8의 결과와 같이, CKDBD 1100 균주는 최적화된 배양 조건 하에서 3.1 g/L의 답토마이신을 생산하였다. 이는 DW-0050 균주와 비교하여 약 10배의 생산성이 향상된 것이다.

또한, CKDBD 1100 균주에 의한 발효 배양액의 답토마이신 순도가 DW-0050 균주에 의한 발효 배양액의 답토마이신 순도보다 약 50% 개선되었다(도 2). 따라서 CKDBD 1100 균주의 유연물질이 DW-0050 균주보다 감소되었기 때문에 답토마이신 정제 공정이 단순화되고 수율이 향상될 수 있다.

데카노익산 용액의 최적 첨가 조건에서 DW-0050 균주와 CKDBD 1100 균주의 답토마이신 생산성 및 순도 확인

균주	답토마이신(g/L)	순도(%)
DW-0050	0.3	32.7
CKDBD 1100	3.1	72.3

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

한국생명공학연구원

KCTC12558BP

20140219

<110> Chong Kun Dang Bio. Co., Ltd. <120> Novel Strain Bacteria Producing Daptomycin and Preparing Method for Daptomycin Using the Same <130> PN140109 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S-27F primer <400> 1 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S-1492R primer <400> 2 ggttaccttg ttacgactt 19 <210> 3 <211> 1400 <212> RNA <213> CKDBD 1100 16S rRNA <400> 3 gctccctccc acaaggggtt gggccaccgg cttcgggtgt taccgacttt cgtgacgtga 60 cgggcggtgt gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgcag caatgctgat ctgcgattac 120 tagcaactcc gacttcatgg ggtcgagttg cagaccccaa tccgaactga gaccggcttt 180 ttgagattcg ctccgcctcg cggcatcgca gctcattgta ccggccattg tagcacgtgt 240 gcagcccaag acataagggg catgatgact tgacgtcgtc cccaccttcc tccgagttga 300 ccccggcagt ctcctgtgag tccccatcac ccccgaaggg catgctggca acacagaaca 360 agggttgcgc tcgttgcggg acttaaccca acatctcacg acacgagctg acgacagcca 420 tgcaccacct gtataccgac cacaaggggg gcaccatctc tgatgctttc cggtatatgt 480 caagccttgg taaggttctt cgcgttgcgt cgaattaagc cacatgctcc gctgcttgtg 540 cgggcccccg tcaattcctt tgagttttag ccttgcggcc gtactcccca ggcggggaac 600 ttaatgcgtt agctgcggca ccgacgacgt ggaatgtcgc caacacctag ttcccaacgt 660 ttacggcgtg gactaccagg gtatctaatc ctgttcgctc cccacgcttt cgctcctcag 720 cgtcagtaat ggcccagaga tccgccttcg ccaccggtgt tcctcctgat atctgcgcat 780 ttcaccgcta caccaggaat tccgatctcc cctaccacac tctagctagc ccgtatcgaa 840 tgcagacccg gggttaagcc ccgggctttc acatccgacg tgacaagccg cctacgagct 900 ctttacgccc aataattccg gacaacgctt gcgccctacg tattaccgcg gctgctggca 960 cgtagttagc cggcgcttct tctgcaggta ccgtcacttt cgcttcttcc ctgctgaaag 1020 aggtttacaa cccgaaggcc gtcatccctc acgcggcgtc gctgcatcag gctttcgccc 1080 attgtgcaat attccccact gctgcctccc gtaggagtct gggccgtgtc tcagtcccag 1140 tgtggccggt cgccctctca ggccggctac ccgtcgtcgc cttggtaggc cattacccca 1200 ccaacaagct gataggccgc gggctcatcc ttcaccgccg gagctttcaa ccccgtccca 1260 tgcgggacag agtgttatcc ggtattagac cccgtttcca gggcttgtcc cagagtgaag 1320 ggcagattgc ccacgtgtta ctcacccgtt cgccactaat ccaccaccga agtgatttca 1380 tcntcgactg catgntaagc 1400

Claims

답토마이신(daptomycin) 생산능을 갖는 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) CKDBD 1100 균주(KCTC 12558BP)
제 1 항에 있어서, 상기 균주는 서열목록 제3서열의 16S rRNA 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 스트렙토마이세스 속 CKDBD 1100 균주.
제 1 항에 있어서, 상기 균주는 데카노익산(decanoic acid)에 대하여 내성을 갖는 것을 특징으로 하는 스트렙토마이세스 속 CKDBD 1100 균주.
제 1 항에 있어서, 상기 균주는 답토마이신에 대하여 내성을 갖는 것을 특징으로 하는 스트렙토마이세스 속 CKDBD 1100 균주.
제 1 항에 있어서, 상기 균주는 야생형 스트렙토마이세스 속 균주와 비교하여 1.5배 내지 10배 증가된 답토마이신 생산능을 갖는 것을 특징으로 하는 스트렙토마이세스 속 CKDBD 1100 균주.
제 1 항에 있어서, 상기 균주는 야생형 스트렙토마이세스 속 균주와 비교하여 감소된 유연물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 스트렙토마이세스 속 CKDBD 1100 균주.
제 1 항에 있어서, 상기 균주는 균주 배양액 1 L 당 1-10 g의 답토마이신을 생산하는 것을 특징으로 하는 스트렙토마이세스 속 CKDBD 1100 균주.
다음의 단계를 포함하는 답토마이신의 생산방법:
(a) 상기 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 스트렙토마이세스 속 CKDBD 1100 균주를 배양시키는 단계; 및
(b) 상기 균주 또는 균주 배양액으로부터 답토마이신을 수득하는 단계.
제 8 항에 있어서, 상기 단계 (a)에서 배양액에 데카노익산 용액을 첨가하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 답토마이신의 생산방법.
제 9 항에 있어서, 상기 데카노익산 용액은 0.1 mL/L시간 내지 1.0 mL/L시간의 속도로 첨가하는 것을 특징으로 하는 답토마이신의 생산방법.
제 9 항에 있어서, 상기 데카노익산 용액은 배양 시작 후 0시간 내지 50시간 내에 첨가하는 것을 특징으로 하는 답토마이신의 생산방법.
제 8 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항의 생산방법에 의해 생산된 답토마이신.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 스트렙토마이세스 속 CKDBD 1100 균주를 포함하는 답토마이신 제조용 조성물.