JP2019504650A - プロセス - Google Patents
プロセス Download PDFInfo
- Publication number
- JP2019504650A JP2019504650A JP2018561309A JP2018561309A JP2019504650A JP 2019504650 A JP2019504650 A JP 2019504650A JP 2018561309 A JP2018561309 A JP 2018561309A JP 2018561309 A JP2018561309 A JP 2018561309A JP 2019504650 A JP2019504650 A JP 2019504650A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- host cell
- nucleic acid
- neosaxitoxin
- sxt
- acid molecule
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
- C12P17/12—Nitrogen as only ring hetero atom containing a six-membered hetero ring
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
- C12P17/182—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
- A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
- A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
- A61K31/52—Purines, e.g. adenine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1288—Transferases for other substituted phosphate groups (2.7.8)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/32—Amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/42—Organic phosphate, e.g. beta glycerophosphate
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
- C12Y207/08—Transferases for other substituted phosphate groups (2.7.8)
- C12Y207/08007—Holo-[acyl-carrier-protein] synthase (2.7.8.7)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Description
(A)反応媒体中で基質:
(i)S−アデノシルメチオニン、
(ii)アルギニン、
(iii)アセチル−CoA、マロニル−CoAまたはプロピオニル−CoA、および
(iv)カルバモイルリン酸
をSxtA、B、D、G、H、I、S、T、U、V、WおよびXのポリペプチドと接触させるステップと、
任意選択で(B)反応媒体からネオサキシトキシンまたはその類似体を単離および/または精製するステップと、
を含むプロセスを提供する。
(A)SxtポリペプチドA、B、D、G、H、I、S、T、U、V、WおよびXをコードする核酸分子を含む宿主細胞を、基質:
(i)S−アデノシルメチオニン、
(ii)アルギニン、
(iii)アセチル−CoA、マロニル−CoAまたはプロピオニル−CoA、および
(iv)カルバモイルリン酸
の存在下で培養培地において、好ましくはネオサキシトキシンまたはその類似体の生産に適している条件下で、培養するステップ
を含むプロセスも提供する。好ましくは、宿主細胞は、PPTaseをコードする核酸分子をさらに含む。
を有する化合物またはその立体異性体を指す。
Sxt ACT C−13アシルトランスフェラーゼ(LWTX)
Sxt DIOX ジオキシゲナーゼ(C−11)
Sxt N1 N−スルホトランスフェラーゼ
Sxt N2 N−スルホトランスフェラーゼ
Sxt SUL O−スルホトランスフェラーゼ(C−11)
Sxt H1 不活性ジオキシゲナーゼ
Sxt M1 MATEエクスポーター
Sxt M2 MATEエクスポーター
Sxt M3 MATEエクスポーター
Sxt PER 薬剤エクスポーター
Sxt PER2 不活性薬剤エクスポーター
からなる群より独立的に選択される1種以上のSxtポリペプチド(またはそのようなポリペプチドをコードする核酸分子)を用いても用いなくてもよい。
(i)S−アデノシルメチオニン、
(ii)アルギニン、
(iii)アセチル−CoA、マロニル−CoAまたはプロピオニル−CoA、および
(iv)カルバモイルリン酸
である。
(A)式II:
(B)反応媒体から式Iの化合物を単離または精製するステップ、
を含むプロセスを提供する。
(A)式II:
を含むプロセスも提供する。
(A)式II:
(B)反応媒体から式Iの化合物を単離または精製するステップ、
を含むプロセスを提供する。
(A)式II:
を含むプロセスも提供する。
(A)式II:
(B)反応媒体から式Iの化合物を単離または精製するステップ、
を含むプロセスを提供する。
(A)式II:
を含むプロセスも提供する。
(式中、RはOHである)の化合物(中間体5’)を生産するためのプロセスであって、
(A)式II:
(式中、RはOHである)の化合物(中間体4’)をSxtDと、および任意選択でNADHと、および任意選択でNADPHと、接触させるステップ、および
(B)反応媒体から式Iの化合物を単離または精製するステップ、
を含むプロセスを提供する。
(式中、RはOHである)の化合物(中間体5’)を生産するためのプロセスであって、
(A)式II:
を含むプロセスも提供する。
(式中、RはOHである)の化合物(中間体6)を生産するためのプロセスであって、
(A)式II:
(式中、RはOHである)の化合物(中間体5)をSxtSと、および任意選択でα−ケトグルタレートと、および任意選択で分子状酸素と、接触させるステップ、および
(B)反応媒体から式Iの化合物を単離または精製するステップ、
を含むプロセスを提供する。
(式中、RはOHである)の化合物(中間体6)を生産するためのプロセスであって、
(A)式II:
(式中、RはOHである)の化合物(中間体5)の存在下で培養培地において、SxtSをコードする核酸分子を含む宿主細胞を、SxtSが生産されるような条件であってSxtSが式IIの化合物を式Iの化合物に変換するような条件の下で培養するステップ、
を含むプロセスも提供する。
(式中、RはOHである)の化合物(中間体6’)を生産するためのプロセスであって、
(A)式II:
(式中、RはOHである)の化合物(中間体5’)をSxtSと、および任意選択でα−ケトグルタレートと、および任意選択で分子状酸素と、接触させるステップ、および
(B)反応媒体から式Iの化合物を単離または精製するステップ、
を含むプロセスを提供する。
(式中、RはOHである)の化合物(中間体6’)を生産するためのプロセスであって、
(A)式II:
(式中、RはOHである)の化合物(中間体5’)の存在下で培養培地において、SxtSをコードする核酸分子を含む宿主細胞を、SxtSが生産されるような条件であってSxtSが式IIの化合物を式Iの化合物に変換するような条件の下で培養するステップ、
を含むプロセスも提供する。
(式中、RはOHである)の化合物(中間体7)を生産するためのプロセスであって、
(A)式II:
(B)反応媒体から式Iの化合物を単離または精製するステップ、
を含むプロセスを提供する。
(A)式II:
(式中、RはOHである)の化合物(中間体6)の存在下で培養培地において、SxtSをコードする核酸分子を含む宿主細胞を、SxtSが生産されるような条件であってSxtSが式IIの化合物を式Iの化合物に変換するような条件の下で培養するステップ、
を含むプロセスも提供する。
(式中、RはOHである)の化合物(中間体7’)を生産するためのプロセスであって、
(A)式II:
(式中、RはOHである)の化合物(中間体6’)をSxtSと、および任意選択でα−ケトグルタレートと、および任意選択で分子状酸素と、接触させるステップ、および
(B)反応媒体から式Iの化合物を単離または精製するステップ、
を含むプロセスを提供する。
(式中、RはOHである)の化合物(中間体7’)を生産するためのプロセスであって、
(A)式II:
(式中、RはOHである)の化合物(中間体6’)の存在下で培養培地において、SxtSをコードする核酸分子を含む宿主細胞を、SxtSが生産されるような条件であってSxtSが式IIの化合物を式Iの化合物に変換するような条件の下で培養するステップ、
を含むプロセスも提供する。
(使用される略語は、LTX:Lyngbya wolleiトキシン;GC:Gymnodinium catenatumトキシン、である)
pET28bにおけるsxtAとsfpのサブクローニング
Cylindrospermopsis raciborskii T3由来のsxtAおよびBacillus subtilis由来のsfpのPCR増幅を、Velocityポリメラーゼ(Bioline)を使用してゲノムDNAから行った。製造業者のプロトコルに従ったが、アニーリング温度は55℃であり、伸長時間はsxtAとsfpについてそれぞれ4分と1分であった(sxtAプライマー:フォワード5’−GGGCTTTCATATGTTACAAAAGATTAA−3’(配列番号81)およびリバース5’−AAAGTATGCGGCCGCATGCTTGAGTAT−3’(配列番号82);sfpプライマー:フォワード5’−GGCATCCATGGGCAAGATTTACGGAA−3’(配列番号83)およびリバース5’−GGCATCTCGAGTTATAAAAGCGCTTCG−3’(配列番号84))。PCRの増幅産物を精製し(DNA clean and concentrator 5X kit, ZymoResearch)、NdeI/NotI(sxtA)またはNcoI/XhoI(sfp;New England Biolabs)で消化した。消化産物を精製し、同じ酵素で切断してアガロースゲル電気泳動により精製(DNA recovery kit, ZymoResearch)したpET−28bに連結した。エレクトロコンピテントEscherichia coli GB2005細胞での形質転換の後、ユニバーサルプライマーT7プロモーターおよびT7ターミネーターを用いた精製済みプラスミド(PureLink Miniprep、Invitrogen)のPCRによって陽性クローンをスクリーニングした。確認のためにインサートを配列決定した(UNSWのRamaciotti Center、オーストラリア)。
sxtAの発現のために、pET28b::sxtA,sfpおよびpRARE(Invitrogen)のプラスミドを含有するE.coli BL21(DE3)形質転換体を一晩培養したもの0.5mLを、50μg・mL−1のカナマイシンおよび30μg・mL−1のクロラムフェニコールを追加した50mLの溶原ブロス(LB)培地で継代培養し、600nmで0.8〜1.0の光学密度になるまで攪拌(200rpm)しながら30℃でインキュベートした。次いで、培養液を、200μMのイソプロピルβ−D−チオガラクトシド(IPTG)で誘導し、撹拌しながら18℃で一晩インキュベートし、遠心分離(4000rpm、4℃で20分間、Hitachi CR22GIII遠心機、R10A5ローター)によってペレット化した。細胞ペレットは、さらなる精製まで凍結した。
sxtAのアシルキャリアータンパク質(sxtA−ACP)をコードする遺伝子を、Velocityポリメラーゼ(Bioline)(プライマー:フォワード5’−ATATCCATGGGACCTGGTGATCGCAAAGGA−3’(配列番号87)およびリバース5’−TATCTCGAGAGTGTTGATTTCGTTGGCTG−3’(配列番号88))を用いて増幅した。製造業者のプロトコルに従ったが、アニーリング温度は54℃であり、伸長時間は1.5分であった。sfpについて説明したのと同じ方法を用いて、PCRの増幅産物を精製し、消化し、pET−28bに連結した。エレクトロコンピテントEscherichia coli GB2005細胞での形質転換の後、ユニバーサルプライマーT7プロモーターおよびT7ターミネーターで陽性クローンをスクリーニングし、先に説明したように配列決定した。sfpとの共発現のために、先に説明したように遺伝子をpET28b::sxtA−ACPプラスミドにクローニングした。
sxtA−ACPの発現のために、pET28b::sxtA−ACPおよびpET28b::sxtA−ACP,sfpのプラスミドを含有するE.coli BL21(DE3)形質転換体を一晩培養したもの10mLを、50μg・mL−1のカナマイシンおよび30μg・mL−1のクロラムフェニコールを追加した1Lの溶原ブロス(LB)で増殖させ、上述されるような100μMのIPTGでの誘導まで攪拌(200rpm)しながら37℃でインキュベートした。細胞を、遠心分離(4000rpm、4℃で20分間、Hitachi CR22GIII遠心機、R10A5)によって回収し、15mLの溶解バッファに再懸濁し、超音波処理(Branson Digital Sonifier M450、3mmプローブ、30%の振幅、1秒の電源オンの後に4秒の電源オフというサイクルで4℃にて3分)によって破壊した。得られた懸濁液を遠心分離(20000g、4℃で60分間、Hitachi CR22GIII遠心機、R20A2ローター)し、上清を、20mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)、500mMのNaCl、20mMのイミダゾール(バッファA)で先に平衡化したNi−アフィニティーカラム(AKTApurifierに装着した1mL HiTrapカラム、GE Healthcare)にロードした。注入後、カラムを洗浄し(35mLのバッファA、1mL・min−1)、20mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)、500mMのNaCl、500mMのイミダゾール(バッファB)と、20分で0%から20%のBへの直線勾配、次いで20%で10分、次いで20分で20%から100%への直線勾配、および20分間の100%での最終洗浄と、を用いてタンパク質を溶出させた。回収した画分(1mL、280nmで検出)を、変性条件下での15%ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)によって分析し、純粋なタンパク質を含有する画分をまとめてプールした。タンパク質溶液を、50mM HEPES−150mM NaCl pH7.4を用いた遠心濾過(centrifucation filtration)(Amicon Ultra−15遠心フィルターユニット3k)を用いて脱塩および濃縮し、液体窒素中で凍結させ、−80℃で保存した。タンパク質アッセイキット(Bio−Rad)を用いてタンパク質濃度を決定した。
タンパク質の質量をMALDI−TOF−TOF質量分析によって検出した。マトリックスの調製のために、10mgの3,5−ジメトキシ−4−ヒドロキシル桂皮酸を、0.1%のTFAを含む80%のアセトニトリル1mLに添加し、1mLのマトリックスをMALDIターゲットプレートの表面上で1μlのタンパク質サンプルと混合した後、YAGレーザーを備えたBruker ultrafleXtreme MALDI−TOF/TOFによって分析した。データの取得は陽イオンモードで実施し、装置を各分析の直前に較正した。100の平均スペクトルを取得する線形ディレイド・エクストラクションモード(linear delayed extraction mode)で分析を実施した。結果を図6に示す。
pRAREおよびpET28b::sxtA,sfpを含むBL21(DE3)形質転換体を、0.1%の酢酸(acid acetic)で酸性化したメタノールに再懸濁した。超音波処理(Branson Digital Sonifier M450、3mmプローブ、30%の振幅、5秒の電源オンおよび15秒の電源オフというサイクルで4℃にて2分)によって細胞を破壊した。得られた懸濁液を遠心分離(20,000rpm、4℃で30分間、Hitachi CR22GIII遠心機、R20A2ローター)した。上清を回転蒸発で乾燥させ、さらなる分析まで−20℃で保存した。
SxtAの生合成産物を決定するために、pET28b::sxtA,sfpおよびpRAREを含むE.coli細胞の細胞内代謝物を化学的に抽出し、LC−MSによって分析した。
C.raciborskii T3に由来する以下の3つのオープンリーディングフレーム(ORF)を、「sxt1」と名付けたヌクレオチドフラグメント中に配置した:sxtA、sxtBおよびsxtC。各ORFは、GeneArtソフトウェアを用いてLife TechnologyによってE.coliでの発現のためにコドン最適化された。
以下のsxt遺伝子を「sxt2」フラグメントに含めた:sxtD、sxtE、sxtG、sxtH、sxtI、sxtJ、sxtK、sxtL。各ORFは、GeneArtソフトウェアを用いてLife TechnologyによってE.coliでの発現のためにコドン最適化された。
sxt3フラグメントの3つのバリアントを設計した。以下のsxt遺伝子を「sxt3」フラグメント・バリアント1に含めた:sxtQ、sxtR、orf24、sxtS、sxtT、sxtU、sxtV、sxtW、sxtX。以下のsxt遺伝子を「sxt3」フラグメント・バリアント2に含めた:sxtQ、sxtR、sxtS、sxtT、sxtU、sxtV、sxtW、sxtX。以下のsxt遺伝子を「sxt3」フラグメント・バリアント3に含めた:sxtS、sxtT、sxtU、sxtV、sxtW、sxtX。各ORFは、GeneArtソフトウェアを用いてLife TechnologyによってE.coliでの発現のためにコドン最適化された。
以下のsxt遺伝子を「sxt4」フラグメントに含めた:sxtF、sxtP、sxtM。各ORFは、GeneArtソフトウェアを用いてLife TechnologyによってE.coliでの発現のためにコドン最適化された。
ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ(PPTase)を用いてポリケチドシンターゼSxtAのアポ−形態をそのホロ−形態に変換することが望ましい。
Life TechnologyによってpMA−RQ(ampR)プラスミドバックボーンの中にsxt1フラグメントが作製された。このプラスミドは、本明細書ではpSxt1と呼称される。そのゲノム中にCylindrospermopsis raciborskii T3由来のホスホパンテテイニルトランスフェラーゼを保持するE.coli BL21(DE3) PPTaseにpSxt1プラスミドを形質転換した。PPTase遺伝子は、T7プロモーターの制御下にあり(IPTG誘導性)、pSxt1上のsxtA遺伝子、sxtB遺伝子およびsxtC遺伝子は、Pmプロモーターの制御下にある(m−トルイル酸誘導性)。
細胞ペレットを1mlの水に再懸濁し、氷上で超音波処理した(出力コントロール4、デューティサイクル50%、2〜3分のサイクルで合計7分)。超音波処理の後、4mlのアセトニトリルを添加し、サンプルをボルテックスし、遠心分離して細胞片および他の微粒子を除去した。
LC−MS分析は、Haukeland University HospitalのHormonelaboratoryにて、50×2.1mm Acquity BEHアミドカラムを取り付けたiclass Acquity UPLCに連結したWaters Xevo TQ−Sで行った。移動相Aは、10mMのギ酸アンモニウム(pH3.0)からなり、移動相Bは、10mMのギ酸アンモニウム(pH3.0)を含む95%のアセトニトリルからなるものであった。流速は0.4ml/分であり、カラム温度は40℃に保持された。85%のBから70%のBへと3分間にわたる勾配を適用した。注入量は常に1μlであった。
以下のようにsxt1コンストラクトをE.coli DE3(BL21) PPTaseのlacオペロンに組み込んだ。
親株として株E.coli BL21(DE3) sfp NSX3v3を用いて、相同組換え法により個々の遺伝子または遺伝子のセットが除去された以下の株を作製した。
LC−MSを使用してネオサキシトキシンとネオサキシトキシンの生産における中間体とを検出した。LC−MS分析は、ESI IIイオン源を装着し、オンラインでDionex 3000 Ultimate RSLC超高圧液体クロマトグラフィー装置に連結した、ThermoFisher Scientific Q Exative Hybrid Quadrupole質量分析計で実施した。
100mlのフラスコ中で20mlのLBブロスにおいてE.coli BL21(DE3) T3PPtase NSX3v1を19℃にて振盪(200rpm)しながら増殖させた。培養液が0.9というOD600に達したら、0.2mMのIPTG、1mMのトルイル酸で培養液を誘導し、OD600=5になるまで18時間増殖させた。
50mlのHi YE培地においてE.coli sfp NSX3v3の種培養液を調製し、30℃で一晩インキュベートした(225rpm)。ヒータースリーブ(heater sleave)、水冷、pHと溶存酸素のプローブを備えたNew Brunswick BioFlo 110発酵槽(2L容積)を製造業者の指示に従って発酵実験のためにセットアップした。発酵槽に2LのHi−YE培地のベースを充填し、オートクレーブした。酵母エキス、塩化マグネシウム、グルコースおよびグリセロールのストック溶液をオートクレーブ処理後に発酵槽に無菌的に添加した。さらに、5%のantifoam204(Sigma Aldrich)の無菌溶液2mlを発酵槽に添加した。5.71というOD600を有する一晩培養した種培養液20mlを培地に植菌した。開始培養液のOD600は、0.15と測定された。培養液を19℃でインキュベートしたが、初期の撹拌は50rpmであり、26時間のインキュベーションの後に600rpmまで増加させた。培養液を2l/時間の流速にて加圧空気でパージした。pHと溶存酸素のレベルを連続的にモニタリングし、サンプルを採取した後に増殖をオフラインで測定した。pH(pH7.1)ならびに溶存酸素レベル(100%)は、実験全体の間、安定していた。22時間のインキュベーションの後に(OD600=10.6)、0.5mMのm−トルイル酸および0.2mMのIPTGで培養液を誘導し、さらに22時間インキュベートした。無菌グルコース溶液(400g/l)を実験の24〜26.3時間の間に2.9ml/分の流速で培養液に供給し(合計11.4g)、増殖およびneoSTXの生産を刺激するために実験の26.3時間の時点で1.8mlの無菌1M硫酸マグネシウム溶液を添加した。45時間後に実験を終了し、その時点で遠心分離(5000×5、4℃で30分)によって培養液を回収した。細胞ペレットを50mlの氷冷MQ水で2回洗浄し(5.000×g、10分、4℃)、秤量し、分析まで−20℃で保存した。得られた全バイオマスは23.77gであった。
天然の遺伝子sxtA、sxtB、sxtCをpVBベクター(Vectrons Biosolutions)にクローニングし、得られたベクターpVB−sxtABCをE.coli BAP1に形質転換した。BAP1 pVB−sxtABCを10mlのTB培地において200rpmで振盪しながら19℃にて24時間増殖させた。遠心分離によって細胞を回収し、氷冷MQ水で2回洗浄し、ペレットを秤量し、分析まで−20℃で保存した。
1. 25mMの水酸化ナトリウムを含む50%メタノール
2. 0.5%の水酸化アンモニウムを含む50%メタノール
3. 0.1%のギ酸を含む50%メタノール
4. 0.1mMの塩酸
5. 0.1%のギ酸
6. 0.5%の水酸化アンモニウム
10mlのLBブロスでE.coli株の種培養液を調製し、200rpmで振盪しながら30℃にて一晩増殖させた。neoSTXの生産レベルについて、以下の株を比較した:
E.coli BL21(DE3) sfp
E.coli BL21(DE3) T3PPTase sxt1 sxt2
E.coli BL21(DE3) T3PPTase NSX3v1
E.coli BL21(DE3) sfp NSX3v1
E.coli BL21(DE3) sfp NSX3v2
E.coli BL21(DE3) sfp NSX3v3
E.coli BL21(DE3) sfp NSX3v4
E.coli BL21(DE3) sfp NSX3v5
E.coli BL21(DE3) sfp NSX3v6
E.coli BL21(DE3) sfp NSX3v7
細菌細胞ペレットを0.1%のギ酸に1:4(wwt:vol)の比率で再懸濁し、5分間煮沸した。抽出物を氷上で短時間冷却し、16.000×gで10分間遠心分離し、上清を回収した。LC−MS分析のために、上清を、25nMのサキシトキシン−15N4内部標準を含む、90%アセトニトリル:10%メタノール:0.1%ギ酸により1:5の比率で希釈した。サンプルを遠心分離し(16.000×g、10分間、4℃)、その上清をLC−MS分析のためにオートサンプラーバイアルに移した。
増殖培地(200μl)を、10%のギ酸2μlで酸性化し、5分間煮沸し、氷上で冷却し、4℃にて10分間、16000×gで遠心分離した。上清を新しいチューブに移し、40μlの内部標準を添加した(10%メタノールと90%アセトニトリルと0.1%ギ酸において25nMのサキシトキシン−15N4)。チューブを16000×g、4℃で10分間遠心分離し、上清をLC−MS分析のためにHPLCオートサンプラーバイアルに移した。結果を図15に示す。
MNBAのためのE.coli培養
E.coli株BL21(DE3) sfpおよびBL21(DE3) sfp NSX3v3の種培養液を10mlのLBブロスで調製し、200rpmで振盪しながら30℃で一晩増殖させた。0.4%のグリセロールを含み、89mMのリン酸緩衝液でpH6.8に緩衝化された、Terrificブロス(TB)50mlに、0.05という適切なOD600となるように、一晩培養した種培養液500μlを植菌した。培養液を、0.4というOD600に達するまで、225rpmで振盪しながら30℃にてインキュベートした。次いで、培養液を19℃(振盪225rpmを伴う)に移し、0.5というOD600まで増殖させた。sfp遺伝子とsxt遺伝子の誘導のために、0.05mMのIPTG(最終濃度0.05mM)およびトルイル酸(最終濃度0.5mM)を培養液に添加し、これを振盪(225rpm)しながら19℃でさらに48時間インキュベートした。各株を3連の継代培養で増殖させた。4℃にて10分間の2500×gでの遠心分離によって培養液を回収した。細胞ペレットを、それぞれ25の氷冷MQ水で2回洗浄した(2500×g、10分間、4℃)。細胞ペレットを秤量し、−20℃で保存した。
MNBAのために、以下のプロトコルに従ってAccell Plus CMカートリッジ(360mg, 1.1ml, WAT010910, Waters)を使用して細菌細胞を弱陽イオン交換固相抽出(WCX−SPE)により抽出した。
マウスneuro−2a細胞株(CCL131)を使用したマウス神経芽腫アッセイを用いた(Humpage et al.(2007). Environ.Toxicol.Chem. 26:1512−9に記載される通り)。
サキシトキシンELISAキット(Abraxis PN 52255B, Microtiter Plate 96T)を使用して、E.coliで生産されたneoSTXを検出した。このキットは、neoSTXに対して1.3%の交差反応性を有するポリクローナルサキシトキシン抗体を利用する。E.coli T3PPTase NSX3v3の培養液を調製し、細胞溶解物を得た。SampliQシリカカラム(Agilent PN 5982−2211, 1ml, 100mg)上での固相抽出によってサンプルを抽出した(Jansson D and Astot C(2015)m J Chromatogr A 1417:41−8)。抽出し蒸発させたサンプルを、STX ELISAキットによって提供されるサンプルバッファ100μlに溶解させた。サンプルバッファ中のE.coli T3PPTase NSX3v3抽出物の1:1000希釈物も調製した。アッセイは、キットによって提供される、ブランクとしてのStd0、Std1(0.0668nMのSTX)およびSTd5(1.3365nMのSTX)を使用した2点の標準曲線によって較正された。参照サンプルを使用してneoSTXについてのSTX ELISAキットの精度を推定したが、SPEの間のneoSTXの回収率は、抽出された参照サンプル対参照サンプルの比に基づいて推定した。アッセイの結果を以下の表に示す。推定された精度は119%であったが、SPEの間の回収率は92%であった。このアッセイは、E.coli T3PPTase NSX3v3の細胞抽出物において1.16nMのSTXに相当する量を検出した。neoSTXに変換すると、これは、89.1nMとなり、E.coliの培養液1リットル当たり約223pmolのneoSTXという収量である。
以下のエレメントを用いて、いくつかのpVBコンストラクトを作製した:
(i)Pmプロモーター;
(ii)sxtA合成(E.coli用にコドン最適化)またはsxt天然遺伝子;および
(iii)リボソーム結合部位(RBS)と開始コドンの間の8または10bpのスペーサー。
この実験では、以下のPPTaseを比較した:
1. T3PPT:E.coli BL21(DE3) T3PPTase NSX3v1
2. T3PPT:E.coli BL21(DE3) T3PPTase NSX3v1 pET28B−NsPPT(Nodularia spumigena由来のホスホパンテテイニルトランスフェラーゼを含むpETベクター)
3. Ala18T3PPT:E.coli BL21(DE3) T3PPTase NSX3v1 pET30b−Ala18T3PPTase(発現されるタンパク質の溶解性を増加させるために最初の18アミノ酸が除去されたT3PPTase)。
サキシトキシンは、SxtNによって(すなわち、カルバモイル側鎖のスルホン化によって)GTX−5に変換され得る。同様に、サキシトキシンは、SxtDIOXによって11−ヒドロキシSTXに変換され得る。これは、STXをGTX−2/3に(またはネオサキシトキシンをGTX−4/1に)変換するC−11スルホン化に先行するステップである。
添付の配列表は、説明の一部として本明細書に完全に組み込まれる。
配列番号91
E.coliのラクトースオペロンへの組み込み後のsxt1フラグメントの配列。
配列番号92
E.coliのキシロースオペロンに組み込まれたsxt3フラグメント・バージョン1の配列。
配列番号93
E.coliのキシロースオペロンに組み込まれたsxt3フラグメント・バージョン2の配列。
配列番号94
E.coliのキシロースオペロンに組み込まれたsxt3フラグメント・バージョン3の配列。
配列番号95
E.coliのラクトースオペロンに組み込まれたsxt1フラグメントの配列。
配列番号96
E.coliのメロビオースオペロンに組み込まれたsxt4フラグメントの配列。
配列番号97
E.coliのマルトースオペロンに組み込まれたsxt2フラグメントの配列。
配列番号98
sxtLの除去後にマルトースオペロンに組み込まれたsxt2フラグメントの配列。
配列番号99
マルトースオペロンに組み込まれたsxt2フラグメントの配列。
Claims (23)
- 宿主細胞においてネオサキシトキシンを生産するためのプロセスであって、
(A)PPTaseをコードしSxtポリペプチドA、B、D、G、H、I、S、T、U、V、WおよびXをコードする核酸分子を含む宿主細胞をネオサキシトキシンの生産に適している条件下において基質:
(i)S−アデノシルメチオニン、
(ii)アルギニン、
(iii)アセチル−CoA、マロニル−CoAまたはプロピオニル−CoA、および
(iv)カルバモイルリン酸
の存在下で培養培地において培養するステップであって、前記宿主細胞は、SxtポリペプチドC、F、J、K、L、M、P、Q、RおよびORF24をコードする核酸分子を含まない、ステップと、
任意選択で(B)ネオサキシトキシンを前記宿主細胞から、または前記培養培地から、単離および/または精製するステップと、
を含む、プロセス。 - ネオサキシトキシンまたはその類似体もしくは変種を生産するためのプロセスであって、
(A)反応媒体中で基質:
(i)S−アデノシルメチオニン、
(ii)アルギニン、
(iii)アセチル−CoA、マロニル−CoAまたはプロピオニル−CoA、および
(iv)カルバモイルリン酸
をSxtA、B、D、G、H、I、S、T、U、V、WおよびXのポリペプチドと接触させるステップと、
任意選択で(B)ネオサキシトキシンまたはその類似体もしくは変種を前記反応媒体から単離および/または精製するステップと、
を含む、プロセス。 - 前記反応媒体が、PPTaseをさらに含む、請求項2に記載のプロセス。
- 宿主細胞においてネオサキシトキシンまたはその類似体もしくは変種を生産するためのプロセスであって、
(A)SxtポリペプチドA、B、D、G、H、I、S、T、U、V、WおよびXをコードする核酸分子を含む宿主細胞をネオサキシトキシンまたはその類似体もしくは変種の生産に適している条件下において基質:
(i)S−アデノシルメチオニン、
(ii)アルギニン、
(iii)アセチル−CoA、マロニル−CoAまたはプロピオニル−CoA、および
(iv)カルバモイルリン酸
の存在下で培養培地において培養するステップと、
任意選択で(B)ネオサキシトキシンまたはその類似体もしくは変種を前記宿主細胞から、または前記培養培地から、単離および/または精製するステップと、
を含む、プロセス。 - 前記宿主細胞が、PPTaseをコードする核酸分子をさらに含む、請求項4に記載のプロセス。
- 前記基質が、SxtポリペプチドC、JおよびKのうちの1つ以上または全てと接触させられない、および/または
前記宿主細胞が、SxtポリペプチドC、JおよびKのうちの1つ以上または全てをコードする核酸分子を含まない、
請求項2〜5のいずれか1項に記載のプロセス。 - 前記基質が、SxtポリペプチドQ、RおよびORF24のうちの1つ以上または全てと接触させられない、および/または
前記宿主細胞が、SxtポリペプチドQ、RおよびORF24のうちの1つ以上または全てをコードする核酸分子を含まない、
請求項2〜6のいずれか1項に記載のプロセス。 - 前記基質が、(a)〜(c):
(a)C、Q、RおよびORF24;
(b)L、Q、RおよびORF24;または
(c)J、K、L、Q、RおよびORF24;
のうちの1つ以上のSxtポリペプチドのいずれとも接触させられない、および/または
前記宿主細胞が、(a)〜(c)のうちの1つ以上の前記Sxtポリペプチドのいずれかをコードする核酸分子を含まない、
請求項2〜7のいずれか1項に記載のプロセス。 - 前記基質が、SxtポリペプチドF、MおよびPのうちの1つ以上または全てと接触させられない、および/または
前記宿主細胞が、SxtポリペプチドF、MおよびPのうちの1つ以上または全てをコードする核酸分子を含まない、
請求項2〜8のいずれか1項に記載のプロセス。 - 前記基質が、SxtC、E、J、K、LおよびRからなる群より選択される1種以上のSxtポリペプチド(好ましくはCおよび/またはE)とさらに接触させられる、および/または
前記宿主細胞が、SxtポリペプチドC、E、J、K、LおよびRのうちの1つ以上(好ましくはCおよび/またはE)をコードする核酸分子をさらに含む、
先行する請求項のいずれか1項に記載のプロセス。 - 前記基質が、SxtF、M、N、O、P、Y、Z、ORF3、ORF4、ORF29、ORF34、OMPRまたはHISAからなる群より選択されるSxtポリペプチドのうちの1つ以上または全てと接触させられない、および/または
前記宿主細胞が、SxtポリペプチドF、M、N、O、P、Y、Z、ORF3、ORF4、ORF29、ORF34、OMPRまたはHISAのうちの1つ以上または全てをコードする核酸分子を含まない、
先行する請求項のいずれか1項に記載のプロセス。 - 前記基質が、SxtNおよび/またはSxtDIOXとさらに接触させられる、および/または
前記宿主細胞が、SxtNおよび/またはSxtDIOXをコードする核酸分子をさらに含む、
先行する請求項のいずれか1項に記載のプロセス。 - 前記宿主細胞が、原核宿主細胞であり、好ましくは細菌細胞であり、最も好ましくはE.coli細胞である、請求項1または4〜12のいずれか1項に記載のプロセス。
- 前記宿主細胞が、従属栄養生物である、請求項1または4〜13のいずれか1項に記載のプロセス。
- 前記宿主細胞が、組換え宿主細胞である、請求項1または4〜14のいずれか1項に記載のプロセス。
- 前記ネオサキシトキシンまたはその類似体もしくは変種、あるいはその医薬的に許容される塩が、医薬組成物に製剤化される、先行する請求項のいずれか1項に記載のプロセス。
- 製剤化するステップが、単離または精製されたネオサキシトキシンまたはその類似体もしくは変種を1種以上の医薬的に許容される担体、補助剤および/または賦形剤と混合することを含む、請求項16に記載のプロセス。
- 先行する請求項のいずれか1項に記載のプロセスによって生産された、ネオサキシトキシンまたはその類似体もしくは変種。
- SxtポリペプチドA、B、D、G、H、I、S、T、U、V、WおよびXをコードする核酸分子を含む宿主細胞であって、
(i)SxtポリペプチドC、JまたはKのうちの1つ以上または全て;
(ii)SxtポリペプチドQ、RおよびORF24のうちの1つ以上または全て;
(iii)SxtポリペプチドC、Q、RおよびORF24のうちの1つ以上または全て;
(iv)SxtポリペプチドL、Q、RおよびORF24のうちの1つ以上または全て;
(v)SxtポリペプチドJ、K、L、Q、RおよびORF24のうちの1つ以上または全て;あるいは
(vi)SxtポリペプチドF、MおよびPのうちの1つ以上または全て;
をコードする核酸分子を含まない、宿主細胞。 - SxtC、E、J、K、Lおよび/またはRからなる群より選択される1種以上のSxtポリペプチド(好ましくはCおよび/またはE)をコードする核酸分子をさらに含む、請求項19に記載の宿主細胞。
- SxtNおよび/またはSxtDIOXをコードする核酸分子をさらに含む、請求項19または請求項20に記載の宿主細胞。
- F、M、N、O、P、Y、Z、ORF3、ORF4、ORF29、ORF34、OMPRまたはHISAからなる群より選択されるSxtポリペプチドのうちの1つ以上または全てをコードする核酸分子を含まない、請求項19〜20のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 原核宿主細胞であり、好ましくは細菌細胞であり、最も好ましくはE.coli細胞である、請求項19〜22のいずれか1項に記載の宿主細胞。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GBGB1602576.9A GB201602576D0 (en) | 2016-02-12 | 2016-02-12 | Process |
GB1602576.9 | 2016-02-12 | ||
PCT/EP2017/053077 WO2017137606A1 (en) | 2016-02-12 | 2017-02-10 | Process |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2019504650A true JP2019504650A (ja) | 2019-02-21 |
Family
ID=55697646
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018561309A Pending JP2019504650A (ja) | 2016-02-12 | 2017-02-10 | プロセス |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US10920256B2 (ja) |
EP (2) | EP3414334B1 (ja) |
JP (1) | JP2019504650A (ja) |
KR (1) | KR20190006478A (ja) |
CN (1) | CN109790558A (ja) |
AU (2) | AU2017218598B2 (ja) |
BR (1) | BR112018016346A2 (ja) |
CA (1) | CA3014109A1 (ja) |
CL (1) | CL2018002149A1 (ja) |
EA (1) | EA201891805A1 (ja) |
GB (3) | GB201602576D0 (ja) |
IL (1) | IL261106A (ja) |
MX (1) | MX2018009676A (ja) |
WO (1) | WO2017137606A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109097415A (zh) * | 2018-08-08 | 2018-12-28 | 浙江海洋大学 | 一种利用产毒海洋亚硫酸杆菌发酵制备石房蛤毒素的方法 |
GB2609817A (en) * | 2020-03-26 | 2023-02-15 | The Cawthron Inst Trust Board | Preparation of neosaxitoxin |
CN115466219B (zh) * | 2022-07-28 | 2023-09-08 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种1-[3-(2-氨基-4-乙基-1h-咪唑-5-基)丙基]胍的制备方法 |
Family Cites Families (29)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ATE255582T1 (de) | 1993-04-08 | 2003-12-15 | Univ Columbia | Verfahren zur synthese von 4-und/oder 5-(di) substituierten 2-aminoimidazolen aus 2- aminoimidazolen und aldehyden |
WO1998051290A2 (en) | 1997-05-16 | 1998-11-19 | Children's Medical Center Corporation | Local anesthetic formulations comprising a site 1 sodium channel blocker combined with a second active agent |
JP4289694B2 (ja) | 1998-04-03 | 2009-07-01 | 正昭 児玉 | 新規のサキシトキシン誘導体およびその製造方法 |
US20040029210A1 (en) | 2000-12-12 | 2004-02-12 | Robillot Cedric Emile Francois | Assay for paralytic shellfish toxin |
JP2003012699A (ja) | 2001-07-04 | 2003-01-15 | Japan Science & Technology Corp | 抗麻酔性貝毒抗体の製法、新規抗体、該抗体を用いるelisa測定キット、該製法による系標識毒標品 |
EA006739B1 (ru) | 2001-11-15 | 2006-04-28 | Майкроу Элджи Корпорейшн | Фармацевтические композиции, содержащие 3,4-пропинопергидропурины, и их применение для блокирования нейронной передачи |
US20030148359A1 (en) | 2002-01-11 | 2003-08-07 | Yale University | Saxitoxin detection and assay method |
AU2003901897A0 (en) | 2003-02-12 | 2003-05-08 | Australian Institute Of Marine Science | Conjugate |
JP2008513407A (ja) | 2004-09-21 | 2008-05-01 | ウェックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド | 中枢神経由来の神経障害性疼痛の治療用テトロドトキシンおよびその誘導体 |
JP2008513528A (ja) | 2004-09-22 | 2008-05-01 | ウェックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド | 末梢神経由来の神経障害性疼痛の治療用テトロドトキシンおよびその誘導体 |
RU2277097C1 (ru) | 2004-12-27 | 2006-05-27 | Институт Молекулярной Генетики Российской Академии Наук (Имг Ран) | Высокомеченный тритием дигидрохлорид [3h]сакситоксина |
AR053811A1 (es) * | 2005-02-11 | 2007-05-23 | Esteve Labor Dr | Utilizacion de un bloqueador del canal de sodio y sus analogos para el tratamiento de la dependencia de la nicotina |
CA2619856A1 (en) | 2005-08-25 | 2007-03-01 | Wex Pharmaceuticals Inc. | Use of sodium channel blockers for the treatment of visceral pain or pain caused by cancer treatment |
EP1931349A4 (en) | 2005-08-25 | 2009-08-05 | Wex Pharmaceuticals Inc | USE OF SODIUM CHANNEL BLOCKERS TO TREAT MUSCULO-SKELETAL PAIN |
EP1844781A1 (en) | 2006-02-22 | 2007-10-17 | Wex Pharmaceuticals Inc. | Use of sodium channel blockers for the treatment of preterm labor |
EP1844782A1 (en) | 2006-03-27 | 2007-10-17 | Wex Pharmaceuticals, Inc | Use of 4,9-anhydro-tetrodotoxin for the treatment of diseases related to the voltage-gated sodium channel subunit Nav1.6 |
EP2394646B1 (en) | 2006-03-27 | 2018-07-25 | Wex Medical Limited | Use of sodium channel blockers for the treatment of neuropathic pain developing as a consequence of chemotherapy |
WO2009049274A2 (en) * | 2007-10-12 | 2009-04-16 | The Regents Of The University Of California | Microorganism engineered to produce isopropanol |
DK2279265T3 (da) | 2008-04-24 | 2014-12-08 | Newsouth Innovations Pty Ltd | Cyanobakterie-saxitoxin-gencluster og detektering af cyanotoksiske organismer |
CL2009000723A1 (es) | 2009-03-24 | 2009-06-19 | Proteus Sa | Metodo de purificacion industrial de ficotoxinas biologicamente activas que comprende proporcionar una cantidad adecuada de una fuente de ficotoxinas como por ejemplo el cultivo de un clon de cianobacterias. |
US8952152B2 (en) | 2009-03-24 | 2015-02-10 | Proteus S.A. | Methods for purifying phycotoxins, pharmaceutical compositions containing purified phycotoxins, and methods of use thereof |
EP2459565B1 (en) | 2009-05-07 | 2018-05-02 | The Board of Trustees of The Leland Stanford Junior University | Saxitoxin derivatives, methods and compositions for studying, imaging, and treating pain |
CN105640501A (zh) | 2010-01-26 | 2016-06-08 | 迈克尔·A·埃文斯 | 用于去神经支配的方法、装置以及药剂 |
JP6112867B2 (ja) | 2010-02-10 | 2017-04-12 | ファイトトックス リミテッドPhytotox Limited | サキシトキシン誘導体での触覚の喪失の処置 |
KR101939421B1 (ko) | 2011-05-16 | 2019-01-16 | 뉴사우스 이노베이션즈 피티와이 리미티드 | 삭시톡신 생성 와편모조류의 검출 |
EP2638908A1 (en) | 2012-03-16 | 2013-09-18 | Phytotox SpA | Paralytic Shellfish Poison |
CN104427987A (zh) | 2012-04-23 | 2015-03-18 | 儿童医学中心公司 | 延缓慢性神经病理性疼痛发作的调配物和方法 |
US10233219B2 (en) | 2013-04-12 | 2019-03-19 | Tufts Medical Center | Methods and systems for designing and/or characterizing soluble lipidated ligand agents |
AU2015243437B2 (en) | 2014-04-09 | 2019-08-29 | Siteone Therapeutics, Inc. | 10',11'-modified saxitoxins useful for the treatment of pain |
-
2016
- 2016-02-12 GB GBGB1602576.9A patent/GB201602576D0/en not_active Ceased
-
2017
- 2017-02-10 JP JP2018561309A patent/JP2019504650A/ja active Pending
- 2017-02-10 MX MX2018009676A patent/MX2018009676A/es unknown
- 2017-02-10 EA EA201891805A patent/EA201891805A1/ru unknown
- 2017-02-10 CN CN201780023087.6A patent/CN109790558A/zh active Pending
- 2017-02-10 GB GB1702275.7A patent/GB2552859B/en active Active
- 2017-02-10 EP EP17706173.6A patent/EP3414334B1/en active Active
- 2017-02-10 CA CA3014109A patent/CA3014109A1/en active Pending
- 2017-02-10 GB GB1903649.0A patent/GB2569907B/en active Active
- 2017-02-10 AU AU2017218598A patent/AU2017218598B2/en active Active
- 2017-02-10 EP EP23192625.4A patent/EP4279577A3/en active Pending
- 2017-02-10 US US16/077,281 patent/US10920256B2/en active Active
- 2017-02-10 BR BR112018016346A patent/BR112018016346A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2017-02-10 WO PCT/EP2017/053077 patent/WO2017137606A1/en active Application Filing
- 2017-02-10 KR KR1020187025912A patent/KR20190006478A/ko unknown
-
2018
- 2018-08-08 CL CL2018002149A patent/CL2018002149A1/es unknown
- 2018-08-12 IL IL261106A patent/IL261106A/en unknown
-
2020
- 2020-10-19 US US17/074,607 patent/US11566271B2/en active Active
-
2021
- 2021-03-30 AU AU2021201969A patent/AU2021201969B2/en active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
GB201702275D0 (en) | 2017-03-29 |
KR20190006478A (ko) | 2019-01-18 |
AU2021201969B2 (en) | 2023-02-02 |
US20190048375A1 (en) | 2019-02-14 |
US10920256B2 (en) | 2021-02-16 |
IL261106A (en) | 2018-10-31 |
EP3414334A1 (en) | 2018-12-19 |
US20210108239A1 (en) | 2021-04-15 |
AU2017218598B2 (en) | 2021-05-06 |
EA201891805A1 (ru) | 2019-02-28 |
GB2552859A (en) | 2018-02-14 |
CA3014109A1 (en) | 2017-08-17 |
GB201903649D0 (en) | 2019-05-01 |
CL2018002149A1 (es) | 2019-02-15 |
AU2021201969A1 (en) | 2021-04-29 |
BR112018016346A2 (pt) | 2019-01-22 |
EP4279577A3 (en) | 2024-01-24 |
AU2017218598A1 (en) | 2018-10-04 |
US11566271B2 (en) | 2023-01-31 |
WO2017137606A1 (en) | 2017-08-17 |
EP3414334C0 (en) | 2023-10-11 |
EP4279577A2 (en) | 2023-11-22 |
GB2569907A (en) | 2019-07-03 |
GB2569907B (en) | 2020-04-08 |
EP3414334B1 (en) | 2023-10-11 |
GB2552859B (en) | 2019-09-18 |
CN109790558A (zh) | 2019-05-21 |
MX2018009676A (es) | 2019-06-06 |
GB201602576D0 (en) | 2016-03-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11566271B2 (en) | Processes to make neosaxitoxin and analogues thereof | |
JP5546870B2 (ja) | 1,2−プロパンジオールおよびアセトールの製造のための微生物および方法 | |
JP2024001078A (ja) | プレニルトランスフェラーゼ変異体およびプレニル化芳香族化合物の製造方法 | |
Kopp et al. | Insights into the complex biosynthesis of the leupyrrins in Sorangium cellulosum So ce690 | |
EP2451955B1 (en) | Process for preparation of tacrolimus | |
Li et al. | Complete elucidation of the late steps of bafilomycin biosynthesis in Streptomyces lohii | |
JP2011515083A (ja) | グリオキサラーゼiii活性を有するポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチドおよびその使用 | |
JP2020529861A (ja) | 操作された微生物からのエリオジクチオールの生合成 | |
CN114286858B (zh) | 叶酸生产菌株及其制备和应用 | |
Huang et al. | AdpA, a developmental regulator, promotes ε-poly-l-lysine biosynthesis in Streptomyces albulus | |
JP2005198658A (ja) | B2:B1アベルメクチン比率を支配するStreptomycesavermitilis遺伝子 | |
CN110713962B (zh) | 一株高产丙二酰辅酶a的基因工程菌及其构建方法和应用 | |
US20130273617A1 (en) | Method for producing indole derivative | |
CN116981769A (zh) | 酪醇和红景天苷的微生物生产 | |
Ünsaldı et al. | Proteomic analysis of a hom-disrupted, cephamycin C overproducing Streptomyces clavuligerus | |
CN112877349B (zh) | 一种重组表达载体、包含其的基因工程菌及其应用 | |
JP6635535B1 (ja) | Efpタンパク質を発現する大腸菌およびそれを用いたフラボノイド化合物製造方法 | |
US7977077B2 (en) | Synthesis of intermediates of oseltamivir carboxylates | |
Sucipto | Synthetic biotechnology to engineer myxopyronin production | |
Navone et al. | AllR controls the expression of allantoin pathway genes in Streptomyces coelicolor |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
RD01 | Notification of change of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7426 Effective date: 20181227 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20181227 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20200205 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20201218 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210209 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20210322 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20210701 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210806 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20220111 |