CN116981769A

CN116981769A - 酪醇和红景天苷的微生物生产

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Publication number: CN116981769A
Application number: CN202280013550.XA
Authority: CN
Inventors: 西蒙·佩德罗·德皮尼奥·苏亚雷斯; 乔安娜·玛格丽达·西尔瓦·戈麦斯; 克里斯蒂安娜·达席尔瓦·法里亚; 伊莎贝尔·克里斯蒂娜·德阿尔梅达·佩雷拉·达罗查; 保罗·里卡多·卡瓦略·维拉萨
Original assignee: Sliko Life Co ltd
Current assignee: Sliko Life Co ltd
Priority date: 2021-02-08
Filing date: 2022-02-08
Publication date: 2023-10-31
Also published as: EP4288528A1; WO2022167692A1; KR20230143166A; JP2024505705A; CA3205518A1; AU2022216857A1

Abstract

本发明涉及一种生产酪醇的方法，其中使异源性表达苯丙酮酸脱羧酶并且过表达磷酸‑2‑脱氢‑3‑脱氧庚糖酸和预苯酸脱氢酶并且其中pheAL和feaB均被失活或去除的转基因细菌细胞在包括磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和赤藓糖4‑磷酸(E4P)的代谢前体，特别是葡萄糖，以及任选地作为补充物的苯丙氨酸的培养基中生长；并且从所述培养基中提取酪醇。本发明还涉及一种生产红景天苷的方法，其中该转基因细胞附加地异源性表达尿苷二磷酸依赖性糖基转移酶(UGT85A1，EC：2.4.1.)。

Description

酪醇和红景天苷的微生物生产

本申请要求于2021年2月8日提交的欧洲专利申请EP21155780.6和于2021年9月13日提交的欧洲专利申请EP21196276.6以及于2021年7月13日提交的葡萄牙专利申请20211000027222的权益，所有这些申请通过引用并入本文。

本发明涉及一种生产酪醇的方法，其中使异源性表达苯丙酮酸脱羧酶且过表达磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚糖酸(deoxyheptonate)和预苯酸脱氢酶并且其中pheAL和feaB均被失活或去除的转基因细菌细胞在包括磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和赤藓糖4-磷酸(E4P)的代谢前体，特别是葡萄糖，以及任选地作为补充物的苯丙氨酸的培养基中生长；并且从所述培养基中提取酪醇。本发明还涉及一种生产红景天苷的方法，其中该转基因细胞附加地异源性表达尿苷二磷酸依赖性糖基转移酶(UGT85A1，EC：2.4.1.)。

描述

酪醇是一种具有巨大工业价值的酚类化合物并且作为精细化学品销售。

红景天苷是酪醇的葡萄糖苷，并且作为推定具有抗抑郁和抗焦虑作用的潜在化合物中的一种已经被研究。

植物中的酪醇浓度通常低，这导致低的商业产品收率和高的生产成本。此外，从植物中获得高纯度酪醇的天然提取工艺是复杂的，这也使得产率相对低。尽管酪醇天然含量丰富，然而因为从天然来源中提取酪醇的成本非常高，所以出于工业目的，酪醇也经由化学合成方法生产，但是从商业观点来看，这些方法还有很大的改进空间。

定义

在当前上下文中提及的转基因细胞意指包括至少一个衍生自与宿主细胞不同的生物体的基因(在本说明书中称为转基因)的细胞。经由分子生物学方法将该基因导入转基因宿主细胞。

与本说明书中提及的某一基因相关的异源表达或异源性表达意指该基因衍生自除被称为异源性表达的宿主物种以外的来源。

与本说明书中提及的某一基因相关的过表达(Overexpressing)或过表达(overexpression)意指：添加所述基因的功能性(转基因或自体)版本，和/或添加控制所述基因的自体(天然)版本的启动子序列，导致基因的生物活性相对于野生型(细菌)细胞显著更高的表达。基因生物活性的显著更高的表达意指与野生型细菌细胞相比，细菌细胞内mRNA分子的数目是至少1.5倍，特别是至少两倍。与野生型核酸和氨基酸序列相比，过表达的基因还可以包括突变(取代、缺失和/或插入)。突变可以增加酶的效力，优化表达率或改变酶的特异性。

与本说明书中提及的某一基因相关的失活或敲除意指该基因的表达与野生型细菌细胞相比显著降低，特别是降低至少30倍，更特别是降低至少100倍，或者不存在该基因的基因表达。

与本说明书中提及的某一基因相关的重组基因表达意指：通过分子生物学方法将重组基因插入宿主细胞。重组基因可以源自与宿主细胞相同的生物体，或者源自不同的生物体。

补充物是指不是细菌细胞的主要碳源的化合物的量，但以细胞代谢可以补偿化合物的营养缺陷现象的足够量给出。需要苯丙氨酸来覆盖pheAL缺失菌株的营养缺陷现象。本发明人使用M9Y，因为它具有作为苯丙氨酸来源的酵母提取物。需要补充酵母提取物或纯苯丙氨酸。

发明的具体描述

本发明的第一方面涉及一种生产酪醇的方法，其中在培养基中生长转基因细菌细胞，该转基因细菌细胞异源性表达以下酶：

a.苯丙酮酸脱羧酶(ARO10，EC：4.1.1.80)，

并且过表达以下酶中的每一种：

b.磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚糖酸醛缩酶(aroF，EC：2.5.1.54)，

c.预苯酸脱氢酶(tyrA，EC：5.4.99.5和EC：1.3.1.12)，

并且该转基因细菌细胞中，以下基因中的每一种被失活或去除(不存在，不表达)：

i.pheAL(双功能分支酸变位酶/预苯酸脱水酶(UniProtKB-P0A9J8；EC：5.4.99.5)，

ii.feaB(苯乙醛脱氢酶，UniProtKB-P80668；EC：1.2.1.39)，

该培养基包括

·磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和赤藓糖4-磷酸(E4P)的代谢前体，特别是葡萄糖，以及

·任选地，作为补充物的苯丙氨酸；

及从所述培养基中提取酪醇。

在某些实施方案中，转基因细菌细胞属于埃希氏杆菌(Escherichia)属。在某些实施方案中，转基因细菌细胞属于大肠杆菌(E.coli)种。在某些实施方案中，转基因细菌细胞属于大肠杆菌BL21菌株。

在某些实施方案中，编码苯丙酮酸脱羧酶的基因源自酵母。在某些实施方案中，编码苯丙酮酸脱羧酶的基因源自酿酒酵母(S.cerevisiae)。

本发明的第二方面涉及一种生产红景天苷的方法，其中

-如前述实施方案中任一项所规定的转基因细胞附加地异源性表达尿苷二磷酸依赖性糖基转移酶(UGT85A1，EC：2.4.1.)，并且

-该细胞在培养基中生长，该培养基包括

o磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和赤藓糖4-磷酸(E4P)的代谢前体，特别是葡萄糖，以及

o任选地，作为补充物的苯丙氨酸；

-并且从所述培养基中提取红景天苷。

本发明的第三方面涉及一种生产羟基酪醇的方法，其中在培养基中生长转基因细菌细胞，该转基因细菌细胞异源性表达以下酶：

a.苯丙酮酸脱羧酶(ARO10，EC：4.1.1.80)，

并且过表达以下酶中的每一种：

b.磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚糖酸醛缩酶(aroF，EC：2.5.1.54)，

c.预苯酸脱氢酶(tyrA，EC：5.4.99.5和EC：1.3.1.12)，

d.4-羟基苯乙酸酯3-单加氧酶(hpaBC*，EC：1.14.14.9)，

该培养基包括

·任选地，作为补充物的苯丙氨酸；

并且从所述培养基中提取羟基酪醇。

本发明的第三方面的替代方案涉及一种生产羟基酪醇的方法，其中在培养基中生长转基因细菌细胞，该转基因细菌细胞重组表达以下酶中的每一种：

a.苯丙酮酸脱羧酶(ARO10，EC：4.1.1.80)，

b.磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚糖酸醛缩酶(aroF，EC：2.5.1.54)，

c.预苯酸脱氢酶(tyrA，EC：5.4.99.5和EC：1.3.1.12)，

d.4-羟基苯乙酸酯3-单加氧酶(hpaBC*，EC：1.14.14.9)，

该培养基包括

·任选地，作为补充物的苯丙氨酸；

并且从所述培养基中提取羟基酪醇。

在某些实施方案中，编码4-羟基苯乙酸酯3-单加氧酶的基因源自埃希氏杆菌。在某些实施方案中，编码4-羟基苯乙酸酯3-单加氧酶的基因源自大肠杆菌。

在某些实施方案中，编码4-羟基苯乙酸酯3-单加氧酶的基因包括氨基酸取代S₂₁₀T、A₂₁₁L和Q₂₁₂E。

在第三方面的某些实施方案中，培养基包括5至10g/L的Na₂HPO₄·2H₂O、2至4g/L的KH₂PO₄、0.25至1g/L的NaCl、0.5至1.5g/L的NH₄Cl、1％至3％(w/v)的葡萄糖、0.01％至0.05％(w/v)的酵母提取物、3至7mM的MgSO₄、0.005至0.02g/L的CaCl₂、0.5至2.0g/L的抗坏血酸和抗生素。

在第三方面的某些实施方案中，将十二烷醇添加到培养基中。在第三方面的某些实施方案中，将约25％的十二烷醇(v/v)添加到培养基中。由于十二烷醇与水不混溶，它在培养基的顶部构建第二层。

在第三方面的某些实施方案中，细胞用≥2％(v/v)的O₂生长。在第三方面的某些实施方案中，细胞用2％至4％(v/v)的O₂生长。

在某些实施方案中，编码尿苷二磷酸依赖性糖基转移酶的基因源自植物。在某些实施方案中，编码尿苷二磷酸依赖性糖基转移酶的基因源自拟南芥属(Arabidopsis)。在某些实施方案中，编码尿苷二磷酸依赖性糖基转移酶的基因源自拟南芥(A.thaliana)。

在某些实施方案中，转基因细菌细胞不过表达以下蛋白质中的任一种：

-醇脱氢酶，(UniProtKB-P39451；EC：1.1.1.1)，

-DNA-结合转录调节蛋白(tyrR NCBI GenPept：NP_415839.1)，

-以及酪氨酸转氨酶，(UniProtKB-P04693，EC：2.6.1.57)。

在某些实施方案中，转基因细菌细胞的唯一转基因是以上提到的转基因。

在某些实施方案中，经由一种或几种质粒载体将过表达的基因和转基因引入转基因细菌细胞，特别是其中

-苯丙酮酸脱羧酶、磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚糖酸醛缩酶和预苯酸脱氢酶由中等拷贝质粒载体编码，和/或

-尿苷二磷酸依赖性糖基转移酶由低拷贝质粒载体编码，和/或

-4-羟基苯乙酸酯3-单加氧酶由低拷贝质粒载体编码。

在某些实施方案中，所述转基因细菌细胞包括一种或多种质粒，该一种或多种质粒在所述细胞中可操作的启动子序列，特别是T7启动子(SEQ ID NO.31)、lac启动子(SEQID NO.32)、tac启动子(SEQ ID NO.33)或trc启动子(SEQ ID NO.34)的控制下，编码所述异源性表达或过表达的酶，更特别是其中

-编码尿苷二磷酸依赖性糖基转移酶的基因在trc启动子的控制下，和/或

-编码苯丙酮酸脱羧酶的基因在T7启动子的控制下，和/或

-编码磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚糖酸醛缩酶的基因在T7启动子的控制下，和/或

-编码预苯酸脱氢酶的基因在T7启动子的控制下；和/或

-编码4-羟基苯乙酸酯3-单加氧酶的基因在T7启动子的控制下。

在某些实施方案中，通过添加异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)，特别是以约0.1mM的IPTG的浓度，来诱导所述异源和/或过表达的基因的表达96小时。

在某些实施方案中，所述培养基包括10至50g/L的葡萄糖，特别是15至30g/L的葡萄糖。

在某些实施方案中，转基因是密码子优化的，用于在所述转基因细菌细胞中表达。

在某些实施方案中，培养基包括5至10g/L的Na₂HPO₄·2H₂O、2至4g/L的KH₂PO₄、0.25至1g/L的NaCl、0.5至1.5g/L的NH₄Cl、1％至3％(w/v)的葡萄糖、0.01％至0.05％(w/v)的酵母提取物、3至7mM的MgSO₄、0.005至0.02g/L的CaCl₂和抗生素，特别地，所述抗生素为50至200μg/mL的氨苄青霉素(ampicillin)、10至50μg/mL的卡那霉素(kanamycin)和25至45μg/mL的氯霉素(chloramphenicol)。

在某些实施方案中，细胞在22℃至30℃，特别是在约30℃生长。

在某些实施方案中，蛋白质苯丙酮酸脱羧酶与SEQ ID NO 1具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或>95％的序列同一性，并且具有SEQ ID NO 1的活性的至少75％的催化活性。在某些实施方案中，蛋白质磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚糖酸醛缩酶与SEQID NO 2具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或>95％的序列同一性，并且具有SEQ ID NO 2的活性的至少75％的催化活性。在某些实施方案中，蛋白质预苯酸脱氢酶与SEQ ID NO 3具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或>95％的序列同一性，并且具有SEQ ID NO 3的活性的至少75％的催化活性。在某些实施方案中，蛋白质尿苷二磷酸依赖性糖基转移酶与SEQ ID NO 4具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或>95％的序列同一性，并且具有SEQ ID NO 4的活性的至少75％的催化活性。在某些实施方案中，蛋白质4-羟基苯乙酸酯3-单加氧酶与SEQ ID NO 035具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或>95％的序列同一性，并且具有SEQ ID NO 035的活性的至少75％的催化活性。

本发明的第四方面涉及如上述实施方案中的任一个所规定的转基因细胞。

第四方面的替代方案涉及转基因细胞，该转基因细胞异源性表达以下酶：

a.苯丙酮酸脱羧酶(ARO10，EC：4.1.1.80)，

并且过表达以下酶中的每一种：

b.磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚糖酸醛缩酶(aroF，EC：2.5.1.54)，

c.预苯酸脱氢酶(tyrA，EC：5.4.99.5和EC：1.3.1.12)，

并且其中以下基因中的每一种被失活或去除(不存在，不表达)：

i.pheAL(双功能分支酸变位酶/预苯酸脱水酶(UniProtKB-P0A9J8；EC：5.4.99.5)

ii.feaB(苯乙醛脱氢酶，UniProtKB-P80668；EC：1.2.1.39)。

第四方面的另一替代方案涉及转基因细胞，该转基因细胞异源性表达以下酶中的每一种：

a.苯丙酮酸脱羧酶(ARO10，EC：4.1.1.80)；

b.尿苷二磷酸依赖性糖基转移酶(UGT85A1，EC：2.4.1.)；

并且过表达以下酶中的每一种：

c.磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚糖酸醛缩酶(aroF，EC：2.5.1.54)，

d.预苯酸脱氢酶(tyrA，EC：5.4.99.5和EC：1.3.1.12)，

ii.feaB(苯乙醛脱氢酶，UniProtKB-P80668；EC：1.2.1.39)。

第四方面的另一替代方案涉及转基因细胞，该转基因细胞异源性表达以下酶：

a.苯丙酮酸脱羧酶(ARO10，EC：4.1.1.80)，

并且过表达以下酶中的每一种：

b.磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚糖酸醛缩酶(aroF，EC：2.5.1.54)，

c.预苯酸脱氢酶(tyrA，EC：5.4.99.5和EC：1.3.1.12)，

d.4-羟基苯乙酸酯3-单加氧酶(hpaBC*，EC：1.14.14.9)。

在第四方面的某些实施方案中，转基因细菌细胞属于埃希氏杆菌属，特别是其中转基因细菌细胞属于大肠杆菌种，更特别是其中转基因细菌细胞属于大肠杆菌BL21菌株。

在第四方面的某些实施方案中，编码苯丙酮酸脱羧酶的基因源自酵母，特别是源自酿酒酵母。

在第四方面的某些实施方案中，编码4-羟基苯乙酸酯3-单加氧酶的基因源自埃希氏杆菌，特别是源自大肠杆菌。

在第四方面的某些实施方案中，编码4-羟基苯乙酸酯3-单加氧酶的基因包括氨基酸取代S₂₁₀T、A₂₁₁L和Q₂₁₂E。

在第四方面的某些实施方案中，编码尿苷二磷酸依赖性糖基转移酶的基因源自植物，特别是源自拟南芥属，更特别是源自拟南芥。

在第四方面的某些实施方案中，转基因细菌细胞不过表达以下蛋白质中的任一种：

-醇脱氢酶，(UniProtKB-P39451；EC：1.1.1.1)，

-DNA-结合转录调节蛋白(tyrR NCBI GenPept：NP_415839.1)，

-以及酪氨酸转氨酶，(UniProtKB-P04693，EC：2.6.1.57)。

在第四方面的某些实施方案中，转基因细菌细胞的唯一转基因是以上提到的转基因。

在第四方面的某些实施方案中，经由一种或几种质粒载体将过表达的基因和转基因引入转基因细菌细胞，特别是其中

-4-羟基苯乙酸酯3-单加氧酶由低拷贝质粒载体编码。

在第四个方面的某些实施方案中，所述转基因细菌细胞包括一种或多种质粒，所述一种或多种质粒在所述细胞中可操作的启动子序列，特别是T7启动子(SEQ ID NO.31)、lac启动子(SEQ ID NO.32)、tac启动子(SEQ ID NO.33)或trc启动子(SEQ ID NO.34)的控制下，编码所述异源性表达或过表达的酶，更特别是其中

-编码苯丙酮酸脱羧酶的基因在T7启动子的控制下，和/或

-编码预苯酸脱氢酶的基因在T7启动子的控制下；和/或

-编码4-羟基苯乙酸酯3-单加氧酶的基因在T7启动子的控制下。

在第四方面的某些实施方案中，蛋白质苯丙酮酸脱羧酶与SEQ ID NO 1具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或>95％的序列同一性，并且具有SEQ ID NO1的活性的至少75％的催化活性。在第四方面的某些实施方案中，蛋白质磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚糖酸醛缩酶与SEQ ID NO 2具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或>95％的序列同一性，并且具有SEQ ID NO 2的活性的至少75％的催化活性。在第四方面的某些实施方案中，蛋白质预苯酸脱氢酶与SEQ ID NO 3具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或>95％的序列同一性，并且具有SEQ ID NO 3的活性的至少75％的催化活性。在第四方面的某些实施方案中，蛋白质尿苷二磷酸依赖性糖基转移酶与SEQ ID NO 4具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或>95％的序列同一性，并且具有SEQID NO 4的活性的至少75％的催化活性。在第四方面的某些实施方案中，蛋白质4-羟基苯乙酸酯3-单加氧酶与SEQ ID NO 035具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或>95％的序列同一性，并且具有SEQ ID NO 035的活性的至少75％的催化活性。

本说明书还包括以下项目。

项目

1.一种生产羟基酪醇的方法，其中在培养基中生长转基因细菌细胞，该转基因细菌细胞异源性表达以下酶：

a.苯丙酮酸脱羧酶(ARO10)，

并且过表达以下酶中的每一种：

b.磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚糖酸醛缩酶(aroF)，

c.预苯酸脱氢酶(tyrA)，

d.4-羟基苯乙酸酯3-单加氧酶(hpaBC*)，

所述培养基包括

·任选地，作为补充物的苯丙氨酸；

并且从所述培养基中提取羟基酪醇。

2.根据第1项所述的方法，其中所述转基因细菌细胞属于埃希氏杆菌(Escherichia)属，特别是其中所述转基因细菌细胞属于大肠杆菌(E.coli)种，更特别是其中所述转基因细菌细胞属于大肠杆菌BL21菌株。

3.根据前述项目中任一项所述的方法，其中编码所述苯丙酮酸脱羧酶的基因源自酵母，特别是源自酿酒酵母(S.cerevisiae)。

4.根据前述项目中任一项所述的方法，其中编码所述4-羟基苯乙酸酯3-单加氧酶的基因源自埃希氏杆菌，特别是源自大肠杆菌。

5.根据前述项目中任一项所述的方法，其中编码所述4-羟基苯乙酸酯3-单加氧酶的基因包括氨基酸取代S₂₁₀T、A₂₁₁L和Q₂₁₂E。

6.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述转基因细菌细胞不过表达以下蛋白质中的任一种：

-醇脱氢酶，

-DNA-结合转录调节蛋白(tyrR)，

-和酪氨酸转氨酶。

7.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述转基因细菌细胞的唯一异源性表达的基因是苯丙酮酸脱羧酶。

8.根据前述项目中任一项所述的方法，其中经由一种或几种质粒载体将所述过表达的基因和转基因引入所述转基因细菌细胞，特别是其中

-4-羟基苯乙酸酯3-单加氧酶由低拷贝质粒载体编码。

9.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述转基因细菌细胞包括一种或多种质粒，所述一种或多种质粒在所述细胞中可操作的启动子序列，特别是T7启动子(SEQ IDNO.31)、lac启动子(SEQ ID NO.32)、tac启动子(SEQ ID NO.33)或trc启动子(SEQIDNO.34)的控制下，编码所述异源性表达或过表达的酶，更特别是其中

-编码4-羟基苯乙酸酯3-单加氧酶的所述基因在T7启动子的控制下，和/或

-编码苯丙酮酸脱羧酶的所述基因在T7启动子的控制下，和/或

-编码磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚糖酸醛缩酶的所述基因在T7启动子的控制下，和/或

-编码预苯酸脱氢酶的所述基因在T7启动子的控制下。

10.根据项目9所述的方法，其中通过添加异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)，特别是以约0.1mM的IPTG的浓度来诱导所述异源和/或过表达的基因的表达96小时。

11.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述培养基包括10至50g/L的葡萄糖，特别是15至30g/L的葡萄糖。

12.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述转基因是密码子优化的，用于在所述转基因细菌细胞中表达。

13.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述培养基包括

·5至10g/L的Na₂HPO₄·2H₂O，

·2至4g/L的KH₂PO₄，

·0.25至1g/L的NaCl，

·0.5至1.5g/L的NH₄Cl，

·1％至3％(w/v)的葡萄糖，

·0.01％至0.05％(w/v)的酵母提取物，

·3至7mM的MgSO₄，

·0.005至0.02g/L的CaCl₂，

·0.5至2.0g/L的抗坏血酸，以及

·抗生素，特别地抗生素是50至200μg/mL的氨苄青霉素(ampicillin)、10至50μg/mL的卡那霉素(kanamycin)和25至45μg/mL的氯霉素(chloramphenicol)。

14.根据前述项目中任一项所述的方法，其中将十二烷醇添加到所述培养基中，特别是将约25％十二烷醇(v/v)添加到所述培养基中。

15.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述细胞用≥2％(v/v)的O₂，特别是用2至4％(v/v)的O₂生长。

16.根据前述项目中任一项所述的方法，其中

a.蛋白质苯丙酮酸脱羧酶与SEQ ID NO 1具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或>95％的序列同一性，并且具有SEQ ID NO 1的活性的至少75％的催化活性，和/或

b.蛋白质磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚糖酸醛缩酶与SEQ ID NO 2具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或>95％的序列同一性，并且具有SEQ ID NO 2的活性的至少75％的催化活性，和/或

c.蛋白质预苯酸脱氢酶与SEQ ID NO 3具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或>95％的序列同一性，并且具有SEQ ID NO 3的活性的至少75％的催化活性，和/或

d.蛋白质4-羟基苯乙酸酯3-单加氧酶与SEQ ID NO 035具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或>95％的序列同一性，并且具有SEQ ID NO 035的活性的至少75％的催化活性。

17.一种根据前述项目中任一项所规定的转基因细胞。

18.一种转基因细胞，所述转基因细胞异源性表达以下酶：

a.苯丙酮酸脱羧酶(ARO10)，

并且过表达以下酶中的每一种：

b.磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚糖酸醛缩酶(aroF)，

c.预苯酸脱氢酶(tyrA)，

并且其中以下基因中的每一种皆不表达：

i.pheAL(双功能分支酸变位酶/预苯酸脱水酶)；

ii.feaB(苯乙醛脱氢酶)。

19.一种转基因细胞，所述转基因细胞异源性表达以下酶中的每一种：

a.苯丙酮酸脱羧酶(ARO10)；

b.尿苷二磷酸依赖性糖基转移酶(UGT85A1)；

并且过表达以下酶中的每一种：

c.磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚糖酸醛缩酶(aroF)，

d.预苯酸脱氢酶(tyrA)，

并且其中以下基因中的每一种皆不表达：

i.pheAL(双功能分支酸变位酶/预苯酸脱水酶)，

ii.feaB(苯乙醛脱氢酶)。

20.一种转基因细胞，所述转基因细胞异源性表达以下酶：

a.苯丙酮酸脱羧酶(ARO10)

并且过表达以下酶中的每一种：

b.磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚糖酸醛缩酶(aroF)，

c.预苯酸脱氢酶(tyrA)；

d.4-羟基苯乙酸酯3-单加氧酶(hpaBC*)。

21.根据前述项目17至20中任一项所述的转基因细胞，其中所述转基因细菌细胞属于埃希氏杆菌属，特别是其中所述转基因细菌细胞属于大肠杆菌(E.coli)种，更特别是其中所述转基因细菌细胞属于大肠杆菌BL21菌株。

22.根据前述项目17至21中任一项所述的转基因细胞，其中编码所述苯丙酮酸脱羧酶的基因源自酵母，特别是源自酿酒酵母。

23.根据前述项目17或20至22中任一项所述的转基因细胞，其中编码所述4-羟基苯乙酸酯3-单加氧酶的基因源自埃希氏杆菌，特别是源自大肠杆菌。

24.根据前述项目17或20至23中任一项所述的转基因细胞，其中编码所述4-羟基苯乙酸酯3-单加氧酶的基因包括氨基酸取代S₂₁₀T、A₂₁₁L和Q₂₁₂E。

25.根据前述项目17或19或21至22中任一项所述的转基因细胞，其中编码尿苷二磷酸依赖性糖基转移酶的所述基因源自植物，特别是源自拟南芥属，更特别是源自拟南芥。

26.根据前述项目17至25中任一项所述的转基因细胞，其中所述转基因细菌细胞不过表达以下蛋白质中的任一种：

-醇脱氢酶，(UniProtKB-P39451；EC：1.1.1.1)，

-DNA-结合转录调节蛋白(tyrR NCBI GenPept：NP_415839.1)，

-以及酪氨酸转氨酶，(UniProtKB-P04693，EC：2.6.1.57)。

27.根据前述项目18或20至26中任一项所述的转基因细胞，其中所述转基因细胞的唯一异源性表达的基因是苯丙酮酸脱羧酶。

28.根据前述项目19或21至26中任一项所述的转基因细胞，其中所述转基因细胞的唯一异源性表达的基因是苯丙酮酸脱羧酶和尿苷二磷酸依赖性糖基转移酶。

29.根据前述项目17至27中任一项所述的转基因细胞，其中经由一种或几种质粒载体将所述过表达的基因和转基因引入转基因细菌细胞，特别是其中

-4-羟基苯乙酸酯3-单加氧酶由低拷贝质粒载体编码。

30.根据前述项目17至28中任一项所述的转基因细胞，其中转基因细菌细胞包括一种或多种质粒，所述一种或多种质粒在所述细胞中可操作的启动子序列，特别是T7启动子(SEQ ID NO.31)、lac启动子(SEQ ID NO.32)、tac启动子(SEQ ID NO.33)或trc启动子(SEQ ID NO.34)的控制下，编码所述异源性表达或过表达的酶，更特别是其中

-编码尿苷二磷酸依赖性糖基转移酶的所述基因在trc启动子的控制下，和/或

-编码苯丙酮酸脱羧酶的所述基因在T7启动子的控制下，和/或

-编码预苯酸脱氢酶的所述基因在T7启动子的控制下；和/或

-编码4-羟基苯乙酸酯3-单加氧酶的所述基因在T7启动子的控制下。

31.根据前述项目17至29中任一项所述的转基因细胞，其中

-所述蛋白质苯丙酮酸脱羧酶与SEQ ID NO 1具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或>95％的序列同一性，并且具有SEQ ID NO 1的活性的至少75％的催化活性，和/或

-所述蛋白质磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚糖酸醛缩酶与SEQ ID NO 2具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或>95％的序列同一性，并且具有SEQ ID NO 2的活性的至少75％的催化活性，和/或

-所述蛋白质预苯酸脱氢酶与SEQ ID NO 3具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或>95％的序列同一性，并且具有SEQ ID NO 3的活性的至少75％的催化活性，和/或

-所述蛋白质尿苷二磷酸依赖性糖基转移酶与SEQ ID NO 4具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或>95％的序列同一性，并且具有SEQ ID NO 4的活性的至少75％的催化活性，和/或

-所述蛋白质4-羟基苯乙酸酯3-单加氧酶与SEQ ID NO 035具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或>95％的序列同一性，并且具有SEQ ID NO 035的活性的至少75％的催化活性。

附图说明

图1示出了使用葡萄糖作为碳源在大肠杆菌BL21(DE3)中酪醇和红景天苷的生物合成。为了生产酪醇，将基因aroF^fbr、tyrA^fbr和ScARO10*克隆到质粒中并且转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，以产生酪醇生产菌株。为了生产红景天苷，将基因AtUGT85A1克隆到不同的质粒中并且转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，以由酪醇生产菌株产生红景天苷生产菌株。对于红景天苷的生产，存在对相关生物合成基因的动态控制，如三角形和圆形符号所指示的：实心三角形指示T7启动子的使用，而空心三角形指示trc启动子的使用；一个圆圈指示低拷贝数质粒的使用，两个圆圈指示中等拷贝数质粒的使用，以及三个圆圈指示高拷贝数质粒的使用。缩写：磷酸烯醇丙酮酸(PEP)；赤藓糖4-磷酸(E4P)；磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚糖酸醛缩酶(aroF^fbr)；3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸(heptulosonate)7-磷酸(DAHP)；预苯酸脱氢酶(tyrA^fbr)；4-羟基苯丙酮酸(4-HPP)；来自酿酒酵母的苯丙酮酸脱羧酶(ScARO10*)；4-羟基苯乙醛(4-HPAA)；醇脱氢酶(Ps)；来自拟南芥的尿苷二磷酸依赖性糖基转移酶(AtUGT85A1)。

图2示出了在大肠杆菌BL21(DE3)中选择最佳苯丙酮酸脱羧酶(ScARO10*、EipdC和KpPDC)用于由葡萄糖生产酪醇。a)用于由葡萄糖生产酪醇的途径的示意性概述。b)在M9Y培养基中用0.1mM的iPTG诱导的菌株ST93、ST135和ST136的酪醇滴度(g/L)。生长72小时后对培养物进行取样用于酪醇检测。使用学生t测试进行统计学分析(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。所有数据表示n＝3个生物学独立样品的平均值，并且误差条示出了标准偏差。

图3示出了adhP*的过表达对在大肠杆菌BL21(DE3)中由葡萄糖生产酪醇的影响。a)用于由葡萄糖生产酪醇的途径的示意性概述。b)在M9Y培养基中用0.1mM的IPTG诱导的菌株ST93、ST81和ST114的酪醇滴度(g/L)。生长48小时后对培养物进行取样用于酪醇检测。菌株ST81在22℃和30℃下生长以评估对酪醇滴度的影响。使用学生t测试进行统计学分析(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。所有数据表示n＝3个生物学独立样品的平均值，并且误差条示出了标准偏差。

图4示出了用以改进在大肠杆菌BL21(DE3)中由葡萄糖生产酪醇的工程化芳香族氨基酸途径。a)用于由葡萄糖生产酪醇的途径的示意性概述。b)在有或没有苯丙氨酸补充的M9Y培养基中用0.1mM的IPTG诱导的携带feaB和pheAL基因敲除的菌株ST170和191的酪醇滴度(g/L)。生长96小时后对培养物进行取样用于酪醇检测。使用学生t测试进行统计学分析(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。所有数据表示n＝3个生物学独立样品的平均值，并且误差条示出了标准偏差。ARO10*_aroF^fbr_tyrA^fbr对应于质粒pET-21a(+)_ScARO10*_aroF^fbr_tyrA^fbr并且adhP*对应于pET-28a(+)_adhP*。

图5示出了AtUGT85A1的不同表达水平对在大肠杆菌BL21(DE3)中由葡萄糖生产红景天苷的影响。a)用于由葡萄糖生产红景天苷的途径的示意性概述。b)在M9Y培养基中用0.1mM的IPTG诱导的菌株ST92、116、131和176的红景天苷和酪醇滴度(g/L)。生长48小时后对培养物进行取样用于红景天苷和酪醇检测。使用学生t测试进行统计学分析(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。所有数据表示n＝3个生物学独立样品的平均值，并且误差条示出了标准偏差

图6示出了用以改进在大肠杆菌BL21(DE3)中由葡萄糖生产红景天苷的芳香族氨基酸途径的工程化。a)用于由葡萄糖生产红景天苷的途径的示意性概述。b)在有或没有苯丙氨酸补充的M9Y培养基中用0.1mM的IPTG诱导的菌株ST172和ST178的红景天苷滴度(g/L)。生长96小时后对培养物进行取样用于红景天苷检测。使用学生t测试进行统计学分析(*p<0.05，***p<0.001)。所有数据表示n＝3个生物学独立样品的平均值，并且误差条示出了标准偏差。

图7.hpaBC*的不同表达水平对在大肠杆菌BL21(DE3)中由葡萄糖生产羟基酪醇的影响。a)由葡萄糖生产羟基酪醇的途径的示意性概述。b)在补充有1g/L的抗坏血酸的M9Y培养基中用0.1mM的IPTG诱导的菌株ST76、119和132的羟基酪醇滴度(g/L)。生长48小时后对培养物进行取样用于羟基酪醇检测。使用学生t测试进行统计学分析(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。所有数据表示的平均值

图8.hpaBC*的不同表达水平对在大肠杆菌BL21(DE3)中由葡萄糖生产羟基酪醇的影响。a)由葡萄糖生产羟基酪醇的途径的示意性概述。b)在补充有1g/L的抗坏血酸和添加或不添加25％(v/v)的1-十二烷醇的M9Y培养基中用0.1mM的IPTG诱导的菌株ST119和132的羟基酪醇滴度(g/L)。生长48小时后对培养物进行取样用于羟基酪醇检测。使用学生t测试进行统计学分析。所有数据表示n＝3个生物学独立样品的平均值，并且误差条示出了标准偏差(参见材料和方法)。

材料和方法

克隆策略

大肠杆菌DH5α细胞(美国马萨诸塞州新英格兰生物实验室(New EnglandBioLabs,Massachusetts,USA))用于基因克隆和载体增殖。在具有适当抗生素浓度的Luria-Bertani(LB)培养基(10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物、10g/L的NaCl)中培养这种菌株。这种培养基的固体形式包括20g/L的琼脂。所有培养均在37℃下进行，并且在液体培养物的情况下，在振荡条件(200rpm)下进行。对于长期储存，将甘油添加到选择性培养基中的过夜培养物中至最终浓度为30％(v/v)并且保持在-80℃的冷冻器中。

使用Phusion高保真DNA聚合酶(美国沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司(ThermoScientific,Waltham,USA))在LifeECO热循环仪中，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增本研究中使用的基因。所有引物购自集成DNA技术公司(Integrated DNA Technologies)(美国科勒维尔(Coralville,USA))。使用DNA清洁和浓缩器(DNA Clean and Concentrator)DNA试剂盒(美国尔湾(Irvine)的Zymo Research公司)纯化DNA片段。

使用质粒小提试剂盒(Plasmid Miniprep Kit)(Zymo Research)提取质粒。使用适当的限制性内切核酸酶(赛默飞世尔科技公司)进行所有消化。用T4 DNA连接酶(赛默飞世尔科技公司)进行连接，并且使用Mix&Go大肠杆菌转化试剂盒和缓冲液组(ZymoResearch)在化学感受态大肠杆菌DH5α细胞和大肠杆菌BL21(DE3)中进行转化。使用DreamTaq(赛默飞世尔科技公司)通过菌落PCR检查到连接的成功，并且通过测序(葡萄牙里斯本(Lisbon,Portugal)的StabVida)进一步证实。根据制造商的说明执行方案。

tyrA^fbr基因及密码子优化的基因ScARO10*、KpPDC、EipdC和AtUGT85A1购自IDTDNA技术公司(美国科勒维尔)，并且在tyrA^fbr和ScARO10*的情况下，克隆到pET-21a(+)载体(德国达姆施塔特(Darmstadt,Germany)的Novagen)中；在KpPDC和EipdC的情况下，克隆到pJET1.2载体(赛默飞世尔科技公司的CloneJET PCR克隆试剂盒)中；以及在UGT基因的情况下，克隆到pET-28a(+)载体(德国达姆施塔特的Novagen)中。由来自新英格兰生物实验室(美国马萨诸塞州)的大肠杆菌BL21(DE3)基因组DNA扩增aroF^fbr和hpaBC*基因。hpaBC*基因在HpaB亚基的S₂₁₀T、A₂₁₁L和Q₂₁₂E中突变，以改进对酪醇的活性(Chen，2019)。adhP*由IsabelRocha教授团队(葡萄牙米尼奥大学(University of Minho,Portugal))惠赠。

质粒构建和细菌菌株

质粒pET-21a(+)、pET-28a(+)、pACYCDuet和pRSFDuet(德国达姆施塔特的Novagen)用于在T7lac启动子和核糖体结合位点(RBS)的控制下，提供每种蛋白质的单独表达。所有质粒都通过传统的分子生物学技术构建，并且质粒构建的成功通过菌落PCR和用适当的引物对感兴趣的区域进行测序来证实。

大肠杆菌DH5α被用作宿主，用于基因克隆和质粒增殖，而大肠杆菌BL21(DE3)，亲本菌株，被工程化以产生酪醇、红景天苷和羟基酪醇。对于所有菌株，阳性转化体在含有适当的抗生素浓度(100μg/mL的氨苄青霉素、30μg/mL的卡那霉素和34μg/mL的氯霉素)的LB琼脂板中分离，并在37℃下孵育过夜。为了证实转化的成功，将一些转化体菌落在具有适当的抗生素的LB培养基中培养过夜。然后，提取质粒，用适当的限制性酶消化，并且通过在1％(w/v)琼脂糖凝胶中进行消化来证实正确的片段长度。

酪醇质粒和菌株的构建

将具有氨苄青霉素抗性标记的质粒pET-21a(+)(Novagen)用于克隆基因adhP*、aroF^fbr、tyrA^fbr和密码子优化的基因ScARO10*。使用引物对ARO10*_pet_fw/ARO10*_RBS_rev(引物示于表1中)通过PCR扩增优化的苯丙酮酸脱羧酶基因ScARO10*，并且使用引物对pet21a_fw/pet21a_rev通过PCR扩增质粒pET-21a(+)。使用环状聚合酶延伸克隆(CPEC)融合这两个片段(Quan,J.等人，《自然实验手册6(Nat Protoc 6)》，242至251(2011))。然后，使用引物ARO10*_pet_fw和ARO10_hindiii_rev通过PCR扩增该PCR产物，用NdeI和HindIII对该PCR产物进行限制，并且将该PCR产物克隆到同样用这些酶进行限制的质粒pET-21a(+)，得到pET-21a(+)_ScARO10*。使用引物对aroF_fbr_RBS_fw/aroF_D147N_rev和aroF_D147N_fw/aroF_fbr_RBS_rev，通过PCR将具有突变D147N的aroF^fbr的PCR产物扩增成两个片段。使用PCR技术将这两个片段与引物对aroF_fbr_RBS_fw/aroF_fbr_RBS_rev进行融合，并且将其进行限制并且连接到先前构建体的HindIII和NotI限制性位点中，得到pET-21a(+)_ScARO10*_aroF^fbr。从IDT DNA技术公司(美国)订购具有突变M₅₃I和A₃₅₄V的分支酸变位酶或预苯酸脱氢酶基因tyrA^fbr，并且用NotI和XhoI对其进行限制，以便克隆到先前构建体中，得到pET-21a(+)_ScARO10*_aroF^fbr_tyrA^fbr。在用NotI限制质粒pET-21a(+)_ScARO10*_aroF^fbr_tyrA^fbr后，用引物Tyr2_adhp_JO_fw和Tyr2_adhp_JO_rev从由Isabel Rocha教授团队(葡萄牙米尼奥大学)惠赠的质粒pET-28a(+)_adhP*，通过PCR扩增醇脱氢酶基因adhP*，然后使用In-HD克隆加试剂盒(Cloning Plus Kit)(法国宝生物公司(TaKaRa,France))连接扩增的片段和质粒，形成pET-21a(+)_ScARO10*_aroF^fbr_adhP*_tyrA^fbr。

表1.本研究中用于酪醇生产菌株的克隆程序的引物序列(⁺限制性位点加下划线)。缩写：fw–正向和rev–反向。

作为选择，含有卡那霉素抗性基因的质粒pET-28a(+)(Novagen)也用于克隆基因aroF^fbr和tyrA^fbr。为此，使用引物pet21a_fw和pet28a_RBS_rev通过PCR扩增pET-28a(+)质粒，并且使用引物RBS_linker_st7_fw和aroF_fbr_RBS_rev从pET-21a(+)_ScARO10*_aroF^fbr_tyrA^fbr质粒扩增aroF^fbr基因。之后，使用CPEC合并两个片段，得到pET-28a(+)_aroF^fbr。然后，使用引物pet21a_fw和aroF_fbr_RBS_rev通过PCR扩增该质粒，并且使用引物RBS_linker_st7_fw和tyrA_fbr_pet_rev从pET-21a(+)_ScARO10*_aroF^fbr_tyrA^fbr质粒扩增tyrA^fbr基因。最后，使用CPEC策略融合这两个片段，形成pET-28a(+)_aroF^fbr_tyrA^fbr。

此外，由分别来自肠杆菌属(Enterobacter sp.)和巴斯德毕赤酵母(Komagataellaphaffii)的EipdC基因和KpPDC基因编码的两种替代脱羧酶进行测试，而不是ScARO10*。为此，将先前克隆到pJET1.2(赛默飞世尔科技公司)中的合成基因用XbaI和HindIII进行限制，并且将其克隆到同样用这些酶进行限制的质粒pET-21a(+)_ScARO10*_aroF^fbr_tyrA^fbr中，分别得到pET-21a(+)_EipdC_aroF^fbr_tyrA^fbr和pET-21a(+)_KpPDC_aroF^fbr_tyrA^fbr。

本工作中构建和使用的质粒和酪醇生产菌株列于表2中。

表2.本工作中用于酪醇生产或工程化以用于酪醇生产的质粒和菌株。(a)质粒由Isabel Rocha教授团队(葡萄牙米尼奥大学)惠赠。

红景天苷质粒和菌株的构建

质粒pET-28a(+)用于克隆密码子优化的基因AtUGT85A1，其对应于所提出的途径的最后步骤，所述途径在于将酪醇转变为红景天苷。使用引物UGT85a1_ncoi_fw和UGT85A1_bamhi_rev(引物示于表3中)，通过PCR扩增AtUGT85A1基因，该引物具有针对NcoI和BamHI的限制性位点，并且将AtUGT85A1基因克隆到pET-28a(+)中，得到pET-28a(+)_AtUGT85A1。

附加地，为了测试不同的质粒拷贝数，将AtUGT85A1基因分别克隆到具有氯霉素和卡那霉素抗性标记的质粒pACYCDuet和pRSFDuet中。为了构建pACYCDuet_AtUGT85A1和pRSFDuet_AtUGT85A1质粒，用NdeI和XhoI从pET28a(+)_AtUGT85A1质粒中提取AtUGT85A1基因，并且将其分别克隆到同样用这些酶进行消化的pACYCDuet和pRSFDuet中。

此外，为了增加红景天苷的产生，使用PCR技术，用引物pacyc_trc_mc2_fw和pacyc_trc_mc2_rev，将pACYCDuet_AtUGT85A1中的T7lac启动子替换为trc启动子，得到pACYCDuet_trc-promoter_AtUGT85A1。

表3.本工作中用于红景天苷生产菌株的克隆程序的引物序列(⁺限制性位点加下划线)。缩写：fw–正向和rev–反向。

本研究中构建和使用的质粒和红景天苷生产菌株列于表4中。

表4.在本研究中用于红景天苷生产或工程化以用于红景天苷生产的质粒和菌株。

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羟基酪醇质粒和菌株的构建

质粒pET-28a(+)用于克隆在HpaB亚基的S₂₁₀T、A₂₁₁L和Q₂₁₂E中具有突变的hpaBC*基因，该酶负责将酪醇转变为羟基酪醇。Chen及其同事鉴定的这些突变提高了HpaB对酪醇的活性和特异性。使用引物对hpaB_rbs_xbai/hpab_210_2_rev和hpab_210_2_fw/hpac_bamhi_rev，使用大肠杆菌BL21(DE3)的基因组DNA作为模板(引物示于表5中)，通过PCR将hpaBC*基因扩增成两个片段以插入给定的突变。使用PCR技术将这两个片段与引物对hpaB_rbs_xbai/hpac_bamhi_rev进行融合，将其进行限制并且连接到质粒pET-28a(+)的XbaI和BamHI限制性位点中，形成pET-28a(+)_hpaBC*。

另外，为了测试不同质粒拷贝数的影响，将hpaBC*基因分别克隆到具有氯霉素和卡那霉素抗性标记的质粒pACYCDuet和pRSFDuet中。对于这两种情况，hpaBC*基因从pET-28a(+)_hpaBC*质粒中提取，将其进行限制并且连接到每个质粒的NdeI和XhoI限制性位点，得到pACYCDuet_hpaBC*和pRSFDuet_hpaBC*。

表5.本研究中用于羟基酪醇生产菌株的克隆程序的引物序列。缩写：fw–正向和rev–反向。

本工作中构建和使用的质粒和羟基酪醇生产菌株列于表6中。

表6.本研究中用于羟基酪醇生产或工程化以用于羟基酪醇生产的质粒和菌株。

菌株保持和培养培养基

所有菌株均在LB肉汤培养基(10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物、10g/L的NaCl)和M9Y培养基中培养，该M9Y培养基含有1×M9最小盐(8.5g/L的Na₂HPO₄·2H₂O、3.0g/L的KH₂PO₄、0.5g/L的NaCl、1.0g/L的NH₄Cl)和2％(w/v)的葡萄糖，并且补充有0.025％(w/v)的酵母提取物、5mM的MgSO4、0.011g/L的CaCl₂并且补充有适当的抗生素浓度(100μg/mL的氨苄青霉素、30μg/mL的卡那霉素和34μg/mL的氯霉素)。附加地，具有大肠杆菌BL21(DE3)ΔpheALΔfeaB背景的菌株补充有20mg/L的苯丙氨酸。

使用工程化的大肠杆菌菌株的单菌落来接种10ml含有适当抗生素的液体LB培养基，并且使其在37℃下以200rpm搅拌生长过夜。然后，将预培养物转移到具有50mL含有适当抗生素的LB培养基的250mL的摇瓶中，其中初始光密度(OD₆₀₀)为0.1。首先，在200rpm和37℃下，将培养物在旋转振荡器上培养直至细胞密度(OD₆₀₀)达到0.6至0.8。此时，在酪醇和红景天苷的情况下，通过离心(6000rpm，10分钟)收集细胞，将其重悬于50ml具有合适抗生素的M9Y培养基中，并且用最终浓度为0.1或1mM的异丙基1-硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导基因表达。诱导后，在22或30℃和200rpm的搅拌下，将培养物进行孵育。在时间0、诱导时间24、48、72、96和121小时，收集肉汤样品用于HPLC分析和细胞密度测量。对于羟基酪醇，如上所述培养细胞，其中具有一些变化：a)添加1g/L的抗坏血酸；b)在诱导16小时的时候，向生长培养基中添加或不添加12.5ml的1-十二烷醇。这些配方旨在提高羟基酪醇回收率。在时间0、诱导时间24和48，收集肉汤样品用于高效液相色谱(HPLC)分析和细胞密度测量。所有实验一式三份进行，并且样品通过HPLC和核磁共振光谱(NMR)分析。

分析方法

使用HPLC分析发酵培养基中酪醇、红景天苷、羟基酪醇、葡萄糖和有机酸的含量。使用NMR技术来证实培养基样品中存在酪醇、红景天苷和羟基酪醇，并且用于量化双相生长的1-十二烷醇级分中的羟基酪醇。

对于每次取样，从培养物中取出1mL的肉汤并且以15000rpm离心10分钟以从培养基中分离细胞。接着，通过孔径为0.22μm的膜过滤器，将上清液过滤到HPLC小瓶中并且储存在-20℃下直至进一步分析。

酪醇、红景天苷和羟基酪醇浓度通过来自岛津制作所(SHIMADZU)(日本京都(Kyoto,Japan))的配备有同样来自岛津制作所的DAD SPD-M20A检测器的Nexera X2型HPLC设备进行定量。使用来自Phenomenex(美国加利福尼亚(California,USA))的C18柱(150mm×2.1mm；粒度1.7μm)来分析样品。对于酪醇和红景天苷的分析，将5μl发酵上清液样品连同包括溶剂A(0.1％甲酸于H₂O中)和溶剂B(具有0.1％甲酸的乙腈)的流动相施加到柱上。在30℃下，以0.5ml/分钟的流量并且在以下HPLC条件下，洗脱每个样品：将溶剂B浓度维持在5％达1分钟，然后在4分钟内从5％增加至9％，在5分钟内从9％增加至30％后，保持30％达6分钟，最后在2分钟内从30％降低至5％。在280nm处检测化合物。在这些条件下，酪醇和红景天苷的保留时间分别为7分钟和5分钟。为了定量培养基中的酪醇和红景天苷，用一系列已知浓度的溶于水中的酪醇标准品(美国世尔公司(Fisher))和红景天苷标准品(美国西格玛奥瑞奇公司(Sigma-Aldrich))生成校准曲线。校准曲线的R²系数>0.99。对于羟基酪醇的分析，将10μl的发酵上清液样品连同包括溶剂A(0.5％的乙酸于H₂O中)和溶剂B(100％的乙腈)的流动相一起施加到柱上。在30℃下，以0.3ml/分钟的流量并且在以下HPLC条件下，洗脱每个样品：将溶剂B浓度维持在5％达2分钟，然后在2分钟内从5％增加至9％，在6分钟内从9％增加至30％后，然后维持30％达4分钟，最后在2分钟内从30％降低至5％。在280nm处检测羟基酪醇，其中保留时间为8分钟。为了定量培养基中的羟基酪醇，用一系列已知浓度的溶于水中的羟基酪醇标准品(日本TCI)生成校准曲线。校准曲线的R²系数>0.99。

使用来自日本分光株式会社(Jasco)(日本)的配备有同样来自日本分光株式会社的UV-2075Plus和RI-4030Plus检测器的LC-NetII/ADC型的HPLC设备，进行葡萄糖和发酵产物的定量分析。使用来自Bio-Rad(美国)的Aminex HPX-87H柱(300mm×7.7mm)分析样品，该柱保持在60℃，并且使用0.5mM的H₂SO₄作为流动相，其中流量为0.5mL/分钟。用折射率(RI)检测器(4030，日本分光株式会社)检测葡萄糖和乙醇，并且使用UV检测器在210nm处检测有机酸(乙酸盐/酯、甲酸盐/酯、乳酸盐/酯、琥珀酸盐/酯和丙酮酸盐/酯)。通过注射已知浓度的标准品获得每个代谢物的校准曲线。通过将样品的峰面积与校准曲线进行比较，来计算样品中的代谢物浓度。校准曲线的R²系数>0.99。

使用来自布鲁克公司(BRUKER)(美国)的Avance II 400MHz型光谱仪的NMR装置设备，通过质子磁共振波谱(¹H)对双相生长的1-十二烷醇级分中的羟基酪醇进行定量。为此，将300μl的1-十二烷醇级分在300μl的氘代氯仿加5μl的250mM的甲酸溶液(内部标准)中稀释。为了证实酪醇、羟基酪醇和红景天苷的生产，将HPLC中分析的阳性样品迅速转移到具有10％(v/v)的D₂O的NMR管中，并且以上提及的光谱仪中读取。

使用来自赛默飞世尔公司(Thermo Fisher)(美国)的NanoDrop One分光光度计进行所有细胞光密度测量(OD₆₀₀)。

统计分析

所有实验独立地进行三次。实验数据以平均值±标准偏差表示。使用学生t测试进行统计分析。当P值<0.05时，认为工程化的菌株之间的差异是显著的。

序列

蛋白质序列：

表7：蛋白质序列的列表。

基因序列：

表8：基因序列的列表。

/>

启动子序列

表9：启动子序列的列表

类型	序列(SEQ ID NO.)
		T7启动子	taatacgactcactatag(SEQ ID NO.31)
lac启动子	tttacactttatgcttccggctcgtatgttg(SEQ ID NO.32)
		tac启动子	ttgacaattaatcatcggctcgtataatg(SEQ ID NO.33)
trc启动子	Ttgacaattaatcatccggctcgtataatg(SEQ ID NO.34)

实施例

本研究的主要目标是优化大肠杆菌中酪醇及其衍生物生产的生物过程，使其滴度为克/升，因为这些化合物具有高附加值及重要的生物活性和应用。为此，大肠杆菌BL21(DE3)经工程化以通过图1中描绘的途径产生酪醇和红景天苷。

实施例1：酪醇生物合成途径在大肠杆菌BL21(DE3)中的实施

在大肠杆菌BL21(DE3)中实施的酪醇生物合成途径(图1)始于葡萄糖，在几个步骤后葡萄糖转变为4-羟基苯丙酮酸，最后以4-羟基苯丙酮酸通过来自酿酒酵母(ARO10*)的苯丙酮酸脱羧酶和内源醇脱氢酶转变为酪醇结束。首先，选择来自酿酒酵母的基因ARO10*并且将其插入pET-21a(+)中，并且将所得质粒克隆到大肠杆菌BL21(DE3)中以形成菌株ST53。在M9Y培养基中用1mM的iPTG诱导48小时后，菌株ST53产生0.05±0.00g/L的酪醇。该结果证实了ScARO10与内源ADH组合的过表达可以使用葡萄糖作为底物将4-羟基苯丙酮酸转变成酪醇。为了改进酪醇生产，将来自大肠杆菌的磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚糖酸醛缩酶(aroF^fbr)和预苯酸脱氢酶(tyrA^fbr)插入pET-21a(+)或pET-28a(+)中并且在大肠杆菌BL21(DE3)中过表达，分别获得菌株ST93和ST96。构建这两个菌株以了解这三个基因在操纵子样系统中更好地起作用，还是在启动子-基因组织中更好地起作用。在M9Y培养基中用1mM的IPTG诱导48小时后，利用菌株ST93和96，酪醇生产显著增加(p<0.001)，菌株ST93达到0.21±0.01g/L，并且菌株ST96达到0.14±0.00g/L。此外，可以验证酪醇的产生与细胞密度(OD₆₀₀ _nm)负相关，指示酪醇产生影响细胞生长。这些结果还表明在相同载体中ScARO10*的异源表达及aroF^fbr和tyrA^fbr的过表达有利于酪醇生产，这意味着操纵子样系统是表达这些基因的最佳结构。

实施例2：优化IPTG浓度

异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)是有力的T7和trc启动子的有效诱导物，并且通常用于克隆程序中。为了选择诱导酪醇生产菌株的最佳IPTG浓度，在M9Y培养基中用0.1和1mM的IPTG诱导菌株ST93达48小时。在这些条件下，在用0.1和1mM的IPTG诱导后，菌株ST93分别获得0.65±0.07g/L和0.21±0.01g/L的酪醇(表10)。这样，揭示了0.1mM的IPTG是诱导酪醇生产菌株的最佳浓度。

表10.在M9Y培养基中用0.1和1mM的IPTG诱导后，利用菌株ST93获得酪醇滴度(g/L)。生长48小时后，对培养物进行取样用于酪醇检测。实验独立进行三次，并且实验数据以平均值±标准偏差表示。

实施例3：最佳苯丙酮酸脱羧酶的选择

苯丙酮酸脱羧酶是参与艾利希(Ehrlich)途径的酶并且催化苯丙酮酸脱羧为苯乙醛(图2a)。在本研究中，将分别来自酿酒酵母、肠杆菌属和巴斯德毕赤酵母的ScARO10*、EipdC和KpPDC克隆到pET-21a(+)中，并且转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，以便评估哪种脱羧酶是用于酪醇生产的最佳酶。以此方式，分别构建携带ScARO10*、KpPDC和EipdC的菌株ST93、ST135和ST136。这些菌株在具有2％的葡萄糖的M9Y中生长，并且用0.1mM的IPTG诱导72小时。结果示出在M9Y培养基中用0.1mM的iPTG诱导72小时后，菌株ST93产生0.73±0.04g/L的酪醇，菌株ST135可以产生0.31±0.05g/L的酪醇，并且菌株ST136仅产生0.09±0.01g/L的酪醇(图2b)。考虑到这一点，用于酪醇生产的最佳脱羧酶是ARO10*，因为菌株ST93产生的酪醇量比菌株ST135高两倍，并且与菌株ST136相比，产生的酪醇量高八倍。此外，同样，较高量的酪醇(ST93)与较低的细胞密度(OD_600nm)相关(图2b)。

实施例4：adhP*过表达的影响

由Isabel Rocha教授团队惠赠的醇脱氢酶AdhP*可以将4-羟基苯乙醛还原成酪醇，并且被修饰成对于大底物来说更好的性能(图3a)。将adhP*基因克隆到pET-28a(+)或pET-21a(+)中并且转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，分别得到菌株ST81和ST114，以评估adhP*的过表达对酪醇生产的影响。在M9Y培养基中用0.1mM的iPTG诱导48小时后，菌株ST81可以产生0.60±0.18g/L的酪醇，并且菌株ST114可以产生0.51±0.01g/L的酪醇(图3b)。将这些结果与图3b中描绘的在相同条件下由菌株ST93获得的滴度(0.65±0.07g/L)进行比较，可以验证adhP*过表达没有改善酪醇生产(数据未示出)，因为由菌株ST93和ST81获得的滴度没有显著差异(p>0.05)，而与菌株ST93相比，菌株ST114产生显著更少量的酪醇(p<0.01)。

此外，为了测试AdhP*催化的最佳条件，在M9Y培养基中将菌株ST81用0.1mM的iPTG在22℃下诱导48小时。在这些条件下，菌株ST81可以产生0.29±0.02g/L的酪醇(图3b)，其滴度甚至低于在30℃下诱导该菌株时获得的滴度。考虑到所有结果，在30℃下，在M9Y中用0.1mM的iPTG诱导72小时后，产生酪醇的最佳菌株和条件是ST93(0.73±0.04g/L)。

实施例5：工程化芳香族氨基酸途径

如前所述，大肠杆菌中的内源ADH能够将4-羟基苯乙醛还原成酪醇，然而该中间化合物也可以被称为FeaB的内源苯乙醛脱氢酶氧化成4-羟基苯乙酸酯(图4a)。另一方面，双功能酶分支酸变位酶/预苯酸脱水酶(PheA)负责苯丙氨酸和酪氨酸的生物合成中非常重要的节点，并且负责将碳通量从分支酸转向苯丙氨酸(图4a)。因此，已知这两种基因的破坏使碳通量重定向到酪醇生产。为了提高酪醇生产，携带feaB和pheAL基因敲除的大肠杆菌BL21(DE3)菌株(可从SilicoLife的实验室获得)用作pET-21a(+)的宿主，该pET-21a(+)具有ScARO10*、aroF^fbr和tyrA^fbr基因，得到菌株ST191。附加地，本发明人还通过转化pET-21a(+)中的ScARO10*、aroF^fbr和tyrA^fbr基因和pET-28a(+)中的adhP*基因，产生菌株ST170，评估了feaB和pheAL缺失菌株中adhP*的过表达。在使这两种菌株生长后，本发明人推断在M9Y培养基中用0.1mM的IPTG诱导96小时后，ST191产生0.78±0.02g/L的酪醇，而ST170产生1.03±0.07g/L的酪醇(图4b)。注意到生长延长至96小时，因为酪醇生产在生长72小时的时候仍然增加。关于细胞密度(OD₆₀₀ _nm)，可以验证在敲除菌株的情况下，与没有敲除的相应菌株相比生长降低(ST93和81)。超过对酪醇的碳偏差，这种降低可以部分地由通过pheAL敲除引起的苯丙氨酸不足来解释，其引发苯丙氨酸营养缺陷现象。因此，发明人怀疑含有0.025％的酵母提取物的M9Y培养基中苯丙氨酸的量不能覆盖该营养缺陷现象。为了测试该假设，在补充有20mg/L的苯丙氨酸的M9Y培养基中用0.1mM的IPTG将菌株ST170和191诱导96小时。在这些条件下，菌株ST170和191分别生产0.80±0.07g/L和1.41±0.02g/L的酪醇(图4b)。

分析这些结果，可以验证苯丙氨酸的添加显著提高了ST191的酪醇生产(p<0.001)，并且降低ST170的酪醇生产。此外，这些菌株的生长对苯丙氨酸的添加表现不同，与没有苯丙氨酸的生长相比，ST170的参数提高，而在ST191的情况下无反应。总之，在本工作中获得的来自葡萄糖的最佳酪醇滴度是1.41±0.02g/L，其中菌株ST191对应于10mM，并且在M9Y培养基中用0.1mM的IPTG诱导96小时和添加20mg/L的苯丙氨酸后获得。该结果证实了由Yang和他的合作者完成的滴度，其菌株通过工程化具有ScARO10*的异源表达和feaB、pheA、tyrB和tyrR基因的敲除的大肠杆菌MG1655，在M9Y培养基中用0.6mM的IPTG诱导48小时后，由葡萄糖产生1.32g/L酪醇(Yang等人，《中国化学工程杂志(Chinese Journal ofChemical Engineering)》，26，2615至2621)。然而，在该研究中，本发明人用携带ScARO10*、aroF^fbr和tyrA^fbr基因并且缺失feaB和pheAL基因的菌株，生产了比Yang及其团队多6％的酪醇。此外，本发明人验证了与构建的第一菌株(ST53)相比，与pET系统中克隆的操纵子样系统中aroF^fbr和tyrA^fbr的过表达相关联的ScARO10*的异源表达将酪醇生产提高了大约92％。附加地，与没有这些敲除的菌株相比，利用feaB和pheAL基因敲除，酪醇生产提高了大约50％。另一方面，AdhP*过表达没有改善酪醇生产，相反，与如上所讨论的没有该酶的菌株相比，它降低了7％。

红景天苷生产

红景天苷是一种广泛分布于植物界的苯乙醇苷，并且由于其在适应性效应中的重要作用，最近受到越来越多的关注。在过去的十年中，在大肠杆菌中实施了新的代谢工程方式，然而还需要更有效的策略。

实施例6：在大肠杆菌BL21(DE3)中工程化红景天苷生物合成途径

在大肠杆菌BL21(DE3)中创建的红景天苷生物合成途径通过ScARO10*和AtUGT85A1基因的异源表达，以及aroF^fbr和tyrA^fbr基因在不同质粒中的过表达实现。该途径的关键步骤是由尿苷二磷酸依赖性糖基转移酶(UGT85A1)介导的酪醇糖基化为红景天苷。将该基因插入pET-28a(+)并且转化到携带pET-21a(+)_ScARO10*的大肠杆菌BL21(DE3)中和携带pET-21a(+)_ScARO10*_aroF^fbr_tyrA^fbr的大肠杆菌BL21(DE3)中，分别获得菌株ST95和ST92。两种菌株均在具有葡萄糖的M9Y培养基中有氧生长，并且在菌株ST95的M9Y培养基中用1mM的IPTG诱导48小时并且过表达aroF^fbr和tyrA^fbr后，示出的红景天苷和酪醇最大为0.02±0.01g/L，而在相同条件下，菌株ST92可以产生比菌株ST95高10倍的滴度的红景天苷(0.24±0.05g/L的红景天苷和0.13±0.03g/L的酪醇)。该结果支持通过菌株ST93获得的酪醇生产结果，其指示与ScARO10*的异源表达相关联的aroF^fbr和tyrA^fbr的过表达提高了酪醇生产，因此提高了通过UGT85A1的红景天苷生产。

实施例7：用于红景天苷的IPTG测试和培养基优化

为了验证用0.1mM的IPTG诱导是否也是用于红景天苷生产的最佳浓度，在M9Y培养基中用0.1mM的IPTG将菌株ST92诱导48小时。在这些条件下，在M9Y培养基中诱导48小时后，菌株ST92产生0.41±0.07g/L的红景天苷和0.15±0.04g/L的酪醇(表11)。该结果表明，与酪醇生产一样，通过用0.1mM的IPTG代替1mM的IPTG诱导，红景天苷生产显著增强(p<0.001)。

表11.在M9Y培养基中用0.1和1mM的IPTG诱导后，用菌株ST92获得酪醇和红景天苷滴度(g/L)。生长48小时后对培养物进行取样用于酪醇和红景天苷检测。实验独立进行三次，并且实验数据以平均值±标准偏差表示。

然而，菌株ST92代谢在红景天苷生产中表现出瓶颈，因为酪醇在所测试的两种浓度的IPTG中累积。不同的场景可以解释这种累积，诸如：低pH导致的生长停滞、UDP-葡萄糖的发酵代谢缺乏或培养基中耗尽的其它关键营养物的结果；或者酶生产/折叠不当。因此，测试了不同的M9Y培养基组成，以便观察葡萄糖和pH对红景天苷生产的影响。为此，在具有两倍量的盐(2xM9Y)并且补充有5、10或20g/L的葡萄糖的M9Y中，用0.1mM的IPTG诱导菌株ST92达48小时。在此条件下，菌株ST92可以由5g/L的葡萄糖产生0.10±0.00g/L的红景天苷和0.08±0.00g/L的酪醇，由10g/L的葡萄糖产生0.26±0.00g/L的红景天苷和0.12±0.02g/L的酪醇，由20g/L的葡萄糖产生0.34±0.01g/L的红景天苷和0.19±0.00g/L的酪醇(表12)。关于葡萄糖供应，在2xM9Y培养基中添加20g/L的葡萄糖有利于红景天苷生产，尽管在补充有20g/L的葡萄糖的M9Y培养基中获得最佳的红景天苷滴度(0.41±0.07g/L)。该结果指示添加两倍量的盐缓冲M9Y培养基没有改善红景天苷生产。

表12.在M9Y或2xM9Y培养基中用0.1mM的IPTG诱导后，利用菌株ST92获得酪醇和红景天苷滴度(g/L)。生长48小时后对培养物进行取样用于酪醇和红景天苷检测。实验独立进行三次，并且实验数据以平均值±标准偏差表示。

另一方面，在补充有20g/L的葡萄糖的2xM9Y培养基(p<0.01)中，培养基pH变化显著高于补充有5和10g/L的葡萄糖的2xM9Y培养基中的变化。这种pH变化是由乙酸产生引起的，当2xM9Y培养基补充有20g/L的葡萄糖时，乙酸产生更高。此外，补充有20g/L的葡萄糖的M9Y培养基和2xM9Y培养基中的pH变化不是非常显著(p<0.05)。考虑到所有这些因素，红景天苷生产的最佳条件是在补充有20g/L的葡萄糖的M9Y培养基中用0.1mM的IPTG诱导。

实施例8：动态控制AtUGT85A1基因

尽管进行了培养基优化的所有尝试，但红景天苷生产中的瓶颈尚未被克服。因此，实施新的策略，以便理解通过将UGT85A1克隆到不同拷贝数的质粒中改变UGT85A1的表达水平是否会影响红景天苷生产(图5a)。以此方式，将AtUGT85A1克隆到pACYCDuet(低拷贝)或pRSFDuet(高拷贝)质粒中，并且转化到携带pET-21a(+)_ScARO10*_aroF^fbr_tyrA^fbr的大肠杆菌BL21(DE3)中，分别获得菌株ST116和ST131。这些菌株的生长示出ST116的生产值为0.49±0.10g/L的红景天苷和0.39±0.06g/L的酪醇，并且ST131的生产值为0.35±0.06g/L的红景天苷和0.03±0.00g/L的酪醇。用0.1mM的IPTG和M9Y培养基诱导48小时后取样(图5b)。

将这些结果与通过菌株ST92获得的结果(0.41±0.07g/L的红景天苷和0.15±0.04g/L的酪醇)进行比较，可以得出结论，尽管ST92和116不产生显著不同量的红景天苷(p>0.05)，但是菌株ST116以绝对值计累积更多的红景天苷。此外，与ST92相比，ST116中酪醇的累积更高。另一方面，对应于菌株ST131的高拷贝质粒pRSFDuet产生红景天苷的最低值(图5b)。

附加地，可以验证增加质粒拷贝数(pACYCDuet<pET-28a(+)<pRSFDuet)，几乎完全实现了酪醇向红景天苷的转变，然而红景天苷滴度没有提高，指示可能UGT85A1是不溶的。考虑到这一点，为了优化酪醇转变和红景天苷滴度，将pACYCDuet_AtUGT85A1的T7启动子替换为trc启动子，得到菌株ST176。在M9Y培养基中用0.1mM的iPTG诱导48小时后，该菌株可以产生1.64±0.07g/L的红景天苷和仅0.10±0.06g/L的酪醇(图5b)。因此，这些结果揭示了酪醇几乎完全向红景天苷转变，并且在低拷贝数质粒(pACYCDuet)中和在较低强度启动子(trc启动子)的影响下，AtUGT85A1的异源表达提高了红景天苷滴度。

实施例9：feaB和pheAL基因敲除的影响

为了改善向红景天苷的代谢流，发明人设定克隆最好的两个基因组织并且试图改善其生产，将最好的基因组织克隆到携带feaB和pheAL基因敲除的大肠杆菌BL21(DE3)中(图6a)，得到具有pET-21a(+)_ScARO10*_aroF^fbr_tyrA^fbr和pACYCDuet_AtUGT85A1的菌株ST172和具有pET-21a(+)_ScARO10*_aroF^fbr_tyrA^fbr和pACYCDuet_trc-pm_AtUGT85A1的菌株ST178。在M9Y培养基中用0.1mM的IPTG诱导96小时后，菌株ST172可以产生0.59±0.09g/L的红景天苷和0.80±0.08g/L的酪醇，并且菌株ST178可以产生2.70±0.06g/L的红景天苷和0.09±0.02g/L的酪醇(图6b)。

同样，在ST178中，酪醇在很大程度上转变为红景天苷，并且如之前所观察到的，ST172累积了红景天苷连同显著量的酪醇。总之，在低拷贝质粒中并且在较弱启动子的影响下，克隆AtUGT85A1平衡了蛋白质的生产并且显著提高了红景天苷滴度。此外，可以验证，与没有敲除的相应菌株相比，敲除提高了两种菌株中的红景天苷生产。

除此之外，还评估了苯丙氨酸补充对红景天苷生产的影响。为此，在补充有20mg/L的苯丙氨酸的M9Y培养基中，用0.1mM的IPTG将菌株ST172和ST178诱导96小时。在这些条件下，菌株ST172可以产生0.43±0.01g/L的红景天苷和0.90±0.03g/L的酪醇，并且菌株ST178可以产生1.25±0.42g/L的红景天苷和0.40±0.12g/L的酪醇(图6b)。这些结果表明，苯丙氨酸的添加降低了红景天苷生产，与酪醇所发生的相反(数据未示出)。因此，在补充有20g/L的葡萄糖的M9Y培养基中用0.1mM的IPTG诱导121小时后，ST178菌株生产了在本研究中实现的由葡萄糖产生的最佳红景天苷滴度(3.11±0.19g/L的红景天苷)。该结果对应于比Chung及其团队获得的量高大约10倍量的红景天苷，Chung及其团队通过工程化具有PcAAS和AtUGT85A1的异源表达和tyrR、pheA和feaB基因的敲除的大肠杆菌BL21(DE3)，于25℃下在M9Y培养基中用1mM的IPTG诱导48小时后，仅由葡萄糖产生0.28g/L的红景天苷(Chung等人，《大肠杆菌科学报告(Escherichia coli.Scientific Reports)》，7，1至8，(2017))。

羟基酪醇生产

羟基酪醇是橄榄中最丰富的酚醇中的一种，并且具有使其理想地用于营养药、农用化学品、药用化妆品和食品工业中实施的一些独特特征。然而，除了已经完成的所有工作之外，还没有找到成本有效的方式。

实施例10：在大肠杆菌BL21(DE3)中过表达hpaBC*

羟基酪醇生物合成的基本步骤是将酪醇转变为羟基酪醇。为了介导该步骤，文献中描述了几种可能的候选酶。Espín及其团队使用了蘑菇酪氨酸酶，然而该酶是不稳定的并且其活性被酚类和抗坏血酸抑制。Liebgott及其同事进行的另一项研究表明，来自不同细菌的4-羟基苯乙酸3-羟化酶负责将酪醇转变为羟基酪醇。此外，鉴定了一些芳香化合物降解微生物的其它天然水解酶，诸如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、恶臭假单胞菌F6(Pseudomonas putida F6)和盐单胞菌属(Halomonas sp.)菌株HTB24将酪醇转变为羟基酪醇。最近，由大肠杆菌工程化4-羟基苯乙酸酯3-单加氧酶(HpaBC*)，以便提高其对酪醇的活性和特异性。使用这种工程化的酶，它们实现了对酪醇的高活性，并且发现其对酪醇的对接能量比对野生型HpaBC的对接能量低得多。因此，在该研究中，从所有酶中选出HpaBC*，因为它是大肠杆菌的内源酶并且为了以酪醇为底物获得更好的性能而加以工程化。这样，通过ScARO10*基因的异源表达和aroF^fbr、tyrA^fbr和hpaBC*基因的过表达，在大肠杆菌BL21(DE3)中实施羟基酪醇生物合成途径(图7a)。在这一思路中，构建了三个菌株来评估质粒拷贝数在hpaBC*过表达中的影响，因此评估了羟基酪醇生产。所有三种菌株都携带pET-21a(+)_ScARO10*_aroF^fbr_tyrA^fbr，然而hpaBC*被克隆到菌株ST76的pET-28a(+)中、菌株ST119的pACYCDuet中和菌株ST132的pRSFDuet中。然后，将所有菌株在补充有1g/L的抗坏血酸的M9Y培养基中用0.1mM的IPTG诱导48小时，以避免羟基酪醇氧化。在这些条件下，菌株ST76产生0.08±0.02g/L的羟基酪醇，菌株ST119产生0.57±0.06g/L的羟基酪醇，以及菌株ST132产生0.48±0.12g/L的羟基酪醇(图7b)。对于所有菌株，累积了残余量的酪醇(<80mg/L)。这些结果不一致，因为分别具有低拷贝和高拷贝质粒的ST119和132不产生显著不同量的羟基酪醇(p>0.05)。然而，重要的是，注意到ST132中的羟基酪醇生产比菌株ST119和76更无规律，这是质粒不稳定性的指示。另一方面，具有中等拷贝质粒的菌株ST76是产生比其它两种菌株更少的羟基酪醇的菌株。此外，表现较低细胞密度(OD₆₀₀ _nm)的菌株是菌株ST119，它是产生更多羟基酪醇的菌株，如对酪醇和红景天苷所观察到的。并且，羟基酪醇浓度低于1g/L时，对羟基酪醇的毒性尚未报道。另一方面，在该菌株生长期间，发明人注意到培养基变为较暗的颜色，指示包括羟基酪醇的培养基组分的氧化。

实施例11：双相生长的影响

如前所述，羟基酪醇是在其生产期间容易氧化的抗氧化剂，使得该化合物比酪醇或红景天苷更不稳定。除此之外，据报道羟基酪醇高于1g/L示出了对细胞生长的抑制作用。考虑到这一点，本发明人设计了利用1-十二烷醇的双相生长，其可以隔绝羟基酪醇，避免其氧化和细胞毒性。为此，当不再观察到生长时，发明人向培养基中添加25％(v/v)的1-十二烷醇，这发生在蛋白质诱导后16小时。在补充有1g/L的抗坏血酸并且添加12.5ml的1-十二烷醇的M9Y培养基中，用0.1mM的IPTG诱导48小时的时候，检测到最大生产(图8b)。结果示出，菌株ST119和132分别能产生0.92±0.15g/L和0.63±0.06g/L的羟基酪醇，及微量酪醇。通过比较菌株ST119和132在添加或不添加1-十二烷醇的情况下获得的羟基酪醇滴度，可以验证在双相系统中，菌株ST119和132分别使其生产增加超过30％和20％。然而，细胞密度没有提高，示出了生长停滞与羟基酪醇累积无关。这些结果证实了双相系统稳定了羟基酪醇生产，并且揭示了当hpaBC*被克隆到低拷贝质粒(ST119)中时，与菌株ST132中的高拷贝质粒相比，羟基酪醇滴度提高了。

实施例12：IPTG优化

诸如对于酪醇和红景天苷，测试不同的IPTG浓度以评估羟基酪醇生产的最佳诱导条件。在这种情况下，在补充有1g/L的抗坏血酸并且添加12.5ml的1-十二烷醇的M9Y培养基中，用0.1mM和0.2mM的IPTG诱导菌株ST119达48小时。在用0.2mM的IPTG诱导后，菌株ST119产生0.56±0.09g/L的羟基酪醇和微量酪醇，这显著小于当用0.1mM的IPTG诱导菌株ST119时获得的羟基酪醇滴度(0.92±0.15g/L的羟基酪醇)(表13)。此外，尽管羟基酪醇的累积量不同，当用0.1或0.2mM的IPTG诱导细胞时，细胞密度(OD₆₀₀ _nm)不受影响。利用该结果可以实现羟基酪醇生产的最佳条件是在补充有1g/L的抗坏血酸并且添加12.5ml的1-十二烷醇的M9Y培养基中，用0.1mM的IPTG诱导48小时。为了评估其基因在pET系统中过表达的ARO10*、AroF^fbr、TyrA^fbr和HpaBC*蛋白质的溶解度，进行SDS-PAGE凝胶，其示出过量产生的蛋白质大部分是可溶的。

表13.在补充有1g/L的抗坏血酸并且与添加25％(v/v)的1-十二烷醇相关联的M9Y培养基中，用0.1和0.2mM的IPTG诱导后，利用菌株ST119获得酪醇滴度和羟基酪醇滴度(g/L)。生长48小时后，对培养物进行取样用于酪醇和羟基酪醇检测。实验独立进行三次，并且实验数据以平均值±标准偏差表示。

总之，羟基酪醇生产的最佳条件是6mM，并且在补充有1g/L的抗坏血酸和20g/L的葡萄糖并且添加12.5ml的1-十二烷醇的M9Y培养基中，用0.1mM的IPTG诱导48小时后，利用菌株ST119获得。在这些条件下，可以累积0.92±0.15g/L的羟基酪醇，这对应于与没有1-十二烷醇的生产相比增加了大约40％，并且据本发明人所知是所报道的最佳羟基酪醇滴度。然而，与酪醇菌株ST191相比，酪醇转变为羟基酪醇不是非常高效的，因为仅60％的酪醇转变为羟基酪醇。此前曾报道了大肠杆菌中的羟基酪醇生产，通过工程化具有ScARO10基因的异源表达及ADH6、tyrA、ppsA、tktA和aroG基因的过表达并且敲除feaB基因的大肠杆菌BW25113，由葡萄糖得到(0.65g/L的羟基酪醇)。它们通过在37℃下在M9Y培养基中用0.5mM的IPTG诱导细胞来实现这种生产。将该结果与本研究中获得的结果进行比较，Li及其团队生产了少约30％的羟基酪醇，这可以通过使用0.5mM的IPTG代替0.1mM的IPTG、过表达了比我们更多的基因并且仅敲除了feaB基因来解释。

实施例13：利用HT1途径的大肠杆菌中的羟基酪醇生产

表14：示出菌株、培养基组成和各自滴度

表15：菌株描述：

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使细胞在LB培养基中生长2小时，洗涤并且在30℃下重悬于M9Y+2％的葡萄糖+0.1mM的IPTG(常规培养基)中并且孵育72小时。hpaBC的低拷贝数有利于羟基酪醇的累积。十二烷醇的添加使羟基酪醇生产增加了大约40％。两相系统稳定了羟基酪醇生产。pheaL和feaB基因敲除和O₂限制降低了羟基酪醇累积。

序列表

<110> 斯力科生命有限公司

<120> 酪醇和红景天苷的微生物生产

<130> sil102wo

<160> 41

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 635

<212> PRT

<213> 酿酒酵母

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<213> 人工序列

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<223> aroFfbr (D147N)

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catgatgttg ttcatgctat gcaatctatc ttacctccgg tttattcagt tggaccgctt 780

catctcttag caaaccggga gattgaagaa ggtagtgaga ttggaatgat gagttcgaat 840

ttatggaaag aggagatgga gtgtttggat tggcttgata ctaagactca aaatagtgtc 900

atttatatca actttgggag cataacggtt ttgagtgtga agcagcttgt ggagtttgct 960

tggggtttgg cgggaagtgg gaaagagttt ttatgggtga tccggccaga tttagtagcg 1020

ggagaggagg ctatggttcc gccggacttt ttaatggaga ctaaagaccg cagtatgcta 1080

gcgagttggt gtcctcaaga gaaagtactt tctcatcctg ctattggagg gtttttgacg 1140

cattgcgggt ggaactcgat attggaaagt ctttcgtgtg gagttccgat ggtgtgttgg 1200

ccattttttg ctgaccagca aatgaattgt aagttttgtt gtgacgagtg ggatgttggg 1260

attgagatag gtggagatgt gaagagagag gaagttgagg cggtggttag agagctcatg 1320

gatggagaga agggaaagaa aatgagagaa aaggcggtag agtggcagcg cttagccgag 1380

aaagcgacgg aacataaact tggttcttcc gttatgaatt ttgagacggt tgttagcaag 1440

tttcttttgg gacaaaaatc acaggattaa 1470

<210> 8

<211> 1470

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 优化的AtUGT85A1

<400> 8

atgggatcac agatcataca caactcgcag aaaccccatg tggtctgtgt accgtacccc 60

gctcagggcc atattaatcc aatgatgcgt gtcgctaaat tacttcatgc cagagggttt 120

tatgtaacat tcgtcaatac agtgtataat cacaatagat ttcttagaag ccgcgggtcg 180

aatgcgttag acggcctgcc ctccttccgg tttgagtcaa tagccgacgg gttgcctgaa 240

acggatatgg acgccacaca ggacataacg gctctgtgtg agtcgactat gaagaattgt 300

ctggctccct tccgcgagtt gctgcaacgg ataaatgctg gggataacgt acctcctgtt 360

agctgtatag tatccgatgg gtgcatgtcc tttacccttg atgtagcaga ggaacttgga 420

gtgccggaag ttttgttctg gaccactagc gggtgtgcct ttttagcata cctgcacttt 480

tatttattta tagaaaaggg gttgtgtccc ttaaaagacg agtcctattt gacgaaggaa 540

taccttgagg acacggttat agatttcata ccgactatga aaaacgttaa gctgaaggat 600

atacctagct tcatacgcac aactaatccg gatgatgtta tgatctcttt tgccctgcgt 660

gagacagagc gcgctaagcg ggcgtctgcg attatattga acacatttga cgatctggaa 720

cacgatgttg tccacgcaat gcagtccatt cttcctccgg tatattcagt gggacccttg 780

caccttttag cgaaccggga aatcgaagaa ggatctgaaa taggtatgat gtcttccaac 840

ttatggaagg aagaaatgga gtgtcttgac tggttggata caaagacaca aaattccgta 900

atatacataa acttcggcag catcacggtg ttgagcgtaa aacagctggt cgaattcgct 960

tggggtttgg caggttccgg taaggagttc ttgtgggtca taagaccaga cttagtcgcg 1020

ggggaagaag caatggtacc ccccgacttc cttatggaga cgaaagaccg ttccatgttg 1080

gcctcttggt gccctcaaga gaaagtcttg tcacatcccg ctattggagg gttcctgaca 1140

cactgtggtt ggaattcaat tcttgagagc ttatcgtgtg gggtgccaat ggtgtgctgg 1200

ccgttctttg cagatcagca aatgaactgt aagttttgct gcgacgaatg ggatgtaggt 1260

atagagatcg gcggcgacgt taagcgcgag gaggtcgagg cagttgtaag agagctgatg 1320

gacggtgaga aaggcaaaaa aatgagagaa aaagcggtcg agtggcagcg gttggctgag 1380

aaagctacgg aacataaact tggcagtagc gttatgaact ttgaaactgt tgtatcgaaa 1440

tttttgctgg ggcagaaaag ccaggactaa 1470

<210> 9

<211> 1908

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<400> 9

atggcacctg ttacaattga aaagttcgta aatcaagaag aacgacacct tgtttccaac 60

cgatcagcaa caattccgtt tggtgaatac atatttaaaa gattgttgtc catcgatacg 120

aaatcagttt tcggtgttcc tggtgacttc aacttatctc tattagaata tctctattca 180

cctagtgttg aatcagctgg cctaagatgg gtcggcacgt gtaatgaact gaacgccgct 240

tatgcggccg acggatattc ccgttactct aataagattg gctgtttaat aaccacgtat 300

ggcgttggtg aattaagcgc cttgaacggt atagccggtt cgttcgctga aaatgtcaaa 360

gttttgcaca ttgttggtgt ggccaagtcc atagattcgc gttcaagtaa ctttagtgat 420

cggaacctac atcatttggt cccacagcta catgattcaa attttaaagg gccaaatcat 480

aaagtatatc atgatatggt aaaagataga gtcgcttgct cggtagccta cttggaggat 540

attgaaactg catgtgacca agtcgataat gttatccgcg atatttacaa gtattctaaa 600

cctggttata tttttgttcc tgcagatttt gcggatatgt ctgttacatg tgataatttg 660

gttaatgttc cacgtatatc tcaacaagat tgtatagtat acccttctga aaaccaattg 720

tctgacataa tcaacaagat tactagttgg atatattcca gtaaaacacc tgcgatcctt 780

ggagacgtac tgactgatag gtatggtgtg agtaactttt tgaacaagct tatctgcaaa 840

actgggattt ggaatttttc cactgttatg ggaaaatctg taattgatga gtcaaaccca 900

acttatatgg gtcaatataa tggtaaagaa ggtttaaaac aagtctatga acattttgaa 960

ctgtgcgact tggtcttgca ttttggagtc gacatcaatg aaattaataa tgggcattat 1020

acttttactt ataaaccaaa tgctaaaatc attcaatttc atccgaatta tattcgcctt 1080

gtggacacta ggcagggcaa tgagcaaatg ttcaaaggaa tcaattttgc ccctatttta 1140

aaagaactat acaagcgcat tgacgtttct aaactttctt tgcaatatga ttcaaatgta 1200

actcaatata cgaacgaaac aatgcggtta gaagatccta ccaatggaca atcaagcatt 1260

attacacaag ttcacttaca aaagacgatg cctaaatttt tgaaccctgg tgatgttgtc 1320

gtttgtgaaa caggctcttt tcaattctct gttcgtgatt tcgcgtttcc ttcgcaatta 1380

aaatatatat cgcaaggatt tttcctttcc attggcatgg cccttcctgc cgccctaggt 1440

gttggaattg ccatgcaaga ccactcaaac gctcacatca atggtggcaa cgtaaaagag 1500

gactataagc caagattaat tttgtttgaa ggtgacggtg cagcacagat gacaatccaa 1560

gaactgagca ccattctgaa gtgcaatatt ccactagaag ttatcatttg gaacaataac 1620

ggctacacta ttgaaagagc catcatgggc cctaccaggt cgtataacga cgttatgtct 1680

tggaaatgga ccaaactatt tgaagcattc ggagacttcg acggaaagta tactaatagc 1740

actctcattc aatgtccctc taaattagca ctgaaattgg aggagcttaa gaattcaaac 1800

aaaagaagcg ggatagaact tttagaagtc aaattaggcg aattggattt ccccgaacag 1860

ctaaagtgca tggttgaagc agcggcactt aaaagaaata aaaaatag 1908

<210> 10

<211> 1917

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 优化的ScARO10*

<400> 10

atggctccgg ttaccatcga aaaattcgtt aaccaggaag aacgtcacct ggtttctaac 60

cgttctgcta ccatcccgtt cggtgaatac atcttcaaac gtctgctgtc tatcgacacc 120

aaatctgttt tcggtgttcc gggtgacttc aacctgtctc tgctggaata cctgtactct 180

ccgtctgttg aatctgctgg tctgcgttgg gttggtacct gcaacgaact gaacgctgct 240

tacgctgctg acggttactc tcgttactct aacaaaatcg gttgcctgat caccacctac 300

ggtgttggtg aactgtctgc tctgaacggt atcgctggtt ctttcgctga aaacgttaaa 360

gttctgcaca tcgttggtgt tgctaaatct atcgactctc gttcttctaa cttctctgac 420

cgtaacctgc accacctggt tccgcagctg cacgactcta acttcaaagg tccgaaccac 480

aaagtttacc acgacatggt taaagaccgt gttgcttgct ctgttgctta cctggaagac 540

atcgaaaccg cttgcgacca ggttgacaac gttatccgtg acatctacaa atactctaaa 600

ccgggttaca tcttcgttcc ggctgacttc gctgacatgt ctgttacctg cgacaacctg 660

gttaacgttc cgcgtatctc tcagcaggac tgcatcgttt acccgtctga aaaccagctg 720

tctgacatca tcaacaaaat cacctcttgg atctactctt ctaaaacccc ggctatcctg 780

ggtgacgttt taaccgaccg ttacggtgta agcaacttcc tgaacaaact gatctgcaaa 840

accggtatct ggaacttctc taccgttatg ggtaaatctg ttatcgacga atctaacccg 900

acctacatgg gtcagtacaa cggtaaagaa ggtctgaaac aggtttacga acacttcgaa 960

ctgtgcgacc tggttctgca cttcggtgtt gacatcaacg aaatcaacaa cggtcactac 1020

accttcacct acaaaccgaa cgctaaaatc atccagttcc acccgaacta catccgtctg 1080

gttgacaccc gtcagggtaa cgaacagatg ttcaaaggta tcaacttcgc tccgatcctg 1140

aaagaactgt acaaacgtat cgacgtttct aaactgtctc tgcagtacga ctctaacgtt 1200

acccagtaca ccaacgaaac catgcgtctg gaagacccga ccaacggtca gtcttctatc 1260

atcacccagg ttcacctgca gaaaaccatg ccgaaattcc tgaacccggg tgacgttgtt 1320

gtttgcgaaa ccggttcttt ccagttctct gttcgtgact tcgctttccc gtctcagctg 1380

aaatacatct ctcagggttt cttcctgtct atcggtatgg ctctgccggc tgctctgggt 1440

gttggtatcg ctatgcagga ccactctaac gctcacatca acggtggtaa cgttaaagaa 1500

gactacaaac cgcgtctgat cctgttcgaa ggtgacggtg ctgctcagat gaccatccag 1560

gaactgtcta ccatcctgaa atgcaacatc ccgctggaag ttatcatctg gaacaacaac 1620

ggttacacca tcgaacgtgc tatcatgggt ccgacccgtt cttacaacga cgttatgtct 1680

tggaaatgga ccaaactgtt cgaagcgttc ggtgacttcg acggtaaata caccaactct 1740

accctgatcc agtgcccgtc taaactggct ctgaaactgg aagaactgaa aaactctaac 1800

aaacgttctg gtatcgaact gctggaagtt aaactgggtg aactggactt cccggaacag 1860

ctgaaatgca tggttgaagc tgctgctctg aaacgtaaca aaaaataaaa gctttaa 1917

<210> 11

<211> 1122

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 11

atggttgctg aattgaccgc attacgcgat caaattgatg aagtcgataa agcgctgctg 60

aatttattag cgaagcgtct ggaactggtt gctgaagtgg gcgaggtgaa aagccgcttt 120

ggactgccta tttatgttcc ggagcgcgag gcatctatgt tggcctcgcg tcgtgcagag 180

gcggaagctc tgggtgtacc gccagatctg attgaggatg ttttgcgtcg ggtgatgcgt 240

gaatcttact ccagtgaaaa cgacaaagga tttaaaacac tttgtccgtc actgcgtccg 300

gtggttatcg tcggcggtgg cggtcagatg ggacgcctgt tcgagaagat gctgaccctc 360

tcgggttatc aggtgcggat tctggagcaa catgactggg atcgagcggc tgatattgtt 420

gccgatgccg gaatggtgat tgttagtgtg ccaatccacg ttactgagca agttattggc 480

aaattaccgc ctttaccgaa agattgtatt ctggtcgatc tggcatcagt gaaaaatggg 540

ccattacagg ccatgctggt ggcgcatgat ggtccggtgc tggggctaca cccgatgttc 600

ggtccggaca gcggtagcct ggcaaagcaa gttgtggtct ggtgtgatgg acgtaaaccg 660

gaagcatacc aatggtttct ggagcaaatt caggtctggg gcgctcggct gcatcgtatt 720

agcgccgtcg agcacgatca gaatatggcg tttattcagg cactgcgcca ctttgctact 780

tttgcttacg ggctgcacct ggcagaagaa aatgttcagc ttgagcaact tctggcgctc 840

tcttcgccga tttaccgcct tgagctggcg atggtcgggc gactgtttgc tcaggatccg 900

cagctttatg ccgacatcat tatgtcgtca gagcgtaatc tggcgttaat caaacgttac 960

tataagcgtt tcggcgaggc gattgagttg ctggagcagg gcgataagca ggcgtttatt 1020

gacagtttcc gcaaggtgga gcactggttc ggcgattacg cacagcgttt tcagagtgaa 1080

agccgcgtgt tattgcgtca ggcgaatgac aatcgccagt aa 1122

<210> 12

<211> 1122

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> tyrA^fbr (M53I和A354V)

<400> 12

atggttgctg aattgaccgc attacgcgat caaattgatg aagtcgataa agcgctgctg 60

aatttattag cgaagcgtct ggaactggtt gctgaagtgg gcgaggtgaa aagccgcttt 120

ggactgccta tttatgttcc ggagcgcgag gcatctatct tggcctcgcg tcgtgcagag 180

gcggaagctc tgggtgtacc gccagatctg attgaggatg ttttgcgtcg ggtgatgcgt 240

gaatcttact ccagtgaaaa cgacaaagga tttaaaacac tttgtccgtc actgcgtccg 300

gtggttatcg tcggcggtgg cggtcagatg ggacgcctgt tcgagaagat gctgaccctc 360

tcgggttatc aggtgcggat tctggagcaa catgactggg atcgagcggc tgatattgtt 420

gccgatgccg gaatggtgat tgttagtgtg ccaatccacg ttactgagca agttattggc 480

aaattaccgc ctttaccgaa agattgtatt ctggtcgatc tggcatcagt gaaaaatggg 540

ccattacagg ccatgctggt ggcgcatgat ggtccggtgc tggggctaca cccgatgttc 600

ggtccggaca gcggtagcct ggcaaagcaa gttgtggtct ggtgtgatgg acgtaaaccg 660

gaagcatacc aatggtttct ggagcaaatt caggtctggg gcgctcggct gcatcgtatt 720

agcgccgtcg agcacgatca gaatatggcg tttattcagg cactgcgcca ctttgctact 780

tttgcttacg ggctgcacct ggcagaagaa aatgttcagc ttgagcaact tctggcgctc 840

tcttcgccga tttaccgcct tgagctggcg atggtcgggc gactgtttgc tcaggatccg 900

cagctttatg ccgacatcat tatgtcgtca gagcgtaatc tggcgttaat caaacgttac 960

tataagcgtt tcggcgaggc gattgagttg ctggagcagg gcgataagca ggcgtttatt 1020

gacagtttcc gcaaggtgga gcactggttc ggcgattacg tacagcgttt tcagagtgaa 1080

agccgcgtgt tattgcgtca ggcgaatgac aatcgccagt aa 1122

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 13

ctcgagcacc accaccac 18

<210> 14

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 14

actttaagaa ggagatatac atatggctcc ggttaccatc g 41

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 15

ctcgagcacc accaccac 18

<210> 16

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 16

aacaaaatta tttctattag gtaccttatt ttttgttacg tttcagagca g 51

<210> 17

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 17

cccaagcttt tattttttgt tacgtttcag agcag 35

<210> 18

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 18

gtttaacttt ataaggagga aaaaaaatgc aaaaagacgc gctga 45

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 19

cggaagcgtt aaatccgaat ag 22

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 20

ctattcggat ttaacgcttc cg 22

<210> 21

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 21

aacaaaatta tttctattag gtaccttaag ccacgcgagc cgtc 44

<210> 22

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 22

gtggcttaag cggcctaata cgactcacta taggggaatt 40

<210> 23

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 23

tttctattag cggccgaatt cttagtgacg gaaatcaatc 40

<210> 24

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 24

aacaaaatta tttctattag gtaccgggga attgttatcc gctc 44

<210> 25

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 25

ggtacctaat agaaataatt ttgtttaact ttataaggag gaaaaaaa 48

<210> 26

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 26

cagtggtggt ggtggtggtg ctcgagttac tggcgattgt cattcg 46

<210> 27

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 27

cccccatggg atcacagatc atacac 26

<210> 28

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 28

ccggatcctt agtcctggct tttc 24

<210> 29

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 29

ttgacaatta atcatccggc tcgtataatg ggaattgtga gcggataaca attc 54

<210> 30

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 30

cattatacga gccggatgat taattgtcaa gcaggagtcg cataagggag agc 53

<210> 31

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 启动子

<400> 31

taatacgact cactatag 18

<210> 32

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 启动子

<400> 32

tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt g 31

<210> 33

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 启动子

<400> 33

ttgacaatta atcatcggct cgtataatg 29

<210> 34

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 启动子

<400> 34

ttgacaatta atcatccggc tcgtataatg 30

<210> 35

<211> 520

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 35

Met Lys Pro Glu Asp Phe Arg Ala Ser Thr Gln Arg Pro Phe Thr Gly

1 5 10 15

Glu Glu Tyr Leu Lys Ser Leu Gln Asp Gly Arg Glu Ile Tyr Ile Tyr

20 25 30

Gly Glu Arg Val Lys Asp Val Thr Thr His Pro Ala Phe Arg Asn Ala

35 40 45

Ala Ala Ser Val Ala Gln Leu Tyr Asp Ala Leu His Lys Pro Glu Met

50 55 60

Gln Asp Ser Leu Cys Trp Asn Thr Asp Thr Gly Ser Gly Gly Tyr Thr

65 70 75 80

His Lys Phe Phe Arg Val Ala Lys Ser Ala Asp Asp Leu Arg Gln Gln

85 90 95

Arg Asp Ala Ile Ala Glu Trp Ser Arg Leu Ser Tyr Gly Trp Met Gly

100 105 110

Arg Thr Pro Asp Tyr Lys Ala Ala Phe Gly Cys Ala Leu Gly Ala Asn

115 120 125

Pro Gly Phe Tyr Gly Gln Phe Glu Gln Asn Ala Arg Asn Trp Tyr Thr

130 135 140

Arg Ile Gln Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Asn His Ala Ile Val Asn Pro

145 150 155 160

Pro Ile Asp Arg His Leu Pro Thr Asp Lys Val Lys Asp Val Tyr Ile

165 170 175

Lys Leu Glu Lys Glu Thr Asp Ala Gly Ile Ile Val Ser Gly Ala Lys

180 185 190

Val Val Ala Thr Asn Ser Ala Leu Thr His Tyr Asn Met Ile Gly Phe

195 200 205

Gly Thr Leu Glu Val Met Gly Glu Asn Pro Asp Phe Ala Leu Met Phe

210 215 220

Val Ala Pro Met Asp Ala Asp Gly Val Lys Leu Ile Ser Arg Ala Ser

225 230 235 240

Tyr Glu Met Val Ala Gly Ala Thr Gly Ser Pro Tyr Asp Tyr Pro Leu

245 250 255

Ser Ser Arg Phe Asp Glu Asn Asp Ala Ile Leu Val Met Asp Asn Val

260 265 270

Leu Ile Pro Trp Glu Asn Val Leu Ile Tyr Arg Asp Phe Asp Arg Cys

275 280 285

Arg Arg Trp Thr Met Glu Gly Gly Phe Ala Arg Met Tyr Pro Leu Gln

290 295 300

Ala Cys Val Arg Leu Ala Val Lys Leu Asp Phe Ile Thr Ala Leu Leu

305 310 315 320

Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr Gly Thr Leu Glu Phe Arg Gly Val Gln

325 330 335

Ala Asp Leu Gly Glu Val Val Ala Trp Arg Asn Thr Phe Trp Ala Leu

340 345 350

Ser Asp Ser Met Cys Ser Glu Ala Thr Pro Trp Val Asn Gly Ala Tyr

355 360 365

Leu Pro Asp His Ala Ala Leu Gln Thr Tyr Arg Val Leu Ala Pro Met

370 375 380

Ala Tyr Ala Lys Ile Lys Asn Ile Ile Glu Arg Asn Val Thr Ser Gly

385 390 395 400

Leu Ile Tyr Leu Pro Ser Ser Ala Arg Asp Leu Asn Asn Pro Gln Ile

405 410 415

Asp Gln Tyr Leu Ala Lys Tyr Val Arg Gly Ser Asn Gly Met Asp His

420 425 430

Val Gln Arg Ile Lys Ile Leu Lys Leu Met Trp Asp Ala Ile Gly Ser

435 440 445

Glu Phe Gly Gly Arg His Glu Leu Tyr Glu Ile Asn Tyr Ser Gly Ser

450 455 460

Gln Asp Glu Ile Arg Leu Gln Cys Leu Arg Gln Ala Gln Asn Ser Gly

465 470 475 480

Asn Met Asp Lys Met Met Ala Met Val Asp Arg Cys Leu Ser Glu Tyr

485 490 495

Asp Gln Asp Gly Trp Thr Val Pro His Leu His Asn Asn Asp Asp Ile

500 505 510

Asn Met Leu Asp Lys Leu Leu Lys

515 520

<210> 36

<211> 1563

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 36

atgaaaccag aagatttccg cgccagtacc caacgtcctt tcaccgggga agagtatctg 60

aaaagcctgc aggatggtcg cgagatctat atctatggcg agcgagtgaa agacgtcacc 120

actcatccgg catttcgtaa tgcggcagcg tctgttgccc agctgtacga cgcactgcac 180

aaaccggaga tgcaggactc tctgtgttgg aacaccgaca ccggcagcgg cggctatacc 240

cataaattct tccgcgtggc gaaaagtgcc gacgacctgc gccagcaacg cgacgccatc 300

gctgagtggt cacgcctgag ctatggctgg atgggccgta ccccagacta caaagccgct 360

ttcggttgcg cactgggcgc gaatccgggc ttttacggtc agttcgagca gaacgcccgt 420

aactggtaca cccgtattca ggaaactggc ctctacttta accacgcgat tgttaaccca 480

ccgatcgatc gtcatttgcc gaccgataaa gtgaaagacg tttacatcaa gctggaaaaa 540

gagactgacg ccgggattat cgtcagcggt gcgaaagtgg ttgccaccaa ctcggcgctg 600

actcactaca acatgattgg cttcggctcg gcacaagtga tgggcgaaaa cccggacttc 660

gcactgatgt tcgttgcgcc aatggatgcc gatggcgtga aattaatctc ccgcgcctct 720

tatgagatgg tcgcgggtgc taccggctcg ccatacgact acccgctctc cagccgcttc 780

gatgagaacg atgcgattct ggtgatggat aacgtgctga ttccatggga aaacgtgctg 840

atctaccgcg attttgatcg ctgccgtcgc tggacgatgg aaggcggttt tgcccgtatg 900

tatccgctgc aagcctgtgt gcgcctggca gtgaaattag acttcattac ggcactgctg 960

aaaaaatcac tcgaatgtac cggcaccctg gagttccgtg gtgtgcaggc cgatctcggt 1020

gaagtggtag cgtggcgcaa caccttctgg gcattgagtg actcgatgtg ttcagaagca 1080

acgccgtggg tcaacggggc ttatttaccg gatcatgccg cactgcaaac ctatcgcgta 1140

ctggcaccaa tggcctacgc gaagatcaaa aacattatcg aacgcaacgt taccagtggc 1200

ctgatctatc tcccttccag tgcccgtgac ctgaataatc cgcagatcga ccagtatctg 1260

gcgaagtatg tgcgcggttc gaacggtatg gatcacgtcc agcgcatcaa gatcctcaaa 1320

ctgatgtggg atgctattgg cagcgaattt ggtggtcgtc acgaactgta tgaaatcaac 1380

tactccggta gccaggatga gattcgcctg cagtgtctgc gccaggcaca aaactccggc 1440

aatatggaca agatgatggc gatggttgat cgctgcctgt cggaatacga ccaggacggc 1500

tggactgtgc cgcacctgca caacaacgac gatatcaaca tgctggataa gctgctgaaa 1560

taa 1563

<210> 37

<211> 1563

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 37

atgaaaccag aagatttccg cgccagtacc caacgtcctt tcaccgggga agagtatctg 60

aaaagcctgc aggatggtcg cgagatctat atctatggcg agcgagtgaa agacgtcacc 120

actcatccgg catttcgtaa tgcggcagcg tctgttgccc agctgtacga cgcactgcac 180

aaaccggaga tgcaggactc tctgtgttgg aacaccgaca ccggcagcgg cggctatacc 240

cataaattct tccgcgtggc gaaaagtgcc gacgacctgc gccagcaacg cgacgccatc 300

gctgagtggt cacgcctgag ctatggctgg atgggccgta ccccagacta caaagccgct 360

ttcggttgcg cactgggcgc gaatccgggc ttttacggtc agttcgagca gaacgcccgt 420

aactggtaca cccgtattca ggaaactggc ctctacttta accacgcgat tgttaaccca 480

ccgatcgatc gtcatttgcc gaccgataaa gtgaaagacg tttacatcaa gctggaaaaa 540

gagactgacg ccgggattat cgtcagcggt gcgaaagtgg ttgccaccaa ctcggcgctg 600

actcactaca acatgattgg cttcggcacc ctggaagtga tgggcgaaaa cccggacttc 660

gcactgatgt tcgttgcgcc aatggatgcc gatggcgtga aattaatctc ccgcgcctct 720

tatgagatgg tcgcgggtgc taccggctcg ccatacgact acccgctctc cagccgcttc 780

gatgagaacg atgcgattct ggtgatggat aacgtgctga ttccatggga aaacgtgctg 840

atctaccgcg attttgatcg ctgccgtcgc tggacgatgg aaggcggttt tgcccgtatg 900

tatccgctgc aagcctgtgt gcgcctggca gtgaaattag acttcattac ggcactgctg 960

aaaaaatcac tcgaatgtac cggcaccctg gagttccgtg gtgtgcaggc cgatctcggt 1020

gaagtggtag cgtggcgcaa caccttctgg gcattgagtg actcgatgtg ttcagaagca 1080

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ctggcaccaa tggcctacgc gaagatcaaa aacattatcg aacgcaacgt taccagtggc 1200

ctgatctatc tcccttccag tgcccgtgac ctgaataatc cgcagatcga ccagtatctg 1260

gcgaagtatg tgcgcggttc gaacggtatg gatcacgtcc agcgcatcaa gatcctcaaa 1320

ctgatgtggg atgctattgg cagcgaattt ggtggtcgtc acgaactgta tgaaatcaac 1380

tactccggta gccaggatga gattcgcctg cagtgtctgc gccaggcaca aaactccggc 1440

aatatggaca agatgatggc gatggttgat cgctgcctgt cggaatacga ccaggacggc 1500

tggactgtgc cgcacctgca caacaacgac gatatcaaca tgctggataa gctgctgaaa 1560

taa 1563

<210> 38

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 38

cctctagatt aactttaaga aggagtatac atatgaaacc agaagatttc cgc 53

<210> 39

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 39

cggcaccctg gaagtgatgg gcgaaaaccc ggac 34

<210> 40

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 40

catcacttcc agggtgccga agccaatcat gttgtag 37

<210> 41

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 41

ccggatcctt aaatcgcagc ttccatttcc ag 32

Claims

1.一种生产酪醇的方法，其中在培养基中生长转基因细菌细胞，所述转基因细菌细胞异源性表达：

a.苯丙酮酸脱羧酶(ARO10)，

并且过表达以下中的每一种：

b.磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚糖酸醛缩酶(aroF)，

c.预苯酸脱氢酶(tyrA)，

并且其中以下基因中的每一种皆不表达：

i.pheAL(双功能分支酸变位酶/预苯酸脱水酶)，

ii.feaB(苯乙醛脱氢酶)，

所述培养基包括

·磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和赤藓糖4-磷酸(E4P)的代谢前体，特别是其中所述代谢前体是葡萄糖，以及

·任选地，作为补充物的苯丙氨酸；

并且从所述培养基中提取酪醇。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述转基因细菌细胞属于埃希氏杆菌属，特别是其中所述转基因细菌细胞属于大肠杆菌种，更特别是其中所述转基因细菌细胞属于大肠杆菌BL21菌株。

3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中编码所述苯丙酮酸脱羧酶的基因源自酵母，特别是源自酿酒酵母。

4.一种生产红景天苷的方法，其中

-根据前述权利要求中任一项所规定的转基因细菌细胞附加地异源性表达尿苷二磷酸依赖性糖基转移酶(UGT85A1)，并且

-所述细胞在培养基中生长，所述培养基包括

o任选地，作为补充物的苯丙氨酸；

-并且从所述培养基中提取红景天苷。

5.根据权利要求0所述的方法，其中编码尿苷二磷酸依赖性糖基转移酶的基因源自植物，特别是源自拟南芥属，更特别是源自拟南芥。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述转基因细菌细胞不过表达以下蛋白质中的任一种：

-醇脱氢酶，

-DNA-结合转录调节蛋白(tyrR)，及

-酪氨酸转氨酶。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述转基因细菌细胞的唯一异源性表达的基因是

i)其中所述方法涉及酪醇的生产，所述细胞中的唯一异源性表达的基因是苯丙酮酸脱羧酶；

ii)其中所述方法涉及红景天苷的生产，所述细胞中的唯一异源性表达的基因是苯丙酮酸脱羧酶和尿苷二磷酸依赖性糖基转移酶。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中经由一种或几种质粒载体将所述过表达的基因和转基因引入转基因细菌细胞，特别是其中

苯丙酮酸脱羧酶、磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚糖酸醛缩酶和预苯酸脱氢酶由中等拷贝质粒载体编码，和/或

尿苷二磷酸依赖性糖基转移酶由低拷贝质粒载体编码。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述转基因细菌细胞包括一种或多种质粒，所述一种或多种质粒在所述细胞中可操作的启动子序列，特别是T7启动子(SEQ IDNO.31)、lac启动子(SEQ ID NO.32)、tac启动子(SEQ ID NO.33)或trc启动子(SEQ IDNO.34)的控制下，编码所述异源性表达或过表达的酶，更特别是其中

-编码苯丙酮酸脱羧酶的所述基因在T7启动子的控制下，和/或

-编码预苯酸脱氢酶的所述基因在T7启动子的控制下。

10.根据权利要求9所述的方法，其中通过添加异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)，特别是以约0.1mM的IPTG的浓度，来诱导所述异源和/或过表达的基因的表达96小时。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述培养基包括10至50g/L的葡萄糖，特别是15至30g/L的葡萄糖。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述转基因是密码子优化的，用于在所述转基因细菌细胞中表达。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述培养基包括：

-5至10g/L的Na₂HPO₄·2H₂O，

-2至4g/L的KH₂PO₄，

-0.25至1g/L的NaCl，

-0.5至1.5g/L的NH₄Cl，

-1％至3％(w/v)的葡萄糖，

-0.01％至0.05％(w/v)的酵母提取物，

-3至7mM的MgSO₄，

-0.005至0.02g/L的CaCl₂

以及

-抗生素，

-特别是其中所述抗生素是50至200μg/mL的氨苄青霉素、10至50μg/mL的卡那霉素和25至45μg/mL的氯霉素。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中

a.所述苯丙酮酸脱羧酶与SEQ ID NO 1具有至少60％、65％、70％、75％、80％、特别地85％、更特别地90％、甚至更特别地95％或还甚至更特别地>95％的序列同一性，并且其中所述苯丙酮酸脱羧酶具有SEQ ID NO 1的活性的至少75％的催化活性，和/或

b.所述磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚糖酸醛缩酶与SEQ ID NO 2具有至少60％、65％、70％、75％、80％、特别地85％、更特别地90％、甚至更特别地95％或还甚至更特别地>95％的序列同一性，并且其中所述磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚糖酸醛缩酶具有SEQ ID NO 2的活性的至少75％的催化活性，和/或

c.所述预苯酸脱氢酶与SEQ ID NO 3具有至少60％、65％、70％、75％、80％、特别地85％、更特别地90％、甚至更特别地95％或还甚至更特别地>95％的序列同一性，并且其中所述预苯酸脱氢酶具有SEQ ID NO 3的活性的至少75％的催化活性，和/或

d.所述尿苷二磷酸依赖性糖基转移酶与SEQ ID NO 4具有至少60％、65％、70％、75％、特别地85％、更特别地90％、甚至更特别地95％或还甚至更特别地>95％的序列同一性，并且其中所述尿苷二磷酸依赖性糖基转移酶具有SEQ ID NO 4的活性的至少75％的催化活性。

15.一种根据前述权利要求中任一项所规定的转基因细胞。