JP5891169B2 - タクロリムスの調製のための方法 - Google Patents

Description

本発明は、免疫抑制化合物タクロリムスの調製のための方法に関する。微生物ストレプトマイセス・ツクバエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）（Ｓ．ツクバエンシス）の遺伝子改変株、およびこれらの遺伝子改変株を培養し、次いで免疫抑制化合物を単離することによるタクロリムス（ＦＫ−５０６）またはこの塩もしくは誘導体の調製のための改善された発酵プロセスも対象とする。

さらに本発明は、アリルマロニルＣｏＡ生合成経路のための、詳細にはＳ．ツクバエンシス中でタクロリムス生合成遺伝子クラスターに位置する酵素をコードする新規遺伝子およびＳ．ツクバエンシスの遺伝子改変株であって、これらの遺伝子が過剰発現および／または不活性化されている新規遺伝子および遺伝子改変株に関する。

ＷＯ ２０１０／００４３０４、ＭｏｓｓらはＦＫ−５０６またはＦＫ−５２０を生成する株を記載している。

ＦＫ−５０６（Ｆｅｒｍｅｎｔｅｋカタログ番号５０６）とも称されるタクロリムスは、２３員環マクロライドラクトンであり、ポリケチド群に属する。タクロリムスは、１９８０年代に土壌細菌ストレプトマイセス・ツクバエンシスの発酵培地から最初に単離された。抗生物質マクロライド化合物タクロリムスは、例えば１９８４年にＫｉｎｏら（Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ４０、１２４９−１２５５頁、１９８４）において報告された。その後タクロリムスは、さまざまな微生物、すなわちストレプトマイセス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ）ＭＡ６８５８（ＵＳ５，１１６，７５６）ＡＴＣＣ５５０９８、ストレプトマイセス・ツクバエンシス ＮＲＲＬ１８４８８（ＥＰ−Ｂ ０３５６３９９およびＵＳ５，２００，４１１）、ストレプトマイセス・クラブリゲルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ） ＣＫＤ １１１９（ＫＲ−Ｂ １００４８５８７７）またはストレプトマイセス・グラウセセンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｌａｕｃｅｓｃｅｎｓ）ＭＴＣＣ ５１１５（ＵＳ２００７ １９１４１５）などの土壌細菌を使用することにより微生物の天然生成物として調製された。

生成物タクロリムスは、酵素ペプチジルプロピルイソメラーゼの活性を低下させるその効果およびタンパク質イムノフィリンＦＫＢＰ１２（ＦＫ５０６結合タンパク質）に結合するその効果により免疫抑制活性を示す。タクロリムスならびに構造的に類似しているポリケチド、アスコマイシンおよびラパマイシンは、生理学的に活性となるために高度に保存されたタンパク質シクロフィリンＦＫＢＰ１２への最初の結合を必要とする。ラパマイシン／ＦＫＢＰ１２複合体はｍＴＯＲ（ラパマイシンの哺乳類での標的）、細胞環境を感受するためおよび翻訳開始を制御するための中心制御器として作用すると考えられるセリン−スレオニンキナーゼへ結合する（例えば、Ｅａｓｔｏｎ Ｊ．Ｂ．およびＨｏｕｇｈｔｏｎ Ｐ．Ｊ．、２００４、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｔｈｅｒ Ｔａｒｇｅｔｓ、８（６）：５５１−６４頁を参照されたい。）。しかしタクロリムス／ＦＫＢＰ１２複合体は、シクロスポリンと同様に、さまざまな細胞標的に結合することが見出され、カルシニューリンのホスファターゼ活性を阻害する（Ａｌｌｉｓｏｎ Ａ．Ｃ．、２０００、Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ；４７（２−３）：６３−８３頁を参照されたい。）。

タクロリムスは、例えば臓器移植後に免疫抑制のためにしばしば使用される。さらにタクロリムスおよびその誘導体は、喘息、炎症性疾患および過剰増殖性皮膚疾患など多数の疾患を治療することにおいて効果的であることが示されている。タクロリムスおよびラパマイシン、シクロスポリンなどの他の免疫抑制剤またはこれらの組合せも種々の自己免疫疾患の治療において有用である。長年にわたりカルシニューリン阻害剤（例えばシクロスポリンおよびタクロリムス）は、免疫抑制療法の中心である。これら２つの化合物は、細胞性免疫応答の強力な抑制因子であり、過去２０年間における臓器移植の転帰を顕著に改善している（Ａｌｌｉｓｏｎ Ａ．Ｃ．、２０００、Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ；４７（２−３）：６３−８３頁を参照されたい。）。

マクロライド、ラパマイシン、アスコマイシンおよびタクロリムスの遺伝子クラスターを含む、微生物由来の多数の医学的に重要な薬物の生合成経路をコードしている遺伝子クラスターは、既にクローン化され、配列決定されている。タクロリムス遺伝子クラスターのクローン化に関しては、ポリケチド合成酵素（ＰＫＳ）をコードしている遺伝子を主に包含する部分配列が文献において報告された（Ｍｏｔａｍｅｄｉ Ｈ．およびＳｈａｆｉｅｅ Ａ．、１９９８、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ；２５６（３）：５２８−３４頁を参照されたい。）。一方、科学者らは、２０００年にアスコマイシン遺伝子クラスターのクローン化を報告した（Ｗｕ Ｋら、２０００、Ｇｅｎｅ；２５１（１）：８１−９０頁、ＵＳ６，５０３，７３７を参照されたい。）。タクロリムスは、構造的におよび生合成的起源についてアスコマイシン（ＦＫ５２０）およびラパマイシンに類似している（Ｒｅｙｎｏｌｄｓら、；Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９９７、８２、４９７−５２０頁を参照されたい。）。これらすべては、ポリケチド（ＰＫＳ）と非リボソーム性ペプチド生合成経路（ＮＲＰＳ）との組合せによって合成されうる（ＭｃＤａｎｉｅｌ Ｒら、２００５、Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ；１０５（２）：５４３−５８頁を参照されたい。）。

タクロリムスおよびアスコマイシンは構造的に類似している。唯一の構造的差異としてタクロリムスの炭素２１におけるアリル側鎖が、アスコマイシンにおいてはエチル側鎖によって置換されている。タクロリムス（ＦＫ５０６）およびアスコマイシン（ＦＫ５２０）化合物の構造は、式（Ｉａ）および（Ｉｂ）に示されている。

アスコマイシンおよびタクロリムスの構造は、生合成機構を考慮して４つのステップに分割されうる複合的生合成経路：
１．独特なシキミ酸由来スターターを使用する鎖の開始、
２．大部分のＰＫＳ由来化合物に共通の鎖の伸長、
３．Ｌ−ピペコリン酸の組み込みによる鎖の終結および環化ならびに
４．ＰＫＳ後処理
を既に示唆している。

国際公開第２０１０／００４３０４号 米国特許第５１１６７５６号明細書 欧州特許第０３５６３９９号明細書 米国特許第５２００４１１号明細書 韓国特許第１００４８５８７７号明細書 米国特許出願公開第２００７／１９１４１５号明細書 米国特許第６５０３７３７号明細書

Ｋｉｎｏら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ４０、１２４９−１２５５頁、１９８４ Ｅａｓｔｏｎ Ｊ．Ｂ．およびＨｏｕｇｈｔｏｎ Ｐ．Ｊ． ２００４、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｔｈｅｒ Ｔａｒｇｅｔｓ、８（６）：５５１−６４頁 Ａｌｌｉｓｏｎ Ａ．Ｃ．、２０００、Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ；４７（２−３）６３−８３頁 Ｍｏｔａｍｅｄｉ Ｈ．およびＳｈａｆｉｅｅ Ａ．、１９９８、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ；２５６（３）５２８−３４頁 Ｗｕ Ｋら、２０００、Ｇｅｎｅ；２５１（１）８１−９０頁 Ｒｅｙｎｏｌｄｓら、；Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９９７、８２、４９７−５２０頁 ＭｃＤａｎｉｅｌ Ｒら、２００５、Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ；１０５（２）：５４３−５８頁

タクロリムス発酵プロセスにおいて、望ましくないアスコマイシン（ＦＫ５２０）生成物も不純物として生成され、それによりタクロリムスの最終収量が低下し、タクロリムスの下流単離プロセスに著しい追加的経費を生じる。

詳細には本発明は、薬剤の調製のためおよびヒトを含む哺乳類の治療のための上に定義した式（Ｉａ）もしくは式（Ｉｂ）の化合物またはこれらの光学異性体、薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和化合物もしくは多形体の使用に関する。本発明は、ヒトを含む動物における状態または疾患の予防および／または治療のための薬剤の調製のための化合物の使用に関する。

エチルマロニルＣｏＡは、アスコマイシン（ＦＫ５２０）生合成のための重要な基本単位として周知である。Ｓ．ハイグロスコピウス（Ｓ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｕｓ）において見出された生合成アスコマイシンクラスターに位置し、アスコマイシン生合成に関与する以下の遺伝子は、最先端として報告されており（Ｌｉｕら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１９９９、１８１、６８０６−６８１３；Ｌｉｕら、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２００１、３、４０−４８頁を参照されたい。）、関連があると考えられる：
ａ）クロトニルＣｏＡ還元酵素（ｃｃｒ遺伝子）をコードする遺伝子、
ｂ）Ｂ_１２依存性イソブチリルＣｏＡムターゼ（ｉｃｍ遺伝子）をコードする遺伝子、
ｃ）エチルマロニルＣｏＡムターゼ（ｅｃｍ遺伝子）をコードする遺伝子。

いくつかのポリケチド由来化合物のポリケチド鎖アセンブリの特定の段階においてエチルマロニルＣｏＡ伸長単位を提供する生合成経路は、最先端として記載されている（Ｗｕら、ｌｏｃ．ｃｉｔ；Ｒｅｙｎｏｌｄｓら、ｌｏｃ．ｃｉｔを参照されたい。）。エチルマロニルＣｏＡ伸長単位は、ブチリルＣｏＡのカルボキシル化反応によって誘導されると考えられる。ブチリルＣｏＡをもたらす少なくとも２つの経路がストレプトマイセスにおいて同定されている。一経路は２つの酢酸単位の縮合を含み、それによりアセト酢酸ＣｏＡ活性化化合物を形成し、これはさらにクロトニルＣｏＡに加工され、クロトニルＣｏＡ還元酵素（ｃｃｒ）によって触媒されるクロトニルＣｏＡからブチリルＣｏＡへの還元の重要なステップを通じて処理される（Ｗａｌｌａｃｅ Ｋ．Ｋ．ら、１９９５、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ；２３３：９５４−９６２頁を参照されたい。）。この遺伝子は、一次代謝遺伝子セット中に位置していることが見出されたＳ．コリヌス（Ｓ．ｃｏｌｌｉｎｕｓ）において最初に同定された。後にその相同体が、エチルマロニルＣｏＡを前駆体として必要とするいくつかの化合物をコードしている生合成クラスターにおいて同定された（Ｃｒｏｐｐら、２００１、Ｊ Ｉｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ；２７：３６８−３７７頁を参照されたい。）。

近年、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）中のｃｃｒ相同体が、クロトニルＣｏＡのエチルマロニルＣｏＡへの還元カルボキシル化を触媒するクロトニルＣｏＡカルボキシラーゼ／還元酵素活性を有する酵素をコードしていることが示された（Ｅｒｂ Ｔ．Ｊ．ら、２００７、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ；２５：１０６３１−１０６３６頁を参照されたい。）。さらにこの酵素は、イソクエン酸リアーゼ遺伝子を欠失している微生物の酢酸を唯一の炭素源とした増殖を可能にする「エチルマロニル−ＣｏＡ経路」と称される新たに発見された酢酸同化経路の一部であることが示された。この経路は、いくつかのステップを含むと予測されている。先の予測のとおりこれは２つのアセチルＣｏＡ単位の縮合および続くクロトニルＣｏＡへの加工によって開始される。次いでクロトニルＣｏＡは、最初に（２Ｒ）−エチルマロニルＣｏＡにエピマー化され、次にビタミンＢ１２依存性エチルマロニルＣｏＡムターゼ（ｅｃｍ）によってメチルスクシニルＣｏＡに転換される（２Ｓ）−エチルマロニルＣｏＡにＣｃｒによって直接転換される（Ｅｒｂ Ｔ．Ｊ．ら、２００８、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ；２８３：３２２８３−３２２９３頁を参照されたい。）。続いて、メチルスクシニルＣｏＡは、メチルスクシニルＣｏＡ脱水素酵素によってメサコニルＣｏＡに転換され、次のステップにおいてメサコニルＣｏＡは、メサコニルＣｏＡ脱水酵素によってβ−メチルマリルＣｏＡに転換される。最後に、β−メチルマリルＣｏＡは、グリオキシル酸と、次に既知の代謝経路に入るプロピオニルＣｏＡとに切断される。グリオキシル酸はアセチルＣｏＡと縮合されてリンゴ酸を生じることができ、プロピオニルＣｏＡはメチルマロニルＣｏＡおよび次いでスクシニルＣｏＡにカルボキシル化されうる。興味深いことにいくつかのストレプトマイセス属種は、ｅｃｍ経路に関与するいくつかの遺伝子をクラスターとしてコードし、唯一の炭素源としての酢酸酪酸または脂肪酸での増殖の際にこの経路がストレプトマイセスにおいて活性であることを示唆している（Ａｋｏｐｉａｎｔｓ Ｋ．ら、Ｊ Ｉｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ；３３：１４１−１５０頁を参照されたい。）。

バリン代謝物、イソブチリルＣｏＡの異性化ステップを通じて進行し、ブチリルＣｏＡを形成し、補酵素Ｂ１２依存性イソブチリルＣｏＡムターゼ（ｉｃｍ）によって触媒される第２経路が提案されている（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ Ｋ．ら、１９８８、Ｊ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ １；３１９５−３２０７頁；およびＺｅｒｂｅ−Ｂｕｒｋｈａｒｄｔ Ｋ．ら、１９９８、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ；２７３：６５０８−６５１７頁を参照されたい。）。

タクロリムス（ＦＫ５０６）生成生物に関してアリルマロニルＣｏＡ前駆体の代謝出発物およびその生合成に関与する遺伝子は、従来技術において同定されていない。
本発明は、アリルマロニルＣｏＡの供給のための新規生合成経路を提供する。驚くべきことに、ＦＫ５０６ポリケチド合成酵素（ＰＫＳ）クラスターの左腕に位置しているアリルマロニルＣｏＡ生合成に関与する遺伝子群が見出された。ＦＫ５０６生合成遺伝子クラスターの最も左側の新たに得られた配列は、アリルマロニルＣｏＡ生合成に関与する遺伝子をコードすることが見出され、タクロリムス遺伝子クラスターの「Ａｌｌｙｌ（Ａｌｌ）クラスター」または「Ａｌｌｙｌ（Ａｌｌ）サブクラスター」と称される（表１を参照されたい。）。

本発明は、ＦＫ５０６ポリケチド合成酵素（ＰＫＳ）遺伝子クラスターの左側に位置する、アリルマロニルＣｏＡ前駆体（基本単位）の生合成に関与する遺伝子を含有するこの新規ヌクレオチド配列に関する。

ＦＫ５０６生成株の改善、具体的には収率および純度に関しての改善のためのこれらの配列の種々の使用も本発明に含まれる。本発明は、タクロリムス、アスコマイシンまたは関連化合物の選択的生成を可能にする不均一に発現された「Ａｌｌｙｌサブクラスター」を有する遺伝子改変株も提供する。

アスコマイシンなどの副産物の形成を低減または消失させることによるおよび／またはタクロリムスの生成の収率を増加させることによるタクロリムス生成のための改善された方法を提供することは本発明の目的の１つである。

アリルマロニルＣｏＡ対エチルマロニルＣｏＡの伸長単位の利用能は、発酵プロセスの最後での所望の生成物タクロリムス（ＦＫ５０６）または副産物としてのアスコマイシン（ＦＫ５２０）それぞれの最終割合において重要な役割を演じることが見出された。したがって本発明は、所望の生成物と副産物との顕著に改善された割合をもたらす、前記伸長単位の割合を制御するいくつかの可能性を提供する。

この態様において本発明は、遺伝子改変株によって、好ましくは生成物アスコマイシン（ＦＫ５２０）の生合成が顕著に低減されうるまたは消失されうるストレプトマイセス・ツクバエンシス（ＮＲＲＬ１８４８８）によって実施されるタクロリムスの改善された発酵調製を記載する。好ましくはタクロリムスの収率は、一定のままであるまたは増加している。したがって本方法は、エチルマロニルＣｏＡ供給を低減する（もしくは消失させる）手段を使用することによっておよび／またはアリルマロニルＣｏＡ生合成を増加させることによって発酵生成の既知の方法の不利益を顕著に低減する。本方法は、アスコマイシン生成を低減させる（または消失させる）ことができ、タクロリムスの生成収率を維持または増加させうる。

本方法の最後における一方でのタクロリムスおよび他方でのアスコマイシンの最終割合は、エチルマロニルＣｏＡおよび／またはアリルマロニルＣｏＡの代謝に関与するこれらの遺伝子の不活性化および／または過剰発現によって制御されうる。
さらに本出願は微生物の遺伝子改変株であって、微生物の遺伝物質がエチルマロニルＣｏＡおよび／またはアリルマロニルＣｏＡの代謝および／または生合成に関与する少なくとも１つの不活性化および／または過剰発現された遺伝子を含む微生物の遺伝子改変株を対象とする。

ストレプトマイセス・ツクバエンシスの「Ａｌｌ遺伝子」サブクラスター（１５０８０ｂｐ）の遺伝子構成を示す図である。 ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス変種アスコマイセティカスＡＴＣＣ１４８９１の抽出された発酵培地中のタクロリムスおよびアスコマイシンの存在をモニターするためのＬＣ−ＭＳクロマトグラム（ＭＲＭ）を示すグラフである。アスコマイシンは、野生型株（列２）およびａｌｌＡ、ａｌｌＫ、ａｌｌＲおよびａｌｌＤ遺伝子を過剰発現している変異株（列４）によって生成される。一方タクロリムスは、野生型株（列１）によって生成されず、ａｌｌＡ、ａｌｌＫ、ａｌｌＲおよびａｌｌＤが過剰発現される場合（列３）にだけ生成される。

本発明は、タクロリムスの調製のための方法であって、微生物、好ましくはストレプトマイセス属に属する微生物の遺伝子改変株、より好ましくはストレプトマイセス・ツクバエンシスの遺伝子改変株の培養のステップを含み、微生物の遺伝物質がエチルマロニルＣｏＡおよび／またはアリルマロニルＣｏＡの代謝および／または生合成に関与する少なくとも１つの不活性化および／または過剰発現された遺伝子を含む方法を対象とする。

本発明は、ストレプトマイセス属に属する微生物の遺伝子改変株であって、前記微生物の遺伝物質がエチルマロニルＣｏＡおよび／またはアリルマロニルＣｏＡの代謝および／または生合成に関与する少なくとも１つの不活性化および／または過剰発現された遺伝子を含む微生物の遺伝子改変株も記載する。
詳細には本出願によるタクロリムスの調製のための方法は、以下のステップの少なくとも１つを含む：
ａ）微生物の遺伝子改変株の作製；
ｂ）微生物の遺伝子改変株の栄養培地への添加および微生物の前記株を培養することを含む種培地の調製；
ｃ）微生物の遺伝子改変株の種培地のバイオリアクター中の栄養培地への添加、微生物の前記株を培養することおよびタクロリムスの生成を含む主発酵；
ｄ）発酵培地からの生成物の分離および精製（回収）。

詳細には本発明によるタクロリムスの調製のための方法は、本出願に記載の微生物の遺伝子改変株の作製、種培地の調製および微生物の前記遺伝子改変株を培養することを含む主発酵を含む。好ましくは本出願によるタクロリムスの調製のための方法は、上に記載のステップａ）からｄ）を含む。方法ステップａ）からｄ）は下により詳細に記載される。

好ましい実施形態において本発明は、上に記載のタクロリムスの調製のための方法であって、微生物の遺伝子改変株の培養ステップを含み、前記微生物が好ましくはストレプトマイセス属から選択される細菌である方法に関する。具体的には前記微生物は、アクチノマイセス目（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）から選択されうる。好ましいのは、ＰＫＳ活性を有するまたは異種性に発現されるＰＫＳもしくはこの一部を有するアクチノマイセス目に属する微生物である。より具体的には微生物は、ストレプトマイセス属から選択されうる。具体的にはストレプトマイセス・ツクバエンシス、ストレプトマイセス属種、ＡＴＣＣ５５０９８またはストレプトマイセス・ハイグロスコピカス変種アスコマイセティカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ｖａｒ．ａｓｃｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ）ＡＴＣＣ１４８９１が使用されうる。

詳細には微生物は、ストレプトマイセス・ツクバエンシス、好ましくはストレプトマイセス・ツクバエンシス（ＮＲＲＬ１８４８８）の遺伝子改変株から選択される。さらに微生物は、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカスの遺伝子改変株から選択されうる。

さらに本発明の方法を実施するために以下の微生物を使用することも検討される：ストレプトマイセス・ツクバエンシスＮｏ．９９９３（Ｆｅｒｍ ＢＰ−９２７）、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス亜種ハイグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）（ＤＳＭ４０８２２）、ストレプトマイセス属種ＡＡ６５５４、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス変種アスコマイセティカスＭＡ６４７５ ＡＴＣＣ１４８９１、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス変種アスコマイセティカスＭＡ６６７８ ＡＴＣＣ５５０８７、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス変種アスコマイセティカスＭＡ６６７４、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス変種アスコマイセティカスＡＴＣＣ５５２７６、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス亜種アスコマイセティカスＡＴＣＣ１４８９１、ストレプトマイセス・カナマイセティカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｋａｎａｍｙｃｅｔｉｃｕｓ）ＫＣＣ Ｓ−０４３３、ストレプトマイセス・クラブリゲルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）ＣＫＤ１１１９、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス亜種ヤクシマエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｙａｋｕｓｈｉｍａｅｎｓｉｓ）、ストレプトマイセス属種ＤＳＭ７３４８、ミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）属種（新種）Ａ９２−３０６４０１ ＤＳＭ８４２９、ストレプトマイセス属種ＭＡ６５４８およびストレプトマイセス属種ＭＡ６８５８ ＡＴＣＣ５５０９８。

他の態様において本発明は、本出願に記載のタクロリムスの調製のための方法であって、微生物、好ましくはストレプトマイセス属に属する微生物の遺伝子改変株の培養ステップを含み、アリルマロニルＣｏＡおよび／またはアリルマロニルＣｏＡの少なくとも１つの前駆体の外部添加の条件下で実施される方法に関する。詳細にはアリルマロニルＣｏＡおよび／またはアリルマロニルＣｏＡの少なくとも１つの前駆体は、上に記載の主発酵プロセス（ステップｃ）で発酵培地に添加される。

さらに本出願に記載の発酵プロセスは、微生物、好ましくはストレプトマイセス属に属する微生物の遺伝子改変株、より好ましくは本発明において提供されるストレプトマイセス・ツクバエンシスの遺伝子改変株を培養することおよび制御されたやり方でアリルマロニル−、エチルマロニル−および／もしくはプロピルマロニルＣｏＡならびに／またはアリルマロニル−、エチルマロニル−および／もしくはプロピルマロニルＣｏＡの前駆体を発酵培地に添加することを含みうる。これにより実質的に純粋なタクロリムス、アスコマイシンまたはそれぞれの関連化合物が得られる。この意味において、配列番号４に記載の不活性化された少なくともＡｌｌＲ遺伝子を有する、好ましくはストレプトマイセス属に属する微生物の遺伝子改変株、より好ましくはストレプトマイセス・ツクバエンシスの遺伝子改変株が使用される必要がある。

他の実施形態において本出願に記載のタクロリムスの調製のための方法は、微生物、好ましくはストレプトマイセス属に属する微生物の遺伝子改変株、より好ましくはストレプトマイセス・ツクバエンシスの遺伝子改変株の培養のステップであって、微生物の遺伝物質が配列番号２に記載のＡｌｌＡ遺伝子、配列番号３に記載のＡｌｌＫ遺伝子、配列番号４に記載のＡｌｌＲ遺伝子、配列番号５に記載のＡｌｌＤ遺伝子、配列番号６に記載のＡｌｌＭ遺伝子、配列番号７に記載のＡｌｌＮ遺伝子、配列番号８に記載のＡｌｌＰ遺伝子、配列番号９に記載のＡｌｌＯ遺伝子および配列番号１０に記載のＡｌｌＳ遺伝子から構成される配列番号１に記載のＡｌｌｙｌサブクラスターの遺伝子配列から選択される少なくとも１つの不活性化および／または過剰発現された遺伝子を含む培養のステップを含む。上に記載のヌクレオチド配列は、表１に記載されており別表に列挙されている。

ＦＫ５０６の生合成のために必要なＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）をコードする遺伝子クラスター全体は配列決定された。ＰＫＳ（ポリケチド合成酵素）遺伝子を含有するクラスターの中央部分の公表された配列（Ｍｏｔａｍｅｄｉ Ｈ．およびＳｈａｆｉｅｅ Ａ．１９９８；Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ；２５６（３）：５２８−３４頁を参照されたい。）に加えて、ポリケチド合成酵素クラスターの左および右の周辺部に存在する遺伝子の配列が取得され、アノテーションされた。遺伝子クラスターの左側では、多数のＯＲＦが同定され、その大部分はアスコマイシン（ＦＫ５２０）生合成クラスターに存在する遺伝子にいかなる相同性も示さなかった（Ｗｕ．Ｋら、２０００、Ｇｅｎｅ；２５１（１）８１−９０頁、ＵＳ６５０３７３７を参照されたい。）。これらのＯＲＦをクエリーとして使用するＢＬＡＳＴ検索は、表１に示すとおり同定された遺伝子の推定上の機能を明らかにした。遺伝子をコードするこのＡｌｌｙｌクラスター（またはＡｌｌｙｌサブクラスター）は、タクロリムスの生合成に特異的に必要なアリルマロニルＣｏＡ前駆体の生合成に関与する。さらに、遺伝子をコードするＡｌｌｙｌサブクラスターは、エチルマロニルＣｏＡの生合成に関与することが見出された。

さらなる態様において、本発明は、配列番号２から配列番号１０に記載のいくつかの遺伝子から構成される配列番号１に記載の配列および１つまたは複数のヌクレオチド追加、欠失、置換または逆位を含むこれらの変種を含むストレプトマイセス属に属する微生物のエチルマロニルＣｏＡまたはアリルマロニルＣｏＡ生合成に関与するＡｌｌｙｌサブクラスターのヌクレオチド配列に関する。Ａｌｌｙｌサブクラスターのヌクレオチド配列は表１に示されており、添付の別表に列挙されている（配列番号１から配列番号１０）。

変異株におけるエチルマロニルＣｏＡおよびアリルマロニルＣｏＡの合成を遮断することにより、これらの基本単位を供給することによってどのポリケチドが生成されるかを制御できる新規方法が可能であることが見出された。酸化還元酵素（クロトニルＣｏＡ還元酵素に類似）をコードするＡｌｌＲ遺伝子の不活性化は、タクロリムスの生成を完全に消失させたことが見出された。しかしアリルマロニルＣｏＡ前駆体の外部添加は、発酵培地中のアスコマイシン生成の消失を伴うタクロリムスの排他的生成を可能にする。ＡｌｌＲ遺伝子の不活性化は、アスコマイシン（ＦＫ−５２０）の生成を完全に消失させたことも見出された。しかしエチルマロニルＣｏＡ前駆体の外部添加は、発酵培地中のタクロリムス生成の消失を伴うアスコマイシン（ＦＫ−５２０）の排他的産生を可能にする。この方法は任意のアスコマイシンまたはタクロリムス生成生物において可能である。アスコマイシン生成生物中でのエチルマロニルＣｏＡの合成を遮断するための方法は、エチルマロニルＣｏＡ生合成に関与する遺伝子がアスコマイシン生成生物において解明されていることから当業者に周知である（Ｗｕら、２０００、Ｇｅｎｅ２５１、８１−９０頁）。ｃｃｒ相同体の不活性化は、そのような生物の調製における最初のステップである。アスコマイシンおよびタクロリムス合成のためのＰＫＳが高度に相同性であることから、アリルマロニルＣｏＡまたはエチルマロニルＣｏＡを取り込むモジュール７の無差別性がすべてのアスコマイシン／タクロリムス生成生物のＰＫＳについて予測されうる。

本発明の一実施形態において、本出願に記載のタクロリムスの調製のための方法は、ストレプトマイセス属に属する微生物の遺伝子改変株、好ましくはストレプトマイセス・ツクバエンシスの遺伝子改変株の培養ステップであって、アリルマロニルＣｏＡおよび／またはアリルマロニルＣｏＡの少なくとも１つの前駆体の外部添加の下で実施される培養ステップを含む。

さまざまなアリルマロニルＣｏＡ前駆体は使用されうる。より詳細にはアリルマロニルＳＮＡＣ（アリルマロニル−（Ｎ−アセチル−システアミン）チオエステル）の添加が好ましい。本発明に関してアリルマロニルＣｏＡ前駆体はアリルマロニルＣｏＡの類似体も含む。

別法としてアリルマロン酸またはこの類似体は、前記方法のために使用される株の追加的遺伝子改変を考慮すると、前記方法において直接使用されうる。この場合マロニルＣｏＡ合成酵素およびジクサルボン酸キャリアタンパク質は、使用される微生物中で発現される必要がある。増殖培地中に加えられるジカルボン酸化合物の取り込みが可能である遺伝子改変微生物の一例は、Ｌｏｍｂｏら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２００１、１７、６１２−６１７頁によって記載されている。基質としてのアリルマロン酸に対するマロニルＣｏＡ合成酵素の十分な活性は、Ｐｏｈｌら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００１、１２３、５８２２−５８２３頁によって記載されている。

詳細には上に記載の方法は、ストレプトマイセス属に属する微生物の遺伝子改変株の培養ステップであって、微生物の遺伝物質が
配列番号３に記載のＡｌｌＫ遺伝子および
配列番号４に記載のＡｌｌＲ遺伝子
の群から選択される少なくとも１つの不活性化および／または過剰発現された遺伝子を含む培養ステップを含む。

本発明のさらなる実施形態において上に記載の方法は、ストレプトマイセス属に属する微生物の遺伝子改変株、好ましくはストレプトマイセス・ツクバエンシスの遺伝子改変株の培養ステップであって、微生物の遺伝物質が配列番号１に記載の追加的不活性化遺伝子ｃｃｒ遺伝子を含む培養ステップを含む。

この詳細な態様において本発明は、ストレプトマイセス・ツクバエンシスの以下の株：
ａ）ストレプトマイセス・ツクバエンシスＦ４９９
受託番号ＤＳＭ２２５０７で２００９年４月２３日にＢｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ／ドイツのＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）に寄託された。この株はＮＲＲＬ１８４８８ΔａｌｌＲと記載される。
ｂ）ストレプトマイセス・ツクバエンシスＦ８７２
受託番号ＤＳＭ２２５０９で２００９年４月２３日にＢｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ／ドイツのＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）に寄託された。この株はＮＲＲＬ１８４８８ΔａｌｌＫと記載される。
に関する。

本発明のさらなる実施形態において上に記載の方法は、ストレプトマイセス属に属する微生物、好ましくはストレプトマイセス・ツクバエンシスの株の遺伝子改変株の培養ステップであって、微生物の遺伝物質が配列番号２に記載のＡｌｌＡ遺伝子、配列番号３に記載のＡｌｌＫ遺伝子、配列番号４に記載のＡｌｌＲ遺伝子、配列番号５に記載のＡｌｌＤ遺伝子、配列番号６に記載のＡｌｌＭ遺伝子、配列番号７に記載のＡｌｌＮ遺伝子、配列番号８に記載のＡｌｌＰ遺伝子、配列番号９に記載のＡｌｌＯ遺伝子および配列番号１０に記載のＡｌｌＳ遺伝子から構成される配列番号１に記載のＡｌｌｙｌサブクラスターから選択される少なくとも１つの不活性化された遺伝子を含む培養ステップであって、アリルマロニルＣｏＡおよび／またはアリルマロニルＣｏＡの少なくとも１つの前駆体の外部添加の下で実施される培養ステップを含む。

好ましい実施形態において上に記載の方法は、ストレプトマイセス属に属する微生物の遺伝子改変株の培養のステップであって、微生物の遺伝物質が配列番号３に記載のＡｌｌＫ遺伝子および配列番号４に記載のＡｌｌＲ遺伝子の群から選択される少なくとも１つの不活性化された遺伝子を含む培養ステップを含み、前記方法はアリルマロニルＣｏＡおよび／またはアリルマロニルＣｏＡの少なくとも１つの前駆体の外部添加の下で実施される。
好ましい実施形態において上に記載の方法は、ストレプトマイセス属に属する微生物の遺伝子改変株、好ましくはストレプトマイセス・ツクバエンシスの遺伝子改変株の培養のステップであって、微生物の遺伝物質が不活性化された配列番号４に記載のＡｌｌＲ遺伝子および不活性化された配列番号１１に記載のｃｃｒ遺伝子を含む培養ステップを含み、前記方法はアリルマロニルＣｏＡおよび／またはアリルマロニルＣｏＡの少なくとも１つの前駆体の外部添加の下で実施される。

さらに本発明は、ストレプトマイセス属に属する微生物のエチルマロニルＣｏＡおよび／またはアリルマロニルＣｏＡの代謝および／または生合成に関与する１つまたは複数の遺伝子をコードし、配列番号２に記載のＡｌｌＡ遺伝子、配列番号３に記載のＡｌｌＫ遺伝子、配列番号４に記載のＡｌｌＲ遺伝子、配列番号５に記載のＡｌｌＤ遺伝子、配列番号６に記載のＡｌｌＭ遺伝子、配列番号７に記載のＡｌｌＮ遺伝子、配列番号８に記載のＡｌｌＰ遺伝子、配列番号９に記載のＡｌｌＯ遺伝子および配列番号１０に記載のＡｌｌＳ遺伝子から構成される配列番号１に記載の配列ならびに１つまたは複数のヌクレオチドの追加、欠失、置換および／または逆位を含むこれらの変種を含むヌクレオチド配列に関する。

詳細には上に記載のヌクレオチド配列は、配列番号１に少なくとも５０％のヌクレオチド同一性を有する。

同様に本発明によって提供されるのは、上に記載のヌクレオチド配列であって、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を、配列番号２から配列番号１０に記載のいくつかの遺伝子から構成される配列番号１に記載の配列に有するヌクレオチド配列である。ヌクレオチド配列の上に記載の変種は、ストレプトマイセス属に属する生物のエチルマロニルＣｏＡまたはアリルマロニルＣｏＡの生合成に関与する酵素をコードする能力を保持しているべきである。

このように本発明は、表１に列挙し配列番号２から配列番号１０に記載のすべての個々の遺伝子のヌクレオチド配列および配列番号１３から配列番号２１に記載のこれらのアミノ酸生成物ならびに１つまたは複数のヌクレオチド追加、欠失、置換および／または逆位を含むこれらの変種であって、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を配列番号２から配列番号１０に記載のいくつかの遺伝子から構成される配列による配列に有するヌクレオチド配列を提供する。

提案された生合成経路は以下のとおり記載されうる。アリルマロニルＣｏＡを得るためにＣ５前駆体、バレリルＣｏＡまたは４−ペンテノイル−ＣｏＡが最初に形成されるべきである。アセト酢酸およびクロトニルＣｏＡを通じて２つの酢酸単位から形成されるエチルマロニル−ＣｏＡと同様に、プロピルマロニルＣｏＡまたはアリルマロニルＣｏＡは１つの３炭素単位および１つの２炭素単位から生成できる。比較的短いポリケチド合成酵素（ＰＫＳ）様酵素複合体によって単一ステップでの縮合反応を実行する、遺伝子ＡｌｌＡ（アシル転移酵素）およびＡｌｌＫ（ケト合成酵素）は同定されている。さらに最終アリルマロニルＣｏＡ、Ｃ５前駆体に加工される前に５炭素中間体（３−オキソペンタン酸またはこの還元中間体）がどのようにＣｏＡの添加によって活性化されるかまたはＦＫ５０６ＰＫＳ複合体に直接転移されるかは明確ではない。しかし最終合成アリル前駆体での供給実験は、伸長物を最終アリルマロニルＣｏＡ形態に組み込むＦＫ５０６ＰＫＳの能力を示している。アセトアセチルＣｏＡ還元酵素に相同な推定上のＡｌｌＳ遺伝子は、３−ヒドロキシペンタノイルＣｏＡを生じる最初の還元ステップを実行する。次いで追加的酸化還元酵素（ＡｌｌＲ、クロトニルＣｏＡカルボキシラーゼ／還元酵素、ＡｌｌＤおよびＡｌｌＯと同様）は、この化合物をさらにプロピルマロニルＣｏＡに還元でき、ＡｌｌＰ、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼと共にＯＨ基および続いて二重結合も４位に導入でき、アリルマロニルＣｏＡを生じる。次いでこれは対応するＰＫＳモジュール４のアシル転移酵素（ＡＴ４）遺伝子によって新生ポリケチド鎖に導入される。Ａｌｌｙｌクラスターの一部として、ＡｌｌＭとして示されたＯＲＦが同定された。この遺伝子産物は、メチオニンγリアーゼに相同性を示し、プロピオニルＣｏＡ（最初の５炭素中間体のＡｌｌＡによる生合成に必要な開始単位）に直ちに代謝される２−オキソ酪酸にメチオニンを転換すると考えられる。プロピオニルＣｏＡ前駆体は、２次代謝の間に限定されうる。したがってＡｌｌＭ遺伝子産物の存在は、最終産物ＦＫ−５０６の収率を増加させるためのプロピオニルＣｏＡの十分な供給のために必要であると考えられる。

提案された経路は、ＦＫ−５０６生成微生物の発酵培地中のエチルマロニルＣｏＡの由来およびそれによりＦＫ−５２０の由来も説明する。アリルマロニルＣｏＡの生合成に関与するＳ．ツクバエンシスのＦＫ−５０６生合成クラスターの≫Ａｌｌｙｌサブクラスター≪中に存在する遺伝子は、エチルマロニルＣｏＡも生成できる。すなわちエノイルＣｏＡ還元酵素（遺伝子ＡｌｌＲ）は、次いで上に記載の経路と同様のやり方で処理されるＣ５単位（３−オキソペンタン酸またはこの還元中間体）の代わりにアセト酢酸（Ｃ４）単位への限定的無差別性をほぼ確実に示す。次のステップは両前駆体について同様のやり方で進行するが、Ｃ４単位はＰ４５０調節水酸化および二重結合の形成に対する基質にはならないと考えられている。エノイルＣｏＡ還元酵素／カルボキシラーゼ（ＡｌｌＲ）遺伝子の欠失は、この生合成経路ならびにＦＫ−５０６およびＦＫ−５２０の生成を完全に消失させることが見出された。ケトアシル合成酵素（ＡｌｌＫ）遺伝子は、ＦＫ−５０６の産生だけを完全に消失させることが見出され、ＦＫ−５２０の産生は野生型Ｓ．ツクバエンシス株のレベルのままである。

興味深いことに、ＦＫ−５２０／ＦＫ−５０６生合成のためのエチルマロニルＣｏＡおよびアリルマロニルＣｏＡ（またはプロピルマロニルＣｏＡ）伸長単位を生じる上に記載の反応ステップは、「エチルマロニルＣｏＡ経路」の最初の反応からエチルマロニルＣｏＡ中間体が形成される点までに機構的に酷似している。この初期代謝経路は、大部分のストレプトマイセス属種の酢酸を唯一の炭素源とした増殖に最も高い可能性で関与し、クロトニルＣｏＡカルボキシラーゼ／還元酵素（ｃｃｒ）によって産生され、さらにエチルマロニルＣｏＡムターゼ（ｅｃｍ）によってメチルスクシニルＣｏＡに転換されるエチルマロニルＣｏＡを中間体化合物として含む。明らかに、所与の増殖条件下で活性であるならば、この経路がＳ．ツクバエンシス中でのエチルマロニルＣｏＡの重要な供給源も表しうることが期待される。しかし、ｃｃｒ（エチルマロニルＣｏＡを産生する。）およびｅｃｍ（これをさらに処理する。）を含む「エチルマロニルＣｏＡ経路」をコードする多数の遺伝子は、ストレプトマイセスにおいて同じオペロンに位置し、共転写されると考えられている。そのような遺伝子構造は、両遺伝子が協調して作用しなければならず、基質が最終産物への代謝経路を迅速に通過しなければならない場合には理想的であるが、単一の中間体（すなわち２次代謝のための基本単位としてのエチルマロニルＣｏＡ）の十分な量を提供するためには不十分である場合がある。これは、伸長単位としてエチルマロニルＣｏＡを必要とするポリケチド生合成のための多数の遺伝子クラスターがｃｃｒ遺伝子相同体（この内容において生成されたエチルマロニルＣｏＡを直ちに消費するｅｃｍ遺伝子は除く）の追加的コピーをも含有することの理由についての説明を提供できる。

含まれる反応は機構的に類似しているが、Ｓ．ツクバエンシスでのＦＫ−５０６およびＦＫ−５２０生合成のための基本単位としてのアリルマロニルＣｏＡ（プロピルマロニルＣｏＡ）およびエチルマロニルＣｏＡを提供する酵素と、この生物の「エチルマロニルＣｏＡ経路」の酵素とは１つの重要な観点において異なっている。「エチルマロニルＣｏＡ経路」はエチルマロニルＣｏＡ中間体を特異的に含み、ごく少量のプロピルマロニルＣｏＡが最終的に形成される場合があるが、ａｌｌサブクラスターにコードされる酵素は異なる特異性を示す。これらは、アリルマロニルＣｏＡ（プロピルマロニルＣｏＡ）を優先的に生成するが、エチルマロニルＣｏＡは少量だけ産生される。経路のいくつかの酵素（すなわちＡｌｌＲ）は４炭素および５炭素中間体を同様の効率で受容できるが、他はアリルマロニルＣｏＡ（プロピルマロニルＣｏＡ）を排他的に生じる基質に対して非常に特異的である場合があることから恐らく量は比較的少ない。ストレプトマイセス酵素によるＦＫ５０６の生成のための発酵プロセスとの関連で、両代謝系は（これらの発現が完全に異なる因子によってほぼ確実に誘導されるけれども）発現されうる。ａｌｌサブクラスターの遺伝子はＦＫ−５０６生合成クラスターの他の遺伝子と一緒に転写されると考えられるが、一度２次代謝が誘導されると「エチルマロニルＣｏＡ経路」酵素の発現および活性は増殖条件、最も重要なことには増殖培地の組成に依存すると考えられる。

明確にはエチルマロニルＣｏＡの濃度、すなわちＦＫ−５２０の収率を可能な限り低く保つために、増殖培地の組成は「エチルマロニルＣｏＡ経路」の遺伝子が転写されないまたは最小レベルで転写されるように適合されるべきである。別法としてｅｃｍ経路に加わりストレプトマイセスにおいて同じオペロン上に通常コードされる酵素の発現は、エチルマロニルＣｏＡ濃度を低く保持するために操作される必要がある。クロトニルＣｏＡカルボキシラーゼ／還元酵素をコードするｃｃｒ遺伝子は、不活性化されるべきである一方で、エチルマロニルＣｏＡムターゼ（ｅｃｍ）、メチルスクシニルＣｏＡ脱水素酵素、メサコニルＣｏＡ脱水酵素およびβ−メチルマリルＣｏＡリアーゼをコードする他の４つの遺伝子は強力な構成的プロモーターを使用して過剰発現されるべきである。しかし、増殖条件および培地とは無関係に細胞中のエチルマロニルＣｏＡの完全な消失が望ましい場合は、両方の経路を同じ機構的ステップで妨害する標的変異を導入する必要がある場合がある。本発明において記載のとおり、このステップは、ｃｃｒ相同体、「エチルマロニルＣｏＡ経路」のｃｃｒ遺伝子およびアリルマロニルＣｏＡ（プロピルマロニルＣｏＡ）の供給に主に関与するａｌｌサブクラスターのａｌｌＲ遺伝子の両方の不活性化でありうる。

本発明の一目的はタクロリムスの調製のための方法であって、微生物、好ましくはストレプトマイセス属に属する微生物の遺伝子改変株、より好ましくはストレプトマイセス・ツクバエンシスの遺伝子改変株の培養ステップを含み、微生物の遺伝物質がアリルマロニルＣｏＡ対エチルマロニルＣｏＡの細胞内プールの比率を改善するように改変されている方法を提供することである。

この実施形態において本発明に記載のタクロリムスの調製のための方法は、微生物、好ましくはストレプトマイセス属に属する微生物の遺伝子改変株、より好ましくはストレプトマイセス・ツクバエンシスの遺伝子改変株の培養ステップであって、微生物の遺伝物質が配列番号２に記載のＡｌｌＡ遺伝子、配列番号３に記載のＡｌｌＫ遺伝子、配列番号４に記載のＡｌｌＲ遺伝子、配列番号５に記載のＡｌｌＤ遺伝子、配列番号６に記載のＡｌｌＭ遺伝子、配列番号７に記載のＡｌｌＮ遺伝子、配列番号８に記載のＡｌｌＰ遺伝子、配列番号９に記載のＡｌｌＯ遺伝子および配列番号１０に記載のＡｌｌＳ遺伝子から構成される配列番号１に記載のＡｌｌｙｌサブクラスターの遺伝子配列から選択される少なくとも１つの過剰発現された遺伝子を含む培養ステップを含む。上に記載のヌクレオチド配列は、表１に記載されており添付の別表に列挙されている。

本出願は、アリルマロニルＣｏＡおよび／またはエチルマロニルＣｏＡ前駆体合成に必要なタンパク質をコードする、不活性化および／または過剰発現された表１に列挙した１つまたは複数の遺伝子を有する１つまたは複数のＳ．ツクバエンシス株の作製を含む。

より詳細には本態様において本発明は、ストレプトマイセス・ツクバエンシスの遺伝子改変株の作製であって、前記株がタクロリムス（ＦＫ−５０６）および／またはアスコマイシン（ＦＫ−５２０）生合成のための重要な基本単位の供給に関与する少なくとも１つの不活性化された遺伝子を含む遺伝子改変株の作製を対象とする。これらの遺伝子改変株は、タクロリムスの改善された産生のために有用であることが見出されている。

微生物の遺伝子改変のための方法、例えば遺伝子コピー数の増幅は当技術分野において周知である。他の例は、強力なプロモーターの制御下での前記遺伝子の追加的コピーの挿入である。さらにこの意味における他の例は「Ａｌｌ」サブクラスターにおいて見出された転写制御因子の活性の改変である。

この意味において本発明は、アリルマロニルＣｏＡ前駆体の細胞内プールを改善するおよびまたはエチルマロニルＣｏＡの細胞内プールを低減することによるタクロリムスの発酵調製のためのストレプトマイセス・ツクバエンシスの改善された株を提供する。表１および配列番号１に記載の新規ヌクレオチド配列は、アリルマロニルＣｏＡの生合成に関与する前記遺伝子の発現を制御するために使用されうる。

本発明の一実施形態において本出願に記載のタクロリムスの調製のための方法は、微生物の遺伝子改変株の培養ステップであって、微生物の遺伝物質が配列番号１１に記載のクロトニルＣｏＡ還元酵素（ｃｃｒ）遺伝子および配列番号１２に記載のエチルマロニルＣｏＡムターゼ（ｅｃｍ）から選択される少なくとも１つの不活性化および／または過剰発現された遺伝子を含む培養ステップを含む。ヌクレオチド配列は添付の別表に列挙されている。

本出願は、ストレプトマイセス属に属する微生物の遺伝子改変株、好ましくはストレプトマイセス・ツクバエンシスの遺伝子改変株であって、微生物の遺伝物質がエチルマロニルＣｏＡおよび／またはアリルマロニルＣｏＡの代謝および／または生合成に関与する少なくとも１つの不活性化および／または過剰発現された遺伝子を含む微生物の遺伝子改変株を対象とする。

詳細には本出願は、上に記載のストレプトマイセス属に属する微生物の遺伝子改変株であって、微生物の遺伝物質が配列番号２に記載のＡｌｌＡ遺伝子、配列番号３に記載のＡｌｌＫ遺伝子、配列番号４に記載のＡｌｌＲ遺伝子、配列番号５に記載のＡｌｌＤ遺伝子、配列番号６に記載のＡｌｌＭ遺伝子、配列番号７に記載のＡｌｌＮ遺伝子、配列番号８に記載のＡｌｌＰ遺伝子、配列番号９に記載のＡｌｌＯ遺伝子および配列番号１０に記載のＡｌｌＳ遺伝子から構成される配列番号１に記載のＡｌｌｙｌサブクラスターの遺伝子配列から選択される少なくとも１つの不活性化および／または過剰発現された遺伝子を含む微生物の遺伝子改変株を対象とする。

詳細には本発明は、上に記載のストレプトマイセス属に属する微生物の遺伝子改変株、好ましくはストレプトマイセス・ツクバエンシスの遺伝子改変株であって、微生物の遺伝物質が配列番号２に記載のＡｌｌＡ遺伝子、配列番号３に記載のＡｌｌＫ遺伝子および配列番号４に記載のＡｌｌＲ遺伝子の群から選択される少なくとも１つの過剰発現された遺伝子を含む微生物の遺伝子改変株を対象とする。

詳細には本出願は、上に記載のストレプトマイセス属に属する微生物の遺伝子改変株、好ましくはストレプトマイセス・ツクバエンシスの遺伝子改変株であって、微生物の遺伝物質が配列番号２に記載のＡｌｌＡ遺伝子および配列番号３に記載のＡｌｌＫ遺伝子の群から選択される少なくとも１つの過剰発現された遺伝子を含む微生物の遺伝子改変株を対象とする。

他に、さらに類似する実施形態においてアリルマロニルＣｏＡ前駆体の生合成に関与する遺伝子を含有する新規ヌクレオチド配列は、タクロリムスの生成のための組換え株の構築を当業者に可能にする。この意味で任意のアスコマイシン生成微生物がタクロリムスを生成するために操作されうる。この意味において適切な微生物は、これだけに限らないがストレプトマイセス・ハイグロスコピカスでありうる。これは、当技術分野において周知の方法による前記ヌクレオチド配列の前記宿主株への転移によって達成されうる。

さらに本発明は、微生物の遺伝子改変株であって、天然のまたは操作されたポリケチド合成活性を有する微生物の遺伝子改変株を対象とする。

本発明は、微生物の遺伝物質が
クロトニルＣｏＡ還元酵素の遠位相同体をコードする配列番号４に記載のＡｌｌＲ遺伝子、
チトクロムＰ４５０酵素をコードする配列番号８に記載のＡｌｌＰ遺伝子、
アシル転移酵素およびアシルキャリアタンパク質をコードする配列番号２に記載のＡｌｌＡ遺伝子、
ケトアシル合成酵素をコードする配列番号３に記載のＡｌｌＫ遺伝子、
アシルＣｏＡ脱水素酵素をコードする配列番号５に記載のＡｌｌＤ遺伝子、
メチオニンγリアーゼ酵素およびアシルキャリアタンパク質をコードする配列番号６に記載のＡｌｌＭ遺伝子、
転写制御因子をコードする配列番号７に記載のＡｌｌＮ遺伝子、
アシルＣｏＡ酸化還元酵素をコードする配列番号９に記載のＡｌｌＯ遺伝子および
アセトアセチルＣｏＡ還元酵素をコードする配列番号１０に記載のＡｌｌＳ遺伝子、
の群から選択される少なくとも１つの不活性化および／または過剰発現された遺伝子を含むストレプトマイセス・ツクバエンシスの遺伝子改変株に関する。

遺伝子のヌクレオチド配列（ＤＮＡ配列）および遺伝子産物のアミノ酸配列は、添付の別表のそれぞれ配列番号２から配列番号１０および配列番号１３から配列番号２１に示されている。

この詳細な態様において本発明は、ストレプトマイセス・ツクバエンシスの以下の株：
（ａ）ストレプトマイセス・ツクバエンシスＦ４９９
受託番号ＤＳＭ２２５０７で２００９年４月２３日にＢｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ／ドイツのＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）に寄託された。この株はＮＲＲＬ１８４８８ ΔａｌｌＲと記載される。
（ｂ）ストレプトマイセス・ツクバエンシスＦ８７２
受託番号ＤＳＭ２２５０９で２００９年４月２３日にＢｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ／ドイツのＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）に寄託された。この株はＮＲＲＬ１８４８８ ΔａｌｌＫと記載される。
（ｃ）ストレプトマイセス・ツクバエンシスＦ９１７
受託番号ＤＳＭ２２５１１で２００９年４月２３日にＢｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ／ドイツのＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）に寄託された。この株はＮＲＲＬ１８４８８ ＡｌｌＰ＋と記載される。
に関する。

さらにアリルマロニルＣｏＡ前駆体の生合成に関与する遺伝子を含有するヌクレオチド配列は、新規ハイブリッドポリケチドを生成するために使用されうる。これは、当技術分野において周知の方法による前記ヌクレオチド配列の任意のポリケチド生成宿主株微生物への転移によって達成されうる。公知であるポリケチド合成酵素（ＰＫＳ）モジュールの無差別性により、少なくとも１つの炭素位置にアリル側鎖を有する少なくとも痕跡量の新規ハイブリッドポリケチド化合物を期待できる。

遺伝子改変（前記遺伝子の過剰発現または不活性化）のために使用されうる微生物は、細菌から選択されうる。より詳細には前記微生物は、アクチノマイセス目から選択される。好ましくはＰＫＳ（ポリケチド合成酵素）活性を有するアクチノマイセス目に属する微生物である。別法として過剰発現のための生物は、異種性に発現されたＰＫＳまたはこの一部を有する任意の微生物であってよい。

より詳細には微生物は、ストレプトマイセス属から選択される。具体的にはストレプトマイセス・ツクバエンシス、ストレプトマイセス属種ＡＴＣＣ５５０９８またはストレプトマイセス・ハイグロスコピカス変種アスコマイセティカスＡＴＣＣ１４８９１が使用されうる。

さらに本発明の方法を実施するために以下の微生物を使用することも企図される：ストレプトマイセス・ツクバエンシスＮｏ．９９９３（Ｆｅｒｍ ＢＰ−９２７）、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス亜種ハイグロスコピカス（ＤＳＭ４０８２２）、ストレプトマイセス属種ＡＡ６５５４、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス変種アスコマイセティカスＭＡ６４７５ ＡＴＣＣ１４８９１、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス変種アスコマイセティカスＭＡ６６７８ ＡＴＣＣ５５０８７、ストレプトマイセス・ハグロスコピカス変種アスコマイセティカスＭＡ６６７４、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス変種アスコマイセティカスＡＴＣＣ５５２７６、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス亜種アスコマイセティカスＡＴＣＣ１４８９１、ストレプトマイセス・カナマイセティカスＫＣＣＳ−０４３３、ストレプトマイセス・クラブリゲルスＣＫＤ１１１９、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス亜種ヤクシマエンシス、ストレプトマイセス属種ＤＳＭ７３４８、ミクロモノスポラ属種（新種）Ａ９２−３０６４０１ ＤＳＭ８４２９、ストレプトマイセス属種ＭＡ６５４８およびストレプトマイセス属種ＭＡ６８５８ ＡＴＣＣ５５０９８。

一実施形態において本発明は、Ｓ．ツクバエンシス染色体上の特定のＦＫ５０６遺伝子クラスターにクラスター化していない遺伝子の第２群の使用に言及する。これらの遺伝子は、ブチリルＣｏＡおよびエチルマロニルＣｏＡ、アスコマイシン（ＦＫ５２０）の生合成のための前駆体の代謝に関与している。

Ｓ．ツクバエンシスにおけるエチルマロニルＣｏＡ供給を減少させるまたは消失させるために、いくつかの戦略が行われた。この観点において本発明は、アスコマイシン生合成についての基本単位、エチルマロニルＣｏＡの代謝に関与し、以下の酵素：
ａ）クロトニルＣｏＡ還元酵素（本明細書以下においてそれぞれｃｃｒ、ｃｃｒ遺伝子と称される。）
ｂ）エチルマロニルＣｏＡムターゼ（本明細書以下においてそれぞれｅｃｍ、ｅｃｍ遺伝子と称される。）
をコードする遺伝子のヌクレオチド配列の使用に関する。

ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、添付の別表に列挙されている（配列番号１１、配列番号１２を参照されたい。）。

この態様において本出願は、タクロリムスの調製のための方法であって、微生物、好ましくはストレプトマイセス属の遺伝子改変株、より好ましくはストレプトマイセス・ツクバエンシスの遺伝子改変株の培養ステップを含み、微生物の遺伝物質が配列番号１１に記載のクロトニルＣｏＡ還元酵素（ｃｃｒ）遺伝子および配列番号１２に記載のエチルマロニルＣｏＡムターゼ（ｅｃｍ）遺伝子から選択される少なくとも１つの不活性化および／または過剰発現された遺伝子を含む方法を対象とする。

詳細にはタクロリムスの調製のための方法は、微生物、好ましくはストレプトマイセス属、の遺伝子改変株、より好ましくはストレプトマイセス・ツクバエンシスの株の培養ステップであって、微生物の遺伝物質が不活性化された配列番号１１に記載のクロトニルＣｏＡ還元酵素（ｃｃｒ）遺伝子を含む培養ステップを含む。

詳細にはタクロリムスの調製のための方法は、微生物、好ましくはストレプトマイセス属、の遺伝子改変株、より好ましくはストレプトマイセス・ツクバエンシスの株の培養ステップであって、微生物の遺伝物質が過剰発現された配列番号１２に記載のエチルマロニルＣｏＡムターゼ（ｅｃｍ）遺伝子を含む培養ステップを含む。

タクロリムスの調製のためのこの改善された方法は、アスコマイシン（ＦＫ５２０）の顕著に低下したまたは消失した生成を示し、これによりタクロリムス精製プロセスを著しく簡素化する。

ｃｃｒおよびｉｃｍの遺伝子相同体は、ブチリルＣｏＡおよび続くエチルマロニルＣｏＡの生合成に関与していくつかの生物において同定された。補酵素Ｂ１２依存性イソブチリルＣｏＡムターゼ（ｉｃｍ；ブタノイルＣｏＡ：２−メチルプロパノイルＣｏＡムターゼ、ＥＣ５．４．９９．１３）は、周知のメチルマロニルＣｏＡムターゼ（ｍｅｍ）反応に密接に関連する反応においてイソブチリルＣｏＡとｎ−ブチリルＣｏＡとの間の可逆的転位を触媒する。クロトニルＣｏＡ還元酵素（ＥＣ．１．３．１．３８、アシルＣｏＡ：ＮＡＤＰ’−トランス−２−酸化還元酵素）は、クロトニルＣｏＡのブチリルＣｏＡ（エチルマロニルＣｏＡ生合成のための重要な基質）への転換を触媒するまたはある環境下ではクロトニルＣｏＡをエチルマロニルＣｏＡに直接転換する。ｅｃｍ（エチルマロニルＣｏＡムターゼ）の遺伝子相同体は、エチルマロニルＣｏＡをメチルスクシニルＣｏＡに転換し、それにより混合物中でエチル置換された生成物の割合を効果的に変化させることが示されている。

クロトニルＣｏＡ還元酵素遺伝子（ｃｃｒ遺伝子）およびエチルマロニルＣｏＡムターゼ遺伝子（ｅｃｍ遺伝子）がさまざまな微生物においていくつかの代謝および生合成経路に関与することは周知である。ポリケチド生合成、詳細にはエチルマロニルＣｏＡの生合成におけるｅｃｍおよびｃｃｒの役割は、記載されている（例えば、ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｅｃｍ ｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｅｎｓｉｎ ｉｎ Ｓ．ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ、Ｚｈａｎｇ Ｗ．ら、２００１、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ；１８３：２０７１−２０８０頁）。

したがって本発明は、エチルマロニルＣｏＡの細胞内レベルが低下している微生物を作製する方法を記載する。これは、エチルマロニルＣｏＡの生合成に関与する酵素を遮断することおよび／またはエチルマロニルＣｏＡを消費する酵素を過剰発現することによって達成される。

ストレプトマイセス・ツクバエンシスにおけるＦＫ５０６／５２０の生合成のための重要な基本単位の生合成に特異的に関与するクロトニルＣｏＡ還元酵素（ｃｃｒ）の活性が改変された。追加的に、エチルマロニルＣｏＡのさらなる処理に関与するエチルマロニルＣｏＡムターゼ（ｅｃｍ）は、タクロリムス生成株ストレプトマイセス・ツクバエンシスにおいて過剰発現された。

一実施形態において本出願は、微生物、好ましくはストレプトマイセス属に属する微生物の遺伝子改変株、より好ましくはストレプトマイセス・ツクバエンシスの遺伝子改変株であって微生物の遺伝物質が、
クロトニルＣｏＡ還元酵素をコードする配列番号１１に記載のｃｃｒ遺伝子および
エチルマロニルＣｏＡムターゼをコードする配列番号１２に記載のｅｃｍ遺伝子
の群から選択される少なくとも１つの不活性化および／または過剰発現された遺伝子を含む微生物の遺伝子改変株を対象とする。

好ましい実施形態において本出願に記載の微生物の遺伝子改変株は、本出願に記載の２つの不活性化および／または過剰発現された遺伝子を含む二重改変微生物である。二重改変微生物は、野生型微生物および単一変異体と比較して大幅に改善された特徴を有することが見出された。

クロトニルＣｏＡ還元酵素遺伝子相同体（ｃｃｒ）の不活性化およびエチルマロニルＣｏＡムターゼ（ｅｃｍ）の過剰発現は、アスコマイシン生合成の顕著な低下によって特徴付けられるタクロリムスの生成のための改善された方法を導く。試験した増殖条件下では、ムターゼ触媒反応はブチリルＣｏＡからイソブチリルＣｏＡへ進行すると考えられる。エチルマロニルＣｏＡムターゼ（ｅｃｍ）遺伝子は、生成株中で過剰発現された場合にエチルマロニルＣｏＡを効果的に消費することが見出された。

一態様において本発明は、遺伝子改変微生物、好ましくはストレプトマイセス属の遺伝子改変微生物、より好ましくはストレプトマイセス・ツクバエンシスの株の遺伝子改変微生物であって、微生物の遺伝物質が不活性化された配列番号１１に記載のクロトニルＣｏＡ還元酵素遺伝子（ｃｃｒ）を含む遺伝子改変微生物を提供する。微生物中のそのような遺伝子を不活性化する方法は、例として手引書「Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｅｎｅｔｉｃｓ」（Ｋｉｅｓｅｒら、２０００、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．ＩＳＢＮ０−７０８４−０６２３−８）に記載のとおり当技術分野において公知である。

他の態様において本発明は、遺伝子改変微生物、好ましくはストレプトマイセス属の遺伝子改変微生物、より好ましくはストレプトマイセス・ツクバエンシスの株の遺伝子改変微生物であって、微生物の遺伝物質が過剰発現された配列番号１２に記載のエチルマロニルＣｏＡムターゼ遺伝子（ｅｃｍ）を含む遺伝子改変微生物を提供する。微生物中のそのような遺伝子を過剰発現させる方法は、例として手引書「Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｅｎｅｔｉｃｓ」（Ｋｉｅｓｅｒら、２０００、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．ＩＳＢＮ０−７０８４−０６２３−８）に記載のとおり当技術分野において公知である。

さらなる態様において本発明は、上に記載のとおり不活性化された配列番号１１に記載のクロトニルＣｏＡ還元酵素遺伝子（ｃｃｒ）および過剰発現された配列番号１２に記載のエチルマロニルＣｏＡムターゼ遺伝子（ｅｃｍ）を含む、遺伝子改変された微生物、好ましくはストレプトマイセス属の、より好ましくはストレプトマイセス・ツクバエンシスの株を提供する。この態様において、二重改変微生物の使用は、野生型微生物および上に記載の単一変異体と比較して大幅に改善された特徴を有する。

具体的には本発明は、ストレプトマイセス・ツクバエンシスの以下の株：
ａ）ストレプトマイセス・ツクバエンシスＦ１３０
受託番号ＤＳＭ２２５０６で２００９年４月２３日にＢｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ／ドイツのＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）に寄託された。この株はＮＲＲＬ１８４８８ Δｃｃｒ：Ｔｓと記載される。
ｂ）ストレプトマイセス・ツクバエンシスＦ８７９
受託番号ＤＳＭ２２５１０で２００９年４月２３日にＢｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ／ドイツのＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）に寄託された。この株はＮＲＲＬ１８４８８ ｅｃｍ^＋と記載される。
に関する。

新たに開発された株は、著しく低下したアスコマイシン含有量を示し、タクロリムス発酵生成の顕著な改善を表す。

本発明によってさらに提供されるのは、配列番号１１に記載のｃｃｒ遺伝子配列、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を有するクロトニルＣｏＡ還元酵素（Ｃｃｒ）をコードする配列および１つまたは複数のヌクレオチドの追加、欠失、置換または逆位を含むこれらの変種を含む、微生物ストレプトマイセス・ツクバエンシスＮＲＲＬ１８４８８のエチルマロニルＣｏＡ生合成に関与する遺伝子をコードする上に記載のヌクレオチド配列である。同様に本発明によって提供されるのは、配列番号１２に記載のｅｃｍ遺伝子配列、配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有するエチルマロニルＣｏＡムターゼ（ｅｃｍ）をコードする配列および１つまたは複数のヌクレオチドの追加、欠失、置換または逆位を含むこれらの変種を含む微生物ストレプトマイセス・ツクバエンシスＮＲＲＬ１８４８８のエチルマロニルＣｏＡ消費に関与する遺伝子をコードするヌクレオチド配列である。同様に本発明によって提供されるのは、上に記載のヌクレオチド配列であって、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％の同一性を配列番号１１および配列番号１２に記載の配列に有するヌクレオチド配列である。

本発明は、タクロリムスの調製のための改善された方法、具体的には産業用発酵方法であって、微生物の遺伝子改変株の培養のステップを含み、微生物の遺伝物質がエチルマロニルＣｏＡおよび／またはアリルマロニルＣｏＡの代謝および／または生合成に関与する少なくとも１つの不活性化および／または過剰発現された遺伝子を含む方法を提供する。前記方法は、上に記載の微生物の少なくとも１つの遺伝子改変株を使用することによって実施されうる。以下にこの方法をより詳細に記載する：
詳細には本発明による方法は以下のステップを含む。

ステップａ）微生物の遺伝子改変株の作製
好ましくはタクロリムスの生成のための本方法は、本発明によって記載される微生物株の遺伝子改変のステップを包含する。この意味において本発明は、具体的にはストレプトマイセス・ツクバエンシスの遺伝子改変株であって、株の遺伝物質がエチルマロニルＣｏＡおよび／またはアリルマロニルＣｏＡの代謝および／または生合成に関与する少なくとも１つの不活性化および／または過剰発現された遺伝子を含む遺伝子改変株に関する。

本発明によるさらなる改変のためのストレプトマイセス・ツクバエンシスを作製するための手順は、当業者に周知である。さらにストレプトマイセス・ツクバエンシスの適切な株は、商業的に入手可能である。適切な株の具体的非限定的な一例は、受託番号ＮＲＲＬ１８４８８を有する野生型ストレプトマイセス・ツクバエンシスである。

微生物中の遺伝子を不活性化する方法は、例えば手引書「Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｅｎｅｔｉｃｓ」（Ｋｉｅｓｅｒら、２０００、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．ＩＳＢＮ０−７０８４−０６２３−８）に記載のとおり当技術分野において公知である。

好ましい実施形態において、微生物、好ましくはＳ．ツクバエンシスの株の遺伝子改変株の芽胞形成培地中での芽胞の調製、濃縮された芽胞懸濁物の調製のそれぞれが実施される。

ステップｂ）種培地の調製
本発明に記載のストレプトマイセス・ツクバエンシスの改変株の培養は、当業者に周知の方法によって実施されうる。ストレプトマイセス・ツクバエンシスの培養プロセスは、例えば手引書「Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｅｎｅｔｉｃｓ」（Ｋｉｅｓｅｒら、２０００、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．ＩＳＢＮ０−７０８４−０６２３−８）に記載されている。
好ましくはタクロリムス生成のための主発酵プロセスにおいて使用されうる種微生物の生成は、前記遺伝子改変微生物の芽胞形態から開始する。この点において本出願による方法は、記載された遺伝子改変微生物の、好ましくはストレプトマイセス・ツクバエンシスの芽胞貯蔵物の調製を含み、場合によって記載された遺伝子改変微生物の濃縮された芽胞懸濁物を含む。芽胞形態のこの調製は、マンガン塩を含む芽胞形成培地を使用するなどの当技術分野において周知の方法を使用して実施されうる。好ましくは微生物の遺伝子改変株のこの芽胞貯蔵物または濃縮芽胞懸濁物は、栄養培地への接種によって栄養種培地を作製するために使用される。記載の微生物の栄養形態の生成は、芽胞を含む比較的少量の種培地での接種を伴って調製されるべきである。

種培地は、バイオリアクターに無菌的に移植されうる。

原理上は種微生物の培養は主発酵プロセス（下のステップｃに記載）と同様の条件下（例えばｐＨおよび温度）で実施されうる。

ステップｃ）主発酵プロセス
好ましくは本出願において記載の遺伝子改変微生物を使用する主発酵プロセスは、バイオリアクター中で、詳細には撹拌および／または通気下で実施される。好ましくは本出願において記載のタクロリムスの生成のための方法は、同化炭素源、窒素源、リン酸源および鉱質源を含有する水性栄養培地（生成培地）中、液内好気性条件下で実施される。主発酵プロセスにおいて前記培地から生成されたタクロリムスの単離は、さらなる分離ステップ（ステップｄ）において実施されうる。

好ましくは、主発酵プロセスは、ステップｂ）で得られた種微生物での生成培地の接種（詳細にはリアクターへの無菌的移植による）を含む。接種のために微生物の栄養形態を使用することは好ましい。
主発酵プロセスにおけるリアクターへの栄養培地（生成培地）の添加は、１回または複数回バッチ法でまたは継続的方法で実施されうる。栄養培地（生成培地）の添加は発酵プロセス前および／またはプロセス中に実施されうる。

栄養培地中の好ましい炭素源は、下に例示のとおりデキストリン、ブドウ糖、可溶性デンプン、グリセロール、乳酸、麦芽糖、果糖、糖蜜およびショ糖から選択されうる。

栄養培地中の好ましい窒素源は、酵母エキス、大豆ペプトン、大豆ミール、細菌ペプトン、カゼイン加水分解物、Ｌ−リジン、硫酸アンモニウム、コーンスティープリカーなどである。

炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウムまたはリン酸カリウム、マグネシウム、マンガン、亜鉛、鉄および他の塩などの無機／鉱質塩も培地に添加されうる。

本方法による主発酵プロセスは、約６．３から８．５のｐＨ範囲内、２０から３５℃の温度範囲内で実施される。好ましくは、ｐＨは約６．５から８．３の範囲内であり、温度は約２３から３１℃の範囲内である。
好ましくは、生成培養物は、８０から約３００時間、より好ましくは約１３０から２８０時間インキュベートされる。

タクロリムスの生成は、生成培地の撹拌および通気を伴う好気性条件で実施されうる。培養混合物の撹拌および通気は、種々の方法で遂行されうる。生成培地の撹拌は、プロペラまたは類似の機械的装置によって提供されることができ、発酵条件および規模に応じてさまざまな程度に変更されうる。通気速度は、バイオリアクターの可動容積に対して１．０から２．５ＶＶＭ（１分間あたり液体の単位容積あたりで流れる気体の容積（１分間あたり容積あたりでの容積））の範囲内で変更されうる。

発酵プロセス用のさらなる周知の添加物は、具体的には主発酵プロセスにおいて添加されうる。培養培地の過度な起泡性を防ぐために、シリコン油、脂肪油、植物油などの消泡剤が添加されえた。具体的にはシリコンを基にする消泡剤が培養培地の過度な起泡性を防ぐために発酵プロセス中に添加されうる。

ステップｄ）発酵培地からの生成物の分離および精製（回収）
発酵培地由来のタクロリムスは、生物学的に活性な物質の回収のために慣用される従来法によって分離および精製されうる。生成されたタクロリムスは、有機溶媒、すなわちアセトン、エタノールまたはメタノール中での抽出によって発酵培地から回収されうる。

場合によって抽出物は次いで濃縮され、粗製タクロリムスを得るためにアセトン：水混合物を使用してＸＡＤ１６吸着剤でカラムクロマトグラフィーされうる。粗製物質は、純粋なタクロリムスを得るために調製用ＨＰＬＣ上でさらに精製されうる。

本出願による方法ステップの好ましい実施形態は、以下のとおり要約されうる：
ｉ）固体芽胞形成アガー培地上で、Ｓ．ツクバエンシス株を２８℃、１０から１４日間培養することによる前記Ｓ．ツクバエンシス株からのＳ．ツクバエンシス芽胞貯蔵物の調製。
ｉｉ）Ｓ．ツクバエンシス株の芽胞は濃縮芽胞懸濁物を作製するためおよび栄養培地６００ｍｌへの接種のために回収され、振とう機２２０ｒｐｍで２４−３２時間、栄養培地のＰＭＶ １０−２０％が達成されるまでインキュベートした。回収時のｐＨは、６．８から７．３の範囲内である。
ｉｉｉ）生成培地に接種するための所望容量の１０％までの種栄養接種物の増殖。栄養培地を含む１０リットル発酵槽は、栄養種で接種され、２４から２８時間、２８℃で培養される。
ｉｖ）栄養種培地の１０％は生成培地１００Ｌに接種するために使用される。発酵プロセスは、１２０から１８０時間、２８℃で硫酸または水酸化ナトリウム溶液を使用してｐＨを７．０−７．２に維持して実施される。

以下に非限定的な例として芽胞形成、種増殖および主発酵プロセスのための好ましい培地が記載される：
１）可溶性デンプン（１０ｇ／Ｌ）、塩化ナトリウム（１ｇ／ｌ）、硫酸アンモニウム（２ｇ／Ｌ）、炭酸カルシウム（２ｇ／Ｌ）、Ｋ_２ＨＰＯ_４（１ｇ／ｌ）、ＭｇＳＯ_４×７Ｈ_２Ｏ（１ｇ／Ｌ）、ＦｅＳＯ_４×７Ｈ_２Ｏ（０．００１ｇ／Ｌ）、ＭｎＣｌ_２×４Ｈ_２Ｏ（０．００１ｇ／Ｌ）、ＺｎＳＯ_４×７Ｈ_２Ｏ（０．００１ｇ／Ｌ）および細菌学的アガー（２０ｇ／Ｌ）を含む固体アガー芽胞形成培地（ＩＳＰ４）。ｐＨは滅菌の前に塩基または酸の適切な添加によって７．０±０．２に調整されるべきである。
２）大豆ミール（２．５ｇ／Ｌ）、デキストリン（１０ｇ／Ｌ）、ブドウ糖（１ｇ／Ｌ）、酵母エキス（５ｇ／Ｌ）、カゼイン加水分解物（７ｇ／Ｌ）、Ｋ_２ＨＰＯ_４（０．２ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（０．５ｇ／Ｌ）、ＭｎＣｌ_２×４Ｈ_２Ｏ（０．００５ｇ／Ｌ）、ＦｅＳＯ_４×７Ｈ_２Ｏ（０．０２５ｇ／Ｌ）、ＺｎＳＯ_４×７Ｈ_２Ｏ（０．００１ｇ／Ｌ）、ＭｇＳＯ_４×７Ｈ_２Ｏ（０．００５ｇ／Ｌ）およびＣａＣｌ_２（０．０２ｇ／Ｌ）を含む種培地。ｐＨは滅菌の前に塩基または酸の適切な添加によって７．０±０．２に調整されるべきである。
３）デキストリン（６０−１２０ｇ／Ｌ）、ブドウ糖（０−１５ｇ／Ｌ）、大豆ミール（５−２０ｇ／Ｌ）、大豆ペプトン（５−２０ｇ／Ｌ）、グリセロール（５−２０ｇ／Ｌ）、Ｌ−リジン（１−７．５ｇ／Ｌ）、Ｋ_２ＨＰＯ_４（０．５−２ｇ／Ｌ）、ＣａＣＯ_３（１−５ｇ／Ｌ）およびポリエチレングリコール（１−５ｇ／Ｌ）を含有する生成培地。ｐＨは、滅菌の前に塩基または酸の適切な添加によって７．０±０．２に調整されるべきである。

本発明の他の好ましい実施形態において主発酵プロセス（ステップｃ）は、アリルマロニルＣｏＡまたはアリルマロニルＣｏＡの少なくとも１つの前駆体（類似体）の外部添加の下で実施される。本発明に関してアリルマロニルＣｏＡ前駆体は、アリルマロニルＣｏＡの類似体も含む。

この点において本発明は、タクロリムスの調製のための方法、具体的には産業用発酵方法であって、ストレプトマイセス属に属する微生物の遺伝子改変株の培養のステップを含み、微生物の遺伝物質がエチルマロニルＣｏＡおよび／またはアリルマロニルＣｏＡの代謝および／または生合成に関与する少なくとも１つの不活性化および／または過剰発現された遺伝子を含み、アリルマロニルＣｏＡおよびまたはアリルマロニルＣｏＡの少なくとも１つの前駆体（類似体）の外部添加の下で実施される方法を提供する。

詳細には本発明は、Ｓ．ツクバエンシスの遺伝子改変株を培養することによるタクロリムス（または関連化合物）の発酵調製であって、アリルマロニル−およびエチルマロニルＣｏＡ活性化前駆体を提供する１つまたは複数の生合成経路が、例えばＡｌｌＲ遺伝子の不活性化および発酵プロセス中にアリルマロニルＣｏＡまたはエチルマロニルＣｏＡ ＳＮＡＣ前駆体を制御されたやり方で培養培地に添加または供給することによって、不活性化されているタクロリムスの発酵調製を対象とする。これは野生型株と比較して顕著な量でのタクロリムスまたはアスコマイシン化合物の産生を結果としてもたらす。したがって本明細書に記載の新規方法は、タクロリムスまたはアスコマイシンが排他的に産生される方法をもたらし、この方法は下流プロセスを顕著に簡素化する。
アリルマロニルＣｏＡもしくはエチルマロニルＣｏＡまたは本明細書に記載の少なくとも１つのこれらの前駆体（類似体）の外部添加の下での、ストレプトマイセス属に属する微生物の遺伝子改変株、具体的にはＳ．ツクバエンシスの遺伝子改変株を使用する純粋なタクロリムスまたは純粋なアスコマイシンの生成のための発酵プロセスは、既に記載されているものと同様に同化炭素源および窒素源を含有する水性栄養培地中において液内好気性条件下で実施されうる。

好ましくはアリルマロニルまたはエチルマロニルエステル前駆体の標的濃度範囲は、０．１から５．０ｇ／Ｌの範囲であり、より好ましくは０．５から３．０ｇ／Ｌの範囲である。標的濃度は、有形データ記憶媒体に好ましくは発酵プロセスの開始前に記録されうる。供給プロセスについては、さまざまなアリルマロニルまたはエチルマロニルエステル前駆体が使用されうる。アリルマロニルまたはエチルマロニルＮ−アセチルシステアミン（ＳＮＡＣ）チオエステルは好ましい。１つのもしくは２つのチオエステルの両方またはこれらの混合物は使用されうる。

発酵培地由来のタクロリムスは、生物学的に活性な物質の回収のために慣用される従来法によって分離および精製されうる。したがって前記方法は、下流プロセスにおいて調製用ＨＰＬＣが使用される必要がある古典的方法と比較して顕著な費用優位性を有する。

さらに本発明は、タクロリムス発酵生成のための方法における上に記載のストレプトマイセス・ツクバエンシスの遺伝子改変株の使用に関する。

さらなる態様において本発明は、上に記載のストレプトマイセス・ツクバエンシスの遺伝子改変株の培養によって生成されたタクロリムスまたは薬学的に許容されるこの誘導体もしくは類似体を含む医薬組成物に関する。用語「類似体」または「誘導体」は、参照分子に構造的に類似しているが参照分子の１つまたは複数の特定の置換基を代替の置換基で置き換えるために標的化されおよび制御されたやり方で改変されており、それにより参照分子に構造的に類似している分子が作製されている分子を意味して、本明細書において従来の薬学的意味で使用される。追加的に当業者に周知の方法を使用して、改善された治療有効性、すなわち特定の標的受容体型でのより高い効力および／または選択性、哺乳類脳血管関門を透過する高いまたは低い能力のいずれか（例えばより高いまたはより低い脳血管関門透過率）、よりまれな副作用などを有する化合物タクロリムスの類似体および誘導体は作製されうる。

本発明の組成物と関連して使用される句「薬学的に許容される」は、哺乳類、例えばヒトに投与された場合に生理学的に許容可能で、典型的には有害反応を生じない分子実体およびそのような組成物の他の成分を意味する。好ましくは本明細書において使用される用語「薬学的に許容される」は、連邦もしくは州政府の監督官庁によって認可されているまたは例えば米国薬局方もしくは哺乳類、より詳細にはヒトにおける使用について他の一般に認められた薬局方に列挙されていることを意味する。

本発明のさらなる実施形態は、式（Ｉ）の少なくとも１つの化合物もしくはこの多形性形態またはこの薬学的に許容される塩および少なくとも１つのさらなる薬学的に許容可能な添加剤を含む医薬組成物である。医薬組成物は、さらなる薬物化合物も含みうる。本発明の医薬組成物において式（Ｉ）の化合物、詳細にはタクロリムスまたはこの多形性形態もしくは薬学的に許容される塩は、前記化合物またはこの薬学的に許容される塩を１日分の投与のための投与単位あたりで例えば０．１から４０００ｍｇ、好ましくは１から２０００ｍｇを含有する投与単位として製剤される。本発明の全ての態様、具体的には医学的なものに関して化合物または組成物の投与は、最終的には主治医によって決定され、使用される化合物、動物種、性別、年齢、体重、症状の重症度、投与の方法、有害反応および／または他の禁忌症などの因子を考慮に入れる投与計画を有する。具体的に決定される投与量範囲は、患者の進行度および回復が完全に観察される標準的な設計の臨床試験によって決定されうる。そのような試験は、ヒトでの開始用量として動物での最大耐用量の低い百分率を使用する用量を漸増させる設計を使用する場合がある。

本発明による生理学的に許容される化合物は、（成人患者に対して）連日投与計画で、例えば０．０１ｍｇ／ｋｇ（治療される哺乳類の体重１ｋｇあたりのｍｇ）から１００ｍｇ／ｋｇの間、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇから７５ｍｇ／ｋｇの間の経口投与量で通常投与される。
配列番号および遺伝子機能は表２に示される：

以下の実施例は本発明を例示するためのものである。

実験手順
以下は、「ｃｃｒ」、「ＡｌｌＫ」、「ＡｌｌＲ」、「ＡｌｌＰ」および「ｅｃｍ」遺伝子をクローン化および分析するためならびにこれらの遺伝子相同体を使用するストレプトマイセス・ツクバエンシス変異体の作製のための実験手順の詳細な例である。同様に含まれるのは、これらの株を使用する発酵手順ならびにＦＫ５０６およびＦＫ５２０生成収率の判定の例である。分子生物学または微生物学の当業者に公知である標準的技術の追加的詳細および使用される具体的な酵素の名称は、例えば手引書「Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｅｎｅｔｉｃｓ」（Ｋｉｅｓｅｒら、２０００、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．ＩＳＢＮ０−７０８４−０６２３−８）に記載されている。

実施例１：
ストレプトマイセス・ツクバエンシス株の維持および芽胞調製
ストレプトマイセス・ツクバエンシス株の菌糸体を芽胞形成培地ＩＳＰ４上で８−１４日間、２８℃でコンフルエント菌叢として増殖させた。ＩＳＰ４培地は：

を含んでいた。

ｐＨは、１Ｍ ＮａＯＨで７．０に調整した。滅菌は、１２１±２℃、１２０±１０ｋＰａで２０分間実施した。８−１４日間の増殖後、芽胞を回収し、グリセロール（２０％）中、−２０℃で使用まで保存した。

実施例２：
ストレプトマイセス・ツクバエンシスゲノムＤＮＡの調製
ストレプトマイセス・ツクバエンシスＮＲＲＬ１８４８８（野生型）の芽胞を２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中のＴＳＢ培地（Ｋｉｅｓｅｒら、２０００、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．ＩＳＢＮ０−７０８４−０６２３−８）５０ｍｌを接種するために使用し、２８℃で２４時間振とう（２１０ｒｐｍ）させて維持した。培養物は、２４時間２８℃で増殖させた。菌糸体を遠心分離で回収し、ゲノムＤＮＡをＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をキット製造者の説明書に従って使用して調製した。ＤＮＡをＴＥ緩衝液（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２０００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＩＳＢＮ−９７８−０８７９６９５７７−４）１００μｌに再懸濁した。

実施例３：
単離されたゲノムＤＮＡをＧＡＴＣ ＡＧ、ドイツのＲｏｃｈｅ ＦＬＸ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙで配列決定した。ＦＫ５０６生合成遺伝子クラスターに属する配列連続断片が同定された場合、ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）の位置および向きをＦｒａｍｅＰｌｏｔ ｂｅｔａ４．０ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｉｓｈｉｋａｗａら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１７４（１９９９）２５１−２５３頁）を使用して分析した。予測アミノ酸配列を使用して、相同性検索をＧｅｎＢａｎｋ ｄａｔａｂａｓｅｓでＢＬＡＳＴｐおよびＢＬＡＳＴｘアルゴリズムを使用してＮＣＢＩ（ＮＣＢＩ／Ｂｌａｓｔ： ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）で実行した。これらの結果に基づき、保存ドメイン検索によって支持された推定遺伝子機能を割り当てた。
合計１５個のＯＲＦをｆｋｂＣから左に同定した。これらの内の６個はＦＫ５２０クラスターに存在するＯＲＦに高い類似性を示し（ｆｋｂＬ−リジンシクロデアミナーゼ、ｆｋｂＧ、ｆｋｂＨ、ｆｋｂＩ、ｆｋｂＪ、ｆｋｂＫ−遺伝子５個はメトキシマロニル−ＡＣＰ生合成に関与する。）、９個の遺伝子は「アリルサブクラスター」を形成すると予測された。このサブクラスターは、アシル転移酵素およびアシルキャリアタンパク質ドメインを含有する遺伝子１個、ケトアシル合成酵素ドメインを含有する遺伝子１個、遠位クロトニルＣｏＡ還元酵素ドメイン１個、遠位アシルＣｏＡ脱水素酵素ドメイン含有相同体２個、メチオニンγリアーゼ含有遺伝子１個、ＡｓｎＣファミリー制御遺伝子１個、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ遺伝子１個および遠位アセトアセチルＣｏＡ還元酵素相同体１個からなる。

実施例４：
ｃｃｒ遺伝子の破壊のためのベクターの構築、不活性化されたｃｃｒ遺伝子を有するＳ．ツクバエンシスＮＲＲＬ１８４８８の変異株の構築ならびに前記変異体のタクロリムスおよびアスコマイシン生成の分析
ａ）プライマーの設計：ｃｃｒ遺伝子の広領域の増幅のためのプライマーをストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）（タンパク質ＩＤ：ＮＰ＿６３０５５６．１、遺伝子ＩＤ：１１０１９１２）由来のｃｃｒ遺伝子を鋳型としたＢＬＡＳＴ検索を使用して見出されたさまざまなストレプトマイセス属種の他の周知のｃｃｒ遺伝子の保存領域および得られたＢＬＡＳＴ結果のＣｌｕｓｔａｌＷパイルアップ配列比較に基づいて設計した。したがってＸｂａＩ制限酵素部位を有するｃｃｒ−Ｆ２（ＧＴＣＴＡＧＡＣＣＡＣＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＣＧＡＣＣ）およびＥｃｏＲＩ制限酵素部位を有するｃｃｒ−Ｒ１（ＣＧＡＡＴＴＣＡＣＧＣＣＧＡＣＣＴＴＧＣＣＣＴＧＧＴＧＣ）をｃｃｒ遺伝子の９１７ｂｐ長領域を増幅するために作製した。
ｂ）ＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅：実施例２で得られたＳ．ツクバエンシスのゲノムＤＮＡをＢｉｏｒａｄ ｉＣｙｃｌｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを使用してＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ反応はＰｆｕポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）および製造者によって提供された緩衝液で、最終容量１００μｌ中、２００μＭ ｄＮＴＰ、１０％グリセロール、０．５μＭの各プライマー、鋳型Ｓ．ツクバエンシスゲノムＤＮＡおよそ５０ｎｇおよび酵素２．５単位の存在下で３０サイクル実施した。全３０サイクルの温度プロファイルは、９５℃、４５秒間（変性ステップ）、６９℃、４５秒間（アニーリングステップ）および７２℃、１分間（伸長ステップ）であった。ＰＣＲ増幅産物をｐＵＣ１９クローニングベクターにクローン化した。クローン化したＰＣＲ増幅産物の配列分析によって、それぞれの部分ｃｃｒ配列を確認した。
ｃ）相同組換えによるＳ．ツクバエンシスｃｃｒ遺伝子の破壊において使用されるｐＫＣ１１３９に基づく温度感受性ベクターおよびｐＫＣ１１３２に基づく自殺ベクターの構築：ｃｃｒ遺伝子のＦ２−Ｒ１増幅断片をｐＵＣ１９からＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ制限酵素部位によって切り出し、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ制限酵素で予め切断したベクターｐＫＣ１１３９およびｐＫＣ１１３２に連結反応によって移行させ、ｐＫＣ１１３９−ｃｃｒおよびｐＫＣ１１３２−ｃｃｒを作製した。ベクターｐＫＣ１１３９は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）での複製のための正常なｐＵＣ１９に基づくＯｒｉを含有しているが、３４℃を超える高い温度では機能できないストレプトマイセスでの複製のための温度感受性Ｏｒｉは含有していない（Ｂｉｅｒｍａｎら、１９９２ Ｇｅｎｅ．１１６（１）：４３−９頁、Ｍｕｔｈら、１９８９ Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ．２１９（３）：３４１−３４８頁）。ベクターｐＫＣ１１３２はＥ．コリでの複製のための正常ｐＵＣ１９に基づくＯｒｉだけを含有するが、ストレプトマイセスでの複製を維持できず（Ｂｉｅｒｍａｎら、１９９２ Ｇｅｎｅ．１１６（１）：４３−９頁）、したがって相同組換えによるゲノムへの組込みなしで失われる。次いでベクターｐＫＣ１１３９−ｃｃｒ１およびｐＫＣ１１３２−ｃｃｒをｃｃｒ遺伝子中で切断するＢａｍＨＩ制限酵素を使用して開き、９１７ｂｐ長断片を一方の３４６ｂｐと他方の５７１ｂｐとに分割し、次いでＤＮＡポリメラーゼＩラージ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片で末端平滑化した。次いでチオストレプトン（Ｔｓ）耐性を付与するカセットをｐＫＣ１１３９−ｃｃｒおよびｐＫＣ１１３２−ｃｃｒ ＢａｍＨＩ切断、末端平滑化ベクターに導入した。ｐ３３０ベクターをＸｂａＩ制限酵素で消化し、Ｔｓカセットを含有するおよそ９６１ｂｐ長断片をＤＮＡポリメラーゼＩラージ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片で末端平滑化し、ｐＫＣ１１３９−ｃｃｒおよびｐＫＣ１１３２−ｃｃｒベクターに連結し、ｐＫＣ１１３９−ｃｃｒＴｓおよびｐＫＣ１１３２−ｃｃｒＴｓベクターをそれぞれ作製した。
ｄ）ｃｃｒ遺伝子破壊のためのベクターのＳ．ツクバエンシスＮＲＲＬ１８４８８株への導入：プラスミド構築物ｐＫＣ１１３９−ｃｃｒＴｓおよびｐＫＣ１１３２−ｃｃｒＴｓを、接合性プラスミドｐＵＺ８００２を含有するエレクトロコンピテントＥ．コリ株ＥＴ１２５６７に形質転換によって導入した（Ｐａｇｅｔら、１９９９ Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１、２０４−２１１頁）。プラスミドｐＵＺ８００２は接合性線毛の構築のために必要な全ての遺伝子を含有しているが、転移の起点を欠いており、したがって宿主細胞に残留する（Ｊｏｎｅｓら、１９９７ Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２３：１６９−１７８頁）。接合手順をＫｉｅｓｅｒら、２０００（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．ＩＳＢＮ０−７０８４−０６２３−８）に記載のとおり行った。ベクターｐＫＣ１１３９−ｃｃｒＴｓでの形質転換だけが接合完了体を生じた。接合完了体は、アプラマイシン５０μｇ／ｍｌを添加した実施例１に記載の芽胞形成培地上で、２８℃で増殖させた。
ｅ）チオストレプトン耐性付与カセットによって破壊されたｃｃｒ遺伝子を有するＳ．ツクバエンシスの安定２次組換え株についての選択：アプラマイシン５０μｇ／ｍｌを添加した芽胞形成培地上で、２８℃で増殖させたベクターｐＫＣ１１３９−ｃｃｒＴｓのＳ．ツクバエンシス接合完了体を、チオストレプトン（２５μｇ／ｍｌ）を含む液体ＴＳＢ培地に接種し、振とうフラスコ中、２８℃、２１０ｒｐｍで、良好な種培養物を生成するためにアプラマイシンの添加をせずに増殖させた。２４時間後、種培養物を、チオストレプトン（２５μｇ／ｍｌ）を含む新鮮ＴＳＢ培地を含む新たな振とうフラスコ中に継代培養し、２４℃より高く温度を上昇させて２１０ｒｐｍで増殖させた。３４℃より高い温度ではｐＫＣ１１３９に基づくベクターは、複製できず、Ｓ．ツクバエンシスゲノムに組み込まれ、それにより一次組換え体が生じる。培養物を、チオストレプトン（２５μｇ／ｍｌ）を含む新鮮ＴＳＢ培地を含む新たな振とうフラスコ中にさらに数回継代培養し、次いでチオストレプトンを含む芽胞形成培地に播種し、２８℃で増殖させた。回収した芽胞をろ過し、系列希釈物を芽胞形成培地のプレート上に作製した。５−８日後、単一コロニーを、チオストレプトンを含む芽胞形成培地のプレート上およびチオストレプトンおよびアプラマイシンを含む芽胞形成培地のプレート上にパッチした。一次組換え体は、アプラマイシンにいまだ耐性である一方で２次組換え体はアプラマイシン耐性を欠失しており、アプラマイシンを含む芽胞形成培地上で増殖できない。選択された２次組換え株は次節に記載のサザンハイブリダイゼーションによっても確認した。
ｆ）Ｓ．ツクバエンシスｃｃｒ破壊変異体ゲノムＤＮＡのサザンハイブリダイゼーションによる分析：ＤＩＧ標識プラスミドＤＮＡプローブの調製：プラスミドｐＫＣ１１３９−ｃｃｒＴｓの挿入部分（Ｔｓ^Ｒカセットを挿入されたｃｃｒ遺伝子の一部）だけをプローブとして使用し、ベクターをＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ制限酵素で消化し、１７４４ｂｐ長断片をＷｉｚａｒｄ ＳＶ ＧｅｌおよびＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で精製した。およそ１μｇの溶出断片をＤＩＧ Ｈｉｇｈ Ｐｒｉｍｅ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｔａｒｔｅｒ Ｋｉｔ Ｉ（Ｒｏｃｈｅ）を使用するランダムプライムド標識技術によってジゴキシゲニン−ｄＵＴＰで一晩標識した。

ｉ）ＤＮＡ移行：Ｓ．ツクバエンシス野生型のゲノムＤＮＡおよびｐＫＣ１１３９−ｃｃｒＴｓ変異体（推定１次組換え体および２次組換え体）をＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をキットの製造者の説明書に従って使用して調製した。単離された各ゲノムＤＮＡおよそ１０μｇをＮａｅＩ制限酵素で消化した。消化終了時にＤＮＡ断片を１％アガロースゲル中、２０Ｖ、１２時間の電気泳動によって分離し、正に荷電したＨｙｂｏｎｄ−Ｎ^＋ｎｙｌｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にアルカリキャピラリーブロッティング法（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．、１９７５、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、９８：５０３）を使用して６時間転写した。

ｉｉ）ハイブリダイゼーション：ナイロン膜に固定化したＤＮＡへのＤＩＧ標識ＤＮＡプローブのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションをＤＩＧ Ｈｉｇｈ Ｐｒｉｍｅ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｔａｒｔｅｒ Ｋｉｔ Ｉ製造者（Ｒｏｃｈｅ）によって示されたとおりに実施した。プレハイブリダイゼーションは、供給されたプレハイブリダイゼーション溶液中、１時間、５０℃で実施した。ハイブリダイゼーション用に変性ＤＮＡ（９０℃、１０分間）１μｇを５０℃に予め加熱した新鮮プレハイブリダイゼーション溶液に加えた。一晩のハイブリダイゼーション後に膜を以下のとおり洗浄した：２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、室温、５分間で２回洗浄および０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５５℃、１５分間で２回洗浄。

ｉｉｉ）免疫学的検出：ハイブリダイズしたプローブを抗ジゴキシゲニン−ＡＰ Ｆａｂ断片で免疫検出し、比色分析基質ＮＢＴ／ＢＣＩＰでＤＩＧ Ｈｉｇｈ Ｐｒｉｍｅ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｔａｒｔｅｒ Ｋｉｔ Ｉ供給者（Ｒｏｃｈｅ）によって示されたとおり可視化した。

ｉｖ）予測されるバンドを分析し、ｐＫＣ１１３９−ｃｃｒＴｓベクターから得られる真の２次組換え体を記載のサザンハイブリダイゼーション手順によって確認した。ｃｃｒ破壊株Ｓ．ツクバエンシスＦ１３０をタクロリムスおよびアスコマイシン生成についてのさらなる検査のために選択した。
ｇ）ｐＫＣ１１３９−ｃｃｒＴｓを使用する２次相同組換えから得られたチオストレプトン耐性ｃｃｒ破壊変異体の発酵タクロリムス生成。

ｉ）種培養プロセス：種培地は：

を含んでいた。

ｐＨを１Ｍ ＮａＯＨで７．０に調整した。ブドウ糖を含まないこの培地５０ｍｌを２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコにろ過し、発泡栓で栓をして滅菌した。滅菌は１２１±２℃、１２０±１０ｋＰａで２５分間実施した。滅菌後、滅菌したブドウ糖懸濁液を加えた。滅菌種培地５０μｇ／ｍｌチオストレプトンを加え、ストレプトマイセス・ツクバエンシス株の芽胞（１％ｖ／ｖ）を種培地に接種し、振とう機で２８℃、２５０ｒｐｍ、２４−４８時間、好気性条件下でインキュベートした。

ｉｉ）主発酵プロセス：上記の種培養物のおよそ１０％ｖ／ｖを、５０ｍｌ発酵培地を含む２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコへの接種に使用した。発酵培地は：

を含んでいた。

発酵培地のｐＨを滅菌前に１Ｍ ＮａＯＨで７．０に調整した。滅菌は１２１℃で２５分間実施した。発酵は振とう機で２８℃、２５０ｒｐｍ、６−７日間実施した。

ｈ）ｐＫＣ１１３９−ｃｃｒＴｓを使用した２次相同組換えから得られたチオストレプトン耐性ｃｃｒ破壊変異体のＨＰＬＣでのタクロリムスおよびアスコマイシン生成の判定：

タクロリムスおよびアスコマイシンの判定のための方法：タクロリムスまたはアスコマイシン生成の判定のための分析を適切なカラムおよび実行条件を使用する無勾配逆相ＨＰＬＣによって実施した：カラム：Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ−１００ Ｃ１８（１５０×４．０ｍｍ、粒径３μｍ）、流速１．５ｍｌ／分、Ｔ℃＝６０℃、移動相：５６０ｍｌ水、３３５ｍｌアセトニトリル、７０ｍｌ ＭＴＢＥおよび０．２ｍｌ ８５％Ｈ_３ＰＯ_４、検出２１０ｎｍ、試料注入２０μｌ。
試料中のタクロリムスおよびアスコマイシン含有量の定量を、タクロリムスが１２．５分で溶出され、アスコマイシンが１１．５分で溶出されたタクロリムスおよびアスコマイシンの外部標準を使用して実施した。結果は試料中のタクロリムス生成と比較したアスコマイシン生成の％で表す。

試料調製：十分に振とうした培地５ｍｌにメタノール５ｍｌを加え、試料を抽出するために試料を１時間振とう機に置いた。抽出後、培地のメタノール抽出物１ｍｌを１．５ｍｌチューブに取り、１０分間、１４０００ｒｐｍで遠心分離した。上清０．８ｍｌを、ＨＰＬＣ分析を実施するためにバイアルに移した。

破壊されたｃｃｒ遺伝子を有する単離された２次組換え変異体は、野生型株ストレプトマイセス・ツクバエンシスＮＲＲＬ１８４８８と比較して平均で４０％のアスコマイシン生成の低下を示した。

実施例５：
ＡｌｌＲ遺伝子の破壊のためのベクターの構築、不活性化されたＡｌｌＲを有するＳ．ツクバエンシスＮＲＲＬ１８４８８の変異株の構築ならびに前記変異体のタクロリムスおよびアスコマイシン生成の分析
ａ）プライマーの設計：実施例４に記載のとおり、４５４に基づく全ゲノム配列分析をＳ．ツクバエンシスのゲノムに使用し、それはＡｌｌＲ遺伝子に隣接する領域の既知のＤＮＡ配列に基づいてＡｌｌＲ遺伝子に隣接する領域の増幅のためのプライマーを設計することを可能にした。したがって、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位を有するＡｌｌＲ−Ｆ１（ＣＡＡＧＣＴＴＣＡＣＣＧＧＴＣＣＣＧＧＧＣＴＣ）およびＮｄｅＩ制限酵素部位を有するＡｌｌＲ−Ｒ１（ＧＣＡＴＡＴＧＧＴＣＣＧＧＴＴＣＧＧＧＧＧＴＧＧＧ）をＡｌｌＲ遺伝子の上流領域を増幅するために作製し、ＮｄｅＩを有するＡｌｌＲ−Ｆ２（ＧＧＧＴＣＡＣＡＴＡＴＧＧＣＧＡＡＣＴＡＣＣＧＧＧ）およびＥｃｏＲＩ制限酵素部位を有するＡｌｌＲ−Ｒ２（ＣＧＡＡＴＴＣＴＧＴＧＧＧＣＣＧＡＣＣＴＣＡＣＣＣＡ）をＡｌｌＲ遺伝子の下流領域を増幅するために作製した。プライマーＡｌｌＲ−Ｒ１とＡｌｌＲ−Ｆ２との間、８９４ｂｐ（２９８アミノ酸）間隙を１３３５ｂｐ ＡｌｌＲ遺伝子のほとんど全体の欠失のために作製した。２つの重複断片をＮｄｅＩ制限酵素部位で組合せる場合、読み枠が保存され下流遺伝子への影響を最小にした標的ＡｌｌＲ遺伝子の「インフレーム」欠失を可能にする。
ｂ）ＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅：実施例２で得られたＳ．ツクバエンシスゲノムＤＮＡを実施例４のｉｉ節の記載と同じ条件を使用し、ＡｌｌＲ−Ｆ１＋ＡｌｌＲ−Ｒ１およびＡｌｌＲ−Ｆ２＋ＡｌｌＲ−Ｒ２プライマー組合せを使用してＢｉｏｒａｄ ｉＣｙｃｌｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを使用してＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ増幅産物をｐＵＣ１９クローニングベクターにクローン化し、クローン化したＰＣＲ産物の配列分析によって、これらそれぞれのＤＮＡ配列を確認した。
ｃ）相同組換えによるＳ．ツクバエンシスＡｌｌＲ遺伝子の破壊に使用するｐＫＣ１１３９に基づく温度感受性ベクターおよびｐＫＣ１１３２に基づく自殺ベクターの構築：ＡｌｌＲ遺伝子に隣接する領域のＦ１−Ｒ１およびＦ２−Ｒ２増幅断片をそれぞれ制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＮｄｅＩとによっておよびＥｃｏＲＩとＮｄｅＩとによってｐＵＣ１９から切り出した。ベクターｐＫＣ１１３９およびｐＫＣ１１３２は、予めＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で切断し、２つの断片を組合せ、各標的ベクターに連結し、それぞれｐＫＣ１１３９−ＡｌｌＲおよびｐＫＣ１１３２−ＡｌｌＲを作製した。次いで実施例４のｉｖ節に記載のとおりベクターｐＫＣ１１３９−ＡｌｌＲおよびｐＫＣ１１３２−ＡｌｌＲを、ＮｄｅＩ制限酵素を使用して開き、抗生物質耐性付与カセットを挿入した。ＡｌｌＲについてさまざまなカセットを使用した；チオストレプトン（Ｔｓ）耐性カセットは実施例４に記載のとおりｐ３３０ベクターから得た、エリスロマイシン（Ｅｒ）耐性カセットはｐＩＪ４０２６ベクターからベクターをＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化し、１６９０ｂｐ長断片を末端平滑化することによって得たならびにカナマイシン（Ｋｎ）耐性カセットはｐＳｕｐｅｒＣｏｓ１（ＲＥＦ！）ベクターからベクターをＳｍａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し１３２３ｂｐ長断片を末端平滑化することによって得た。各カセットを、開いたｐＫＣ１１３２−ＡｌｌＲおよびｐＫＣ１１３９−ＡｌｌＲベクターに連結し、それぞれｐＫＣ１１３２−ＡｌｌＲＴｓ、ｐＫＣ１１３２−ＡｌｌＲＥｒ、ｐＫＣ１１３２−ＡｌｌＲＫｎ、ｐＫＣ１１３９−ＡｌｌＲＴｓ、ｐＫＣ１１３９−ＡｌｌＲＥｒおよびｐＫＣ１１３９−ＡｌｌＲＫｎベクターを作製した。
ｄ）ＡｌｌＲ遺伝子の破壊のためのＳ．ツクバエンシスＮＲＲＬ１８４８８株へのベクターの導入：プラスミド構築物ｐＫＣ１１３９−ＡｌｌＲＴｓ、ｐＫＣ１１３９−ＡｌｌＲＥｒおよびｐＫＣ１１３９−ＡｌｌＲＫｎをＳ．ツクバエンシスＮＲＲＬ１８４８８株に実施例４ｄの記載と同じ接合手順によって導入した。
ｅ）抗生物質耐性付与カセットによって破壊されたＡｌｌＲ遺伝子を有するＳ．ツクバエンシスの安定２次組換え株の選択：ベクターｐＫＣ１１３９−ＡｌｌＲＴｓ、ｐＫＣ１１３９−ＡｌｌＲＥｒおよびｐＫＣ１１３９−ＡｌｌＲＫｎ、ｐＫＣ１１３９−ｃｃｒＴｓのＳ．ツクバエンシス接合完了体についてのチオストレプトン抗生物質付与カセットによって破壊されたＡｌｌＲ遺伝子を有するＳ．ツクバエンシスの安定２次組換え株の選択のための手順は、実施例６における記載と同様であった。継代培養を、対応する抗生物質（それに対する耐性カセットがＡｌｌＲ遺伝子に隣接する領域間に挿入されている。）を含む液体ＴＳＢ培地で実施した。選択された２次組換え株は、もはやアプラマイシン中では増殖できないが、耐性カセットがＡｌｌＲ遺伝子に隣接する領域間に挿入されている第２の抗生物質中では増殖できた。
ｆ）予め不活性化ｃｃｒ遺伝子が付与されているＳ．ツクバエンシスＦ１３０株へのＡｌｌＲ遺伝子の破壊のためのベクターの導入：プラスミドｐＫＣ１１３９−ＡｌｌＲＥｒおよびｐＫＣ１１３９−ＡｌｌＲＫｎを実施例４に記載のＳ．ツクバエンシスＦ１３０ ｃｃｒ破壊株に、実施例４ｄの記載と同じ接合手順によって導入した。
ｇ）チオストレプトン耐性付与カセットによって破壊されたｃｃｒ遺伝子およびエリスロマイシン耐性付与カセットによって破壊されたＡｌｌＲ遺伝子を有するＳ．ツクバエンシスの安定２次組換え株の選択：破壊されたｃｃｒおよびＡｌｌＲ両遺伝子を有するＳ．ツクバエンシスＦ１３０の誘導体、Ｓ．ツクバエンシスの安定２次組換え株を選択するための手順は、実施例４ｅの記載と同様であった。継代培養を、対応する抗生物質（それに対する耐性カセットが、ＡｌｌＲ遺伝子に隣接する領域間に挿入されている。）を含む液体ＴＳＢ培地で実施した。選択された２次組換え株は、もはやアプラマイシン中では増殖できないが、チオストレプトン（ｃｃｒ遺伝子を破壊している）、および耐性カセットが、ＡｌｌＲ遺伝子に隣接する領域間に挿入されている、第２の抗生物質中では両方とも増殖できた。
ｈ）ｐＫＣ１１３９−ＡｌｌＲＥｒを使用する２次相同組換えによって得たエリスロマイシン耐性ＡｌｌＲ破壊変異体の発酵でのタクロリムス生成：エリスロマイシン耐性ＡｌｌＲ破壊変異体についてのタクロリムス生成は、培養の開始時にエリスロマイシン５０μｇ／ｍｌを発酵培地に添加したことを除いて実施例４ｇに記載のとおり実施した。
ｉ）ｃｃｒおよびＡｌｌＲ二重破壊変異体による発酵でのタクロリムス生成：エリスロマイシン耐性ｃｃｒおよびＡｌｌＲ破壊変異体についてのタクロリムス生成は、培養の開始時にチオストレプトンおよびエリスロマイシンを各５０μｇ／ｍｌの濃度で発酵培地に添加したことを除いて実施例４ｇに記載のとおり実施した。供給実験用にアリルマロニルＣｏＡおよびエチルマロニルＣｏＡ前駆体、ジエチルアリルマロニルＳＮＡＣ、アリルマロニルジＳＮＡＣおよびエチルマロニルＳＮＡＣを発酵培地に濃度５−２０ｍＭで添加した。
ｊ）ｐＫＣ１１３９−ＡｌｌＲＥｒを使用する２次組換えによって得たエリスロマイシン耐性ＡｌｌＲ破壊変異体のＨＰＬＣでのタクロリムスおよびアスコマイシン生成の判定：
エリスロマイシン耐性ＡｌｌＲ破壊変異体のタクロリムスおよびアスコマイシン生成の判定のために実施例４ｈでの記載と同じ方法を使用した。

破壊されたＡｌｌＲ遺伝子を有する単離された２次組換え変異体は、タクロリムス生成の完全な消失を生じた。アリルマロニルＳＮＡＣまたはアリルマロニルジＳＮＡＣを発酵培地に添加した場合タクロリムスの生成が再確立された。同様にエチルマロニルＳＮＡＣを添加した場合アスコマイシン生成が再確立された。
ｋ）ｃｃｒおよびＡｌｌＲ二重破壊変異体のＨＰＬＣでのタクロリムスおよびアスコマイシン生成の判定：
ｃｃｒおよびＡｌｌＲ二重破壊変異体のタクロリムスおよびアスコマイシン生成の判定のために、実施例４ｈに記載の方法を使用した。

タクロリムスの完全な消失が不活性化されたｃｃｒおよびＡｌｌＲ遺伝子を有する単離された２次組換え変異体で生じた。アリルマロニルＳＮＡＣまたはアリルマロニルジＳＮＡＣを発酵培地に添加した場合、タクロリムスの生成が再確立された。同様にエチルマロニルＳＮＡＣを添加した場合アスコマイシン生成が再確立された。

実施例６：
ａｌｌＫ遺伝子の破壊のためのベクターの構築、不活性化されたａｌｌＫを有するＳ．ツクバエンシスＮＲＲＬ１８４８８の変異株の構築ならびに前記変異体のタクロリムスおよびアスコマイシン生成の分析
ａ）プライマーの設計：４５４に基づく全ゲノム配列決定をＳ．ツクバエンシスのゲノムに使用し、それはａｌｌＫ遺伝子に隣接する領域の既知のＤＮＡ配列に基づいてａｌｌＫ遺伝子に隣接する領域の増幅のためのプライマーを設計することを可能にした。それにより、ＥｃｏＲＩ制限酵素部位を有するａｌｌＫ−Ｆ１（ＡＧＡＡＴＴＣＧＴＴＡＣＧＧＧＧＡＧＡＣＧＧＣＡＴＣＣＣＧＧ）およびａｌｌＫ−Ｒ１（ＡＧＧＡＴＣＣＧＧＧＣＧＧＧＣＴＣＧＴＣＧＣＧＧＴ）を、内部ＢａｍＨＩ制限酵素部位を含むａｌｌＫ遺伝子の上流領域を増幅するために作製し、ＢａｍＨＩを有するａｌｌＫ−Ｆ２（ＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＣＧＴＡＴＣＧＣＣＡＡＣＣＧＣＴＡＣ）およびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位を有するａｌｌＫ−Ｒ２（ＡＡＡＧＣＴＴＣＣＣＧＧＴＡＧＴＴＣＧＣＣＡＴＡＴＧＴＧＡＣＣＣＧ）をａｌｌＫ遺伝子の下流領域を増幅するために作製した。内部ＢａｍＨＩ制限酵素部位とａｌｌＫ−Ｆ２との間、１６９８ｂｐ（５６６アミノ酸）間隙を、２３８８ｂｐ ａｌｌＫ遺伝子のほとんど全体の欠失のために作製した。２つの重複断片をＢａｍＨＩ制限酵素部位で組合せる場合、読み枠が保存され下流遺伝子への影響を最小にしての標的ａｌｌＫ遺伝子の欠失が可能になる。
ｂ）ＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅：実施例２で得られたＳ．ツクバエンシスゲノムＤＮＡを実施例４ｂのｉｉ節での記載と同じ条件を使用し、ａｌｌＫ−Ｆ１＋ａｌｌＫ−Ｒ１およびａｌｌＫ−Ｆ２＋ａｌｌＫ−Ｒ２プライマー組合せを使用してＢｉｏｒａｄ ｉＣｙｃｌｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを使用してＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ増幅産物をｐＵＣ１９クローニングベクターにクローン化し、クローン化したＰＣＲ産物の配列分析によって、これらそれぞれのＤＮＡ配列を確認した。
ｃ）相同組換えによるＳ．ツクバエンシスａｌｌＫ遺伝子の破壊に使用するためのｐＫＣ１１３９に基づく温度感受性ベクターおよびｐＫＣ１１３２に基づく自殺ベクターの構築：ａｌｌＫ遺伝子に隣接する領域のＦ１−Ｒ１およびＦ２−Ｒ２増幅断片をそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩとによっておよびＨｉｎｄＩＩとＢａｍＨＩとによってｐＵＣ１９から切り出した。ベクターｐＫＣ１１３９およびｐＫＣ１１３２は、予め制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、２つの断片を組合せ、各標的ベクターに連結し、それぞれｐＫＣ１１３９−ａｌｌＫおよびｐＫＣ１１３２−ａｌｌＫを作製した。
ｄ）ａｌｌＫ遺伝子のインフレーム破壊のためのベクターのＳ．ツクバエンシスＮＲＲＬ１８４８８株への導入：実施例４ｄでの記載と同じ接合手順によってプラスミド構築物ｐＫＣ１１３９−ａｌｌＫをＳ．ツクバエンシスＮＲＲＬ１８４８８に導入した。
ｅ）破壊されたａｌｌＫ遺伝子を有するＳ．ツクバエンシスの安定２次組換え株の選択：アプラマイシン５０μｇ／ｍｌを添加した芽胞形成培地上、２８℃で増殖させたベクターｐＫＣ１１３９−ａｌｌＫのＳ．ツクバエンシス接合完了体を液体ＴＳＢ培地に接種し、良好な種培養物を生成するためにアプラマイシン５０μｇ／ｍｌを添加して振とうフラスコ中、２８℃、２１０ｒｐｍで増殖させた。２４時間後、種培養物をアプラマイシン５０μｇ／ｍｌを添加した新鮮ＴＳＢ培地を含む新たな振とうフラスコ中に継代培養し、３４℃より高く温度を上昇させて２１０ｒｐｍで増殖させた。３４℃より高い温度ではｐＫＣ１１３９に基づくベクターは複製できず、Ｓ．ツクバエンシスゲノムに組み込まれ、それにより一次組換え体が得られる。次いで培養物を、アプラマイシンを含まない新鮮ＴＳＢ培地を含む新たな振とうフラスコ中に数回継代培養し、相同組換えによってｐＫＣ１１３９に基づくベクターが除去され、次いで芽胞形成培地に播種し、２８℃で増殖させた。回収した芽胞をろ過し、系列希釈物を芽胞形成培地のプレート上に作製した。５−８日後、芽胞形成培地のプレート上およびアプラマイシンを含む芽胞形成培地のプレート上に単一コロニーをパッチした。一次組換え体は、アプラマイシンにまだ耐性である一方で２次組換え体はアプラマイシン耐性を失っており、アプラマイシンを含む芽胞形成培地上で増殖できない。ａｌｌＫ遺伝子の所望のインフレーム欠失を有する真の２次組換え変異体を、実施例４ｆに記載のサザンハイブリダイゼーションを使用して野生型復帰変異体と照らし合わせて同定した。
ｆ）ｐＫＣ１１３９−ａｌｌＫを使用する２次相同組換えから得られたａｌｌＫ破壊変異体の発酵でのタクロリムス生成：ａｌｌＫ破壊変異体についてタクロリムス生成を、抗生物質を増殖培地に添加せずに実施例４ｇに記載のとおり実施した。
ｇ）ａｌｌＫ破壊変異体による発酵でのタクロリムス生成：タクロリムス生成ａｌｌＫ破壊変異体を実施例４ｇに記載のとおり実施した。供給実験のためにアリルマロニルＣｏＡおよびエチルマロニルＣｏＡ前駆体、アリルマロニルＳＮＡＣ、アリルマロニルジＳＮＡＣおよびエチルマロニルＳＮＡＣを濃度５−２０ｍＭで発酵培地に添加した。
ｈ）ｐＫＣ１１３９−ａｌｌＫを使用する２次組換えから得られたａｌｌＫ破壊変異体のＨＰＬＣでのタクロリムスおよびアスコマイシン生成の判定：ａｌｌＫ破壊変異体のタクロリムスおよびアスコマイシン生成の判定のために実施例４ｈの記載と同じ方法を使用した。

破壊されたａｌｌＫ遺伝子を有する単離された２次組換え変異体は、タクロリムスおよびジヒドロタクロリムス生成の完全な消失を生じた。アリルマロニルＳＮＡＣまたはアリルマロニルジＳＮＡＣを発酵培地に添加した場合、タクロリムスの生成が再確立された。同様にエチルマロニルＳＮＡＣを添加した場合、アスコマイシン生成が大幅に増加した。

実施例７：
ＡｌｌＰ遺伝子の過剰発現用のベクターの構築、過剰発現されたＡｌｌＰを有するＳ．ツクバエンシスＮＲＲＬ１８４８８の変異株の構築ならびに前記変異体のタクロリムスおよびアスコマイシン生成の分析
ａ）ＡｌｌＰ遺伝子の化学合成：４５４−全ゲノム配列決定に基づいてＳ．ツクバエンシスＮＲＲＬ１８４８８のゲノムのＤＮＡ配列を、ＯＲＦの５’末端にＮｄｅＩ制限酵素部位およびＯＲＦの３’末端にＸｂａＩ制限酵素部位を付与するＡｌｌＰ遺伝子のＤＮＡ配列を設計および合成するために使用した。
ｂ）ＡｌｌＰ遺伝子の過剰発現のためのｐＳＥＴ１５２に基づく発現ベクターの構築：合成したＡｌｌＰ遺伝子を制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｂａＩによって切断した。Ｅｒｍ^＊プロモーター配列をｐＳＥ１５２ベクターのマルチクローニング部位にＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ制限酵素部位を使用して予め導入し、ＮｄｅＩ部位をプロモーター配列の３’末端に作製した。このベクターをＮｄｅＩおよびＸｂａＩで切断し、ＡｌｌＰ遺伝子のＮｄｅＩおよびＸｂａＩ断片と連結してｐＳＥＴ−１５２−ＡｌｌＰプラスミドを作製した。
ｃ）Ｓ．ツクバエンシスＮＲＲＬ１８４８８株へのＡｌｌＰ遺伝子の過剰発現：
プラスミド構築物ｐＳＥＴ１５２−ＡｌｌＰをＳ．ツクバエンシスＮＲＲＬ１８４８８株に実施例４ｄに記載の接合手順によって導入した。
ｄ）ｐＳＥＴ１５２−ＡｌｌＰプラスミドを付与するＳ．ツクバエンシス変異体のタクロリムスおよびアスコマイシン生成の判定
タクロリムスおよびアスコマイシン生成の判定のためにＨＰＬＣ法を実施例４ｈに記載のとおり使用した。

ＡｌｌＰ遺伝子が過剰発現された単離された組換え変異体は、野生型株ストレプトマイセス・ツクバエンシスＮＲＲＬ１８４８８と比較して２５％増加したタクロリムス生成を示した。

実施例８：
ｅｃｍ遺伝子の過剰発現のためのベクターの構築、過剰発現されたｅｃｍ遺伝子を有するＳ．ツクバエンシスＮＲＲＬ１８４８８の変異株の構築ならびに前記変異体のタクロリムスおよびアスコマイシン生成の分析
ａ）ｅｃｍ遺伝子の化学合成：４５４−全ゲノム配列決定に基づいてＳ．ツクバエンシスＮＲＲＬ１８４８８のゲノムのＤＮＡ配列を、ＯＲＦの５’末端にＮｄｅｌ制限酵素部位およびＯＲＦの３’末端にＸｂａＩ制限酵素部位を付与するｅｃｍ遺伝子のＤＮＡ配列を設計および化学合成するために使用した。
ｂ）ＡｌｌＰ遺伝子の過剰発現のためのｐＳＥＴ１５２に基づく発現ベクターの構築：合成したｅｃｍ遺伝子断片を制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｂａＩによって切断した。Ｅｒｍ^＊プロモーター配列をｐＳＥＴ１５２ベクターのマルチクローニング部位にＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ制限酵素部位を使用して予め導入し、ＮｄｅＩ部位を前記プロモーター配列の３’末端に追加した。このベクターをＮｄｅＩおよびＸｂａＩで切断し、ＡｌｌＰ遺伝子のＮｄｅＩおよびＸｂａＩ断片と連結してｐＳＥＴ−１５２−ｅｃｍ構築物を作製した。
ｃ）Ｓ．ツクバエンシスＮＲＲＬ１８４８８株へのｅｃｍ遺伝子の過剰発現のためのベクターの導入：
プラスミド構築物ｐＳＥＴ１５２−ｅｃｍをＳ．ツクバエンシスＮＲＲＬ１８４８８株に実施例４ｄに記載の接合手順によって導入した。
ｄ）ｅｃｍ過剰発現変異体におけるタクロリムスおよびアスコマイシン生成のＨＰＬＣ分析
ｅｃｍ過剰発現変異体のタクロリムスおよびアスコマイシン生成の判定のために実施例４ｈに記載のとおりの方法を使用した。

過剰発現されたｅｃｍ遺伝子を有する単離された組換え変異体は、野生型株ストレプトマイセス・ツクバエンシスＮＲＲＬ１８４８８と比較して２０％減少したアスコマイシン生成を示した。

実施例９：
ａｌｌＡおよびａｌｌＫ遺伝子の過剰発現のためのベクターの構築、このベクターを有するＳ．ツクバエンシスＮＲＲＬ１８４８８のａｌｌＫ不活性化株の相補性ならびに前記変異体のタクロリムスおよびアスコマイシン生成の分析
ａ）プライマーの設計：実施例４に記載のとおり、４５４に基づく全ゲノム配列決定をＳ．ツクバエンシスのゲノムに使用し、それはａｌｌＡからａｌｌＤ遺伝子のａｌｌサブクラスター領域の増幅のためのプライマーの設計を可能にした。それによりＮｄｅＩ制限酵素部位を有するＡＴ−ｅｘｐ−Ｆ１（ＡＣＡＴＡＴＧＣＴＣＧＧＧＴＣＧＴＴＣＧＴＴＡＣＧＧＧＧＡＧ）およびＸｂａＩ制限酵素部位を有するＡＴ―ｅｘｐ―Ｒ１（ＡＴＣＴＡＧＡＡＣＧＴＧＧＧＴＣＡＴＣＧＧＣＴＧＧＴＣＣＴＴＧ）をこれら２つのＯＲＦ（ａｌｌＡおよびａｌｌＫ）を増幅するために作製した。
ｂ）ＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅：実施例２で得られたＳ．ツクバエンシスゲノムＤＮＡをＢｉｏｒａｄ ｉＣｙｃｌｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを使用してＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ反応はＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）および製造者によって提供された緩衝液で、最終容量５０μｌ中の２００μＭ ｄＮＴＰ、３％ＤＭＳＯ、０．５μＭの各プライマー、鋳型Ｓ．ツクバエンシスゲノムＤＮＡおよそ５０ｎｇおよび酵素２．５単位の存在下で３０サイクル実施した。最初の５サイクルの温度プロファイルは、９８℃、１５秒間（変性ステップ）、６５℃、３０秒間（アニーリングステップ）および７２℃、３分１５秒間（伸長ステップ）であった。残りの２５サイクルの温度プロファイルは９８℃、１５秒間（変性ステップ）、６０℃、３０秒間（アニーリングステップ）および７２℃、３分１５秒間（伸長ステップ）であった。ＰＣＲ増幅産物をｐＵＣ１９クローニングベクターにクローン化した。クローン化したＰＣＲ産物の配列分析によってａｌｌＡおよびａｌｌＫ遺伝子の配列を確認した。
ｃ）ａｌｌＡおよびａｌｌＫ遺伝子の過剰発現のためのｐＳＥＴ１５２に基づく発現ベクターの構築：３．９ｋｂ挿入物を制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｂａＩによってｐＵＣ１９ベクターから切り出した。ＥｒｍＥ^＊プロモーター配列をｐＳＥＴ１５２ベクターのマルチクローニング部位にＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ制限酵素部位を使用して予め導入し、ＮｄｅＩ部位をプロモーター配列の３’末端に作製した。このベクターをＮｄｅＩおよびＸｂａＩで切断し、続いてａｌｌＡおよびａｌｌＫ遺伝子を含むＮｄｅＩおよびＸｂａＩ断片と連結してｐＳＥＴ１５２−ｅｒｍＥ^＊−ａｌｌＡ−Ｋプラスミドを作製した。
ｄ）実施例６において得た不活性化ａｌｌＫ遺伝子を有するＳ．ツクバエンシス株へのａｌｌＡおよびａｌｌＫ遺伝子の導入：プラスミド構築物ｐＳＥＴ１５２−ｅｒｍＥ^＊−ａｌｌＡ−ＫをＳ．ツクバエンシスＮＲＲＬ１８４８８のａｌｌＫ不活性化株に実施例４ｄに記載の接合手順によって導入した。
ｅ）ｐＳＥＴ１５２−ｅｒｍＥ^＊−ａｌｌＡ−Ｋベクターで形質転換したａｌｌＫ破壊変異体の発酵でのタクロリムス生成：形質転換した変異体に関してタクロリムス生成を、抗生物質を増殖培地に添加せずに実施例４ｇに記載のとおり実施した。
ｆ）ｐＳＥＴ１５２−ｅｒｍＥ^＊−ａｌｌＡ−Ｋプラスミドを付与されたａｌｌＫ不活性化Ｓ．ツクバエンシス変異体のタクロリムスおよびアスコマイシン生成の判定

ａｌｌＫ遺伝子活性の減失がａｌｌＡおよびａｌｌＫの過剰発現によって相補されたａｌｌＫ不活性化株の単離された組換え変異体は、回復したタクロリムス生成を示した。

実施例１０：
ａｌｌＡ、ａｌｌＫ、ａｌｌＲ、ａｌｌＤ遺伝子の過剰発現のためのベクターの構築、このベクターを有するＳ．ツクバエンシスＮＲＲＬ１８４８８のａｌｌＲ不活性化株の相補性ならびに前記変異体のタクロリムスおよびアスコマイシン生成の分析
ａ）プライマーの設計：実施例４に記載のとおり、４５４に基づく全ゲノム配列決定をＳ．ツクバエンシスのゲノムに使用し、それはａｌｌＡからａｌｌＤ遺伝子のａｌｌサブクラスター領域の増幅のためのプライマーの設計を可能にした。それによりＮｄｅＩ制限酵素部位を有するＡＴ−ｅｘｐ−Ｆ１（ＡＣＡＴＡＴＧＣＴＣＧＧＧＴＣＧＴＴＣＧＴＴＡＣＧＧＧＧＡＧ）およびＸｂａＩ制限酵素部位を有するＡＴ―ｅｘｐ―Ｒ２（ＡＴＣＴＡＧＡＡＣＡＴＧＣＣＣＴＡＧＧＴＡＣＧＴＴＴＣＧＣＧＧ）をこれら４つのＯＲＦ（ａｌｌＡ、ａｌｌＫ、ａｌｌＲおよびａｌｌＤ）を増幅するために作製した。
ｂ）ＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅：実施例２で得られたＳ．ツクバエンシスゲノムＤＮＡをＢｉｏｒａｄ ｉＣｙｃｌｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを使用してＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ反応はＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）および製造者によって提供された緩衝液で、最終容量５０μｌ中の２００μＭ ｄＮＴＰ、３％ＤＭＳＯ、０．５μＭの各プライマー、鋳型Ｓ．ツクバエンシスゲノムＤＮＡおよそ５０ｎｇおよび酵素２．５単位の存在下で３０サイクル実施した。最初の５サイクルの温度プロファイルは、９８℃、１５秒間（変性ステップ）、６５℃、３０秒間（アニーリングステップ）および７２℃、３分１５秒間（伸長ステップ）であった。残りの２５サイクルの温度プロファイルは９８℃、１５秒間（変性ステップ）、６０℃、３０秒間（アニーリングステップ）および７２℃、３分１５秒間（伸長ステップ）であった。ＰＣＲ増幅産物をｐＵＣ１９クローニングベクターにクローン化した。クローン化したＰＣＲ産物の配列分析によってａｌｌＡ、ａｌｌＫ、ａｌｌＲおよびａｌｌＤ遺伝子の配列を確認した。
ｃ）ａｌｌＡ、ａｌｌＫ、ａｌｌＲおよびａｌｌＤ遺伝子の過剰発現のためのｐＳＥＴ１５２に基づく発現ベクターの構築：６．４ｋｂ挿入物を制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｂａＩによってｐＵＣ１９ベクターから切り出した。ＥｒｍＥ^＊プロモーター配列をｐＳＥＴ１５２ベクターのマルチクローニング部位にＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ制限酵素部位を使用して予め導入し、ＮｄｅＩ部位をプロモーター配列の３’末端に作製した。このベクターをＮｄｅＩおよびＸｂａＩで切断し、続いてａｌｌＡ、ａｌｌＫ、ａｌｌＲおよびａｌｌＤ遺伝子を含むＮｄｅＩおよびＸｂａＩ断片と連結してｐＳＥＴ１５２−ｅｒｍＥ^＊−ａｌｌＡ−Ｄプラスミドを作製した。
ｄ）実施例５において得た不活性化ａｌｌＲ遺伝子を有するＳ．ツクバエンシス株へのａｌｌＡ、ａｌｌＫ、ａｌｌＲおよびａｌｌＤ遺伝子の導入：プラスミド構築物ｐＳＥＴ１５２−ｅｒｍＥ^＊−ａｌｌＡ−ＤをＳ．ツクバエンシスＮＲＲＬ１８４８８のａｌｌＲ不活性化株に実施例４ｄに記載の接合手順によって導入した。
ｅ）ｐＳＥＴ１５２−ｅｒｍＥ^＊−ａｌｌＡ−Ｄベクターで形質転換したａｌｌＲ不活性化変異体の発酵でのタクロリムス生成：形質転換した変異体に関してタクロリムス生成を、抗生物質を増殖培地に添加せずに実施例４ｇに記載のとおり実施した。
ｆ）ｐＳＥＴ１５２−ｅｒｍＥ^＊−ａｌｌＡ−Ｄプラスミドを付与されたａｌｌＲ不活性化Ｓ．ツクバエンシス変異体のタクロリムスおよびアスコマイシン生成の判定

ａｌｌＲ遺伝子活性の減失がａｌｌＡ、ａｌｌＫ、ａｌｌＲおよびａｌｌＤの過剰発現によって相補されたａｌｌＲ不活性化株の単離された組換え変異体は、タクロリムスおよびアスコマイシンの回復した生成を示した。

実施例１１：
プラスミドｐＳＥＴ１５２−ｅｒｍＥ^＊−ａｌｌＡ−Ｄのストレプトマイセス・ハイグロスコピカス変種アスコマイセティカスＡＴＣＣ１４８９１株への導入、この株でのａｌｌＡ、ａｌｌＫ、ａｌｌＲおよびａｌｌＤ遺伝子の過剰発現ならびに前記変異体のタクロリムスおよびアスコマイシン生成の分析
ａ）ａｌｌＡ、ａｌｌＫ、ａｌｌＲおよびａｌｌＤ遺伝子の過剰発現のためのｐＳＥＴ１５２に基づく発現ベクターの構築：ｐＳＥＴ１５２−ｅｒｍＥ^＊−ａｌｌＡ−Ｄプラスミドを実施例１０に記載のとおり調製した。
ｂ）ａｌｌＡ、ａｌｌＫ、ａｌｌＲおよびａｌｌＤ遺伝子の、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス変種アスコマイセティカスＡＴＣＣ１４８９１への導入：プラスミド構築物ｐＳＥＴ１５２−ｅｒｍＥ^＊−ａｌｌＡ−Ｄを、接合性プラスミドｐＵＺ８００２を含有するエレクトロコンピテントＥ．コリ株ＥＴ１２５６７への形質転換によって導入した（Ｐａｇｅｔら、１９９９ Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１、２０４−２１１頁）。プラスミドｐＵＺ８００２は接合性線毛の構築に必要な全ての遺伝子を含有しているが、転移の起点を欠いており、したがって宿主細胞に残留する（Ｊｏｎｅｓら、１９９７ Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２３：１６９−１７８頁）。ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス変種アスコマイセティカスＡＴＣＣ１４８９１の接合手順をＫｉｅｓｅｒら、２０００（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．ＩＳＢＮ０−７０８４−０６２３−８）に記載のとおり行った。接合完了体は、アプラマイシン５０μｇ／ｍｌを添加した実施例１に記載の芽胞形成培地上、２８℃で増殖させた。
ｃ）ｐＳＥＴ１５２−ｅｒｍＥ^＊−ａｌｌＡ−Ｄベクターで形質転換した株の発酵でのアスコマイシンおよびタクロリムス生成：形質転換した変異体のアスコマイシンおよびタクロリムス生成のための発酵プロセスは抗生物質を増殖培地に添加せずに実施例４ｇに記載のとおり実施した。
ｄ）ａｌｌＡ、ａｌｌＫ、ａｌｌＲおよびａｌｌＤ遺伝子を過剰発現しているストレプトマイセス・ハイグロスコピカス変種アスコマイセティカスＡＴＣＣ１４８９１変異体のＬＣ−ＭＳ／ＭＳでのタクロリムスおよびアスコマイシンの生成の判定：

試料調製：十分に振とうした培地５ｍｌにメタノール５ｍｌを加え、試料を抽出するために試料を１時間振とう機に置いた。抽出後、培地のメタノール抽出物１ｍｌを１．５ｍｌチューブに取り、１０分間、１４０００ｒｐｍで遠心分離した。上清０．８ｍｌをＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を実施するためにバイアルに移した。

タクロリムスおよびアスコマイシン判定のための方法：培養培地中のＦＫ５０６およびＦＫ５２０の同一性をＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析によって判定した。本発明者らは、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘからの逆相カラム（Ｇｅｍｉｎｉ Ｃ１８ ｃｏｌｕｍｎ、５μｍ、１５０ｍｍ×２ｍｍ ｉ．ｄ．）を使用するＷａｔｔｅｒｓ Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｑｕａｔｔｒｏ ｍｉｃｒｏ ｄｅｔｅｃｔｏｒと共にＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ｓｅｒｉｅｓ ＬＣ−ＭＳ ｓｙｓｔｅｍを使用した。分離は、流速０．２５０ｍｌ／分、溶媒Ａとして０．５％ＴＦＡ、溶媒Ｂとしてアセトニトリルでの勾配溶出によって実施した。勾配プログラムは：６０％Ａ、０分；６０−２０％Ａ、０−１７分；２０−６０％Ａ、１７−１８分；６０％Ａ、１８−３０分であり、注入容量１０μＬ、カラム温度４５℃を使用した。質量選択検出器（Ｗａｔｅｒｓ、Ｑｕａｔｔｒｏ ｍｉｃｒｏ ＡＰＩ）は分析物の陽イオン化にコーン電圧２０Ｖおよびキャピラリー電圧３．５ｋＶを使用するエレクトロスプレーイオン化を備えていた。乾燥窒素を３５０℃に加熱し、乾燥ガス流量は４００ｌ／時間に、衝突エネルギーは２０ｅＶにした。ＥＳＩ^＋ポジティブモードにおいては、ＦＫ５０６のナトリウムイオン（［Ｍ＋Ｎａ］^＋）の捕獲に対応するｍ／ｚ＝８２６．５のイオンが最も強く、他の調査者の結果と一致した（Ｙｕａｎ Ｊ．ら、２００８、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．、Ｂ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｍｅｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．８６８、３４−４１頁を参照されたい。）。ＦＫ５０６同一性確認に関して、多重反応モニタリングモードを使用し、遷移ＦＫ５０６ ｍ／ｚ＝８２６．５［Ｍ＋Ｎａ］^＋→ｍ／ｚ＝６１６．４を記録した。同様にＦＫ５２０モニタリングについても遷移ｍ／ｚ＝８１４．５［Ｍ＋Ｎａ］^＋→ｍ／ｚ＝６０４．４を記録した。タクロリムスはおよそ１８．２分に溶出され、アスコマイシンはおよそ１７．５−１７．７分に溶出された。ＦＫ５０６とＦＫ５２０との存在量は判定できず、したがって両化合物の存在または不在だけが確立された（図２）。

ａｌｌＡ、ａｌｌＫ、ａｌｌＲおよびａｌｌＤ遺伝子が過剰発現されているストレプトマイセス・ハイグロスコピカス変種アスコマイセティカスＡＴＣＣ１４８９１の単離された組換え変異体は、この株で通常生成されるアスコマイシンに加えてタクロリムスの生成も示した。

実施例１２：
ａｌｌサブクラスターの大部分（ａｌｌＤからａｌｌＳ）の欠失のためのベクターの構築、ａｌｌサブクラスターのこの部分を欠失しているＳ．ツクバエンシスＮＲＲＬ１８４８８の変異株の構築ならびに前記変異体のタクロリムスおよびアスコマイシン生成の分析
ａ）プライマーの設計：実施例４に記載のとおり、４５４に基づく全ゲノム配列決定をＳ．ツクバエンシスのゲノムに使用し、それはａｌｌＤ遺伝子の上流およびａｌｌＳ遺伝子の下流の領域の既知のＤＮＡ配列に基づいてａｌｌＤとａｌｌＳ遺伝子との間の領域に隣接する領域の増幅のためのプライマーを設計することを可能にした。これにより、ＢａｍＨＩ制限酵素部位を有するＫＳ−ｄｅｌＦ２ｂ（ＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＣＧＴＡＴＣＧＣＣＡＡＣＣＧＣＴＡＣ）およびＸｂａＩ制限酵素部位を有するＡｌｌＲｅｘｐＲ１（ＡＴＣＴＡＧＡＧＧＣＧＴＴＣＧＧＡＴＴＣＧＣＴＣＡＣＣＧ）をａｌｌＤ遺伝子の上流領域を増幅するために作製し、ＸｂａＩを有するＣｌｕｓＤｅｌＦ２（ＡＴＣＴＡＧＡＧＧＧＣＧＧＡＴＡＣＧＴＣＡＣＣＧＧＣＧ）およびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位を有するＣｌｕｓＤｅｌＲ２ｂ（ＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧＡＧＡＴＣＡＴＣＧＡＡＧＧＣＡＧＣ）をａｌｌＳ遺伝子の下流領域を増幅するために作製した。プライマーＡｌｌＲｅｘｐＲ１とＣｌｕｓＤｅｌＦ２の間、６２６２ｂｐの間隙をａｌｌＤ、ａｌｌＭ、ａｌｌＮ、ａｌｌＰ、ａｌｌＯおよびａｌｌＳ遺伝子の欠失のために作製した。
ｂ）ＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅：実施例２で得られたＳ．ツクバエンシスゲノムＤＮＡをＢｉｏｒａｄ ｉＣｙｃｌｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを使用してＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ反応はＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）および製造者によって提供された緩衝液で、最終容量５０μｌ中の２００μＭ ｄＮＴＰ、３％ＤＭＳＯ、０．５μＭの各プライマー、鋳型Ｓ．ツクバエンシスゲノムＤＮＡおよそ５０ｎｇおよび酵素２．５単位の存在下で３０サイクル実施した。最初の５サイクルの温度プロファイルは、９８℃、１５秒間（変性ステップ）、６５℃、３０秒間（アニーリングステップ）および７２℃、１分間（伸長ステップ）であった。残りの２５サイクルの温度プロファイルは９８℃、１５秒間（変性ステップ）、６０℃、３０秒間（アニーリングステップ）および７２℃、１分間（伸長ステップ）であった。ＰＣＲ増幅産物をｐＵＣ１９クローニングベクターにクローン化した。クローン化したＰＣＲ産物の配列分析によって増幅された上流および下流領域の配列を確認した。
ｃ）相同組換えによるＳ．ツクバエンシスゲノムのａｌｌＤ−ａｌｌＳ領域の破壊に使用するｐＫＣ１１３９に基づく温度感受性ベクターの構築：隣接領域のＫＳ−ｄｅｌＦ２ｂ−ＡｌｌＲｅｘｐＲ１およびＣｌｕｓＤｅｌＦ２−ＣｌｕｓＤｅｌＲ２の増幅断片をそれぞれ制限酵素ＢａｍＨＩとＸｂａＩとによっておよびＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩとによってｐＵＣ１９から切り出した。ベクターｐＫＣ１１３９は、予め制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、２つの断片を組合せ、各標的ベクターに連結し、ｐＫＣ１１３９−ＣｌｕｓＤｅｌを作製した。
ｄ）ａｌｌサブクラスターのａｌｌＤ−ａｌｌＳ領域の欠失のためのベクターの、Ｓ．ツクバエンシスＮＲＲＬ１８４８８株への導入：プラスミド構築物ｐＫＣ１１３９−ＣｌｕｓＤｅｌをＳ．ツクバエンシスＮＲＲＬ１８４８８株に実施例４ｄの記載と同じ接合手順によって導入した。
ｅ）ａｌｌＤ−ａｌｌＳ領域を欠失しているＳ．ツクバエンシスの安定２次組換え株の選択：２次組換え体の選択は、実施例６ｄの記載と同じ手順を使用して実施した。
ｆ）ｐＫＣ１１３９−ＣｌｕｓＤｅｌを使用する２次相同組換えによって得たａｌｌＤ−ａｌｌＳ領域を欠失している変異体の発酵でのタクロリムス生成：ａｌｌＤ−ａｌｌＳ欠失変異体のタクロリムス生成のための発酵プロセスを、抗生物質を増殖培地に添加せずに実施例４ｇに記載のとおり実施した。
ｇ）ｐＫＣ１１３９−ＣｌｕｓＤｅｌを使用する２次組換えによって得たａｌｌＤ−ａｌｌＳ欠失変異体のＨＰＬＣでのタクロリムシスおよびアスコマイシン生成の判定：ａｌｌＤ−ａｌｌＳ欠失変異体のタクロリムスおよびアスコマイシン生成の判定のために、実施例４ｈにおける記載と同じ方法を使用した。

破壊されたａｌｌＤ−ａｌｌＳ領域を有する単離された２次組換え変異体は、タクロリムスおよびアスコマイシン生成の完全な消失を生じた。

Claims (6)

1. 微生物の遺伝子改変株の培養ステップを含み、前記微生物がストレプトマイセス・ツクバエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）の遺伝子改変株から選択され、前記微生物の遺伝物質がエチルマロニルＣｏＡの生合成に関与する少なくとも１つの不活性化された遺伝子および／またはエチルマロニルＣｏＡの代謝に関与する少なくとも１つの過剰発現された遺伝子を含む、タクロリムスの調製のための方法であって、前記微生物の遺伝物質が配列番号１１に記載のクロトニルＣｏＡ還元酵素（ｃｃｒ）遺伝子の不活化された遺伝子および／または配列番号１２に記載のエチルマロニルＣｏＡムターゼ（ｅｃｍ）遺伝子の過剰発現された遺伝子を含み、アリルマロニルＣｏＡおよび／またはアリルマロニルＣｏＡの少なくとも１つの前駆体の外部添加の下で実施される、方法。
2. ストレプトマイセス属に属する微生物の遺伝子改変株であって、微生物の遺伝物質がエチルマロニルＣｏＡの生合成に関与する少なくとも１つの不活性化された遺伝子および／またはエチルマロニルＣｏＡの代謝に関与する少なくとも１つの過剰発現された遺伝子を含み、前記遺伝子が、配列番号２に記載のＡｌｌＡ遺伝子、配列番号３に記載のＡｌｌＫ遺伝子、配列番号４に記載のＡｌｌＲ遺伝子、配列番号５に記載のＡｌｌＤ遺伝子、配列番号６に記載のＡｌｌＭ遺伝子、配列番号７に記載のＡｌｌＮ遺伝子、配列番号８に記載のＡｌｌＰ遺伝子、配列番号９に記載のＡｌｌＯ遺伝子および配列番号１０に記載のＡｌｌＳ遺伝子からなる群より選択される、前記微生物の遺伝子改変株。
3. 天然のまたは遺伝子操作されたポリケチド合成活性を有する、請求項２に記載の微生物の遺伝子改変株。
4. タクロリムス製造のための、請求項２または３に記載の微生物の遺伝子改変株の使用。
5. 配列番号２に記載のＡｌｌＡ遺伝子、配列番号３に記載のＡｌｌＫ遺伝子、配列番号４に記載のＡｌｌＲ遺伝子、配列番号５に記載のＡｌｌＤ遺伝子、配列番号６に記載のＡｌｌＭ遺伝子、配列番号７に記載のＡｌｌＮ遺伝子、配列番号８に記載のＡｌｌＰ遺伝子、配列番号９に記載のＡｌｌＯ遺伝子および配列番号１０に記載のＡｌｌＳ遺伝子から構成される配列番号１に記載の配列を含む、ストレプトマイセス属に属する微生物のエチルマロニルＣｏＡの代謝および／または生合成に関与する遺伝子をコードするヌクレオチド。
6. 配列番号１と少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する、請求項５に記載のヌクレオチド。

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