DE2109854A1 - Cephalosporin-Derivate - Google Patents
Cephalosporin-DerivateInfo
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- DE2109854A1 DE2109854A1 DE19712109854 DE2109854A DE2109854A1 DE 2109854 A1 DE2109854 A1 DE 2109854A1 DE 19712109854 DE19712109854 DE 19712109854 DE 2109854 A DE2109854 A DE 2109854A DE 2109854 A1 DE2109854 A1 DE 2109854A1
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Description
Die Erfindung umfasst 7ß-(D-5~Amino-5-carboxyvaleramido.)~
7-meth.o3cy-3-cep]ieia-4-carbonsäuren, die in der J-Stellung
des "Cephem"-Kerns durch eine Vielzahl von Alkyl-, Halogenalky
I- oder Sauerstoff-, Schwefel- und Stickstoff-haltige
Substituenten substituiert sind, und deren Salze, Ester und Amid-Lerivate. Bestimmte dieser Produkte werden durch
Fermentation erhalten und andere werden auf synthetischem Weg erhalten. Die Produkte sind wirksam gegen gram^negative
und gram/poeitive Bakterien.
Die Erfindung betrifft eine neue Klasse antibiotischer Substanzen und ein Verfahren zu deren Herstellung. Insbesondere
sind diese neuen Antibiotika Produkte vom Cephalosporintyp, die einen Methoxy-Substituenten in der
7-Stellung des "Cephean-Kerns enthalten. Sie sind strukturell
mit der Cephalosporin-Reihe von Verbindungen verwandt,
jedoch anders als Cephalosporin C, das lediglich eine D-^-Amino^-carboxyvaleramido-Einheit in der 7-Stellung
enthält, enthalten die vorliegenden Produkte auch
— Λ —
109839/1836
einen 7-Methoxy-Substituenten} und während Cephalosporin C
durch Acetoxymethyl in der ^-Stellung des Rings substituiert
ist, können die Produkte der Erfindung ausser Acetoxymethyl eine grosse Vielzahl anderer Substituenten
aufweisen. Beispiele dieser Substituenten sind Methyl-, Halogenmethyl-, Hydroxymethyl-Substituenten, ein Acyloxymethyl-Anteil
der aliphatischen, acyclischen und aromatischen Arten, Carbamoyloxymethyl-, N-substituierte und
N,N-disubstituierte Carbamoyloxymethyl-, Alkylthiomethyl-Substituenten,
heterocyclisch-substituierte Thiomethyl-, {Drialkylammoniummethyl-, Pyridiniummethyl-Substituenten,
kernsubstituierte Pyridiniummethyl-, Thiouroniummethyl-,
Amidinothiomethyl-Substituenten, in denen die beiden Stickstoffatome mit 1 bis 5 Alkylresten substituiert sein
können, Aminothiocarbonylthiomethyl-Substituenten, II-substituierte
Aminothiocarbonylthiomethyl-, Aroylthiomethyl-}
Oxythiocarbonylthio-methyl-, Alkarylsulfonylmethyl-,
Azidomethyl-, Aminomethyl-, Amidomethyl-, PoIyhydroxybenzyl-,
N-niedrig-Alkyl-indol-3-ylmethyl- und
©liocyanatomethyl-Substituenten. Diese Produkte können v;ie
folgt wiedergegeben werden;
Q OCH
I t
HOOO-CH-(CH2) -C-HH-^^
worin E ein Wasserstoffatom, einen Halogenrest, beispielsweise
Chlor, Brom, Pluor oder Jod und dgl., einen Hydroxyrest,
Acyloxyrest, z. B. einen niederen Alkanoyloxyrest, wie beispielsweise Acetoxy-, n-Propionyloxyaeest und dgl.,
109839/ 1836
einen mononuklearen und binuklearen aromatischen Carbonyloxyrest, beispielsweise Benzoyloxy-, Naphthoyloxyrest und
dgl., heterocyclischen Carbonyloxyrest, worin der Heterocyclus
ein 6-gliedriger stickstoffhaltiger Heterocyclus ist j wie beispielsweise 4-Pyridylrest und dgl., Aralkanoyloxyrest,
wie beispielsweise Phenacetyloxy-, 3-^enylpropionyloxy-,
2-Naphthylacetoxyrest oder Hydrocinamoyloxyrest und dgl., Cycloalkancarbonyloxyrest mit 5 bis 6 Ringkohlenstoff
atomen, beispielsweise Cyclopentancarbonyloxyrest oder Cyclohexancarbonyloxyrest und dgl., oc-Methoxypj-sulfooxycinnamoyloxy-
oder oc-Methoxy-p-hydroxycinnamoyloxyrest
und dgl., einen Carbamoyloxyrest der Formel: -00CIiR1R2, worin R1 und R2 Wasserstoff atome, niedere Alkylreste,
beispielsweise Methyl-, Äthyl-, n-Propyl-, tert.-Butylreste
und dgl., Halogen-niedrig-alkylreste, wie beispielsweise Chlormethyl-, 2-Chloräthyi- oder Chlor-tert.-butylreste
und dgl., niedere Alkoxycarbonylreste, wie beispielsweise Äthoxycarbonylreste und dgl., Arylreste, beispielsweise
mononukleare und binukleare Arylreste, wie beispielsweise Phenyl-, Naphthylreste und dgl., Alkarylsulfonylreste,
beispielsweise mononukleare Alkarylsulfonylreste, wie beispielsweise p-3?olylsulfonylreste und dgl.,
und Benzhydrylreste bedeuten oder H und R zusammen mit
dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, unter Bildung eines mononuklearen Heterocyclus, wie beispielsweise Pyrrolidinyl-,
Piperidino- oder Morpholinoring, verbunden sein können; einen Thiorest der !Formel* -SR^, worin R^ einen
niederen Alkylrest, beispielsweise einen Methyl-, Äthyl-, n-Propylrest und dgl., einen stickstoffhaltigen Heterocyclus,
wie beispielsweise Pyridylrest, z« B. 2-, 3- oder
4-Pyridylrest, einen niederen alkylsubstituierten Ihiazolylrest,
wie beispielsweise 4-Methylthiazol-2-yl- oder 4-Äthylthiazol-2-ylrest und dgl., 1,3,4-0}hiadiazol-2-ylrest,
einen niedrig-alkylsubstituierten Ijjj^-Thiadiazol-2-ylrest,
wie beispielsweise 5-Methyl-1,3,^t-thiadiazol-2-
1098 3 9/1836
ylrest und dgl., 2-Benzothiazolylrest, einen 4—niedrig-Alkylpyrimidinylrest,
wie beispielsweise 4-Methylpyrimidin-2-ylrest
bedeutet; einen Ammoniumrest, beispielsweise einen Tri-niedrig-alkylammoniumrest, wie beispielsweise Trimethylammoniumrest
oder Triäthylammoniumrest und dgl., oder einen Pyridiniumrest der Formel:
worin X ein Wasserstoffatom, einen Halogen-, Trifluormethyl-,
Cyano-, Carboxy-, Carbamoyl-, N-niedrig-Alkyl- und N,N-Di-niedrig-alkylsubstituierten Carbamoylrest, wie
beispielsweise N-Methylcarbamoyl-, N-Äthylcarbamoyl-, N,N-Dimethylcarbamoyl-,
Ν,Ν-Diäthylcarbamoyl- oder N,N-Diisopropylcarbamoylpest,
Carboxymethylrest, niedrig-Alkanoylrest, wie beispielsweise Acetyl- oder Propionylrest und
dgl., niederen Alkylrest, beispielsweise Methyl-, Äthyloder n-Propylrest und dgl., Hydroxymethylrest oder SuIforest,
d. h. -SCUCOH) bedeutet; einen Thiouroniumrest der
Formel: -.v
NH2
einen Amidinothiorest der Formel: -S-
4· 5 6
worin E , E^ und E , die gleich oder verschieden sein können, Wasserstoffatome oder niedere Alkylreste, wie beispielsweise Methyl-, Äthyl-, n-Propylreste und dgl, bedeuten; einen Aminothiocarbonylthiorest der Formel:
worin E , E^ und E , die gleich oder verschieden sein können, Wasserstoffatome oder niedere Alkylreste, wie beispielsweise Methyl-, Äthyl-, n-Propylreste und dgl, bedeuten; einen Aminothiocarbonylthiorest der Formel:
.7*8
-SCBE
_ /j. _
_ /j. _
109839/1836
7 ·8
worin R' und R , die gleich oder verschieden sein können, Wasserstoffatome, niedere Alkylreste, z. B. Methyl-, Äthyl-, n-Propylreste und dgl., Hydroxy-niedrig-alkylreste, beispielsweise 2-Hydroxyäthylrest und dgl., Di-niedrig-alkylamino-niedrig-alkylreste,wie beispielsweise 2-(Dimethylamino)-äthyl-, 2-(Mäthylamino)-äthyl-, 2-(Di-n-propylamino)-äthyl~ oder 5-(Diäthylamino)-propylres"te und dgl., morpholinosubstituierte. niedrige Alkylreste, z. B. 2-Morpholinoäthylrest und dgl., N-Aryl-N-niedrig-alkylaminoalkylrest, beispielsweise 2-(N-Phenyl-IT-methylamino)-äthylrest bedeuten oder die Reste R' und R zusammengenommen mit dem Stickstoffatom, an das sie gefunden sind, unter Bildung eines Morpholine-, Piperidino-, Pyrrolidinyl- oder Piperazinorestes der Pormel:
worin R' und R , die gleich oder verschieden sein können, Wasserstoffatome, niedere Alkylreste, z. B. Methyl-, Äthyl-, n-Propylreste und dgl., Hydroxy-niedrig-alkylreste, beispielsweise 2-Hydroxyäthylrest und dgl., Di-niedrig-alkylamino-niedrig-alkylreste,wie beispielsweise 2-(Dimethylamino)-äthyl-, 2-(Mäthylamino)-äthyl-, 2-(Di-n-propylamino)-äthyl~ oder 5-(Diäthylamino)-propylres"te und dgl., morpholinosubstituierte. niedrige Alkylreste, z. B. 2-Morpholinoäthylrest und dgl., N-Aryl-N-niedrig-alkylaminoalkylrest, beispielsweise 2-(N-Phenyl-IT-methylamino)-äthylrest bedeuten oder die Reste R' und R zusammengenommen mit dem Stickstoffatom, an das sie gefunden sind, unter Bildung eines Morpholine-, Piperidino-, Pyrrolidinyl- oder Piperazinorestes der Pormel:
worin R^ einen Alkylrest, beispielsweise einen Methyl-,
Äthyl-, n-Propyl-, Isopropyl-, n-Butyl-, Amyl-, n-Octyl-,
Decylrest und dgl., oder einen Phenylrest bedeutet, verbunden sein können; einen Aroylthiorest, beispielsweise
einen mononuklearen Aroylthiorest, z. B. einen Benzoylthiorest; einen Oxythiocarbonylthiorest der Pormeli
ΊΟ
worin E einen niederen Alkylrest, beispielsweise einen Äthyl-, n-Propyl-, Isopropyl-, n-Butyl-, n-Hexylrest und dgl., oder einen niederen Cycloalkylrest, d. h. einen Cycloalkylrest mit 5 bis 6 Ringkohlenstoffatomen, wie beispielsweise Cyclopentyl- und Cyclohexylrest; Alkarylsulfo-
worin E einen niederen Alkylrest, beispielsweise einen Äthyl-, n-Propyl-, Isopropyl-, n-Butyl-, n-Hexylrest und dgl., oder einen niederen Cycloalkylrest, d. h. einen Cycloalkylrest mit 5 bis 6 Ringkohlenstoffatomen, wie beispielsweise Cyclopentyl- und Cyclohexylrest; Alkarylsulfo-
— 5 — 109839/ 1836
nylrest, beispielsweise einen mononuklearen Alkarylsulfonylrest,
z. B. p-Iolylsulfonylrest und dgl.} einen Azidorest;
einen Aminorest, einen Amidorest der Formel:
-HHR11 ,
worin R einen Acylrest, beispielsweise einen niederen
Alkanoylrest, wie beispielsweise Acetyl- oder Propionylrest oder Aralkanoylrest, z. B. einen mononuklearen Aralkanoylrest,
wie beispielsweise 2-Phenylacetylrest und
dgl.; einen Polyhydroxyphenylrest, z. B. Dib.ydroxyph.enylrest,
wie beispielsweise 2,4-Dihydroxyphenylrest oder einen
N-niedrig-Alkylindol-5-ylrest, z. B. N-Methylindol-3-ylrest
und dgl., oder einen Thiocyanatorest bedeutet. Ferner Bind die pharmakologisch verträglichen Salze Ester und
Amide der vorliegenden Produkte umfasst. Dazug gehören organische und anorganische Salze, z. B. Säureadditionssalze,
Metallsalze, quaternäre Salze und Aminsalze, die sich von tertiären organischen stickstoffhaltigen Basen
ableiten. Zu geeigneten Ester- und Amid-Berivaten gehören die Mono- und Di-ester, s. B. solche, die sich von Alkanolen,
Cycloalkanolen, aromatischen Alkoholen und Aralkanolen
ableiten und Mono- und Di-amide, die sich beispielsweise von Ammoniak, niederen Alky!aminen, Di-niedrig-alkylaminen,
Aralkylaminen und heterocyclischen Aminen ableiten. Beispiele dieser Derivate und Verfahren zu ihrer Herstellung
sind in dem mit synthetischen Methoden bezeichneten Unterabschnitt aufgeführt.
Antibiotikum 81QA: Im wesentlichen umfassen die Produkte
der vorstehenden Formel I zwei Gruppen von Fermentationsprodukten. Eine dieser Gruppen besteht aus einem Gemisch
von Verbindungen, woraus zwei deutliche Produkte isoliert und identifiziert worden sind. Diese beiden Produkte sind
durch das Vorhandensein einer a-Methoxy-p-sulfooxycinn-
- 6 109839/1836
H5O5 210985<
amoyloxy- oder einer α-Methoxy-p-hydroxycinnamoyloxy-Einheit
in der 3-Stellung des Cephem-Kerns gekennzeichnet und entsprechen der folgenden Strukturformel:
HOOC-CH-(CH2), NH2
Ia
1?
worin R einen Hydroxy- oder SuIfooxyrest, d. h. -OSO,H bedeutet. Diese Produkte werden durch Kultivierung eines neuen Stamms von Actinomycete, bezeichnet als MA-2837, der Kulturensammlung von Merck & Co., Inc., Rahway, New Jersey, unter geregelten Bedingungen gleichzeitig erzeugt. Eine Probe dieser Kultur wurde auch auch zur dauernden Niederlegung in die Kulturensammlung der Northern Utilization Research and Development Branch of the U. S. Department of Agriculture in Peoria, Illinois, gebracht, und erhielt die Kultur-Nummer NRRL 3851. 25 andere Kulturen' wurden gleichfalls als Erzeuger dieses Antibiotikumgemischs (Ia) identifiziert, und diese zusammen mit der Kultur MA-2837 werden im folgenden in dem mit die Microorganismen bezeichneten Abschnitt beschrieben. Im folgenden wird das Antibiotikümgemisch (Ia), das diese beiden Produkte aufweist, als Antibiotikum 810A oder einfach mit 810A bezeichnet.
worin R einen Hydroxy- oder SuIfooxyrest, d. h. -OSO,H bedeutet. Diese Produkte werden durch Kultivierung eines neuen Stamms von Actinomycete, bezeichnet als MA-2837, der Kulturensammlung von Merck & Co., Inc., Rahway, New Jersey, unter geregelten Bedingungen gleichzeitig erzeugt. Eine Probe dieser Kultur wurde auch auch zur dauernden Niederlegung in die Kulturensammlung der Northern Utilization Research and Development Branch of the U. S. Department of Agriculture in Peoria, Illinois, gebracht, und erhielt die Kultur-Nummer NRRL 3851. 25 andere Kulturen' wurden gleichfalls als Erzeuger dieses Antibiotikumgemischs (Ia) identifiziert, und diese zusammen mit der Kultur MA-2837 werden im folgenden in dem mit die Microorganismen bezeichneten Abschnitt beschrieben. Im folgenden wird das Antibiotikümgemisch (Ia), das diese beiden Produkte aufweist, als Antibiotikum 810A oder einfach mit 810A bezeichnet.
Antibiotikum 84-2A; Die zweite Gruppe der Fermentationsprodukte umfasst 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
(folgende Formel (Ib)) und deren Salze. Diese Verbindung
— 7 —
109839/1836
14305
weist folgende Strukturformel auf:
HH,
OCH
COOH
Dieses Produkt (Ib) wird auch durch einen neuen Stamm von Actinomycete erzeugt, und eine Probe dieses Mikroorganismus,
bezeichnet mit MA-2908, wurde in der Kulturensammlung von Merck & Co., Inc., Rahway, New «Jersey, aufgenommen. Eine
Probe dieser Kultur wurde auch zur dauernden Hinterlegung bei der Kulturensammlung der Northern Utilization Research
and Development Branch of the U.S. Department of Agriculture in Peoria, Illinois, gebracht. Diese Kultur erhielt
die Kultur-Nummer NERL 3802. Zusätzlich zu seiner antibiotischen Wirksamkeit ist dieses Produkt (Ib) auch ein Zwischenprodukt
bei der Herstellung der entsprechenden 3-Hydroxy-, 3-Acyloxy- und Carbamoyloxy-Derivate. Das Verfahren
zur Herstellung dieser Derivate ist in dem mit synthetische . Methoden bezeichneten Unterabschnitt beschrieben.
In der folgenden Beschreibung wird das Produkt Ib, d. h. 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4--carbonsäure
als Antibiotikum 842A oder einfach mit 84-2A bezeichnet.
Eine HauptSchwierigkeit bei der antimikrobiellen Therapie
ist die Empfindlichkeit der meisten Antibiotika gegenüber enzymatischem Abbau. Beispielsweise ist Penicillin G wirk-
10SG3G/1836
sam gegen eine grosse Vielzahl gram .positiver und gramnegativer
Mikroorganismen, jedoch wird es in Gegenwart von Penicillinase zu einer Form abgebaut, die gegenüber den
meisten Pathogenen unwirksam ist.
Ein Versuch zur Bewältigung dieses Problems bestand in der Entwicklung neuer Antibiotika, welche die "Cephem"-Kerneigenschaft
von Cephalosporin C aufweisen. Cephalosporin C besitzt eine ihm eigene Beständigkeit gegenüber Penicillinase
und ist wirksam sowohl gegen gram^-tiegative als auch
grammpositive Bakterien; jedoch ist es nur massig wirksam,
und es gibt andere Enzyme als Penicillinase, welche seine Wirksamkeit zerstören. Diese Enzyme werden mit Cephalosporinasen
bezeichnet. Die erfindungsgemässen Produkte (I) liefern nicht nur Beständigkeit gegenüber Penicillinase,
sondern gleichfalls gegenüber den Cephalosporinsen. Sie
liefern Wirksamkeit sowohl gegen gram/negative als auch gram/positive Bakterien, jedoch ist das Ausmass der Aktivität
und der Bereich von Organismen, gegen die sie wirksam sind, nicht identisch.
Antibiotikum 842A ist durch eine gesteigerte Wirksamkeit
gegenüber granL-negativen Mikroorganismen gekennzeichnet.
Anders als Cephalosporin C, das eine relativ geringe antibakterielle Wirksamkeit besitzt, übt dieses Produkt einen
erheblichen gramxnegativen Effekt in vivo mit einer Wirksamkeit
aus, die im allgemeinen grosser als Cephalothin ist. Zu dieser Wirksamkeit gehören die Wirksamkeit in vivo
gegenüber Proteus morganii und eine Wirksamkeit gegenüber den folgenden gram/negativen Bakterien: Escherichia coli,
Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Proteus morganii, Salmonella schottmuelleri, Klebsiella pneumoniae AD,
Klebsieila pneumoniae B und Paracolobactrum arizoniae.
Antibiotikum 8A-2A stellt eine bevorzugte Ausfuhrungsform der
— Q _ 109839/1836
Erfindung dar. Ausser einer allgemein gesteigerten grains ·
negativen Wirksamkeit und einer erhöhten Wirksamkeit im Vergleich zu Cephalothin und einer grösseren Beständigkeit
gegenüber Cephalosporinasen zeichnet sich 842A durch ein geringeres Ausmass an Toxizität aus und erzeugt rasche
Werte im Blut. Innerhalb von 6 Stunden nach Verabreichung sind etwa 100 % im Urin beseitigt. Ferner ist es beständiger
gegenüber enzymatischem Abbau als Cephalosporin C und Resistenz gegenüber diesem Antibiotikum entwickelt sich
langsam, und es wirkt bakterizid. Bei oraler Verabreichung schützt es gegen Infektionen auf Grund von Paracolobactrum
arizoniae 3270, Proteus vulgaris 1810 und Salmonella
schottmuelleri 3010; und bei subkutaner Verabreichung ist
as 2- bis 10mal wirksamer als Cephalothin gegenüber den
gleichen Infektionen.
Antibiotikum 810A ist ein Mttel mit breitem Wirkungsspektrum,
das eine etwa ausgeglichene gramxnegative und graia.-positive
Wirksamkeit entfaltet. Dazu gehören die Wirksamkeit in vivo gegenüber den folgenden gram/negativen Organismen:
Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Salmonella pullorum, Escherichia coli und Xlebsialla pneumoniae und
in vivo Wirksamkeit gegen die folgenden gram-rpositiven
Organismen: Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes und Diplococcus pneumoniae.
Von· den verschiedenen Produkten, die das Antibiotikum 810A
ausmachen, stellt die 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(
a-methoxy-p-sul f ooxy-cinnamoy loxym ethyl)-7-m e thoxy-3-cephem-4~carbonsäure-Art
entsprechend der obigen Formel Ia, worin E einen Sulfooxyrest bedeutet und deren Salze, wie
beispielsweise das liatriumsalz, eine bevorzugte Ausführungsform
der Erfindung dar. Dieses Produkt besitzt folgende Strukturformel:
- 10 10983 9/1836
O NH0 O1
Ii I 2 fl
HOC-Ch-CH2-CH2-CH2-C-HH-
OCH
Ic
Diese Verbindung besitzt eine grössere Beständigkeit gegenüber Cephalosporinasen als Cephalothin und ist durch ein
geringeres Ausmass an Toxizitat bei Mäusen gekennzeichnet.
Ferner ist es beständiger gegenüber enzymatischem Abbau als Cephalosporin C und es wirkt bakterizid. Bei oraler
Verabreichung schützt es gegen Infektionen auf Grund von Proteus vulgaris und bei subkutaner Verabreichung ist es
wirksam gegenüber einer Vielzahl von gram/negativen und gram./positiven Infektionen.
810A Kulturen: Der Mikroorganismus, welcher das Antibiotikum
810A erzeugt-, wurde ursprünglich als Einzelkolonie aus Boden isoliert. Diese Kolonie wurde auf eine Strichplatte
der folgenden Zusammensetzung gegeben:
Medium A: | 10,0 g |
Hefeextrakt | 10,0 g |
Dextrose | 20,0 g |
Agar | 1000,0 ml |
Destilliertes Wasser | |
Nach mehrtägigem Wachstum erzeugte der Mikroorganismus das Antibiotikum 810A. Dieses Antibiotikum wurde dann in
Schüttelkolben reproduziert und von bekannten Antibiotika
- 11 109833/1836
auf Grund verschiedener biologischer und chemischer Untersuchungen
differenziert. Ein Vergleich dieser Daten mit denjenigen, die über andere bekannte Antibiotika erhalten
wurden, lieferte die Peststellung, das 810A eine neue Einheit ist.
810A Taxonoinie und Morphologie: Der Mikroorganismus (Kultur
MA-2837)» welcher das Antibiotikum 810A produziert,
wurde als Streptomyces griseus identifiziert. Die zu dieser Bestimmung verwendete Taxonomie ist in "Bergey's Manual of
Determinative Bacteriology", 7· Ausgabe und in "The Actinomycetes",
Band 2, von S. A. Waksman (1961 ) beschrieben. Unter Verwendung diese Verfahrens wurde festgestellt, dass
die Kultur aus einem Stamm von Streptomyces griseus besteht, der hinsichtlich der Beschreibung, der Melanin-Erzeugung
und des Kohlenstoff -Verbrauchs, dem Streptomyces griseinus sehr stark gleicht, wie in International Journal
fo Systemic Bacteriology" 7· Ausgabe (1957) beschrieben, da die Gruppe von Streptomyces griseus-Kulturen 1959» zwei
Jahre nach Veröffentlichung der Ausgabe, geteilt wurde. Jedoch sowohl in Waksman als auch in "International Journal
of Systemic Bacteriology" wird Streptomyces griseinus als "grisein-erzeugender Stamm von Streptomyces griseus" oder
als "grisein-erzeugende oder grisein-ähnliche Substanz"
definiert. Streptomyces griseus (MA-28J7) ist ein Stamm, der
sich von der klassischen Beschreibung in Bergey und in Waksman insofern unterscheidet, als er ein Luftmycel besitzt,
das vorwiegend braungelb und auf einigen Medien grüngelb mit einem etwas·abweichenden Kohlenstoffverbrauchsmuster
ist. Waksman beschreibt auf Seite 111 und 1JJ von
"The Actinomycetes" diese Streptomyces griseus-Reihe als
eine Eeihe, Vielehe viele verwandte Species und Stämme umfasst, was sich durch farbloses bis oliv-sandfarbenes Substratwachstum,
Luftmycel, das gelblich mit einer grünlichen Färbung oder grünlich-grau oder gelb-verbrannt oder gras-
- 12 1098 3 9/1836
grün bis grau ist, Melanin negativ ist, gerade oder biegsame
und in Büscheln erzeugte Sphorophore und ovale Sporen kennzeichnet. Die folgenden Tabellen vergleichen die Eigenschaften
der das Antibiotikum 810A erzeugenden Kultur mit den Streptomyces griseus und Streptomyces griseinus-Kulturen.
Die Charakterisierung des Ausgangsisolats MA-2837 im Vergleich
mit in Bergey und Waksman beschriebenem Streptomyces
griseus und auch die Charakterisierung von MA-2837
im Vergleich mit dem in Waksman beschriebenem Streptomyc
griseinus sind in den Tabelle I und Ia aufgeführt.
- 13 -109839/1836
Vergleich der Kultureigenschaften von MA-2837 Kultur
to co
ω
to
MA-2837
Sporophoren sind monopodial
verzweigt unter Bildung von Büscheln, mit geraden "bis etwas
gebogenen Sporenketten. Sporen: kugelförmig bis oval, Durchmesser 0,9 ja
bis 0,9 χ 1,2ja in Ketten von etwa 1Ό - 15
Sporen. Vegetative
Hyphen von 0,9 M Breite (Glyc erin-Asparaginagar-9702)
Sporen. Vegetative
Hyphen von 0,9 M Breite (Glyc erin-Asparaginagar-9702)
Streptomyces * griseus (Bergey )
Streptomyces 2 griseus (Waksman )
. Luftmycel: Reichlich,
pulverförmig, wassergrün. Sporophore erzeugt in Büscheln. Sporen kugelförmig bis
ellipsoid, 0,8 χ 0,8 bis 1»7/u. Vegetatives
Wachstum: Kolonien glatt oder gefältelt, farblos, später nach oliv bis sandfarben übergehend
Gerade in Büscheln zeugte Sphorphore. Sporen kugelförmig bis oval, 0,8 χ 0,8
bis 1,7/i "
glatt '
er-
Oberfläche
Streptomyces griseinus (Waksman^)
Gerade Sporophore erzeugt in Klumpen oder Büscheln ohne Spiralen.
Sporen stabförmig, 1,0 bis 1,8 χ 0,8 bis 1,0 μ
Bergey's "Manual of Determinative Bacteriology", 7· Ausgabe (1957)
Waksman, S.A., "The Actinomycetes", Band 2 (1961)
(JD OO
Tabelle la'
Vergleich der Kultureigensciiaften von MA-2857 Kultur
Medium
MA-2837
S. griseus
(Bergey)
(Bergey)
S. griseus
(Waksman)
(Waksman)
Tomatenpaste Hafermehl-Agar
CO
OO
to
Glyc erin-Asparaginagar
Czapek-Doxagar
(Sacharosenitrat·
agar)
(Sacharosenitrat·
agar)
Vegetatives Wachstum: Rückseite braun, eben, sich verbreitend,
Luftmycel: Mitte gelbbraun bis graugelb
Kante bräunlich-gelb
Lösliches Pigment: gelbbraun
Vegetatives Wachstum: Rückseite gelbbraun, eben, sich verbreitend,
Luftmycel: pulverförmig, gelbbraun bis gelb
Lösliches Pigment: hell, gelbbraun-gelblieh
Vegetatives Wachstum: Rückseite gelblichorange, eben, sich verbreitend,
Luftmycel: pulverförmig gelbbraun bis gelb (verschiedene
Schattierungen, jedoch vorwiegend Rand gelbbraun-gelblich) leichtes
Wachstum im Mittelpunkt und stärkeres an den Rändern,
Lösliches Pigment: hell, Selbbraun-gelblich
vn
S. griseinus (Waksman)
O CD OO
Wachstum spärlich, sich verbreitend, farblos, wird οIivbis
sandfarben,
Luftmycel dick,
pulverförmig,
Wasser grün,
Pigment unlöslich
Luftmycel dick,
pulverförmig,
Wasser grün,
Pigment unlöslich
Sub stratwachstum faltig, Rückseite ererne-färben bis r
bräunlich, Luftmycel: weiss bis
creme-färb en mijb hellgrün-Ii chCTj^
Stich, Kein !etliches "Pt o-mf»n-h —
OO
cn
!Tabelle Ia (Fortsetzung)
Medium
MA-2837
OD
CO
OJ
CD
^ I
CO ι
Bahragar
Agar
S. griseus
(Bergey)
(Bergey)
S. griseus
(Waksman)
(Waksman)
S. griseinus (Waksman)
Ei alb uminagar
Vegetatives Wachstum: Eückseite gräulich
gelbbraun, eben, sich ausbreitend
Luftmycel: Gelbbraun bis gelblich mit grünlicher Schattierung, Rand gelbbraun gelblich, geringes Wachstum im Mittelpunkt, stärkeres Wachstum längs der Bänder
Luftmycel: Gelbbraun bis gelblich mit grünlicher Schattierung, Rand gelbbraun gelblich, geringes Wachstum im Mittelpunkt, stärkeres Wachstum längs der Bänder
Lösliches Pigment: hell gelbbraun gelblich
Vegetatives Wachstum: Eückseite bräunlichgelb Luftmycel: Samtig, gelbbraungelb,
Eand gelbbraun gelb
Lösliches Pigment: hell braun
reichliches,
cremefarbenes fast
transparentes Wachstum,
cremefarbenes fast
transparentes Wachstum,
Luftmycel pulverförmig,
weiss bis hellgrau,
kein lösliches Pigment
weiss bis hellgrau,
kein lösliches Pigment
Wachstum reichlich, fast transparent, creme-färben.
Luftmycel pulverförmig, weiss bis hellgrau, kein lösliches Pigment
Luftmycel pulverförmig, weiss bis hellgrau, kein lösliches Pigment
O CD OO CJl
Tabelle la (Fortsetzung)
Medium
MA-2837
Syntheti scher
Agar
Agar
Gelatine-Ansatz
ITährgelatine-
agar
Lackmusmilch
S. griseus (Bergey)
S. griseus
(Waksman)
(Waksman)
S. griseinus (Waksman)
Spärliches sich ausbreitendes farbloses Wachstum, das oliv bis sandfarben wird
Luftmycel: dick, pulverförmig, wassergrün
Flockiges creme-färbenes
Wachstum setzt sich am Boden des Eohrs ab. Vollkommene Verflüssigung
Vegetativ Wachstum:
creme-färb en
Luftmycel: blass, gelbbraun gelb
Lösliches Pigment: keines
Luftmycel: blass, gelbbraun gelb
Lösliches Pigment: keines
Verflüssigung der Gelatine : gut
Teilweiser Hing, Vegetatives Wachstum:
bräunlich
Luftmycel: gering, weiss-Ii ch
Peptonisierung wird alkalisch
Grünlich gelbes
oder creme-farbenes Oberflächenwachstum mit bräunlichem Stich. Easche Verflüssigung
oder creme-farbenes Oberflächenwachstum mit bräunlichem Stich. Easche Verflüssigung
Wachstum cremefarben mit bräunlichem Stich -Luftmycel: fehlt oder spärlich,
weiss.
Easche Verflüssigung
Creme-färb ener
Eing, Koagulierung mit rascher
Peptonisierung,
wird alkalisch
Eing, Koagulierung mit rascher
Peptonisierung,
wird alkalisch
Wachstum cremefarben.
Coagulierung und Peptonisierung
Tabelle la (Fortsetzung)
Medium
MÄ.-2837
S. griseus
(Bergey)
(Bergey)
S. griseus
(Waksman)
(Waksman)
S. griseinus
(Waksman)
Entrahmte Mich
Magermi 1 chagar
Glucοse-agar
Glueoseflüssigkeit
3?eilweiser Hing Vegetatives Wachstum:
Bräunlich
Luftmycel: keines Loslich.es Pigment:
hellbraun
Peptonisierung wird
alkalisch
Vegetatives Wachstum: ererne-färben, eben,
sich ausbreitend Luftmycel: spärlich, gelblichweiss bis cremefarben
Lösliches Pigment: sehr hellbraun Hydrolyse von Casein
Im Mittelpunkt verstärktes Wachstum
s trahlenförmig ?
creme-farben bis
orange, Rand gezackt
s trahlenförmig ?
creme-farben bis
orange, Rand gezackt
ReichliciLe, gelbliche Haut mit
grünlichem Stich.,
stark gefältelt
grünlichem Stich.,
stark gefältelt
{Tabelle Ia (Fortsetzung)
Medium
MA-2837
Stärke-Agar
Nährstärkeagar
VJD
Kartoffelsclmitt
Vegetatives Wachstum: creme-färben
Luftmyc el: "bla s s gelbbraun
gelb Lösliches Pigment: keines
Hydrolyse gut
Hydrolyse gut
Vegetatives Wachstum:
hellbraun
Luftmycel: massig,
braungelb
leichtes Bräunlichwer-
de/n der Kartoffel
S. griseus
(Bergey)
(Bergey)
S. griseus
(Waksman)
(Waksman)
Dünnes» sich aus- Dünnes Wachstum,
breitendes trans- sich ausbreitend,
parentes Wachstum, transparent,
Stärke ist hydro- starke Hydrolyse
lysiert
lysiert
Gelbliches, gefal- Bunzliges faltitetes
Wachstum? ges Wachstum,
bedeckt mit veis- gelblich bis
sem, pulferförmi- bräunlich, begem Luftmycel deckt mit weis-
bedeckt mit veis- gelblich bis
sem, pulferförmi- bräunlich, begem Luftmycel deckt mit weis-
sem, pulverförmigem
Luftmycel
S. griseinus (Waksman) ^
Farbloses bis creme-farbenes Wachstum,
Luftmycel: grauolive
Paltiges gelblieh weisses Wachstum
Luftmycel gräulich-weiss mit olive-färbenem Stich
Luftmycel gräulich-weiss mit olive-färbenem Stich
Medium
Calciummalatagar
Tyr ο sin-Nahragar
MA.-2837
Tabelle la (Fortsetzung)
S. griseus
(Bergey)
(Bergey)
Vegetatives Wachstum: eben, sich ausbreitend durchscheinend und
farblos an den Rändern opak und creme-färben
im Mittelpunkt. Luftmycel: Massig, cremefarben bis gelb, Bänder
gelbbraun gelb Lösliches Pigment: keins
Vegetatives Wachstum: eben, sich ausbreitend, creme-farben
Luftmycel: gelblich braungelb mit grünlicher Schattierung, Ränder gelbbraun-gelb
Luftmycel: gelblich braungelb mit grünlicher Schattierung, Ränder gelbbraun-gelb
Lösliches Pigment: sehr hellbraun
Tyrosin-Kristalle zersetzen sich ,
Pepton-Eisen-Hefe- Vegetatives Wachstum:
Extraktagar creme-efärben
Luftmycel: keins Lösliches Pigment: keines Melanin negativ
S. griseus
(Waksman)
(Waksman)
Grünes oder gelbes lösliches
Pigment, das auf
dem Calciummalat
und Succinatmedium erzeugt
wird
Pigment, das auf
dem Calciummalat
und Succinatmedium erzeugt
wird
Häufig erzeugtes
dunkles Pigment
dunkles Pigment
S. griseinus
(Waksman)
(Waksman)
4* VJi
Keine löslichen Pigmente
auf Calciummalat oder
Succinatmedium
Succinatmedium
Kein erzeugtes Pigment
Tabelle Ia (Portsetaung)
Medium
M/L-2837
Erzeugung von ELS
Loeffler's Blutserum-Schrägkultüren
Temperaturbereich
(Hefeextrakt-
Dextrose-Salz-
agarschrägkultu-
ren)
Mikroärophiles
VactLstum (Hefeextrakt-I) extr ο s e-SaIze-Ansatz
mm Tiefe)
VactLstum (Hefeextrakt-I) extr ο s e-SaIze-Ansatz
mm Tiefe)
Reduktion von
Nitraten zu Nitriten
Nitraten zu Nitriten
S. griseus
(Bergey)
(Bergey)
S. griseus
(Vaksiaan)
(Vaksiaan)
Negativ
Vegetatives Wachstum: gelbbraun
Luftmycel: hellgelblich
Lösliches Pigment: bräunlich
Vollkommene Verflüssigung
28° C gutes Wachstum 37~ C gutes Wachstum
C kein Wachstum
Di e Oberfläche bedekkendes und längs der
gesamten Ansatzlinie verlaufendes gutes Wachstum
Negativ
Negativ
S. griseinus (Waksman)
Negativ
Optimalt emp eratür
370 C
370 C
Positiv
Positiv
Positiv
Diese Beobachtungen erfolgten nach dreiwöchiger Inkubierung bei 28° C, falls nicht anders vermerkt ist. Der pH-Wert
des bei diesen Untersuchungen verwendeten Mediums war etwa neutral, d. h. 6,8 bis 7j2. Die physiologischen Versuche
wurden nach Ablauf von 7 und 22 Tagen durchgeführt. Die zur Beschreibung verwendeten Farben entsprechen den Definitionen von "Color Harmony Manual", 4. Ausgabe, 1958» Container
Corporation of America.
81QA Kohlehydrat-Verwendung:
Die Streptomyces griseus-Kultur (MA-2837) wurde auch hinsichtlich
ihrer Fähigkeit zur Verwendung oder Assimilierung verschiedener Kohlehydrate durch das Wachstum des Mikroorganismus
in synthetischem Ausgangsmedium (T. G. Pridham
aüd D. Gottlieb, 1948), das 1 % des Kohlehydrats bei υ28° C
während 3 Wochen getestet. Die folgende Tabelle II gibt den Verbrauch oder die Assimilation dieser Kohlehydratquellen
durch die Streptomyces griseus Kultur (MA-2837) wieder. Die Erklärung der Zeichen in Tabelle II sind wie
folgt: + bedeutet gutes Wachstum, + bedeutet schlechtes Wachstum und - bedeutet kein Wachstum auf dem speziellen
Kohlehydrat.
Kohlehydrat | MA-2837 | Kohlehydrat | MA-2837 |
Kultur | Kultur | ||
Glucose | + | Lactose | + |
Arabinose | + | Inosit | + |
Xylose | + | Saccharose | + |
Maltose | + | ßhammose | + |
Mannose | + | Raffinose | + |
Fructose | - | Cellulose | - |
Mannit |
- 22 -
109833/1 836
Die in den Tabellen I, Ia und II beschriebenen Eigenschaften
wurden zur Herabsetzung der Streptomyces griseus Kultur (HA.-2837) auf eine Klassifikation einer Species über den in
"Bergeys's Manual of Determinative Bacteriology", 7· Ausgabe, Seiten 694- - 829 (1957) und in "The Actinomycetes", Band 2,
Seiten 61 - 292 (1961) beschriebenen Schlüssel verwendet.
Ein Vergleich der Kultur (HA-2837) m^ bekannten Species
zeigt, dass sie dem Streptomyces griseus ähnlich ist. Es bestehen morphologische Unterschiede, wie beispielsweise hinsieht
der Farbe des Luftmycels, das bei Streptomyces griseus vorwiegend gelbbraum-gelb und grünlich-gelb ist, jedoch im
Einblick auf die erhebliche Anzahl von Ähnlichkeiten und lediglich geringen Unterschieden ergibt sich keine Berechtigung
für eine neue Species-Bezeichnung. Der Mikroorganismus (MA-2837), der clas Antibiotikum 810A produziert, wurde somit
als ein Stamm von Streptomyces griseus identifiziert.
Zusätzlich zu der vorstehenden Kultur (MA-2837) wurden 25
weitere Kulturen als Erzeuger des Antibiotikums 810A identifiziert. Dazu gehören: drei Kulturen von Streptomyces
griseus, elf Kulturen von Streptomyces viridochromogenes, fünf Kulturen von Streptomyces fimbriatus, drei Kulturen
von Streptomyces halstedii, eine Kultur von Streptomyces rochei, eine Kultur von Streptomyces cinnamonensis und eine
Kultur von Streptomyces chartreusis. Diese Streptomyces-Stämme werden als die folgenden Kulturen in der Kulturensammlung
von Merck & Co., Ine, Rahway, New Jersey, identifiziert:
MA-4160, MA-4174, MA-4171, MA.-4177, MA-4178,
MA.-4180, MA.-4164, MA-4-165, MA-4-166, MA-4-167, MA-2892, MA-3265,
MA-4-162, MA-4-163, MA-4-159, MA-4169, MA-4170, MA-4-179, MA-4-161,
MA-^168, MA-4175, M-4181, MA-2938, ΜΑ-^-176 und MA-4173.
Diese Kulturen wurden zur dauernden Hinterlegung bei der Kulturensammlung der Northern Utilization Research and
Development Branch of the U.S. Department of Agriculture in Peoria, Illinois, hinterlegt.
- 23 -
1 0 S S i : / ' 8 3 6
Div- zugeeilten Kiüii-Kultiir-Beseiclinüngen eiiid wie folgt;
Streptomyces R-risetisi
Mi-4160 | MRRL 3951 |
MA.-4174 | IJRRL 3953 |
MA-4171 | MRRL 3952 |
Streptomyces viridochromogenes: | |
MA-4177 | KRRL 3970 |
MA.-4178 | NRRL 3971 |
MA.-4180 | NRRL 3972 |
HA.-4164 | NRRL 3966 |
MA-4165 | NRRL 3967 |
MA.-4166 | NRRL 3968 |
HA-4167 | NRRL 3969 |
MA.-289 2 | NRRL 3962 |
MA-3265 | IiRRL 3963 |
MA-4-162 | NRRL 3964 |
MA.-4163 | NRRL 3965 |
Streptomyces fimbriatus: | |
MA.-4159 | NRRL 3954 |
MA-4169 | NRRL 3956 |
MA.-4170 | NRRL 3957 |
MA.-4179 | NRRL 3958 |
MÄ.-/+161 | NRRL 3955 |
Streptomyces halstedii: | |
MA-4168 | NRRL 3959 |
MA.-4175 | NRRL 3960 |
MA-4181 | NRRL 3961 |
Streptomyces rochei: | |
MÄ-2938 | NRRL 3973 |
Streptomyces cinnamonesis: | |
MA.-4-176 | NRRL 3974 |
- 24 -
1098 3 3/1836
«505 ■ „ 210985.»
Streptomyces chartreusiss
MA-4173 HEEL
Die Charakterisierung der vorstehend erwähnten Isolate im
Vergleich mit Streptomyces griseus, Streptomyces viridochromogenes,
Streptomyces fimbriatus, Streptomyces halstedii, Streptomyces rochei, Streptomyces cinnamonensis und Streptomyces
chartreusis sind in den folgenden !Tabellen 11a bis
He wiedergegeben. *
109839/1836
KuI tureigenschaf tender das Antibiotikum 810A erzeugenden Stämme von
Streptomyces griseus
Medium MA-4160 MA-4174-
Morphologie Sporophore bilden Büsche mit geraden bis leicht gewundenen Sporenketten«
Sporen sind kugelförmig bis oval - 0,9 μ Durchmesser bis 0,9 μ x 1,2/,
in Ketten von etwa 10 bis 15 Sporen ' ' '
Tomatenpaste- Vegetatives Wachstum: gut, eben, sich ausbreitend- ——-—=-■·■■
Hafermehlagar gelbbraun
Luftmycel: Luftmycel: pulver- Luftmycel:
pulverförmig, gelbbraun förmig, gelbbraun pulverförmig, gelbbrairi
' mit grünlicher Schat- mit stark grüner stark grüner Übertönung;
ro tierung Übertönung
Lösliches Pigments hellbraun — ———~—«—
Glycerin- Vegetatives Wachstum: gut, eben, gelbbraun
oSE^ tuftmycel: pulverförmig, gelbbraun mit grünlicher Schattierung und
aßar - Vektoren
Lösliches Pigment: hellbraun
Csapek-Dox Vegetatives Wachstum: eben, sich ausbreitend, transparent ——».-.-.-..-
gar Luftmycel: Luftmycel: Luftmycel:
massig, gelbbraun massig, gelbbraun massig, gräulich
oq Lösliches Pigment: Lösliches Pigment: Lösliches Pigment
:?,
ro
co ■ ' ■ ' '■'!
m „ ,,
Tabelle IIa (Fortsetzung) Medium MA-4-160
Eefeextrakt - egetatives Wachstum: eben, sich ausbreitend, gelbbraun
Dextrose + Luftmycel: gut, pulverförmig, beige ——-———————·■
Salzagar
Lösliches Pigment: hellbraun = ————
Lösliches
Pigment auf . kein kein kein
ο Pepton-Eisen-
co Hefe-Extrakt
ro agar
(.i'S
UD
CD CO CXI
Tab ell e Ht
Kultureigenschaften von das Antibiotikum 810A erzeugenden Stämmen von Streptomyces virido- ο
chromogenes ^
Medium
MA-2892
-3265
MA-4162'
Morphologie
Tomatenpaste-Hafermehlagar
Sporophore sind kurze, kompakte Spiralen, die als Seitenzweige auf Lufthyphen
auftreten.
Sporen sind kugelförmig bis oval - 0,9 bis 1,2 ia Durchmesser und 0,9 bis 1,2 χ
1~,2 bis 1,7yU, Ketten von etwa 10 bis 15 Sporen.
Vegetatives Wachstum: Vegetatives Wachs- Vegetatives Wachs- Vegetatives Wachstun
Glycerinasparaginagar
Eückseite braun
Luftmycel: samtig, dunkelgrau und weiss
Lösliches Pigment: hellbraun turn: Rückseite turn: Eückseite
gelbbraun dunkelbraun
Luftmycel: samtig, Luftmycel:
hellgrau und weiss samtig, bläulich-
gelbbraun dunkelbraun
Luftmycel: samtig, Luftmycel:
hellgrau und weiss samtig, bläulich-
grau und weiss
Lösliches Pigment: Lösliches Pigment
keines hellbraun
keines hellbraun
Eückseite braun
Luftmycel: samtig, mittelgrau und weiss
Lösliches Pigment: hellbraun
Vegetatives Wachstum: Vegetatives Wachs- Vegetatives Wachs- Vegetatives Wachstum:
Eückseite dunkelbraun turn·: Eückseite dunkelbraun
Luftmycel: hellgrau
Luftmycel: hellgrau
und creme-
farben
Lösliches Pigment: hellbraun turn: Eückseite
dunkelbraun
Luftmycel:
creme-färben und
hellgrau
dunkelbraun
Luftmycel:
creme-färben und
hellgrau
Lösliches Pigment: Lösliches Pigment:
hll
keines hellbraun
Bückseite braun
Luftmycel:
creme-färben und grau
Lösliches Pigment: hellbraun
Tabelle Hb (Fortsetzung)
Medium
MA-2892
MA-3265
MA-4162
ΜΑ-Λ163
Czapek-Dox Agar
CX? U5 CD
Hefeextrakt Dextros eagar
Vegetatives Wachstum : dunkelbraun
Luftmycel:
seta? spärlich
Lösliches Pigment: dunkelbraun
Vegetatives Wachstum : dunkelbraun
Luftmycel:
sehr spärlich
Lösliches Pigment: hellbraun
Vegetatives Wachstum: dunkelbraun
Luftmycel:
hellgrau und weiss
hellgrau und weiss
Lösliches Pigment: hellbraun
Vegetatives Wachs-
t um: Rucks ei s e
braun
Luftmyc el: hellgrau
Lösliches Pigment: keines
Lösliches Pigment auf Pep ton-Eisen-Hefe
extraktsgar
Vegetatives Wachstum: dunkelbraun Luftmycel:
sehr spärlich Lösliches Pigment: hellbraun Vegetatives Wachstum: dunkelbraun Luftmycel:
sehr sparsam Lösliches Pigment : hellbraun
Vegetatives Wachstum: gelbbraun
Luftmycel:
sehr spärlich
Lösliches Pigments hellbraun
Vegetatives Wachstums dunkelbraun
Luftmycel: sehr spärlich
Lösliches Pigments hellbraun
dunkelbraun
CO OO CP
Medium
CO OO
U)
Glycerin-Asparagin-
agar
OO
on
Czapek-Lox Agar
MA-2892
Tabelle lib(Portsetzung)
U 3265 MA-4-162
Morphologie
Tomatenpaste Hafenn ehlagar
Sporophore sind kurze, kompakte Spiralen, die als Seitenzweige auf Lufthyphen
auftreten. Sporen sind kugelförmig bis oval - 0,9 bis 1,2 μ Durchmesser imcl
0,9 - 1,2 χ 1,2 - 1,7 JU , Ketten von etwa 10 bis 15 Sporen
- Vegetatives Wachstum: Rückseite dunkelbraun —-~™.-=,,-.,~=
Luftmycel: Luftmycel: Luftmycel: Luftmycel:
samtig, bläulich- samtig, mittel- samtig, mittelgrau samtig, dunkelgrau
grau und creme- grau und creme- und creme-färb en und creme-färb ti.·::.
farben farben
Vegetatives Wachstum: Rückseite dunkelbraun
Luftmycel: dunkelgrau und cremefarben
Vegetatives Wachstum: braun
Luftmyc el: s ehr
spärlich
Lösliches Pigment: braun
Lösliches Pigments hellbraun
Vegetatives Wachs- Vegetatives Wachstum: Rückseite turn: duiikelgrau
dunkelbraun
Luftmycel:
mittelgrau und
creme-färben
mittelgrau und
creme-färben
Luftmycel: spärlich gräulich
Lösliches Pigment: hellbraun
Vegetatives Wachs- Vegetatives Wachstum: Rückseite turn: braun
braun .
braun .
Luftmycel: hell- Luftmycel: sehr
grau und creme- spärlich
farben Lösliches Pigment:
Lösliches Pigment: braun
hellbraun
hellbraun
Vegetatives Wa turn: Rückseite braun
Luftmye el s iiei
und
Vegetative» U.v. ■·.
turn: gelbbrat;»
Luftmycel: sera:· spärlich Lösliches Tigpiu
hellbraun
Medium
Hefeextrakt-Dextrose- agar
Lösliches Pigment auf Pept/.on- Eisen-He
fe extraktagar
Tabelle Hb (Fortsetzung)
MA-4-165
MA.-4-166
MA-A--1S?
Vegetatives Wachstum: dunkelbraun Luftmycel: sehr sparsam ■Lösliches
Pigment: hellbraun
dunkelbraun
Tabelle Hb (Portsetzung)
OO Ca)
Medium
Morphologie
Tomatenpas teil aferm ehl a gar
Glycerin-
Asparaginagar
Czapek-Dox Agar
MA-4177
MA-4178 MA-4180
Sporophore sind kurze, kompakte Spiralen, die als Seitenzweige auf Lufthyphen
auftreten. Die Sporen sind kugelförmig bis oval - 0,9 bis 1,2 a Durchmesser und 0,9 bis 1,2 χ 1,2 bis 1,7 ü in Ketten von etwa 10 bis 15
Sporen
Vegetatives Wachstum: Vegetatives Wachstum: Rückseite gelbbraun Rückseite braun
Luftmycel: samtig, dunkelgrau und weiss
Luftmycel: samtig, dunkelgrau Vegetatives Wachstum:
Rückseite braun
Rückseite braun
Luftmycel: samtig,
dunkelgrau und cremefarben
dunkelgrau und cremefarben
-Lösliches Pigment: hellbraun
Vegetatives Wachstum: Vegetatives Wachstum: Rückseite braun Rückseite dunkelbraun
Luftmycel: dunkelgrau
Luftmycel: dunkelgrau Vegetatives Wachstum: Rückseite dunkelbraun
Luftmycel:
Gemisch aus hell und
dunkelgrau
■ Lösliches Pigment: hellbraun
Vegetatives Wachstum: Vegetatives Wachstum: Vegetatives Wachstum: gelbbraun dunkelbraun gelbbraun
Luftmycel: sehr spärlich
Lösliches Pigment: hellbraun
Sabelle lib (Fortsetzung)
-a V>4
00 ι
Medium
Lösliches Pigment auf P ep t on-Ei s en-Hefeextrakt-
agar
MÄ.-4177
MA-4178
MA-4-180
Hefeextrakt Dextroseagar
Vegetatives Wachstum: Vegetatives Wachstum: Vegetatives Wachstum: dunkelbraun braun braun
Luftmycel: spärlich-gräulich
Luftmycel:
sehr spärlich
sehr spärlich
Luftmycel:
sehr spärlich
sehr spärlich
Lösliches Pigment: hellbraun
dunkelbraun
T
a
b e
1 1
e
Hc
Kultureigenschaften von das Antibiotikum 810A erzeugenden Stämmen von Streptomyceg
fimbriatus
Medium
MA-4169 MA-4-170
MA-A-179
MA-4161
Morphologie Sporophore sind kurze, kompakte Spiralen und einige Schleifen, die Sporophorö sind
als Seitenzweige auf Lufthyphen auftreten. Die Sporen sind kugel- kurze Halcaa und
förmig bis oval - 0,9 ja Durchmesser und 0,9 χ 1,2 η mit Ketten von Schleifen, öle &1&
etwa 10 bis 15 Sporen' f Seitenzweige auf
Luftmycel auftreten. Spox/e/i Ia.
Ketten von v.^w.w-'
als 10 Sp^Ai^.iV
oval,
messer
messer
1S /! '1.-.V?"..!
und 0,4 χ
Tomatenpaste Hafeaehl- agar
Vegetatives Vegetatives Wachs-Wachstum: Rück- turn: Rückseite seite gelbbraun gelbbraun
Luftmycel: Luftmycel: massig, massig, hellgrau hellgrau
Vegetatives Vegetatives
Wachstum: Wachstum:
Rückseite gelb-Rückseite gelb
Wachstum: Wachstum:
Rückseite gelb-Rückseite gelb
braun
Luftmycel!
massig, hellgnra und cremefarben
Luftmycel!
massig, hellgnra und cremefarben
braun
Luftmyc el
spärlichgräulich
Luftmyc el
spärlichgräulich
turn: gelbbraun
Luf tmy ce1.;1. spärlich.·, ^,v-l-u
Glycerin-
Asparaginagar Lösliches Pigment: hellbraun
Vegetatives Wachs- Vegetatives Vegetatives
turn.: dunkelbräun- Wachstum: Wachstum:
turn.: dunkelbräun- Wachstum: Wachstum:
Vegetatives
Wachstum: dun-
kelbräunlichtis lieh bis grau dunkelbräun- dunkelbräun-
grau lieh bis grau lieh bis grau
Vegetatives Wach tum: Kückueite
gelbbraun mit rö tli ch ^el
Velrtos: or."
Tabelle Hc ( Ports etz α ag )
Medium
MA-4-I7O
MA-4-179
IU-4-161
Czapek-Dox
Agar
Agar
CO
CO
CO
CO
CO
CO
CO
Vegetatives Wachstum: dunkelbräunlich bis
grau
Luftmycel: sehr spärlich
Lösliches Pigment ί
braun
Vegetatives Wachs- Vegetatives Wachstum: dunkelbräun- turn: dunkelbräunlieb,
bis grau lieh bis grau
Luftmycel: massig, Luftmycel: massig,
grau grau
Lösliches Pigment: Lösliches Pigment:
braun braun
Vegetatives ·
Wachstum: dunkelbräunlich
bis grau
Wachstum: dunkelbräunlich
bis grau
Luftmycel:
sehr spärlich
sehr spärlich
Lösliches
Pigment:
braun
Hefeextrakt Vegetatives Vegetatives Wachs- Vegetatives Wachs- Vegetatives
Dextrose + Wachstum: turn: dunkelbräun- turn: dunkelbräun- Wachstum: dun-
dunkelbräun- lieh bis grau lieh bis grau kelbräunlich
lieh bis grau bis grau
Luftmycel: sehr spärlich
vwi* Salz-Agar
Vegetatives
Wachstum;
gelbbraun
Luf tmy c el s spärlich
Lösliches Pigment:
hellbraun
hellbraun
Vegetatives
Wachstum:
braun
Lösliches Pigment: braun
Lösliches
Pigment auf
Pepton-Eisen-"
Hefeextrakt-
Pigment auf
Pepton-Eisen-"
Hefeextrakt-
Agar
dunkelbraun
!Tabelle lld
co cn u-
Xulturexgenscliaften von das Antibiotikum 810A erzeugenden Stämmen von Str'eptomyces halsteäii
Medium
Morphologie
Tomatenpaste Hafsrmehlagar
Glyc erin-Asparagin-Agar
MA-4168 MÄ.-4181
Sporophore sind lange, lose Spiralen, die als Seitenzweige auf Lufthyphen
auftreten. Die Sporen sind kugelförmig bis oval - 0,9 M Durchmesser und
0,9 χ 1,2 ja. - in Ketten von mehr als 10 Sporen '
Vegetatives Wachstum: Bückseite braun
Luftmycel:
pulverförmig, dunkelgrau
Vegetatives Wachstum: Eückseite braun bis dunkelbraun
Luftmycel:
pulverförmig, dunkelgrau und weiss Vegetatives Wachstum:
Eückseite gelbbraun
Luftmycel:
dunkeigrau und weiss, pulverförmig
Vegetatives Wachstum: Eückseite braun
Luftmycel:
dunkelgrau und weiss
Lösliches Pigment: keines '
Vegetatives Wachstum: Vegetatives Wachstum:
Eückseite gräulich
Luftmycel:
pulverförmig, vorwiegend dunkelgrau gemischt mit hellgrau
und weiss
Lösliches Pigment: keines
Eückseite gräulich
Luftmycel:
dunkelgrau, pulverförmig
Tabelle Ild (Fortsetzung)
Medium
Gzapek-Dox
Agar
Hefeextrakt Dextrose + SaIζ-Agar
Losliches 05^ Pigment auf
Pepton-Eisen-Eefeextrakt-
Agar
MA.-4-168
MA-4-181
Vegetatives Vaclistum: creme-färben
Luftmycel: gräulich cremefarben
Vegetatives Wachstum: Vegetatives Wachstum;
Rückseite rötlich- creme-färben
braun
Luftmyc el: Luftmyc el:
gräulich creme-farben sehr spärlich
Vegetatives Wachstum: gelbbraun
Luftmycel: gräulich, spärlich Lösliches Pigment: keines
Vegetatives Wachstum: Vegetatives Wachstum: gelbbraun braun
Luftmycel:
spärlich, gräulich
spärlich, gräulich
Lösliches Pigment: keines
keines
Luftmycel:
spärlich, gräulich
spärlich, gräulich
„λ
Kuitureigenschaften von das Antibiotikum 810A erzeugenden Streptomyces Species
Medium MA-2938 MA-4-176 MA-4-173
Morphologie
(O
CO
CO
CO
CO
CO
CO
Somatenpaste -
Eafermehl-Agar
GIyc erin-Aspa-
ragin-Agar
Streptomyces rochei Sporophore bilden
kompakte Spiralen,die als Seitenketten von
etwa 10 - 15 Sporen kugelförmig bis oval, 0,9 >u Durchmesser und
0,9 x 1,2 u auftreten
Vegetatives Wachstum: Rückseite rötlich bis
: mittel
grau
Lösliches Pigment: keines
Vegetatives Wachstum: Rückseite rötlich bis braun
Luftmycel:
mittelgrau
mittelgrau
Lösliches Pigment: keines
Streptomyces^cinnamonesis
Sporophore sind Haken,
Schleifen und einige lose
Spiralen, die als Seitenzweiße auf Lufthyphen auftreten. Die Sporen sind
in Ketten von mehr als
10 Sporen, kugelförmig
bis oval, 0,9 <u Durchmesser und 0,9 x'1,2 n.
Sporophore sind Haken,
Schleifen und einige lose
Spiralen, die als Seitenzweiße auf Lufthyphen auftreten. Die Sporen sind
in Ketten von mehr als
10 Sporen, kugelförmig
bis oval, 0,9 <u Durchmesser und 0,9 x'1,2 n.
Vegetatives Wachstums
gelbbraun
gelbbraun
Luftmycel: beige mit
rosa Färbung, samtig
rosa Färbung, samtig
Lösliches Pigment:
braun
braun
Vegetatives Wachstum:
Rückseite dunkelrötlich
bis braun
Rückseite dunkelrötlich
bis braun
Luftmycel: beige mit
rosa färbung
rosa färbung
Lo ε I ;i, c h e s Pi gia e nt ι
braun
braun
Streptoayces chartreusis
Sporophoren sind korapak'öe
Spiralen, die als Seitenzvi ei ge auf Lufthyphen auftreten. Die Sporen sind
in Ketten von mehr al::: 10 Sporen, kugelförmig bl?
oval, 0,9 bis 1,2ja Durchmesser und 0,9 bis it2 ::,
1,2 bis 1,7 ja
Vegetatives Wachstums hellbraun mit orange "bis braunen Vektoren Luftmycel: pulverförmig,
dunkelgrau mit blau-grüner I'ärbung Lösliches Pigment: ti . ί:.
Vegetatives Wachstum: braun
Luftmycel: sehr spärlich
Ifö s 1 i c h e s Pi gm en 11
hellbraun
■ '-λ ν ■■■
Tabelle He (Fortsetzung)
ο co co ω
Medium
Czapek-Dox Agar
Hefeextrakt Dextrose + SaIz-Agar
Lösliches Pigment auf Pepton-Eisen-Hefeextrakt- Agar
MA-2958
Vegetatives Wachsturn: rötlichbraun
Luftraycel:
sehr sparsam
Lösliches Pigment: keines
Vegetatives Wachstum: gelbbraun
Luftmycel: gräulich
Lösliches Pigment: hellbraun
keines Vegetatives Wachstum: Rückseite dunkelbraun
Luftmycel: massig,beige mit rosa Färbung
Lösliches Pigment:
braun
braun
Vegetatives Wachstum: braun
Luftmycel: spärlich, creme-färben bis weiss
Lösliches Pigment:
hellbraun
hellbraun
dunkelbraun
MA-4173
Vegetatives Wachstums orange- bis braun
Luftmycel: sehr spärlich
Lösliches Pigments heilbraun
Vegetatives Wachstum.· braun
Luftmycel:
sehr spärlich
Lösliches Pigment: braun
dunkelbraun
ο co oo cn
Die vorstehende Beschreibung der das Antibiotikum 810A erzeugenden Mikroorganismen dient einfach zui1 Erläuterung
der verwendbaren Arten von Stämmen und nicht zur Begrenzung der Erfindung auf einen Organismus, der die Merkmale dieser
speziellen Beschreibung erfüllt. Die Erfindung umfasst die Verwendung anderer Mikroorganismen einschliesslich Stämme
von Actinomyceten, die aus der Natur isoliert oder durch Mutation erhalten werden, beispielsweise solche, die durch
natürliche Auswahl erhalten werden oder solche, die durch Mutationsmittel, beispielsweise Bestrahlung mit Röntgenstrahlen,
Ultraviolett-Bestrahlung, Stickstoffsenfgase und
dgl., die unter geeigneten Bedingungen ein identisches Antibiotikum ergeben, erhalten werden»
842A Kultur: Der das Antibiotikum 842A erzeugende Mikroorganismus
ist ein bisher unbekannter Stamm von Actinomycete. Das ursprüngliche Isolat wurde als eine Einzelkolonie aus
Boden auf einer Agar-Schrägkultur erhalten und in einem Medium der folgenden Zusammensetzung gezüchtet:
Medium B:
Hefeextrakt 10,Og
Glucose 10,0 g
# Phosphat-Puffer 2,0 ml
MgSO4-7H2O 0,05 S
Destilliertes Wasser 1000,0 ml
pH 6,5
* Phosphat-Puffer:
KH2PO4 91,0g
Na2HPO4 95,0 6
Destilliertes Wasser 1000,0 ml
Es wurde festgestellt, dass nach mehrtägigem Wachstum keine
Sporenbildung festgestellt werden konnte. Der Mikroorganismus erzeugte ein Antibiotikum, das sich von bekannten Antibiotika auf Grund seines Profils in verschiedenen biologischen
10 9 8 3 9/1836
und chemischen Untersuchungen unterschied» Vergleiche dieser Daten mit solchen, die über bekannte Antibiotika erhalten
wurden, ergaben, dass-842A ein neuer Körper war.
Taxonomie: Der 842A erzeugende Mikroorganismus (Kultur
MA-29O8) wurde als ein neues Actinomycete identifiziert.
Die bei dieser Bestimmung verwendete Taxonomie ist in "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 7» Ausgabe
und in "The Actinomycetes", Band 2, "Classification, Identification
and Description of Genera and Species", S. A. Waksman (196"O beschrieben. Unter Verwendung dieses Verfahrens,
wurde festgestellt, dass die Kultur zum Genus Streptomyces gehört und viele der Attribute der bekannten Species
Streptomyces fradiae besitzt. Biochemisch stimmt sie hauptsächlich vollständig mit letzterer überein. Morphologisch
bestehen jedoch wesentliche Unterschiede. Beispielsweise ist die Farbe des Luftmycels von S. fradiae ein seemuschelfarbenes
Eosa, während die Kultur MA-2908 gewöhnlich cremefarben gefärbt ist. Auch zeigt das vegetative Wachstum
in der MA-2908-Kultur Pigmentunterschiede auf verschiedenen verwendeten Medien, und, wie vorstehend angegeben, wurde auf
Standard-Taxonomie-Medium keine Sporenbildung wahrgenommen.
Auf der Basis dieser Unterschiede wurde die Kultur als eine neue Species: Streptomyces lactamdurans bezeichnet. Die
folgende Tabelle III beschreibt die biochemischen Eigenschaften der Streptomyces lactamdurans-Species und solche
der bekannten Streptomyces fradiae. Sämtliche Werte in Tabelle III wurden nach 3 wöchiger Inkubierung bei 28° C ermittelt,
ausgenommen dort, wo es anders vermerkt ist. Der pH-Wert des verwendeten Mediums bei diesen Untersuchungen
war etwa neutral, nämlich 6.8 bis 7»2. Die physiologischen
Versuche wurden nach Ablauf von 7 und 21 Tagen durchgeführt.
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ΐ a >:< e j, I e
842A biochemischer Vergleich
7ersuch | Streptomyces lactaradurans |
Streptomyces fradxaa |
Luftmycel | gerade, einige Verzw ei gung en |
gerade, Verzweigimgs- fäden |
G oni dien | nicht ermittelt | stabförmig |
Lösliches Pigment | keines | keines |
optimale Tempe ratur |
28° C | 25° C |
Invertase | negativ | negativ |
Reduktion von Nitrat |
negativ | negativ |
Gelatine-Ver flüssigung |
positiv | positiv |
Oellulose- verbrauch |
negativ | negativ |
Lackmusmilch | alkalische Pep t oni si er ung |
alkalische Peptoni si erung |
842A Morphologie: |
ßporophore wurden nicht ermittelt, wenn die Kultur auf den bei der Beschreibung der Kultureigenschaften aufgeführten
Medium gezüchtet wurde, selbst obgleich wiederholte Beobachtungen bis zu 8 Wochen durchgeführt wurden. Jedoch zeigten
gefärbte Impressionsobjektträger lange Fäden, von denen
viele in Untereinheiten verschiedener Grossen im allgemeinen breitgeformt und von etwa 0,9 x 1,7/U Grosse unterteilt
waren.
Das Luftmycel ist kurz, gerade, wenig verzweigt. Es scheint etwa die gleiche Grosse wie das vegetative Mycel aufzuweisen
0,9 XL Breite. Es ist hell, pulverförmig und leicht abkratzbar.
109839/1836
Bas vegetative Mycel ist grammpositiv, nicht säurefest. Es
haftet fest an dem Agar und ist in einigen Fällen in den Agar eingebettet. Es besteht eine gewisse Aufspaltung zu
Stäben bei der Schüttelkolbenzüchtung, die jedoch nicht erheblich ist. Das vegetative Mycel auf den Schüttelkolben und
den stationären Kolben (Impfmedium, 4 bis 6 Tage, 28° C)
zeigte einige "Keime" und kurze, verdickte, fast knoten- oder keulenartige Segmente auf dem Mycel, jedoch waren diese nicht
zahlreich und ihre Bedeutung, falls überhaupt, ist nicht bekannt.'
Vegetatives Wachstum - Rückseite orange, eben, trockenes Aussehen,
faltig
Luftmycel - spärlich, creme-farben ICein lösliches Pigment
Vegetativ - eben, tiefcreme-farben Luftmycel - pulverförmig, creme-farben weiss
Kein lösliches Pigment
Vegetatives Wachstum - eben, Rückseite goldgelb bis orange
Luftm5Tcel - pulverförmig, creme-farben mit blasspfirischfarbenen
Tönungen
Lösliches Pigment - blass-bernstein-farben
Lösliches Pigment - blass-bernstein-farben
Vegetatives Wachstum - eben, creme-farben bis gelb Luftmycel - pulverförmig, creme-farben
Kein lösliches Pigment
Vegetatives Wachstum - eben,Rückseite - gelb mit orange-
- 45 10 9 8 3 9/1836 , :
färb en ein Rand Luftmycel - pulverförmig, weiss bis creme-farben mit
pfirsich-färbenem Hand
Kein lösliches Pigment
Vegetatives Wachstum - eben, gelbbraun bis orange Luftmycel - spärlich, creme-farben mit weiss
Kein lösliches Pigment .!yrosin-Kristalle werden zersetzt
Melasse - Hefe-Hydrolysat-Ap-ar
Vegetatives Wachstum - eben^Rückseite - orange
Luftmycel - pulverförmig, creme-farben weiss Kein lösliches Pigment
NähraRar
Vegetativ - eben goldgelb Luftmycel - pulverförmig, creme-farben Kein lösliches Pigment
Spärliches Ringwachstum - gelbbraunes, vegetatives Wachstum kein Luftmycel
Peptonisierung: alkalische Reaktion pH 7,3 bis 7,4 (Vergleich pH - 6,7)
Spärliches Ringwachstum - gelbbraun bis orange Vegetatives Wachstum - kein Luftmycel
hell-gelbbraunes lösliches Pigment Peptonisierung - alkalische Reaktion
PH 7,2 (Vergleich pH - 6,6)
Vegetatives Wachstum - eben, orange
- 44 -
109033/1836
Luftmycel - massig, ererne-färben bis blass-korallen-farben
hell-gelbbraunes lösliches Pigment
Hydrolyse von Casein
Hydrolyse von Casein
spärliches, creme-färbenes bis orange-farbenes, vegetatives
Kolbenwachstum innerhalb des Rohrs suspendiert
Kein lösliches Pigment
Vollständige Verflüssigung
Kein lösliches Pigment
Vollständige Verflüssigung
Vegetatives Wachstum - eben, orange Luftmycel: spärlich, pulverförmig creme-farben
Kein lösliches Pigment Verflüssigung von Gelatine
Vegetatives Wachstum - eben, orange-farben
Luftmycel - spärlich, pulverförmig, rosa-farben bis cremefarben
Luftmycel - spärlich, pulverförmig, rosa-farben bis cremefarben
Kein lösliches Pigment Massige Hydrolyse der Stärke
Vegetatives Wachstum - eben, Rückseite creme-farben mit
orange-färbenem Rand
Luftmycel - pulverförmig, weiss mit pfirsich-färbenem Rand
Kein lösliches Pigment Massige Hydrolyse der Stärke
Vegetatives Wachstum - creme-farben bis orange Luftmycel - keines Kein lösliches Pigment
Keine Verflüssigung
- 45 -
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r%°
t# 21 O 9 η 5 ΐ
FsOton-Eiaen-Esfeextrair-t-Aprar
Vegetatives Wachstum - creme-färben
Luftmycel - spärlich, weiss Kein lösliches Pigment
itLkroaerophiles Wachstum
(Hefeextrakt - Dextrose-Stichkultur - 40 mm Tiefe des Stichr-)
Gutes Oberflächenwachstum längs des oberen 1/4 der Stichliriis
Gutes Wachstum bei 28° C Spärliches Wachstum bei 37° c
Kein Wachstum bei 50° C.
Vegetatives Wachstum - eben, goldgelb
Luftmycel - pulverförmig, creme-farben bis blas fleisch-farbsn
Kein lösliches Pigment
Vegetatives Wachstum - trocken, eben, creme-färben bis orange
Luftmycel - spärlich, creme-färben
Kein lösliches Pigment
Kein lösliches Pigment
Reduktion von Nitraten - negativ.
Sämtliche Werte wurden nach 3 wöchiger Inkubierung bei 28° G
genommen, ausgenommen, wo es anders vermerkt wird. Physiologische Versuche erfolgten nach 7 and 21 Tagen.
Die morphologischen Unterschiede zwischen Streptomyces
lactamdurans und Streptomyces fradiae sind in der folgenden Tabelle IV aufgeführt. Die Beobachtungen erfolgten auf den
in Tabelle IV angegebenen Medien in Wachsintervallen von
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1 Woe 1:2, 3 Voolien and 8 Wochen. Das Luftmycel von S„ Iac ü»>.—
cLurar-s Ist kurz und gerade mit wenig Verzweigung. Es scheint
etwa die gleiche Grosse wie das vegetative Mycel aufzuweisen,
α» h. 0,9 /U Breite, Es ist hell« pulverförmig und leicht
abkratzbar. Das vegetative Hycel ist gram positiv; es'ist
nicht säurefest. Es haftet fest an einigen Medien und ist in Agar eingebettet. Es besteht eine gewisse Aufspaltung in
Stäbe bei Schüttelkolben-Wachstum, jedoch ist dies nicht erheblich.
Das vegetative Mycel aus Schüttelkolben und stationären Kolben (Iiapfmedium "währexid 6 !Tagen, 28° C) zeigt
einige "Keime" und kurze, verdickte, fast keulenförmige Segmente auf dem Mycel, jedoch waren diese nicht zählreich.
Sämtliche Werte in Tabelle IV wurden nach 3wöchiger Inkubierurin;
bei 28° C genommen, ausgenommen dort, wo es anders vermerkt ist. Der pH-Wert des zu diesen Untersuchungen verwendeten
Mediums war "etwa neutral, d. h. 6,8 bis 7,2. Die physiologischen Versuche erfolgten nach Ablauf von 7 und
21 Tagen. Die zur Beschreibung verwendeten Farben stehen in Übereinstimmung mit den Definitionen nach "Color Harmony
Manual", 4·. Ausgabe, 1958; Container Corporation of America.
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S? a
belle
842Α Morphologischer Vergleich von Streptomyces lactamdurans und Streptomyces fradiae
Medium Streptomyces lactamdurans Streptomyces fradiae
Czapek-Dox
Agar
Agar
Eahragar
GIyc erin-Asparagin-
Vegetatives Wachstum: eben, tief-cremefarben Luftmycel: pulverförmig, creme-farben-
weiss
Kein Lösliches Pigment
Kein Lösliches Pigment
Vegetatives Wachstum: eben, creme-far-
fen bis goldgelb
Luftmycel: pulverförmig, creme-farben Kein lösliches Pigment
Vegetatives Wachstum: eben, Rückseite
goldgelb bis orange 'Vegetatives Wachstam: farblos
Luftmycel: Muschelschalenrosa
Vegetatives Wachstum: orange bis gell)
- Vegetatives Wachstum: sand-farben
Luftmycel: pulverförmig, creme-farben mit blass-pfirsich-farbener
Tonung
Lösliches Pigment: blass-bernstein-far-
Td en
Vegetatives Wachstum: eben,.goldgelb
Luftmycel: pulverförmig, creme-farben bis blass-fleischrosa
Kein lösliches Pigment
Synthetischer Vegetatives Wachstum: eben, Rückseite
creme-färben mit
orange-färbenen Rändern Luftmycel: pulverförmig, veiss- mit
pfirsich-färbenen Rändern
Lösliches Pigment:
Massige Hydrolyse der Stärke
Massige Hydrolyse der Stärke
Hefeextrakt
JDextrose-
JDextrose-
y
Stärkeagar
Stärkeagar
Vegetatives Wachstum: sand-farben
Vegetatives Wachstum: farblos Luftmycel: Seemuschelrosa
Tabelle IY (Fortsetzung)
fco σ>
Medium
Kartoffel-
schnitt
Gelatinestich
Lackmusmilch
Streptomyces lactumdurans
Vegetatives Wachstum: trocken, eben,
creme-farben bis
orange
Luftmycel: spärlich, creme-farben
Kein Lösliches Pigment
Vegetatives Wachstum; spärliche, cremefarbene bis orange-färbene
Flocken suspendiert in dem Rohr
Luftmycel:
Kein lösliches Pigment
Vollständige Verflüssigung
Vegetatives Wachstum: gelbbraun, spärlicher Wuchsring
Luftmycel: keines
Peptonisierung: alkalische Reaktion,
pH 7,3 bis 7,4-(Vergleich
pH- 6,7) Streptomyces fradiae
Vegetatives Wachstum: orange
Vegetatives Wachstum: creme-färben bis
braun
Vegetatives Wachstum: creme-farben
14303
210985*
Kohleh.yd.rat-Verwertong: Die Söreptcruj/ces
Kultur (MA-2908) wurde auch hinsichtlich ihrer !'ähißkeiu,
verschiedene Kohlehydrate zu verwerten, oder zu assimilieren, untersucht, indem der Mikroorganismus in einem synthetischen
Grundmedium (T. G. Pridham und D. Gottlieb, 194-8)?
das 1 % des Kohlehydrats enthielt, bei 28° C während 3 Wochen gezüchtet wurde. Tabelle V gibt die Verwertung oder
Assimilation dieser Kohlehydratquellen durch die Streptomyces
lactamdurans Kultur (MA-2908) wieder. Die Erklärung der Zeichen in Tabelle V sind wie folgt: + bezeichnet gutes
Wachstum, - bezeichnet geringes V/achstum und - bezeichnet
kein Wachstum auf dem speziellen Kohlehydrat.
Kohlehydrat
Glucose Arabinose
Maltose Eaffinose Saccharose
Xylose Mannit Lactose Mannose
MA-2908 Kultur
Kohlehydrat
Rhamnose Cellulose Fructose
Inosit Acetat Citrat Paraffin Glycerin
MA-2908 Kultur
Die in den Tabellen III, IV und V beschriebenen Eigenschaften wurden zur Zurückführung der Streptomyces lactamdurans Kultur
(MA-2908) auf eine Species-Klassifikation über die in "Bergey's
Manual of Determinative Bacteriology", 7· Ausgabe, Seiten 694 bis 829 (1957) und. in "The Actinomycetes", Band 2,
Seiten 61 bis 292 (1961) beschriebenen Schlüssel verwendet. Ein Vergleich der detailierten Eigenschaften der Streptomyces
lactamdurans Kultur mit bekannten Species zeigt, das«
109839/1836
Ύ 210985
d;.e Ä'ulfcur biochemisch. Streptcrcyces fradiae ähnlich ist*
Jsdoch "bestehen, \äe oben angegeben, bedeutende morphologische
Unterschiede, beispielsweise hinsichtlich der Farbe
des Luftoycels von S. fradiae, die seemuschelrosa-farben ist
im Vergleich zur Creme-Farbe der Kultur. Auch wurde, während
das vegetative Wachstum bei S. fradiae keine Pigmentunterschiede auf verschiedenen Medien ergibt, keine Sporenbildung
bei der Kultur festgestellt. Auf der Basis dieser Unterschiede und der in den vorangehenden Tabellen beschriebenen
Eigenschaften, wurde der das Antibiotikum 84-2A (MA-2908)
erzeugende Mikroorganismus als neue Species Streptomyces lactamdurans bezeichnet.
Die vorangehende Beschreibung des Mikroorganismus, welcher
das Antibiotikum 84-2A erzeugt, dient lediglich zur Erläuterung des Art von Stämmen der Mikroorganismen, die verwendet
v/erden können, und nicht zur Begrenzung auf Mikroorganismen, welche diese spezielle Beschreibung erfüllen. Die
Erfindung schliesst die Verwendung anderer Mikroorganismen ein, einschliesslich Stämme von Actinomyceten sowohl isoliert
aus der Natur als auch durch Mutation erhalten, beispielsweise liefern solche, durch natürliche Auswahl
solcher durch Mutationsmittel, wie beispielsweise Röntgenctrahl-Bestrahlung,
-Ultraviolett-Bestrahlung, Stickstoffsenfgase und dgl., erhaltene Stämme unter geeigneten Bedingungen
das Produkt 842A.
Antibiotikum 81QA, in vitro: Die biologische in vitro Charakterisierung des Antibiotikums 810A erfolgte durch, die
Petri-Schalen-Agar-Diffusionsmethode. Diese Versuche wurden
so durchgeführt, dass mit der Antibiotikumlösung angefeuchtete 7 mra-Scheiben auf die Oberfläche von Petri-Schalen gebracht
wurden, die mit 5 ml Difco-Nähragar und 0,2%igex
Hefeextrakt begossen wurden, der mit 5 oder 10 ml Impfstoff
109839/1836
21Π9854
je 150 ml Medium beimpft vrar, und bei 25° C oder 37° C
16 Stunden inkubiei-t wurde. Die Methode und Abhandlung über
diese Versuche sind in der Veröffentlichung: "Cross Resistance Studies and Antibiotic Identification", applied
Microbiology, Band 6, Seiten 392 bis 398 (19^0) beschrieben.
Die folgenden Tabellen VI, VlI und VII geben die Ergebnisse
dieser Versuche hinsichtlich der antibakteriellen und Kreuzungsresistenz wieder und führen die verwendeten Versuchsorganisnien
und die angewendeten Bedingungen auf*
-52-108833/ 1836
Tabelle VI
Iestorganismus
Eschericnia coli Bacillus species Proteus vulgaris Pseudomonas aeruginosa
Serratia marcescens
Staphylococcus aureus Bacillus subtilis
Sarcina lutea Stphylococcus aureus
(Streptomycin-Streptotnricinresistent)
Streptococcus faecalis Alcaligenes faecalis Bruceila Dronchiseptica
Salmonella gallinarum Vibrio percolans Xanthcmonas vesicatoria
eriell | es Spektrum, in vitro | ml , !Temp. C | Wirksamkeit |
Sestbedingungen | 25 | Inhibierungszone, | |
25 | Durchmesser | ||
37 | mm * | ||
25 | 810A | ||
25 | 5 mg/ml | ||
Impfstoff** Inkubigrung | 25 | 15 | |
ml7i5O | 25 | 22 | |
5 | 25 | 29 | |
5 | 37 | 7 | |
5 | 37 | 7 | |
LfN | 37 | 26 | |
5 | 37 | 33 | |
5 | 25 | 26 | |
5 | 27 | 19 | |
5 | 25 | 7 | |
LA | 25 | ||
15 | 21 | ||
5 | 15 | ||
10 | 36 | ||
10 | 15 | ||
10 | |||
5 |
VM O VJl
7 mm = Scheibengrösse (keine Inhibierungszone beobachtet)
Übernacht-Kultur, verdünnt auf einen Wert von 60 am auf dem Lumetron-Colorimeter
UJ LTl
Tabelle VII
810A Kreuzungsbeständigkeit, in vitro Untersuchung
Escherichia coli - Stamm**
Unt ersuchungsbedingungen
CO OO OJ CO
CO CaJ
Sensitiver Ausgangsstamm Streptomycin-resistent
Streptothricin-resistent OJAI iYC IK- r e s i s t en t
Pieojiidiii-resistent
CLlcraiuphenicol-resistent
Chlortetracyclin-resistent
G^ytetracyclin-resistent
Nsonycin-resistent
üetracyclin-resistent
Vioraycxn-resistent
P
yp Grisein-resistent
Impfstoff*** | Inkubierung |
ml/150 ml | Temp. 0C |
5 | 25 |
.25 | |
10 | 25 |
10 | 25 |
10 | 57 |
10 | 25 |
10 | 25 |
10 | 25 |
10 | 57 |
10 | 25 |
10 | 57 |
10 | 25 |
VJi | 25 |
Inhibi erungss one Durchmesser
Π1ΠΓ
mg/ml
15
15
17
10
17 15 15
7 mm = Scheibengrösse (keine Inhibierungszone beobachtet)
Versuche gegenüber einer Seihe von Stämmen von E. coli^isoliert aus der gleichen
Ausgangskultur durchgeführt und anschliessend gegenüber den einzelnen Antibiotika
ausgesetzt
übernacht-Kultur, verdünnt auf einen Wert von 60 diai auf dem Lunetron-Colorimetei?
Tabelle VIII
810A spezielles Virkungsspektral, in vitro Untersuchung
Escherichia coli W-MB-60
(mit speziellen Zusätzen wie angegeben)
Vergleich (keine Zusätze) 0,1 Hol. Phosphat-Puffer - JpH
0,1 mol, Phosphat-Puffer - pH
0,1 mol.Phosphat-Puffer - pH Menschliches Blutplasma 20 %
Kationen-Austaucchharz (Dow ET 91-1%» Agar-Konzentration
auf 1 % nur für die Harzplatte
herabgesetzt)
Testb edingungen | Inkubierung Temp. C |
Inhibi erungss one Durchmesser |
Impfstoff* ml/150 ml |
25 | öl OA 5 mg/ml |
VJl | 25 | 13 |
5 | 25 | 13 |
5 | ' 25 ' | 16 |
5 | 25 | 18 |
5 | 25 | 15 |
5 | 12 |
* 7 nim Scheibengrösse (keine Inhibierungszone beobachtet)
'* tJbernacht-Kultur, verdünnt auf einen Wert von 60 au auf dem Lumetron-Colorimeter
Antibiotikum 810Α,, in vivo: Die biologische in vivo Charakterisierung
ergibt5 dass 810A ein Antibiotikum mit breitem
VirkungsSpektrum ist, das gegen Infektionen mit drei Species
γόη Proteus, zwei von Salmonella, einem Stamm von Escherichia
coli, zwei von Klebsialla unddrei gram-positive Organismen: Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes und Diplococcus
pneumoniae schützt.
Methode: Die zu dieser Charakterisierung verwendete Methode
ist wie folgt: Weisse, weibliche Schweizer Mäuse mit einem Durchschnittsgewicht von 20 bis 33 g wurden intraperitoneal
mit dem 3- bis 20fachen der Anzahl an Organismen infiziert,
die als lethal für 50 % der infizierten Kontrolltiere berechnet
wurde (LD^-Dosis 3 bis 20). Zum Zeitpunkt der
Infektion und wiederum 6 Stunden später, wurde über den bezeichneten
Weg Therapie angewendet. Kontrollen der Virulenz der Kultur und der Toxizität des Antibiotikums für nichtinfizierte
Mäuse wurden in die Versuche eingeschlossen. 7 Tage nach der Infektion wurde der Versuch als beendet erachtet,
und die Menge des Antibiotikums (I), die zum Schutz von 50 % der infizierten und behandelten Tiere notwendig
ist, wurde nach der Methode von Knudsen und Curtis, J. Amer. Stat. Assoc, Band 42, Seite 282 (1947) berechnet.
Ergebnisse: Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabelle IV
aufgeführt. Diese Daten zeigen, dass das aus der Kultur MA-2837 erhaltene Antibiotikum 810A ein Mittel mit breitem
Virkungsspektrum ist, das sowohl gegen gram-positive als
auch gram.-negative Organismen schützt.
Obgleich Wirksamkeit bei oraler Verabreichung (p.o.) erzielt wurde, erhielt man die besten Ergebnisse über den subkutanen
(s.c.) oder intraperitonealen (i.p.) Weg. Das antibiotische
Gemisch tötete keine nichtinfizierten Mäuse, wenn
zwei Dosierungen, die jeweils 1 mg des Produktes enthielten y
- 56 10S839/ 1836
14305
intraperitoneal verabreicht wurden, oder wenn zwei Dosierungen von jeweils 18 mg subkutan oder oral verabreicht wurden.
Tabelle IX
810A in vivo | Testorganismus | Wirksamkeit | 33 500 12100 200 5000 |
Proteus vulgaris Proteus mirabilis |
419 9000 |
||
Salmonella schottmuelleri | EI) Therapie- 50 in Mikrogramm weg x zwei Dosierungen |
3750 | |
Escherichia coIi | i.p. S.C. Ρ·ο. i.p. p.o. |
1330 | |
Escherichi coIi | i.p. S.C. |
2500 | |
Klebsiella pneumoniae | i.p. | 1670 | |
Salmonella gallinarum | i.p. | 625' | |
Salmonella pullorum | i.p. | 258 | |
Diplococcus pneumoniae | i.p. | 927 | |
Staphylococcus aureus | i.p. | 625 | |
Streptococcus pyogenes | i.p. | Die biologische in vitro | |
Antibiotikum 842A, in vitro: | i.p. | ||
i.p. |
Charakterisierung erfolgte nach der Scheibenplatten-Agar-Diffusionsmethode.
Dieser Versuch wurde so durchgeführt, dass 7 mm Scheiben, die mit der Antibiotikumlösung angefeuchtet
waren, auf die Oberfläche von Petri-Schalen gebracht v/urden, die mit 5 nil Difco Nähragar und 0,2 %
Hefeextrakt, die mit 5 oder 10 ml Standard-Zellsuspension (OD = 0,22 bei 660 mu) je 150 ml Medium beimpft waren,
Übergossen wurden und bei 25° C oder 37° C 16 Stunden wie
angegeben inkubiert wurde. Die Methode und Abwandlung dieser Versuche sind in der Veröffentlichung: "Cross Resistance
- 57 -
109839/1836
2109-
Btuoi.es and Antibiotic Identifies ti on"» Applied
Band 6, Seiten $92 bis 598 (1958) beschrieben. Die folgenden
Tabellen geben die Ergebnisse dieser Versuche bezüglich iztantibakteriellen
Spektrums und der Kreuzungsresistenz wieder und führen dj.e angewendeten Testorganismen und die νervjendet
en Bedingungen an.
- 58 -
109839/1836
842A antibakterielles Spektrum, in v:! tro Wirksamkeit
Testorgani smus
Escherichia coli Bacillus sp. Proteus vulgaris Pseudomonas aeruginosa
Serratia marcescens Staphylococcus aureus Bacillus subtilis Sarcina lutea
Staphylococcus aureus (Streptomycin-Strepto-
thricin-resistent) Streptococcus faecalis
Alcaligenes faecalis Brucella bronchiseptica Salmonella gallinarum
Vibrio percolans Xanthomonas vesicatoria
lDXDfstoff | ±nkubierung |
ml7i5O ml | Temp. 0C |
5 | 25 |
VJl | 25 |
VJl | 37 |
VJl | 25 |
5 | 25 |
VJl | 25 |
VJl | 25 |
VJi | 25 |
VJl | 37 |
15 | 37 |
5 | 37 |
10 | 37 |
10 | 25 |
10 | 27 |
20 | 18 |
8 | 7 |
22 | 24 |
7 | 7 |
7 | 7 |
7 | 7 |
13 | 18 |
10 | 9 |
11 | 10 |
7 | 7 |
27 | η |
24 | 26 |
21 | 25 |
30 | 38 |
25 I.nhibierunRszone, Durchmesser,, msr
Hohes 842A (Ib) i'rei"e Saure~" KatriumsaIz
mg/ml 166 ug/ml 192/Ug/ail
16
7 21 7 7
7 16 9 7
22
28 20 37
12 19
7 mm β Scheibengrösse (keine Inhi bi erungszone beobachtet)
to a>
co
co
Tabelle XI
84-2A Ereuzungsbeständigkeit, in vitro Untersuchung
84-2A Ereuzungsbeständigkeit, in vitro Untersuchung
Escherichia coli-Stamm* *
Impfstoff ml/150 ml
Sensitiver Ausgangsstamm
Streptomycin-resistent
Streptothricin-reistent
OXMYCIN-resistent
Pleocidin-resistent
Chloramphenicol-resistent
Chlortetracycline-resistent Oxytetracyclin-resistent
Neomycin-resistent
Tetracyclin-resistent
Viomycin-resistent
Polymycin-resistent
Grisein-resistent
Streptomycin-resistent
Streptothricin-reistent
OXMYCIN-resistent
Pleocidin-resistent
Chloramphenicol-resistent
Chlortetracycline-resistent Oxytetracyclin-resistent
Neomycin-resistent
Tetracyclin-resistent
Viomycin-resistent
Polymycin-resistent
Grisein-resistent
5 5
10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 5
Inkubierung Temp. ° C ■
25 25 25 25
37 25 25 25 37 25 37 25 25 InhibierunRszone, Durchmesser, mm*
Kohes 84-2A (Ib) Freie Natriumsaü*
mg/ml Säure 192 ug/al
»g/ml x
16
13
13
15
13
21
20
18
16
15
23
18
13
15
13
21
20
18
16
15
23
18
20
19 14
13 18
17 20
23 17 20 16 21 21
18 16 18 17 17 16
23 24-
17 20
30
16
** Die Versuche wurden gegenüber einer Reihe von Stämmen von E. ccli, die aus der gleichen
Ausgangskultur isoliert würden, und nachfolgende Aussetzung gegenüber den einzelnen Anti
biotika durchgeführt
Ausgangskultur isoliert würden, und nachfolgende Aussetzung gegenüber den einzelnen Anti
biotika durchgeführt
* 7 &m = Scheibengrösse (keine Inhibierungszone beobachtet)
a b e 1 1 e XIa ^
842A spezielles Wirkungsspektrum, in vitro Untersuchung
. Escherichia coli W-MB-60 Versuchbedingungen Inhibierungszone, Durchmesser, mm*'
(mit speziellen Zusätzen Impfstoff inkubierung- Hohes 84-2A (Ib) Freie Säure Natriumsalz
wie angegeben) ml/150 ml Temp. oC 8 mg/ml 166 ng/ml 192 ng/ml
Vergleich (keine Zusätze) 5 25 16 20 18
0,1 riol, PhosTDhat-Puf f er
-* pH 5 " 5 25 19 20 15
-* pH 5 " 5 25 19 20 15
ίο 0,1 raol-Phosphat-Puff er
co pH 7 5 25 22 29 25
^ 0,1 Bjo 1. Phosphat-Puffer
js pH9 5 25 21 22 24
j£ Menschliches Blutplasma 20% 5 25 17 22 21
*** * Eationenaustauschharz
m (Dow ET 91) 1 % 5 25 20 21 18
* (Agar-Konzentration auf
1 % nur für Earzplatte
herabgesetzt
1 % nur für Earzplatte
herabgesetzt
fr ^
842A, in vivo
Wenn 842A subkutan an Mäuse verabreicht wird, ist es im allgemeinen"
stärker wirksam als Cephalothin und etwa gleicia -;:.r
sam wie Cephaloridin, Ampicillin und Chlormycetin hinsichtlich
des Schutzes gegenüber Infektion durch gram-·negative
Organismen. Es ist bemerkenswert nicht toxisch und wird rasch im Urin ausgeschieden, wobei etwa 79 % des subkutan
injizierten 842A innerhalb von 4 Stunden gewonnen werdenr
Bei in vivo Untersuchungen schützt das Antibiotikum 842a gegen Infektionen mit drei Species von Proteus, zwei von
Salmonella, einen Stamm von Escherichia coli, zwei von Kleb» sialla und auch gegen paracolobactxmia arizoniae, Aerobacter
aerogenes, Pasteurella multocida und Diplococcus pneumonise E400.
Das bei diesen Untersuchungen angewendete Verfahren ist das gleiche wie vorstehend mit Bezug auf die in vivo Charakterisierung
von 810A beschriebene. Die Ergebnisse dieser Versuche
sind in der folgenden Tabelle XIb wiedergegeben;
- 62 -
109839/1838
21098F4
T a b e 1 1 e
in vivo Wirksamkeit
TestOrganismus
1Q auf subkutanem Wege χ zwei Dosierungen
Proteus vulgaris Proteus mirabilis Proteus morganii 3202
Salmonella schottmuelleri · Klebsiella pneumoniae AD
Klebsiella pneumoniae B Paracolobactum ariaoniae
Escherichia coli
Aerobacter aerogenes Pasteurella multocida Salmonella typhosa Diplococcus pneumoniae E4-00
51/ig
276/ig 276 yig
103
125/ig
125
200
49 /ig
57/ig
3^/ig
566 /ig
81OA Fermentation: Das Antibiotikum 810A wird während der
aeroben Fermentation geeigneter, wässriger Kährmedieii unter
geregelten Bedingungen über die Beimpfung mit der Streptomyces
griseus Kultur MA.-2837 erzeugt. Wässrige Medien, wie
sie beispielsweise zur Herstellung anderer Antibiotika verwendet werden, sind gleichfalls zur Herstellung des Antibiotikums
810A geeignet. Derartige Medien enthalten durch den Ilikroorgani smus assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen
und anorganische Salze.
Im allgemeinen können Kohlehydrate, wie beispielsxtfeise Zukker,
z. B. Glucose, Arabinose, Maltose, Xylose, Mannit und dgl., und Stärken, wie Getreide, z. B. Hafer, Heis, Maisstärke,
Maismehl und dgl., entweder allein oder in Kombination als
- 63 -
109839/1836
14305
assimilierbare Kohlenstoffquellen in dem Nährmedium verwendet
werden. Die genaue Menge der verwendeten Kohlehydratquelle
oder -quellen in dem Medium hängt teilweise von den anderen Bestandteilen des Mediums ab, Jedoch im allgemeinen variiert
die Menge an Kohlehydrat gewöhnlich zwischen etwa 1 und 6 Gew.% des Mediums. Diese Kohlenstoffquellen könen einzeln
verwendet werden^oder es können verschiedene derartiger Kohlenstoffquellen
in dem Medium kombiniert werden. Im allgemeinen kann irgendein proteinhaltiges Material als eine
Stickstoffquelle in dem Fermentationsprozess eingesetzt werden.
Zu geeigneten Stickstoffquellen gehören beispielsweise Hefehydrolysate, Hefeautolysat, Sojabohnenmehl, Hydrolysate
von Casein, Maisquellflüssigkeit, lösliche Destillationsrückstände oder Tomatenpaste und dgl. Die Stickstoffquellen
werden entweder allein oder in Kombination in Mengen im Bereich von etwa 0,2 bis 6 Gew.% des wässrigen Mediums verwendet.
Typische Medien, die zur Herstellung des Antibiotikums 810A geeignet sind, sind die im folgenden aufgeführten.
Diese Medien und andere in den folgenden Beispielen beschriebene. Medien dienen lediglich zur Erläuterung einer grossen
Vielzahl von Medien, die eingesetzt werden können und dienen nicht zur Begrenzung.
Medium I:
Difco-Hefeextrakt Glucose * Phosphateuffer
g41 2
Destilliertes Wasser Difco-Agar
*Phosphatpuffer: KH PO
NaJHPÜ Destilliertes Wasser
Medium II:
Rindsextrakt * NZ Amin Dextrose
NaCl
Destilliertes H~0 pH auf 7,2 mit KaOH eingestellt
*ein enzymatisch abgebautes Casein
- 64 -
10,0 | 6 | ml |
10,0 | S | g |
2,0 | ml | ε |
0,05 g | S | |
1000,0 | ml | |
25,0 | g | |
91,0 | g | |
95,0 | ε | |
1000,0 | g | |
3,0 | ml | |
10,0 | ||
10,0 | ||
5,0 | ||
1000,0 |
1098 3 9/1836
14305
Medium III:
Dextrose Asparagin KHPO
MgSO4 .
Hefeextrakt * Spurenelementgemisch Nr.'2
Destilliertes H2O pH auf 7,2 mit NaOH eingestellt
Spurenelementgemisch Nr. 2: · 7H2O
• H2O
* 2H2O
(NH4)6M0?02i
ZnSO4 · 7H2O
Destilliertes
MnSO^
CuCl, CaCl!
10,0 g 1,0 g 0,1 g
o,5 g
0,5 g 10,0 ml 1000,0 ml
1,0 g 1,0 g 25,0 mg 100,0 mg 56,0 mg 19,0 mg 200,0 mg
1000,0 ml
Medium IV:
V8 Saft Staley's 4S Sojabohnenmehl
Dextrose Agar
Destilliertes H0O pH 7,9 - 8,0 d
Medium V:
100,0 ml 20,0 g 2,0 g 25,0 g auf 1000,0 ml
Hefe-Autolysat (Ardamin) Glucose * Phosphatpuffer MgSO4- 7H2O
Destilliertes H2O
pH - auf 6,5 unter Verwendung von NaOH eingestellt
*PhosOhatpufferlösung:
KHJO
Na2HPO4 Destilliertes H0O
10,0 g 10,0 g 2,0 ml 0,05 g
1000,0 ml
91,0 g 95,0 g 1000,0 ml
- 65 -
10983 9/1836
14J05
Medium VI:
Maisguellflussigkeit (au: Dextrose |
E" feuchter Ba | tsisj | OTOT OTOT | 40,0 g 20,0 g 2,5 ε ο,5 ε |
bezogen auf das Volumen (zu federn Kolben ein zein zuge geben) |
OTOTOTOtOtOt |
Polyglykol 2000 Destilliertes H2O |
ε | 0,25 %, 1000,0 ml |
ε | |||
pH - auf 7,0 mit NaOH | eingestellt | ε | ε | |||
Medium VII: | ε | Produktion | ε | |||
Impfung | ε | 5,0 4,0 2,0 1,5 5,0 2,0 |
ε | |||
L-Asparagin Ij-Fi s ti din DL-Phenylalanin Mononatrium-glutamat NaCl |
5,0 4,0 5,0 2,0 |
ε | 0,4 | ε | ||
CaCl2 · 2H2O | 0,4 | ε ε ml |
0,1 | ε ε ml |
||
MnSO4 · H2O | 0,1 | 0,1 | ||||
FeSO4 . 7H2O | 0,1 | 0,05 | ||||
ZnSO.. . 7H0O | 0,05 | 1,0 | ||||
MgSO4 * 7H2O | 1,0 | 20,0 2,5 **1000,0 |
||||
Glycerin Saccharose Destilliertes H0O |
20,0 2,5 *1000,0 |
* pH auf 7,0 mit NaOH eingestellt ** pH auf 7,1 mit NaOH eingestellt
Flei schextrakt
NaCl
NZ Amin Dextrose pH 7,0
NZ Amin Dextrose pH 7,0
0,3 %
0,5 % 1 % 1 %
- 66 -
109839/1836
Die Fermentation erfolgt bei Temperaturen im Bereich von etwa 20 "bis 37° C, jedoch wird es zur Erzielung optimaler
Ergebnisse "bevorzugt, die Fermentation bei Temperaturen von etwa 22 bis 30° C durchzuführen. Der pH-Wert der für das
Wachstum der Streptomyces griseus Kultur (MA. 2837) -und zur
Erzeugung des Antibiotikums 810A geeigneten Mhrmedien soll
im Bereich von etwa 5,5 "bis 8,0 liegen.
Ein kleiner Fermentationsansatz des Antibiotikums 810A erfolgt
in einfacher V/eise durch Beimpfung eines geeigneten Eänrmediums mit der das Antibiotikum erzeugenden Kultur, wobei
man die Fermentation bei einer konstanten Temperatur von etwa 24 bis 28° C auf einem Schüttler über einen ausgedehnten
Zeitraum, wie beispielsweise mehrere Tage, fortschreiten lässt. Nach Beendigung des InkubierungsZeitraums
wird das Mycel entfernt, und die überstehende Flüssigkeit
wird untersucht.
In Praxis wird diese Fermentation in einem sterilisierten Kolben über eine ein-, zwei-, drei- oder vierstufige Keimentwicklung
durchgeführt. Das iiährsiedium für die Impfctufe
kann irgendeine geeignete Kombination von Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sein, wie beispielsweise irgendeines der
vorstehend unter I bis VIII beschriebenen Medien. Der Impfkolben wird in einer konstanten Tesperaturkammer bei etwa
28° C während eines Zeitraums von 1 bis etwa 5 Tagen geschüttelt,
und die erhaltene Kultur wird zur Beimpfung entweder
eines Zweistufen-Impfmediums oder des Produktionsmediums
verwendet. Wenn Zwischenstufen-Impfkolben verwendet werden,
werden diese in praktisch der gleichen Weise entwickelt, d. h., der Inhalt des Kolbens wird zur Beimpfung des Produktionsmediums eingesetzt, die beimpften Kolben werden bei einer
konstanten Temperatur mehrere Tage geschüttelt, und am Ende des Inkubierungszeitraums wird der Inhalt des Kolbens zum
Entfernen des Mycels zentrifugiert. Die überstehende Flüssig-
- 67 109833/1836
,keit oder Brühe wird dann konzentriert und unter Herstellung
des Antibiotikums 810A gereinigt.
Für ein Arbeiten im grösseren Masstab wird es bevorzugt, die
Fermentierung in geeigneten Tanks durchzuführen, die mit einem Rührwerk und einer Vorrichtung zur Belüftung des Fermentationsmediums
versehen sind. Nach, dieser Methode wird das Nährmedium in den Tank gebracht und durch Erhitzen auf Temperaturen
von bis zu etwa 120° C sterilisiert. Nach dem Abkühlen wird das sterilisierte Medium mit der erzeugenden Kultur geimpft,
und man lässt die Fermentation während eines Zeitraums von mehreren Tagen, beispielsweise von 2 bis 4 Tagen, fortschreiten,
während das Nährmedium gerührt und/oder belüftet wird und die Temperatur bei etwa 24- bis 28° C gehalten wird.
Durch Veränderungen der Impfstoffentwicklung und Veränderungen des Produktionsmediums ist es möglich, eine mehrfache Verbesserung
hinsichtlich der Produktion und eine Steigerung der Wirksamkeit des Antibiotikums zu erhalten.
810A Versuchsverfahren unter Verwendung von Proteus Vulfcaris:
Das Antiobiotikum 810A wurde in einfacher Weise durch ein
Scheiben-Platten-Verfahren unter Verwendung von Proteus vulgaris MB-838 (ATCC 21100 und MHHL B-3361) unter Beibehaltung
als eine Schrägkultur auf Nähragar (Difco) plus 0,2 %
Hefeextrakt (Difco) als Testorganismus untersucht. Die beimpften Schrägkulturen wurden bei 37° C während 18 bis 24
Stunden inkubiert und bei Kühlschranktemperaturen gelagert, bis sie verwendet wurden, wobei frische Schrägkulturen jede
Woche hergestellt wurden.
Der Impfstoff für die Versuchsplatten wird täglich durch Beimpfung
eines 250 ml Erlenmeyer-KoIbens, der 50 ml Nährbrühe
(Difco) plus 0,2 % Hefeextrakt (Difco) enthält, mit einem Abstrich der Schrägkultur hergestellt. Der Kolben wird bei
- 68 1098 39/183 6
57° c auf einer Schuttelmaschine während 18 bis 24- Stunden
inkubiert. Die Flüssigkeitskultur wird dann auf 40%ige
Durchlässigkeit bei einer Wellenlänge von 660 ma unter Verwendung eines Bausch & Lomb Spectronic-20 Geräts durch Zugabe
einer 0,2%igen Hefeextraktlösung zu der Kultur eingestellt.
Nichtbeimpfte Flüssigkeit wird als Blindversuch für diese Bestimmung verwendet. Die eingestellte Brühe (30 ml)
wird zur Beimpfung von 1 1 Medium verwendet.
Nähragar (Difco) plus 0,2 % Hefeextrakt (Difco) werden als
Versuchsmedium eingesetzt. Dieses Medium wird hergestellt,
durch Autoklavieren sterilisiert, und man lässt es auf 50° C
abkühlen. Nachdem das Medium beimpft ist, wird zu jeder der verschiedenen sterilen Petri-Schalen 10 ml zugegeben,
und das Medium kann sich verfestigen.
Es wurden Versuche an diesen Platten nach dem Scheiben-Platt
en- Verfahr en unter Verwendung von 15 M Filterpapier-Scheiben
durchgeführt. Die Versuchsplatten wurden 20 bis 24 Stunden bei 37° C inkubiert. Die Auswertungen wurden als
mm Durchmesser der Inhibierungszone ausgedrückt. Sie wurden
zur Bestimmung der relativen Wirksamkeiten oder, wenn sie mit einem gereinigten Bezugsstandard verglichen wurden,
der Wirksamkeit in Aig/ml verwendet. Wenn ein derartiger Versuch
quantitativ durchgeführt wird, können 2 bis 4- Jtig/ml
Antibiotikum ermittelt v/erden.
810A Versuchsverfahren unter Verwendung von Vibrio percolans:
Es vmrden auch Versuche bezüglich 810A nach dem Scheiben-Platten-Verfahren
gegen Vibrio percolans (MB-1271) unter Verwendung von 13 mm Filterpapierscheiben durchgeführt. Die
Versuchsplatten wurden unter Verx^endung von Difco Nähragar
plus 2,0 g /1 Difco Hefeextrakt mit 10 ml je Platte hergestellt.
Eine Ubernachtkultur des Versuchsorganismus, Vibrio
percolans (MB-12?2) in Nährflüssigkeit plus 0,2 % Hefeextrakt
- 69 1 09839/1836
wurde in steriler Salzlösung auf eine Suspension mit 40%iger
Durchlässigkeit bei einer Wellenlänge von 660 mu verdünnt.
Diese Suspension wurde mit 20 ml/1 Medium vor dem Begiessen der Platten zugegeben.
Die Versuchsplatten wurden bei 4° C gehalten, bis sie verwendet wurden (maximal 5 Tage). Nach der Aufbringung der mit
Antibiotikum gesättigten Versuchsscheiben wurden die Platten bei 28° C während eines Zeitraums von 8 bis 24 Stunden inkubiert.
Inhibierungszonen wurden als mm Durchmesser abgelesen.
Bakterialle Inaktivierung mit 810A: Ein in vitro Versuch diente zur Bestimmung der Resistenz des Antibiotikums 810A
gegenüber bakterieller Inhibierung im Vergleich mit Cephalosporin
C, Cephaloridin und Cephalothin. Diese Untersuchung zeigte, dass das Antibiotikum 810A beständiger als letzteres
gegenüber bestimmten Mikroorganismen ist.
Das in diesem Versuch verwendete abbauende Bakterium war ein
Organismus, von dem bekannt ist, dass er Cephalosporin C vollständig inaktiviert, nämlich Alcaligenes faecalis (1ΊΒ-9).
(a) Herstellung von Bakterienzellen: Alcaligenes faecalis
(MB-9)-Zellen wurden wie folgt hergestellt: Der Inhalt eines L-Rohrs wurde mit einigen ml Nährflüssigkeit, die
0,2 °/o Hefeextrakt enthielt, vermischt. Eine schleifevoll Aufschlämmung wurde über die Oberfläche einer Nähragar-Schrägkultur
verteilt und 18 Stunden bei 37° C inkubiert. Sämtliche Schrägkulturen wurden bei 5° c aufbewahrt und
innerhalb 1 V/oche nach der Inkubierung verwendet. Eine schleifevoll des Oberflächenwachsturns aus jeder Schrägkultur
wurde askeptisch in 50 ml Nährbrühe, die 0,2 %
Hefeextrakt enthielt, überführt und 18 Stunden bei 28° C unter Schütteln inkubiert. Die Kultur wurde dann bei
4000 Upm 10 Minuten zentrifugiert. Das üb einstehende Ma-
- 70 109833/ 1836
terial vmrde abdekantiert, und der restliche Zellklumpen
wurde zweimal mit sterilem 0,1 m-Phosphatpuffer, pH 7»5
(6,8 g Kaliumphosphat und 7»1 6 Natriumhydrogenphosphat
je Liter destilliertes Wasser) gewaschen. Die gewaschenen
Zellen wurden dann in einem Zehntel des Originalvolumens
einer 4 mg/ml Antibiotikumlösung in 0,1 m-Phosphatpuffer
wieder suspendiert. Das Versuchsgemisch wurde dann ohne Schütteln in einem auf 37° C eingestellten Wasserbad eis
zu 4- Stunden inkubiert. Die Versuchsgemische wurden dann
bei 2000 Up:n 10 Minuten -zentrifugiert, wobei sich ein
klares überstehendes Material bildete, das in sterila Reagensgläser dekantiert wurde und unmittelbar in Trokkeneis
gefroren wurde, bis es zur biologischen Bestimmung bereit war, gewöhnlich innerhalb von 5 Stunden. Vergleichsproben wurden in genau der gleichen Weise Jedoch ohne
Zellen inkubiert.
(b) Ausnass der Inaktivierung des Antibiotikums 810A: Die
überstehenden Flüssigkeiten wurden hinsichtlich ihrer antibakteriellen Wirksamkeit in folgender Weise getestet:
Papierscheiben von 6,4- am wurden mit den überstehenden
Flüssigkeiten angefeuchtet und auf die Oberfläche von Nähragar-(G,2 c/o) Eefeextrakt-Platten gebracht, die vorher
mit dem entsprechenden Testorganismus beimpft worden waren. B. subtilis (HB-964-)-Versuchsplatten wurden in folgender
Weise beimpft: 5 ml einer Suspension von gewaschenen Sporen
in 0,9 % Salzlösung wurden zu jeweils 150 ml Nähragar-(0,2
c,o) Hefeextrakt zugegeben, wovon 5 ml dann in Petri-Schalen
von 15 x 100 m verteilt wurden. Sämtliche Versuchsplatten
wurden bei 5° C gelagert und innerhalb von
5 Tagen verwendet. Die Versuchsplatten wurden übernac ht bei 25° C inkubiert, bevor Inhibierungszonen rund um die
Testscheiben gemessen wurden.
Zellfreie Kontrollproben jedes Antibiotikums wurden in
- 71 -
109839/1836
Verdünnungen von 1 : 1, 1 : 2, 1 : 4, 1 : 8,1 :16 und
1 : J2 untersucht, um eine Standard-Bezugskurve zu erhalten.
Lösungen der Testantibiotika wurden bei voller Stärke nach Inkubierung in Gegenwart der gewaschenen Bakterienzellen
untersucht. Sämtliche Proben wurden dreifach gefahren.
(c) Erprebnisse: Die prozentuale Inaktivierung wurde berechnet,
indem der Mittelwert der aus jedem Versuch erhaltenen drei Iniiibierungszonen genommen wurde und die Menge an verbleibendem
Antibiotikum in der Testlösung bestimmt, wie sich aus der Standardkurve ergibt. Dieser Wert wurde dann
von der Ausgangskonzentration (4 mg/ml) subtshiert und
der Rest durch die Ausgangskonzentration geteilt und mit
100 multipliziert, wobei die vorhandene Inaktivierung erhalten würde. Die folgenden Tabellen XII und XIII geben
die erhaltene Inaktivierung für Cephalosporin C, Cephalothin und das Antibiotikum 810A unter den oben beschriegenen
Bedingungen wieder.
Ta b e 1,1 .e XII
Prozentuale Inaktivierung nach Inkubierung mit gewaschenen
Bak t eri enz el 1 en (bestimmt auf B. subtilis (iiB-964) Platten)
Antibiotikum 3 Stunden Inkubierung mit
Alcaligcnes faecalis
810A 0
Cephalosporin C 99+
Cephalothin 62,5
- 72 -
109833/ 1836
Prozentuale Inaktivierung nach Inkubierung mit gewaschenen
Bak t eri enz e 11 en (bestimmt auf V. percolans (MB-1272) Platten)
Antibiotikum 3 Stunden Inkubierung mit
Alcaligenes faecalis
810A 0
Cephalosporin C 99+'
Cephalothin 50
Die Fähigkeit des Antibiotikums 810A und von Cephalosporin C, dem Abbaueffekt der Aerobacter cloacae (MB-2646)-Kultur zu
widex^stehen, wurde ebenfalls bestimmt. Diese Kultur ist
gram.«-negativ und gegenüber Cephalosporin C resistent. Bei
Durchführung des Versuchs wurden Proben der einzelnen Gemische der Organismen und eine Probe des Antibiotikum-Gemischs nach
2stündiger Inkubierung entnommen und auf die verbliebene antibiotische. Wirksamkeit untersucht. Das Verfahren ist die
gleiche Untersuchungsmethode, wie oben für Algaligenes faecalis beschrieben. Die Quelle der Inaktivierungssubstanz
ist eine 1 : 160-Verdünnung des Piltrats einer bei 37° C
während 18 Stunden durchgeführten Schüttelkultur von Aerobacter cloacae MB-2646 in Nährbrühe, die 0,2# Hefeextrakt
enthielt. Die folgende Tabelle XIV gibt die prozentuale Inaktivierung von Antibiotikum 810A, Cephalothin, Cephaloridin
und Cephalosporin C auf Vibrio percolans (MB-1272) gemäss dieser Methode wieder:
- 73-109839/1836
14305
Tabelle XIV
Prozentuale Inaktivierung nach. Inkubierung mit ζ ellfrei ein.
Extrakt
(bestimmt auf V. percolans (MB-1272) Platten)
(bestimmt auf V. percolans (MB-1272) Platten)
Antibiotikum
810A
Cephalothin Cephaloridin Cephalosporin C
2stündige Inkubierung mit Aerobacter cloacae
16 66 96 96
Unter Verwendung des gleichen Versuchsablaufs v«Tie obon beschrieben,
gibt die folgende 'Tabelle XV die relative Beständigkeit des Antibiotikums 810A gegenüber enzymatischer
Inaktivierung durch Aerobacter cloacae wieder. Die Ausgangskonzentration
beträgt 250 Hg/ml. Die Ergebnisse sind in ug/ml ausgedrückt.
Tabelle XV
Verbleibende, antibiotische Wirksamkeit (ug/ml)
(Ausgangskonzentration = 250 ug/ml)
Antibiotikum
Versuchsorganismüs
2stündige Inkubierung mit Aerobacter cloacae *
810A | B. | subtilis 964 | 190 |
Cephalothin | Il | 140 | |
Cephaloridin | Il | <10 | |
810A | V. | percolans 12 72 | 210 |
Cephalothin | It | 85 | |
Cephaloridin | Il | <10 |
* Zeilfreier Extrakt
1098^9/1836
2109804
Im Hinblick auf die vorstehenden Daten ist das Antibiotikum 810A offensichtlich beständiger als Cephalosporin C, Cephalothin
und Cephaloridin gegen Inaktivierung durch Aerobacter
cloacae.
842A Fernientaticn; Das Antibiotikum 84-2A wird während der
aeroben Fermentation geeigneter wässriger Nährmedien unter geregelten Bedingungen durch Beimpfen mit dem Organismus
Streptouiyces lactamdurans erzeugt. Im allgemeinen können viele
Medien, die eine Kohlenstoff- und Stickstoffquelle darstellen, zur Herstellung von 84-2A eingesetzt werden. Beispiele
hierfür sind die oben in Verbindung mit der Fermentation von 810A beschriebenen, wässrigen Medien und Kohlehydrat- und
Gtickstoffquellen. Die genaue Henge der Kohlehydrat- und
Stickstoffquellen hängt von den anderen im Fermentationsmediuni enthaltenen Bestandteile ab, jedoch liegt im allgemeinen
die Kohlehydratmenge gewöhnlich bei 1 bis 6 Gew.% des
Mediums und die Menge an verfügbarem Stickstoff, entweder allein oder in Kombination liegt gewöhnlich im Bereich von
etwa 0,2/ό bis etwa 6 Gew.% des Medi uras. Die verschiedenen,
im folgenden beschfiebenen Medien dienen zur Erläuterung
von Medien, die zur Herstellung des Antibiotikums 842A geeignet sind. Diese Medien sind lediglich Beispiele verwendbarer
Medien und dienen nicht zur Begrenzung.
Medi U": IX:
Amber-Hefe ITr. JOO ' 10,0 g
Lösliche Brauerei-Bückstände 20,0 g
Dextrose 10,0 g
Destilliertes Wasser 1000,0 ml pK 7,0
109839/1836
Medi am X: ft
Staley's 4-S-Sojabohnenmehl 30?° S
Lösliche Brauerei-Sückstände 7,5 ε
Cerelose ' 20,0 g
NaCl 2,5 g
GaGO3 (nachher pH-Wert auf 7,0) 10,0 g
Destilliertes Wasser 1000,0 ml
Medium XI:
Amber-Hefe Nr. 300 10,0 g
Lösliche Brauerei-Rückstände 20,Og
Destillisiertes Wasser 1000,0 m. pH 7,0
Die Fermentation wird bei Temperaturen im Bereich von etwa
20 bis 37° C durchgeführt, jedoch wird es zur Erzielung optimaler
Ergebnisse bevorzugt, die Fermentation bei Temperaturen von etwa 24 bis 32° C durchzuführen. Der pH-Wert
der für das Wachstum der Streptomyces lactamduraiis Kultur
(MB-2908) und zur Erzeugung des Antibiotikums 842A geeignetenNährmedien
soll im Bereich von etwa 6,0 bis etwa 8,0 liegen.
Eine Fermentation des Antibiotikums 84-2A in kleinem Masstab
wird in einfacher Weise durch Beimpfen eines geeigneten
Nährmediums mit der das Antibiotikum erzeugenden Kultur
durchgeführt, wobei man die Fermentation bei einer konstanten Temperatur von etwa 28° C während mehrerer Tage auf einer Schüttelvorrichtung fortschreiten lässt. Nach Beendigung des Inkubierungszeitrauns wird das Mycel entfernt, und die
überstehende Flüssigkeit wird untersucht.
Nährmediums mit der das Antibiotikum erzeugenden Kultur
durchgeführt, wobei man die Fermentation bei einer konstanten Temperatur von etwa 28° C während mehrerer Tage auf einer Schüttelvorrichtung fortschreiten lässt. Nach Beendigung des Inkubierungszeitrauns wird das Mycel entfernt, und die
überstehende Flüssigkeit wird untersucht.
In der Praxis erfolgt die Fermentation in einem sterilisierten Kolben über eine ein-, zwei-, drei- oder vierstufige
Keimentwicklung. Das Nährmedium für die Keimstufe kann irgend
eine geeignete Kombination von Kohlenstoff- und Stickstoff
quellen sein, beispielsweise irgendeines der vorstehend unter IX bis XC beschriebenen Medien. Der Keimkolben wird
- 76 109839/1836
in einer bei konstanter Temperatur von etwa 28° G gehaltenen
Kammer während eines Zeitraums von 1 "bis etwa 3 Tagen geschüttelt,
und der erhaltene Wuchs wird entweder zur Beimpfung einer zweiten Keimstufe oder des Produktionsmediums
verwendet. Falls Zwischenstufen-Keimkolben verwendet werden,
werden diese in praktisch der gleichen Weise entwickelt, d. h., der Inhalt des Kolbens wird zur Beimpfung des Produktionsmediums verwendet, die beimpften Kolben werden bei einer konstanten
Temperatur mehrere Tage geschüttelt, und nach Beendigung des Inkubierungszeitraums wird der Inhalt der Kolben
zur Entfernung des Mycels zentrifugiert. Die überstehende
Flüssigkeit oder Brühe wird dann konzentriert und unter Erhalt
des Antibiotikums 84-2A gereinigt.
Beim Arbeiten in grösserem Masstab wird es bevorzugt, die
Fermentation in geeigneten Tanks durchzuführen, die mit einem Rührwerk und einer Einrichtung zut Belüftung des Fermentationsmediums
versehen sind. Nach dieser Methode wird das Nährmedium in den Tank gebracht und durch Erhitzen auf Temperaturen
bis zu etwa 120° C sterilisiert. Nach dem Kühlen wird das sterilisierte Medium mit der Produktionskultur beimpft,
und man lässt die Fermentation während eines Zeitraums von einigen Tagen, beispielsweise 2 bis 4 Tage, fortschreiten,
während das Nährmedium bewegt und/oder belüftet wird und die Temperatur bei etwa 28° C gehalten wird. Durch
Veränderung der Entwicklung des Inoculum's und Veränderungen des Produktionsmediums ist es auch möglich, eine mehrfache
Verbesserung der Produktion und eine Steigerung der Wirksamkeit dieses Antibiotikums zu erreichen.
842A Versuchsverfahren unter Verwendung; von Vibrio percolans:
Es wurden Versuche nach dem Scheiben-Platten-Verfahren unter Verwendung von 13 mm Filterpapierscheiben durchgeführt. Diese
Versuchsplatten wurden unter Verwendung von Difco Nähragar plus 2,0 g/l Difco Hefeextrakt bei 10 ml je Platte her-
-77 109839/ 1836
gestellt. Ein Übernachtwuchs des Versuchsorganismus Vibrio percolans (MB-1272) in Fährbrühe und 0,2 % Hefeextrakt wurde
in steriler Salzlösung auf eine Suspension mit 40%iger
Durchlässigkeit bei einer Wellenlänge von 660 mn verdünnt. Diese Suspension wurde in 20 ml/1 Medium vor dem Begiessen
der Platten zugegeben.
Die Versuchsplatten wurden bei 4-° C gehalten, bis sie verwendet
wurden (maximal 5 Tage). Nach dem Aufbringen der mit Antibiotikum gesättigten Versuchsscheiben wurden die Platten
bei 28° 0 während eines Zeitraums von 8 bis 24· Stunden inkubiert.
Die Inhibierungszonen wurden als mm Durchmesser abgelesen.
Sie wurden zur Bestimmung der relativen Wirksamkeiten oder, wenn sie mit einem reinen Bezugsstandard verglichen
wurden, der Wirksamkeit in üg/ml verwendet. Wenn ein derartiger
Versuch in quantitativer Weise durchgeführt wird, können 1 bis 2 iig/ml Antibiotikum festgestellt werden.
Bakterielle Inaktivierung: mit 842A: Eine Untersuchung in
vitro diente zur Bestimmung der Beständigkeit des Antibiotikums 842A gegenüber bakterieller Inaktivierung im Vergleich
mit Cephalosporin C, Cephaloridin und Cephalothin. Diese Untersuchung zeigte, dass das Antibiotikum 842A beständiger
als letztere gegen bestimmte Kikroorganismen ist.
Die bei dem Versuch verwendeten, abbauenden Bakterien waren zwei Organismen, von denen bekannt ist, dass sie Cephalosporin
C vollständig inaktivieren, nämlich Alcaligenes faecalis (MN-9) und Alcaligenes viscosus (MI3-12).
(a) Herstellung von Bakterienzellen: Alcaligenes viscosus
(ΙΊΝ-12) und A. faecalis (MB-9) Zellen wurden wie folgt
hergestellt: Der Inhalt eines L-Rohrs wurde mit einigen
ml Nährbrühe, die 0,2 % Hefeextrakt enthielt, vermischt.
Eine schleifevoll Aufschlämaiung wurde über die Oberfläche
- 78 -
109839/1836
einer Näliragar-Schrägkultur verteilt und 18 Stunden bei
37° C inlcubiert. Sämtliche ßchrägkulturen wurden bei 5° C
aufbewahrt und innerhalb 1 Woche nach Inkubierung verwendet. Eine schleifevoll des Oberflächenwachstum aus Jeder
Sc_2irägkultur wurde aseptisch in 50 al Nährbrühe, die
0,2 % Hefeextrakt enthielt, überführt und 18 Stunden bei
280C unter Schütteln inkubiert. Die Kultur wurde dann
10 Minuten bei 4000 Upm zentrifugiert. Me überstehende
!Flüssigkeit wurde dekantiert und der restliche Zellklumpen
v;urde zweimal mit steriTem 0,1 m-Phosphatpuffer, pH 7*5
(6,8 g Kaliumphosphat, d. h. KH^PO^ und 7^1 g Hatriumhydrogenphosphat
je Liter destilliertes Wasser) gewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden dann in einem Zehntel des
Originalvolumens einer 4 mg/ml-Lösung des Antibiotikums
in 0,1 m-Phosphatpuffer resuspendiert. Das Versuchsgemisch
wurde dann ohne Schütteln in einem auf 37° C eingestellten Wasserbad während 4 Stunden inkubiert. Die Versuchsge-Ed.sehe
wurden dann bei 2000 Upm 10 Minuten zentrifugiert,
und dabei wurde eine klare übex'stehende Lösung erzeugt,
die in sterile Reagensgläser dekantiert wurde und unmittelbar in Trockeneis gefroren wurde, bis sie zur biologischen
Bestimmung bereit war, gewöhnlich innerhalb von 3 Stunden. Versuchsproben wurden in genau der gleichen
Weise mit Ausnahme der Abwesenheit von Seilen inkubiert.
(b) Auslass der Inaktivierung des Antibiotikums 842A; Die
überstehenden Flüssigkeiten wurden auf ihre antibakterielle
Wirksamkeit in der folgenden Weise getestet: 6,5 mm Papierscheiben wurden mit den überstehenden Flüssigkeiten
angefeuchtet und auf die Oberfläche von Ilähragar-0,2
% Hefeextrakt-Platten gebracht, die vorher mit
dem entsprechenden Testorganismus beimpft worden waren. B. subtilie (MB-964) Versuchsplatten wurden in der folgenden
Weise beimpft: 5 ml einer Suspension von gewaschenen
Sporen in 0,9 % Salzlösung wurde zu jeweils 1'50 ml eines
- 79 -109839/1836
0,2 % Nähragar-Hefeextraktes ( 45° C) zugegeben, wovon
5 ml dann in Petri-Schalen von 15 x 100 mm verteilt wurden.
Sämtliche Versuchsplatten wurden bei 5° C gelagert und innerhalb von 3 Tagen verwendet. Die Versuchsplatten wurden
übernacht bei 25° C vor der Messung der Inhibierungszonen
rund um die Testscheiben inkubiert.
Zellfreie Kontrollproben jedes Antibiotikums wurden in
Verdünnungen von 1:1,1:2,1:4,1:8,1:16 und 1 : 32 untersucht, um eine Standard-Bezugskurve zu erhalten.
Lösungen der Testantibiotika wurden bei voller Stärke nach Inkubierung in Gegenvrart der gewaschenen Bakterienzellen
untersucht. Sämtliche Proben wurden dreifach gefahren.
(c) Ergebnisse: Der Prozentgehalt der Inaktivierung wurde
berechnet, indem der Mittelwert der drei aus jedem Versuch erhaltenen Inhibierungszonen genommen wurde und die
Menge an in der Testlösung verbleibendem Antibiotikum, wie sich durch die Standardkurve ergibt, ermittelt wurde.
Dieser V/ert wurde dann von der Ausgangskonzentration
(4mg/ml) subtrahiert und der Sest durch die Ausgangskonzentration
dividiert und mit 100 multipliziert, um die prozentuale Inaktivierung zu erhalten. Die folgende Tabelle
XVI gibt die erhaltene Inaktivierung für Cephalosporin C und das Antibiotikum 842A unter den oben beschriebenen
Bedingungen wieder.
- 80 -
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14305
Prozentuale Inaktivierung nach Inkubierung mit gewaschenen
Bakterienzellen
(bestimmt auf B. subtilis (MB-964) Platten)
Abbauender 4stündige Inkubierung
Organismus Ceph C Antibiotikum
Alcaligenes faecalis
MB-9 99+ O
A. viscosus MB-12 99+ 5^»^
Die Fähigkeit des Antibiotikums 84-2A und von Cephalosporin C,
der abbauenden Wirkung von vier anderen Kulturen zu widerstehen, wurde gleichfalls bestimmt. Diese Kulturen sind:
Escherichia coli 236, Proteus morganii 251 j Proteus morganii
356 und Proteus mirabilis 241. Jede ist gram/negativ und
gegen Cephalosporin C resistent. Bei Durchführung der Untersuchung !wurden Proben der Einzelgemische der Organismen und
eine Probe des Antibiotikums nach 4stündiger Inkubierung entnommen und. hinsichtlich der verbliebenen antibiotischen
Wirksamkeit untersucht. Das Verfahren ist die gleiche Untersuchungsmethode wie oben gegen Alcaligenes faecalis MB-9 und
A. viscosus MB-12 beschrieben. Die folgende Tabelle gibt die
prozentuale Inaktivierung von Cephalosporin C und 842A auf
B. subtilis (MB-964) nach dieser Methode wieder:
236 251 356 241 |
Tabelle | XVII | |
Kultur | Ceph C | Antibiotikum 842A | |
Escherichia coli Proteus morganii Proteus morganii Proteus mirabilis |
>99 >99 >99 72 |
38 80 69 5 |
|
- 81 -
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Die vorangehenden Daten zeigen, dass das Antibiotikum 842A offensichtlich gegenüber Inaktivierung durch A. faecalis,
A. viscosus, Escherichia coli 236, Proteus morganii 251» Proteus morganii 236 und Proteus mirabilis 241 beständiger
ist als Cephalosporin G.
Das nach dem vorliegenden Ifermentationsverfahren erhaltene
Antibiotikum 842A ist eine amphotere Verbindung mit einem scheinbaren i so elektrischen Punkt von etwa pH 3*5; sie ist
bei einem pH-Wert oberhalb von 9»0 instabil, jedoch bei pH 1,5 relativ stabil.
Da die Antibiotika 810A und 842A und deren Salze das Wachstum
verschiedener Species von Salmonella in wirksamer Weise inhibieren, können sie als Desinfektionsmittel zu verschiedenen
Haushaltszwecken und industriellen Zwecken verwendet werden. Beispielsweise ist 810A wirksam gegen Salmonella schottmuelleri
und S. gallinarum, und 842A ist wirksam gegen Salmonella schottmuelleri 3010, S. gallinarum und S. typhosa,
und diese Eigenschaft zeigt deren Brauchbarkeit als sanitäre Mittel für Haushaltszwecke und industrielle Zwecke an.
Antibiotikum 810A: Das Antibiotikum 810A kann durch Adsorption
an ein Ionenaustauschharz, beispielsweise an synthetische Anionaustauschharze, die sich von Dextrose oder Acryl-Copolymeren
ableiten oder nicht-ionische, vernetzte Polymere
gereinigt werden. Das adsorbierte Antibiotikum wird aus dem Harz oder Polymeradsorbat mit V/asser oder mit einer wässrigen,
alkoholischen Lösung eines geeigneten Salzes, wie beispielsweise Ammoniumchlorid, Natriumchlorid und dgl., eluiert. Beispiele
für verwendbare Ionenaustauschharze und Polymere,sind
die DEAE-Sephadex A-25-, Amberlite IKA-68 und Amberlite XAD-2-Medien,
die im folgenden beschrieben sind. Gegebenenfalls
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kann das nach dem vorstehenden Verfahren erhaltene Eluat
durch eine zweite und dritte Adsorptions- und Eluierungsstufe gereinigt werden. Es werden dann Konzentrate sämtlicher
Eluate erhalten, um das gereinigte Produkt zu ergeben.
BIOA-Komponenten: Das Antibiotikum 810A kann in seine Komponenten,
7ß-(I)-5-Amino-5~carboxyvaleramido)-3-(a-methoxyp-sulfooxjrcinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-5-cephem-4-carbonsäure und 7ß-'(^-5-Amino*-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxyp-hydroxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsaure
durch Chromatographie getrennt werden. Dazu gehören:
(1) Chromatographie auf einem stark-hydrophilen Anionenaustauschhars,
wie beispielsweise *DEAE Sephadex A-25? entwickelt mit einem Ammoniumbromid-Ameisensäure-System.
Es können verschiedene Konzentrationen dieses Systems .verwendet werden, jedoch wird in der Praxis eine Lösung
aus 0,5 m-Animoniumbromid und 0,1 m-Ameisensäure bevorzugt.
(2) Chromatographie auf einem schwach-basischen Anionenaustauschharz,
wie beispielsweise **Amberlite lKA-68. Dies
ist eine Gruppenabtrennung, wobei Material in roher Form
bei einem pH-Wert von etwa 3 bis 3,5 aufgegeben wird und
zunächst rat einer Säure bei einem pH-Wert von etwa 2
und dann mit NaCl/HCl bei einem pH-Wert von etwa 1 elu-
dert wird.
(3) Chromatographie nach einem nicht-ionischen, vernetzten Polystyrol-Polymerisat, wie beispielsweise ***Amberlite
XAD-2. Die Eluierung erfolgt mit einem geeigneten, wässrigen System, jedoch ist es im allgemeinen am günstigsten,
ein Gemisch aus Wasser und einem niederen Alkylketon zu verwenden. Typische verwendbare Eluiermittel sind beispielsweise
10 % Methanol in V/asser und anschliessend
- 83-1Q9839/1836
50 % Methanol in Wasser. Anstelle der 50%igen Methanolin-
Wasser- Lösung kann 20 % Aceton-in-Wasser verwendet
Vi erden.
* DEAE Sephadex A-25 ist ein synthetisches Anioiienaustauschharz,
das sich von dem Polysaccharid, Dextran in seiner Chloridform ableitet, d. h. mit
Chlorid-Gegenionen; Pharmacia Fine Chemicals, Inc., 800 Centenial Avenue, Piscataway, New Market, New
Jersey 08854.
** Ein synthetisches Anionenaustauschharz; ein vernetztes
Acrylcopolymerisat, das eine schwachbasische tertiäre Aminogruppe enthält; Rohm & Haas
Co., Philadelphia, Pennsylvania 19105.
*** Ein nicht-ionischer, vernetzter Polystyrol-Polymersorbent;
Rohm & Haas Co., Philadelphia, Pennsylvania 19ΊΟ5·
Die nach den obigen Methoden erhaltenen einzelnen Produkte können durch Rechromatographie gereinigt werden. So kann
beispielsweise 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(ccmethoxy-p-sulfooxycinnamoyloxyiaethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
(Ic) gereinigt werden, indem dieses Produkt der in der obigen Methode 1 beschriebenen Reinigungsmethode unterzogen
wird, mit nachfolgender Entsalzung auf Amberlite XAD-2-Ab sorb ent, und 7ß-(D-5-amirio-5-carboxyvalerainido)-3-(a-methoxy-p-hydroxycinnamoyloxymethyl)-7-methox5r-3-cephem-4-carbonsäure
kann durch Rechromatographie auf einem Sephadex-A-25 Anionenaustauschharz, das mit 0,5 m-Ammoniumbromid
und 0,05 m-Essigsäure entwickelt wird, erneut gereinigt werden.
Antibiotikum 842A; Das Antibiotikum 842A kann durch Adsorption
an einemIonenaustauschharz, wie beispielsweise auf Harzen, die aus quaternaren Ammonium- oder ßulfonsäure-Austauschmedien
aufgetaut sind, gereinigt werden. Das adsorbierte Antibiotikum wird aus dem Harzadsorbat mit wässrigen
Lösungen oder mit einer wässrigen, alkoholischen Lösung
- 84 109839/1836
eines geeigneten Salzes, z. B. Ammoniumchlorid, Natriumchlorid
und dgl., eluiert. Zu geeigneten, verwendbaren Ionenaustauschharz en gehören beispielsweise die Polystyrolharze
mit im Kern befindlichen Sulfonsäuregruppen (45 % oder 53 °/°
Wasser) oder Polystyroltrimethylbenzylammoniumharze (43 % Wasser, die als Dowex 50 bzw. Dowex 1 bekannt sind. Gegebenenfalls
kann das nach dem vorstehenden Verfahren erhaltene Eluat durch eine zweite und dritte Adsorptions- und
Eluierungsstufe weiter gereinigt werden. Konzentrate sämtliche
Eluate werden dann erhalten, um das gereinigte 842A-Produkt zu ergeben.
Das Antibiotikum 810A und seine einzelnen Bestandteile und das Antibiotikum 842A können allein oder in Kombination als
aktiver Bestandteil in irgendeinem einer Vielzahl pharmazeutischer Präparate verwendet werden. Diese Antibiotika
und ihre entsprechenden Salze können in Kapselform oder als Tabletten, Pulver oder flüssige Lösungen oder als Suspensionen
oder Elixiere verwendet werden. Sie können oral, intravenös oder intramuskulär verabreicht werden. Zu geeigneten
in der Zusammensetzung verwendeten Trägern gehören beispielsweise
Mannit, Saccharose, Glucose oder sterile Flüssigkeiten, wie ζ. B. Wasser, Salzlösung, Glykole und öle
aus Erdölherkunft, tierischer, pflanzlicher oder synthetischer
Herkunft, wie beispielsweise Erdnussöl, Mineralöl oder Sesamöl. Ausser dem Träger können die erfindungsgemassen
Zubereitungen auch andere Bestandteile enthalten, wie beispielsweise Stabilisatoren, Bindemittel, Antioxidantien,
Konservierungsmittel, Gleitmittel, Suspendierungsmittel,
Viskositätsmittel, Geschmacksstoffe und dgl. Ferner können in den Zubereitungen auch andere aktive Bestandteile enthalten
sein, um ein breiteres Spektrum antibiotischer Wirksamkeit
zu liefern.
- "85 109839/1836
8(
Die zu verabreichende Dosis hängt weitgehendem Zustand des
zu behandelnden Lebewesens und dem Gewicht des Wirts ab. Der ■- parenterale Weg wird für allgemeine Infektionen und der orale
Weg für Intestinalinfektionen bevorzugt. Im allgemeinen besteht eine tägliche Dosis aus etwa 15 bis etwa 175 mg aktivem
Bestandteil je kg Körpergewicht des Lebewesens in einer oder mehreren Anwendungen je Tag. Eine bevorzugte tägliche Dosis
für das Antibiotikum 810A oder dessen Einzelkoiaponenten
liegt im Bereich von etwa 20 bis 40 mg an aktivem Bestandteil je kg Körpergewicht. Die bevorzugte tägliche Dosis für das
Antibiotikum 842A liegt im Bereich von etwa 40 bis 80 mg an aktivem Bestandteil je kg Körpergewicht.
Die vorliegenden Zubereitungen können in verschiedenen Einhe .tsdosierungsformen, beispielsweise in fester oder flüssiger,
oral einnehmbarer Dosierungsforni, verabreicht werden.
Die Zubereitungen enthalten je Einheitsdosierung, gleich ob flüssig oder fest, im allgemeinen etwa 15 mg bis etwa 700 mg
aktivem Bestandteil, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zubereitungen; jedoch wird es im allgemeinen bevorzugt, eine
Dosierungsmenge im Bereich von etwa 80 mg bis 320 mg zu verwenden. Bei parenteraler Verabreichung ist die Einheitsdosierung gewöhnlich die reine Verbindung in einer sterilen
Wasserlösung oder in Form eines löslichen Pulvers, das zur Auflösung bestimmt ist.
Eine typische Einheitsdosierungsform besteht im Vermischen von 120 mg Antibiotikum 810A oder 120 mg einer seiner Bestandteile
oder eines Salzes mit 20 mg Lactose und 5 mg Magnesiumstearat und Einbringung des 145 mg Gemische in
eine Gelatine-Kapsel Nr. 3. In ähnlicher Weise können unter Verwendung von mehr aktivem Bestandteil und weniger Lactose
andere Dosierungsformen in Gelatine-Kapseln Nr. 3 eingebracht
werden, und sollte es notwendig sein, mehr als 145 mg Be-
- 86 109839/1836
standteile zusammen zu vermischen, können grössere Kapseln
verwendet werden. In ähnlicher Weise können andere Einheitsdosierungen, wie beispielsweise gepresste Tabletten und Pillen
gleichfalls hergestellt werden. Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung:
Trockengefüllte Kapsel, die 120 mg 7ß-(D-5-amino-5-carboxyval
eramido )- J- (cr-raethoxy-p- nul f ooxycinnamoyloxymethyl )-?-
metlio2ry-3-(cephe^-4-carbonsäiLre(Ic; enthält
je Kapsel
7-ß- (D-5-Ainino-5-carbo:xyval eramido )-j-Ca-methoxy-p-sulfooxycinnaraoyl)-oxyra
ethyl) -7-ni e thoxy- 3- c ephem-4- c arbonsaüre
(Ic)
Lactose
Magz^Gsiumstearat
Magz^Gsiumstearat
Kapselgrösse Kr. 3 Λ^ mg
120 | mg |
20 | mg |
5 | mp; |
Die 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxyniethyl)-7-methoxy-3-cephein-4—carbonsäure
(Ic) wird auf ein Pulver einer Korngrösse entsprechend einem Siebdurchgang durch ein Sieb mit 0,25 1^ (Nr. 60)
zerkleinert und dann werden Lactose und riagnesiumstearat
durch, ein Siebtuch jnit 0,25 e™ lichter Ha sch emv ei te (Nr. 60)
auf das Pulver gegeben, und die vereinigten Bestandteile werden 10 Hinuten vermischt und dann in Gelatine-Kapseln
Nr. 3 eingefüllt.
Indem 40 mg Antibiotikum 842A und 100 mg Lactose anstelle
der 120 mg an aktivem Bestandteil und 20 mg Lactose in der vorangehenden Zubereitung eingesetzt werden, erhält man eine
145 ng Kapsel, die gleichfalls zur oralen Verabreichung geeignet
ist.
-87 -
10 9 8 3 9/
250 mg 7ß-(D-5--Ä-niino-5-carboxyvaleramido)-3-(tt-methoxy-psulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-fflethox3''-3-cephem-4-carbon
säure (Ic) enthaltende Tablette
je Tablette
7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-
3-(<x-methoxy-p-sulfooxycinnamoyl-
oxymethyl)-7-m ethoxy- 5- c ephem-4-
carbonsäure (Ic) 250
Dicalciumphosphat, U.S.P. 192 mg
Magnesiumstearat 5 mg
Lactose, U.S.P. 65 mg
Der aktive Bestandteil wird mit dem Dicalciumphosphat und der Lactose vermischt. Das Gemisch wird mit 15%iger Maisstärkepaste
(6 mg) granuliert und grobgesiebt. Es "wird bei
45 C getrocknet und wieder durch ein ßieb mit 1,2 mm
lichter Maschenweite (Wr. 16) gesiebt. Das Magnesiumstearat wird zugegeben und das Gemisch zu Tabletten von etwa 13 mm
Durchmesser gepresst.
7ß-(D-5-Amino~5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)~
^-methoxy-J-cephera—^-carbonsäure (Ib) enthaltende Tablette
7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvuleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-Biethoxy-3-cephem-4-carbonsäure
(Ib) Maisstärke, U.S.P.
Di calci umpho sphat
Lactose, TJ.S.P.
Di calci umpho sphat
Lactose, TJ.S.P.
Der aktive Bestandteil wird mit dem Dicalciumphosphat und der Lactose und etwa der Hälfte der Maisstärke vermischt.
Das Gemisch wird dann mit einer 15%igen Haisstärkepaste (6 mg) granuliert und grobgesiebt. Es wird bei 45° C getrocknet
und durch Siebe mit 1,2 mm lichte Haschenweite
- 88 1098 3 9/1836
je Tablette | mg |
125 | mg |
6 | mg |
192 | mg |
190 |
(Nr. 16) gesiebt. Der Best der Maisstärke und das Magnesiumstearat
v/erden zugegeben, und das Gemisch wird zu Tabletten mit einem Durchmesser von etwa 13 ^™-» cüe je 800 mg wiegen,
verpresst.
500 mg 7ß-(I)-5--Ä-niino-5-carboxyvaleramido)-3-(oc-methoxy-psulfooxycinnamoyloxyinethyl)-7-ittethoxy-3-cephem-4-carbonsäure
(Ic) enthaltende parenterale Lösung
Ampulle:
7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleraniido)-3-(a-methoxy-p-sulfooxycirmamoyloxyl)7hb
y)7y3p säure (Ic) . 500 mS
Ampulle:
Verdünnungsmittel: Steriles Wasser für -,
die Injektion 2 cm5
Die 7ß-(D-5--A-mii1o-5-carboxyvaleramido)-3-(a-2iethoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-iaethoxy-3-cephem-4-carbonsäüre
(Ic) kann allein oder in Kombination mit anderen biologisch aktiven Bestandteilen verabreicht werden, beispiels
weise mit anderen antibakteriellen Mitteln, wie beispielsweise Lincomycin, einem Penicillin, Streptomycin, Novobiocin,
Gentamicin, Neomycin, Colistin und Kanamycin.
Durch Einsatz einer äquivalenten Menge -7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
(Ib) anstelle der 500 mg 7ß-(^-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxyme.thyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
(Ic) in der vorangehenden Zubereitung kann auch eine zur parenteralen
Verabreichung geieignete Zubereitung erhalten werden.
Ausser den vorstehend beschriebenen Fermentationsprodukten umfasst die Erfindung Derivate, in denen der 3-Carbamoyloxy
- 89 109839/1836
Anteil von 842A durch, eine grosse Vielzahl von Substituenten
ersetzt ist. Im allgemeinen erfolgt dieser Ersatz oder diese Substitution durch einfache Behandlung von 842A mit einer.!
Reagens, das zur Überführung des 3-Carbamoyloxy-Anteils in
den gewünschten Substituenten R (siehe Formel I) befähigt ist. Jedoch ist es in der Praxis häufig notwendig, vor dem
Ersatz des 3-Carbamoyloxy-Restes die freien Amino- und Carboxy-Gruppen
durch Behandlung von 84-2A mit einem Stickstoff-Blockierungsmittel,
wie beispielsweise einem IT-niedrig-Alkoxycarbonylphthalimid
und einem Veresterungsiaittel unter Bildung des entsprechenden 7ß-(D-5-Phthaloyla:Lino-5-carboxyvaleramido
)~$- ( cax-bamoyloxyniethyl )-7-methoxy- 3-cephem-4-carbonsäure-diesters
(folgende Verbindung II) zu schützen. Zu geeigneten Veresterungsmitteln gehören Phenyldiazomethan
od. jr Diphenyldiazomethari und dgl. Auch gehören zu anderen
anstelle des N-niedrig-Alkoxycarbonylphthalimids verwendbaren
Stickstoff-Blockierungsmitteln tertiäres Butyloxyazid oder Trihalogenäthoxycarbonylhalogenide, wie beispielsweise
Trichioräthoxycarbonylchlorid und dgl. Die folgende Gleichung,
in der das Stickstoff-Blockierungsmittel ein H-niedrifc-Allroxycarbonylphthalimid
ist, erläutert diese Reaktion, jedoch sei
darauf hingewiesen, dass andere Stickstoff-Blockierungsmittel,
beispielsweise die oben erwähnten, anstelle dessen in einer sonst gleichen Reaktion eingesetzt werden können, um das
entsprechende li-substituierte Derivat zu erhalten:
- 90 _
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34
O OCH-
HOOC-CH-(CH
2' 3
L. \
NH-
Ib
COOH
I!
0 OCH3
HOOC-CH- (CH2) 3-CNH~-
CO
COOH
I!
R13R14HCOOC-CH-(CH0),-•
j 2 3
O=C C=O -
II
0 OCH,
COOCHR13R14
worin Ii ^H C=ITp Diazomethan oder ein arylsubstituiertes
Diazomethan ist, v;ie beispielsweise Phenyldiazonethan oder
Ί "5 Ί4-Diphenyldiaz03ethan
und dgl., und K ^ und R V/asserstoff oder Phenylreste sind. Die auf diese Weise erhaltene Verbindung
(II) ist das Ausgangsmaterial in den folgenden synthetischen Verfahren.
1 O S 8 3 9 / 1 8 3
14305
Das 3-Hydroxyinethylanaloge von 842A wird durch Behandlung der
Verbindung II mit einem Nitrosyl1 halogenid, beispielsweise
Nitrosylchiοrid, in einem geeigneten Lösungsmittel, wie beispielsweise
lie thy 1 enchlpri d, erhalten. Die folgende Gleichung erläutert dieses Herstellungsverfahren:
O OCH-
R13R14HC-OOC-CII-- (CH2) 3~C-h
II
, .J-CH2OCNII2
COO-CIIR13R14
NOCl/CI^Cl
\l
O OCH-
R13R14HC-OOC-CH-(CH2) 3-C~miS
O=C
C=O
III
20H .00-CHR13R1
-92-
109829/1836
14305
Ί4
worin R J und R die vorstellend angegebene Bedeutung besitzen.
Der so erhaltene Diester, vorzugsweise der Di-benzylester
(lila) kann dann in die entsprechende freie Aminosäure (IV) durch katalytische Hydrierung und Behandlung mit Hydrazinhydrat
in einer basischen Lösung hergestellt werden. Die Deblockierung erfolgt nach dieser Methode am zweckmässigsten,
wenn das Diester-Reaktionsmittel der Dibenzylester (lila)
ist. Die folgende Gleichung erläutert dieses Herstellungsverfahren:
O OCH3
-C-NH-f
IHa
COO-CH2
K2Pd
0 OCH0
- Il f \
HOOC-CH- (Clip) --C-NH-f- f hs
■I
o=c c=o
N J
-CII9OH
COOH
Biise
O OCH J
MOOC-CH-(CH9) -C-NH-
IV
- 93
109839/1836
wobei M das von einem Alkali- oder Erdalkalimetall abgeleitete
Kation ist.
Die N-mono-substituierten und Ν,Ν,-disbustituierten J-Carbfcmoyloxyaiialogen
von 842A werden in einfacher V/eise durch Behandlung des Diesters der 7ß-(D-5-ßithaloylamino-5-carboxyvalerai;iido)-3-(hydro>^rraethyl)-7-methoxy-3-cephem-4~cai-bon~
säure, vorzugsweise in Form ihres Dibenzhydryl esters (IHb), mit einem Carbony!halogenid, wie beispielsweise Carbonylchlorid
(d. h. Phosgen) oder Carbonylbromid, und βηεοΙιϋοΞ-sende
Reaktion des auf diese V/eise erhaltenen Bibenzhydrylesters
der 7ß-(D-5-i>hthaloyIamino-5-carboxyvaleramido)-3-(halogenformyloxymethyl)-7-methoxy~3~cepheia-4--carbonsäure
(Yj mit dem entsprechenden rlono-niedrig-alkylamin, Diniedrig-alkylamin
oder heterocyclischen Amin erhalten:
- 94 -
109839/1836
14305
9. ocii.
-cH- (cn) 3-c-uH-|
IHb
-CH OH 2
COOCH-i^
COX-
C C
O OCIU
Il 4
C-KII
Ii
COOCHίζ
HNR15R16
O OCH.
VfCIl-OOC-CH- (CH0) --C-NH--
2 3
o=c c=o
/RJ-J
15 ^CH2OC^r16
COO-CHf^ V>)
VI
worin COXp ein Carbonylnalogenia, beispielsweise Carbonylchlorid
(ά. h. Phosgen) oder Carbonylbronid und X einen
Λ C /IC
Halogenrest, beispielsweise Chlor, Brom und dgl., HIiR -\R
- 95 39/1836
14305
ein primäres oder sekundäres Amiη aus Kono-niedrig-alkylaminen,
Di-niedrig-alkylaminen und/oder heterocyclischen
Aminen und
und E niedere Alkylreste, wie beispielsweise
Methyl-, Äthyl-, n-Propyl-, n--Butylreste und dgl. bedeuten
und R und R. zusammengenommen mit dem Stickstoffatom, an
das sie gebunden sind, unter Bildung eines mononuklearen,
heterocyclischen Amins aus Pyrrolidin, Piperidin und/oder Morpholin kombiniert sein können. Das so erhaltene Produkt
(VI) kann dann in die entsprechende freie Aminosäure durch Behandlung mit Trifluoressigsöure in Xylol und darm mit
Hydrazinhydrat in einer basischen Lösung überführt werden:
O OCH Il
-00C-CH-(CH9)-,-
-00C-CH-(CH9)-,-
O-C C=O
\Z)
vi
J]
HOOC-CH- (CII9) .,-C-UH-
HOOC-CH- (CII9) .,-C-UH-
I J
O=C
Va
O OCH-, J] I 3
COOH
Base
O QCH3
MOOC-CH-(CH2J3-C-NH-
109839/1836
1 5 16
worin M nnd R ^ und R die vorstehend angegebene Bedeutung
worin M nnd R ^ und R die vorstehend angegebene Bedeutung
besitzen«.
Ein anderes Verfahren zur Herstellung der N-monosubstituierten
Derivate von 842A besteht in der Behandlung der Verbindung
III oder eines Disalzes davon mit einem geeigneten Isocyanat.
Diese Umsetzung wird besonders vorteilhaft in Gegenwart
einer starken organischen Base, beispielsweise Triäthylamin und in Gegenwart eines inerten Lösungsmittels, z. B. Dimethylformamid, Methylenchlorid, Tetrahydrofuran oder Acetonitril , durchgeführt:
einer starken organischen Base, beispielsweise Triäthylamin und in Gegenwart eines inerten Lösungsmittels, z. B. Dimethylformamid, Methylenchlorid, Tetrahydrofuran oder Acetonitril , durchgeführt:
R13R14HCOOC-CII- (C
-N
O=C"
O=C"
COOCIIR13R14
III
0 OCH _
Il rf
R13R14HCpOC-CII-(CH0) ,-CNH-/ f-"SN ' 0
ί 2 3 Il
COOClIR13R14
-97 109839/1836
worin E ' einen niederen Alkylrest, halogensubstituierten
niederen Alkylrest. z. B. ChIοrmethyl-, 2-Chloräthyl- oder
Chlor-tert.-butylrest und dgl., niederen Alkoxycarbonylrest,
beispielsweise einen A'thoxycarbonylrest und dgl. , mononuklearen
und birxuklearen Arylrest, z. B. Phenyl-, liaphthyirest
und dgl., mononuklearen Alkarylsulfonylrest, z. B. p-Tolylsulfonylrest
und dgl. , od.er einen Benzhydrylrest bedeutet. Typische verwendbare Isocyanat-Reaktionsmittel
(d. h. OC-KE ') sind beispielsweise Methylisocyanat, ilthylisocyanat,
tert.-Butylisocyanat, Chlonaethylisocyanat,
ß-Chloräthylisocyanat, Carbäthoxyisocyanat, PhenyIisocyanat
und Benzhydryli so cyanat. Die nach diesem Verfahren erhaltenen Produkte können dann in die entsprechende freie Säure
nach der vorherbeschriebenen Methode, d. h. durch Behandlung v±t Trifluoressigsäure in Xylol und anschliessende Umsetzung
des erhaltenen Zwischenproduktes mit Hydrazinhydrat in basischer Lösung überführt werden.
Die 3-acylierten Derivate der Erfindung entsprechen der
Formel I, worin E einen niederen Alkanoyloxyrest, aromatischen Carbonyloxyrest, Aralkanoyloxyrest oder Cycloalkancarbonyloxyrest
bedeutet, werden in einfacher V/eise durch Behandlung des Dibenzhydryiesters der 7ß-(D-5-Phthaloylamino-5-carboxyvaleramido)-3-(hydroxymethyl)-7-methoxy-3~
cephem-4~carbonsäure (IHb) mit einem geeigneten Acylhalogenid
erhalten. Die folgende Gleichung erläutert dieses Herstellungsverfahren
:
- 98 -
109839/1836
14-305 -
Il
OCH
CII-OC-CII- (CII0) -.-C-NH-/
ι 2 3
O-C
C=O
HIb
XCR
18
O OCH.
(' V)CH-OOC-CH-(CHn) -CNH-i——
HlC
NH- p\ 0
J. J1 J-CIT OCP18
COOClH ^ \\
18
worin R einen niederen Alkylrest, "beispielsweise einen Methyl-, ilthylrest und dgl., mononeklearen und binuklearen Arylrest, beispielsweise einen Phenylrest, einen mononuklearen, stickstoffhaltigen Heterocyclus, wie beispielsweise 4—Pyridylrest und dgl., Naphthylrest und dgl., mononuklearen und bi-nuklearen niederen Alkylrest, wie beispielsiveise Benzyl-, ilenapiithylrest und dgl., oder einen Cycloalkylrest mit 5 bis 6 Kernkohlenstoffatomen, ζ. B. Cyclopentyl- oder Cycloliexylrest und dgl. , bedeutet und X die vorstehend angegebene Bedeutung besitzt. Das so erhaltene Produkt kann wiedei'um in die entsprechende freie Säure durch Behandlung mit Trifluoressigsäure in Xylol und anschliessende Umsetzung des erhaltenen Zwischenproduktes mit Hydrazinhydrat in einer basischen Lösung erhalten werden.
worin R einen niederen Alkylrest, "beispielsweise einen Methyl-, ilthylrest und dgl., mononeklearen und binuklearen Arylrest, beispielsweise einen Phenylrest, einen mononuklearen, stickstoffhaltigen Heterocyclus, wie beispielsweise 4—Pyridylrest und dgl., Naphthylrest und dgl., mononuklearen und bi-nuklearen niederen Alkylrest, wie beispielsiveise Benzyl-, ilenapiithylrest und dgl., oder einen Cycloalkylrest mit 5 bis 6 Kernkohlenstoffatomen, ζ. B. Cyclopentyl- oder Cycloliexylrest und dgl. , bedeutet und X die vorstehend angegebene Bedeutung besitzt. Das so erhaltene Produkt kann wiedei'um in die entsprechende freie Säure durch Behandlung mit Trifluoressigsäure in Xylol und anschliessende Umsetzung des erhaltenen Zwischenproduktes mit Hydrazinhydrat in einer basischen Lösung erhalten werden.
- 99 -
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Die 3-Methylanalogen von 84-2A werden in einfacher Weise durch
Reduktion von S4-2A oder einem Salz davon, beispielsweise
durch katalytisch^ Hydrierung des entsprechenden Alkalioder
Erdalkalisalzes, erhalten. Zu Katalysatoren, die in diesem Verfahren verwendet v/erden können, gehören beispielsweise
beliebige Metalle der Gruppe VIII des Periodischen Systems, beispielsweise Palladium, Platin oder Nickel. Die folgende
Gleichung erläute3?t dieses Herstellungsverfahren:
1100C-CH-(CH0) _-
ί 2 3 NIU
Il
CH2OCKH2
COOH
HOOC
-CH-* (CH ) -C-NH-^--—
COOH
Solche Derivate von 842A, die nicht nach den vorangehenden-Methoden
hergestellt werden, können durch Behandlung eines 3-Acyloxymethylanalogen von 842A, beispielsweise dem 3-niedrig-Alkanoyloxymethylanalogen,
z. B. 7ß-(D-5-Airiino-5-carboxyvalerani
do)-J-(ac etoxymethyl)-7-Kethoxy-3-c ephem-4-carbonsäure,
mit dem geeigneten Thioharnstoff oder li-substituierten
Thioharnstoff, Thiol, Dithiocarbamat, Dithio-
- 100
10983971836
carboxylat, Amin, Pyridin, kernsubstituierben Pyridin, Alkalisulf
inat, Az.id, Polyhydroxybenzol oder 11-niedrig-Alkylindol
erhalten werden. Die sich ergebenden Produkte können dann durch übliche Mittel, z. B. durch Umkristallisation aus geeigneten
Lösungsmitteln, wie beispielsweise Methanol und
Wasser oder durch Fraktionierung durch ein geeignetes Ionenaustauschharz
gereinigt werden.
Es wurde festgestellt, dass ausser dem 3-Acyloxymethylanalogen
von 842A das 842A an sich als ein Ausgangsiaat'erial bei
der Umsetzung mit Thioharnstoff und Alkaliaziden usw. verwendet v/erden kann. So kann beispielsweise 842A mit dem
geeigneten Thioharnstoff, N-substituierten Thioharnstoff,
Ν,ΐί-disubstituierten Thioharnstoff, Alkaliazid, Thiazol,
Thiadiazol, Halogenierungsmittel oder Alkalithiocyarat unter
Bildung der entsprechenden 3-Thiouroniumnethyl-, J-Azidomethyl-,
3-Thiazolylm-ercaptomethyl-, J-Thiadiazolylmercaptomethyl-,
Ilalogenmethyl- und 3-Thiocyanatomethylanalogen von 842A behandelt \ferden. Im Prinzip ist es lediglich notwendig,
die Ausgangsmaterialien zu vereinigen, um die Synthese
herbeizuführen, jedoch ist es in der Praxis gewöhnlich zweckmässig,
die Reaktion durch Anwendung von Wärme, beispielsweise durch Erhitzen auf Temperaturen im Bereich von etwa
45 bis 95° G während eines Zeitraums von etwa 2,5 Tagen bis
einigen Minuten zu katalysieren. Eine bevorzugte Arbeitstemperatur liegt im Bereich von etwa 75 bis 80° C, und gute
Ergebnisse wurden auch'nach Erhitzen der Eeaktionsteilnehmer bei 95° c während etwa 8 Minuten erhalten. In einigen Fällen
ist es auch zweckmässig, die freie Amiriogruppe in der 5~ Amino-5-carboxyvaleramido-öeitenkette des 842A zu schützen,
indem letztere mit tert.-Butoxycarboriylazid oder einem ähnlichen
Blockierungsmittel behandelt wird. Die erhaltene 7ß-(D-5-N-tert.-Butoxycarbonylairiino-5-carbo3cyvaleramido)-3-carbamoy
loxyrn.ethyl)-7-methoxy- J-c epheu-4- carbonsäure kann
dann mit dem entsprechenden Thioharnstoff, Alkaliazid, Thia-
.-. 101 >
109839/ 1836
4Oi
zol, Thiadiazol, Halogenierungsmittel oder 'I'hiocyanat-Reaktionsmittel
behandelt ν/erden, um den gewünschten Substituenten
in der J-Stellung des 842A Kerns ohne die Gefahr
irgendwelcher unpassenden Seitenreaktionen einzuführen. Das so erhaltene Zwischenprodukt kann dann durch Behandlung mit
einem geeigneten Reagens, wie beispielsweise Trifluoressigsäure,
unter Erzielung des gewünschten Produktes deblockiert Vi erden.
Bas nach dem vorangehenden Verfahren erhaltene 3-Azidomethyl-Deri
vat von 84-2A wird in sein entsprechendes J-Aminomethylanaloges
durch Reduktion überführt. Zu geeigneten Mitteln gehören beispielsweise molekulare Reduktion und Hydrierung
über einem geeigneten Metallkatalysator, wie beispielsweise äi-i Metalle der Gruppe VIII des Periodischen Systems. Zu
typischen verwendbaren Metallen gehören beispielsweise Platin, Palladium und Nickel und deren Kombinationen.
Die molekulare Reduktion des 3-Azidomethyl-Derivats wird
am günstigsten durchgeführt, indem Zinkstaub zu einer sauren Lösung des J-Azidomethyl-Reaktionsmittels zugegeben wird.
Die erhaltene Lösung wird dann mit Schwefelwasserstoff oder einem äquivalenten Material zur Entfernung des löslichen
Zinks aus der Lösung in Form eines Niederschlags behandelt. Das auf diese Weise erhaltene Produkt ist das praktisch reine
3-Aminomethylanaloge von 842A.
Die erfindungsgemässen Produkte (I) bilden eine grosse Vielzahl
pharmakologisch verträglicher Salze mit anorganischen und
organischen Basen; dazu gehören beispielsweise Metallsalze, wie z. B. solche, die sich von Alkali- und ErdalkalihydiO-xiden,
Carbonaten und Bicarbonaten ableiten und Salze, die sich von primären, sekundären und tertiären Aminen ableiten,
wie beispielsweise Monoalkylamine, Dialkylamine, Trialkylaniine,
niedere Alkanolamine, Di-niedrig-alkanolamine, niedere
- 102 109839/1836
Alkyl endiamine, IT, N-Diaralkyl-ni edri g-alkylendiamine, Aralkylamine,
aminosubstituierte niedere Alkanole, N,N~di-niedrigalkylaminosubstituierte
niedere Alkanole, amino-, polyamino- und guanidinosubstituierte niedere Alkansäuren und stickstoffhaltige
heterocyclische Amine. Zu typischen Beispielen dieser Salze gehören Salze, die sich von Natriumhydroxid, Natriumcarbonat;,
Katriumbicarbonat, Kaliuiacarbonat, Kali uinhydr oxid,
Calciumcarbonat und dgl. ableiten und Salze, die sich von
Aminen, wie beispielsweise Trimethylamin, Triäthylamin, Piperidin,
Horpholin, Chinin,. Lysin, Protamin, Arginin, Procain,
Ethanolamin, Morphin, Benzylamin, Äthylendiamiη, Ν,Ν1-Dibenayläthylendiamin,
Diethanolamin, Piperazin, Dimethylarninoäthanol,
2-Amino-2-methyl-1-propanol, Theophyllin und
N-rlethylglucanin und dgl. , ableiten.
Die vorstehend erwähnten Salze können Monosalze sein, wie
beispielsweise das Hononatriumsalz, das beispielsweise durch
Behandlung eines Iquivaleriö Natriumhydroxid mit einem Äquivalent
des Produktes (I) erhalten \irird, oder gemischte Disalze,
die durch Behandlung eines Äquivalente des Monosalzes
mit einem Äquivalent einer abweichenden Base, erhalten \*rird.
Diese Disalze können auch erhalten werden, indem ein Äquivalent
einer Base mit einem zweiwertigen Kation, wie beispielsweise Calciumhydroxid, mit einem Äquivalent des Produktes
(I) behandelt wird. Ferner kommen gemischte Salze und Ester,-wie beispielsweise solche, die durch Behandlung
des Produktes (1) mit einem Äquivalent Natriumhydroxid und dann mit einem Äquivalent Milchsäure erhalten werden, in Betracht.
Die erfindungsgemässen Salze sind pharmakologisch verträgliche,
nicht-toxische Derivate die als wirksamer Bestandteil
in geeigneten pharmazeutischen Einheitsdosierungsformen verwendet werden können. Sie können auch mit anderen Arzneimitteln
kombiniert werden, um Präparate mit einem breiten Virkungsspektrum zu ergeben. Ferner sind die erfindungsgemäs-
- 103 109 8 3 3/1836
O 1 η η ο r /
sen Salze und ebenfalls die entsprechenden Ester und Amid-Derivate
brauchbar als Zwischenprodukte zur Herstellung des durch die Formel I wiedergegebenen Carbonsäure-Produktes. Die
Salze können auch zur Herstellung anderer pharmazeutischverträglicher
Salze verwendet werden.
Ausser in Salze können die erfindungsgemässen Produkte (I)
auch in ihre, entsprechenden Mono- und Diester und Mono-
und Diamide überführt werden, wie beispielsweise die PfrfiLoyloxymethyl-
oder Dibenzhydrylester oder Alkyl-, Cycloalkyl.-, Aryl- oder Aralkylester, wie beispielsweise die Methyl-,
Äthyl-, Cyclohexyl-, Phenyl- und Benzylester oder Amide, Diamide, N-niedrig-Alkylamide, Ιί,Π-Di-niedrigalkylamide, E-Aralky!amide,
N,Ii-Diaralky!amide oder heterocyclische Amide,
wie beispielsweise Η-Methyl- und B-Jithylamid, N,H-Dimethy1-amid,
Ν,Η-Diäthylamid, Π-Benzylamid, Η,Ε-Dibenzylamid, Piperidid,
Pyrrolidid oder Morpholid und dgl.
Zu Methoden zur Herstellung der vorstehend erwähnten Ester und Amid-Derivate gehören die Reaktion des Carbonsäure-Produktes
(I) oder eines entsprechenden Säurehaiοgenids mit
Methanol, Äthanol, Cyclohexanol, Phenol, Benzylalkohol oder Dibenzhydrol. In ähnlicher Weise können die Amid-Derivate
erhalten werden, indem das entsprechende Säurehalogenid mit.
Ammoniak oder mit dem entsprechenden Alkylamin, Dialkylamin, Aralkylamin oder heterocyclischen Amiη behandelt wird. Diese
und andere übliche Methoden zur Herstellung dieser Ester und Amide sind dem Fachmann geläufig.
Die folgenden Beispiele erläutern die Verfahren, über die die erfindungsgeraässen Produkte erhalten werden können. Die
Beispiele dienen jedoch lediglich zur Erläuterung, und es ist dem Fachmann klar, dass von der Erfindung andere funktionell-äquivalente
Produkte und Verfahren zu ihrer Herstellung eingeschlossen sind. Daher ist jede Modifikation dieser
- 104- -
1098 3 S/183 6
14 305
Synthesen, die zur Bildung eines identischen Produktes führt, als analoge Methode anzusehen. Das beanspruchte Verfahren
unterliegt weitgehender Variation und Kodifikation, und daher wird Jede geringe Abweichung oder Ausdehnung als im Rahmen
der Erfindung liegend betracht.
Ein lyophilisiertes Reagensglas mit Streptomyces griseus Kultur
(MA-2837) wurde aseptisch geöffnet» Der Inhalt wurde zur
Beimpfung von vier ßchrägkulturen eines Nährmediums der folgenden
Zusammensetzung verwendet:
Medium I;
Difco-Hefeextrakt 10,0 g
Glucose 10,0 g
* Phosphatpuffer 2,0 ml
MgSO4 · 7H2O 0,05 g
Destilliertes Wasser · 1000,0 ml
Difco-Agar 25,0 g
* Phosphatpuffer
91,0 g
24 95,Og
Destilliertes Wasser 1000,0 ml
Die Schrägkulturen wurden durch Verteilung von 14 ml/ 22 χ 75 mm Kulturreagensglas hergestellt. Das Reagensglas
wurde mit V/atte verstopft, 15 Hinuten auf 120° G zur Sterilisierung
erhitzt, und man liess das Medium in schräger Anordnung verfestigen. Die beimpften Schrägkulturen wurden
bei 28° C 1 Woche inkubiert und dann bei 4° C bis zur Verwendung
gelagert. Die Kultur auf einer dieser Schrägkultu-· ren wurde dann zur Beimpfurig v_n mit Unterteilungen ver—
- 105 - · 109839/1836
sehenen 250 ml Erlenmeyer-Kolben verwendet, die 50 ml Medium II
enthielten, indem 5 ml steriles Medium zugegeben wurden, die
Schrägkultur-Oberfläclie gekratzt wurde,um das Wachstum zu
unterbrechen und 1 ml in jeden der drei Keimkolben aseptisch
pipettiert wurde. Das Medium II besass die folgende Zusammensetzung:
Medium II;
Rindsextrakt . 3,0 g
* NZ Amin 10,Og
Dextrose 10,0 g
NaCl . 5,0 g
Destilliertes V/asser 1000,0 ial
pH mit NaOH auf 7,2 eingestellt
* Ein enzymatisch abgebautes Casein
Der Keimkolben wurde auf einem Rotationsschüttler bei 220 Upm
mit einen Hub von 5 cm 3 £"age geschüttelt. Die Keiiakolbenkultur
wurde dann zur Beimpfung von 11 mit Unterteilungen versehenen 2-Liter-Erlenmeyer-Kolben verwendet, die 350 ml
Medium III enthielten, wobei 2 bis 3 °/° Inoculum verwendetwurde.
Medium III besass die folgende Zusaramens etzung:
Medium III:
Dextrose Asparagin
Hefeextrakt * Spurenelement gemi sch ITr. 2
Destilliertes Wasser
pH mit ITaOH auf 7,2 eingestellt
10,0 | 6 |
1,0 | ε |
0,1 | S |
0,5 | ε |
0,5 | g |
10,0 | Eil |
1000,0 | ml |
- 106 -
109839/1836
14305
* 7H
Gpurenelementgemisch Hr. 2:
7H2O 1,0 g
H2O 1,0 g
CuCl2 · 2E2O 25,0 mg
CaCl2 100,0 mg
56,0 mg
• 4Ho0 19,0 mg
ZnSO4 β 7H2O 200,0 mg
Destilliertes Wasser 1000,0 ml
Die ICoIl)en wurden dann auf einem Schüttler "bei 135
150 Upm. mit einem Hub von 5 cm 4 Tage bei 28° C geschüttelt
Kac.li BeendiGizrig des Inkubationszeitraums wurde der Inhalt
der 11 Kolben vereinigt und untersucht. Die Untersuchung der kombinierten, zentrifugierten Brühe zeigte eine Inhibier
ungßζoixu von 22 mm (13 mm-Scheiben) gegen Proteus vulgariy
auf einer Standard-Versuchsplatte. Dieses Antibiotikum,
wurde als 810A identifiziert, d. h. ein Antibiotikumgemisch, das 7ß-(D~5-Amino-5-carboi:yvaleramido)-3-(aiaeth.o3^-p-suli"ooxycinnainoyloxyrtethyl)-6-m.ethoxy-3-ceph.em-4-carbonsäure
und 7ß-(D-5-Amino-5-carbocyvaleramido)-3-(a-
carbonsäure (xa) enthält.
Beispiel 2
Beispiel 2
Antibiotikum 81QA
Ein lyophiliciertes Reagensglas mit Streptomyces griseus
(ΓΙΑ-2837) wurde aseptisch geöffnet, und der Inhalt wurde
zur Beimpfung der als Medium I in Beispiel 1 beschriebenen Nährmedium-Schrägkulturen verwendet. Diese Schrägkulturen
wurden bei 28° C 1 Woche .inkubi-ort, wonach sie bei 4° C
gelagert wurden. Ein Teil der Kultur auf einer dieser Schrägkulturen wurde dann zur Beimpfung eines mit Unterteilungen
- 10=7 109839/1836
versehenen 250 ml-Iinpf-ErleiiPieyer-Kolbens, der 50
als Medium Il in Beispiel 1 beschriebenen Mediums enthielt,
verwendet. Dieses beimpfte Hedium wurde bei 28° G 2 Tage
auf einem Kotationsschüttler mit einem Hub von 5 cm bei
220 Upm inkubiert. !Das Inoculum wurde dann as ep ti sch unter
Herunterz entri fungi c-ren den My c eis gewaschen, die'überstehende
Flüssigkeit abgegossen, in einem gleichen Volumen Salzlösung resuspendiert, resentrifungiert und wieder in
einer 0,9%igen Natriumchloridlösung resuspendiert. Das £ev.'aschene
Hy eel wurde dann zur Beinrpfung (2 % Inoculum) von
zwei mit Unterteilungen versehenen 250 ml-Erlenineycr-Koiben,
die jeweils 50 ml eines chemisch bestimmten Produktiorunne-diums
enthielten, das bei 120° C 15 Minuten steril!eiert
worden war, verwendet. Das chemisch definierte Produkt!onsmedium
hatte die folgende Zusammensetzung:
Produktionsmedium:
L-Prοlin Glycerin Saccharose
Mononatriumglutamat NaCl
CaCl2
3 2 ZnCl2
15,0 | S |
20,0 | K |
2,5 | ε |
1,5 | 6 |
5,0 | S |
2,0 | 6 |
0,4 | g |
0,1 | g |
0,1 | ε |
0,05 | ε |
1,0 | 6 |
1000,0 | ml |
Destilliertes Wasser
pH (nicht eingestellt) 7,1
Die Produktionskolben wurden dann bei 220 Upm auf einem
Schüttler mit einem Hub von 5 cm 4 Tage bei 28° C geschüttelt.
'Es.wurden Versuche bei 3 und 4 Tagen durchgeführt. Proben"
- 108 -
109839/1836
14-305
wurden zentrifugiert und die überstehenden Flüssigkeiten nach
dem Scheiben-Petri-Schalen-Verfahren untersucht. Unter Verwendung
von 13 mm-ßcheiben ergaben diese Brühen Inhibierungszonen
gegen Proteus vulgaris (MB-838) von 21 mm nach 3 Tagen
und 26 LTiii nach M- Tagen. Das Produkt wurde als Antibiotikum
810A identifiziert.
Beispiel 3
Antibiotikum 81QA
Ein lyophilisiertes Reagensglas mit Streptomyces griseus
(MA-4-I253.) wurde aseptisch geöffnet und der Inhalt in Schräg-'
kulturen der folgenden Zusammensetzung überführt:
Medium IV:
V8-Saft 100 ml
Staley's 4S-So1J abolin enm ehl 20,0 g
Dextrose 2,0 g
Agar · 25,0 g
Destilliertes Wasser bis 1000,0ml pH 7,9 his 8,0
Die so erhaltenen öchrägkulturen wurden dann zur Beimpfung
verschiedener 250 ml-Erlenmeyer-Kolben, die jeweils 50 ml
des folgenden Mediums V enthielten, verwendet.
Medium Vj-
Hefe-Autolysat (Ardaain) 10,0 g
Glucose 10,0 g
* Phoßphatpuffer 2,0 ml
MgSO4 * 7H2O 0,05 g
Destilliertes Wasser - 1000,0 ml
pH-v/ert unter Verwendung von I1IaOH
auf 6,5 eingestellt.
- 109 10 9 8 3 9/1836
Phosphatpufferlösung:
91,0 g
24 95,0 g
Destilliertes Wasser 1000,0 ml
Die Keimkorben wurden 1 Tag bei 28° C and 220 üpm geschüttelt.
Der Inhalt der Kolben wurde dan ζ ma Beimpfen von 59 250-ml-Erlenuieyer-Kolben
ohne Unterteilungen, die 40 ml den Mediums VI enthielten, mit *>)5 ml Inoculum je Kolben verwendet.
Median VI:
Maisquellflüssigkeit (.feuchte Basis) 40,0 g
Dextrose 20,0 g
NaCl 2,5 g
MgSO4 · 7H2O 0,5 g
Polyglykol 2000 0,25
(zu ,jedem Kolben einzeln
zugegeben) ·
Destilliertes Wasser 1000,0 ml
pH-Wert mit EaOH auf 7,0 eingestellt.
Die Produktionskolben wurden auf eines Eotationsschüttler
mit einem Hub von 5 cm bei 220 UpH und bei 24° C wehrend
40 Stunden geschüttelt, wonach die Kolben zusanmengcgeben
wurden, eine aliquote Menge zur Untersuchung entnommen wurde und der Rest zu Extraktionsstudieii verwendet wurde. Die
Probe zur Untersuchung wurde unter Verwendung von Chlorwasserstoff säure auf pH 4,0 angesäuert, filtriert, auf 1 : 4
in "Phosphatpuffer mit pH 55O verdünnt und auf Proteus vulgaris
KB-838-Platten unter Verwendung von I5 ica Scheiben
gebracht. Die Inhibierungszoiie betrug 26,5 m:a. Das Produkt vmi.i ?
- 110 -
10 9 8 3 9/18 3 6
14305
als Antibiotikum. 810A identifiziert, bestand jedoch vorwiegend
aus 7ß-(B-5-Amino-5-carboxyvaleiiamido)~3-(a-methoxy-psul
f ooxycinnamoyl oxymethy 1)- 7-m etlioxy- 3- c ep Ii em ~ 4- c arbonsä ure
mit lediglich «Spurenmengen an 7ß-(D-5-Amino-5-carbox3rvaler~
a:aido)-3-(a-metlio;c3'-p-hydroxycir-namoyloxyniethyl)-7-i'aethoxy-3-c
ephem-4- carbonsäur e.
B e i η ρ i e 1 M-
Antibiοtikuai 810A
Eine V3 Nedium-Üchrägkultur der ütreptomyces griseus Kultur
(I-IA-4125A) viurde zur Beinpfung von 50 ml Hediura V in einem
mit Unterteilungen versehen 250 ml-Erlenmeyer-Kolben verv.Ten det.
mit Unterteilungen versehen 250 ml-Erlenmeyer-Kolben verv.Ten det.
e(IiUTi V:
Hefe-Autolysat (Ardamin)
Glucose
* Piiopphatpuffer
4 2
Destilliertes V.;asser
Destilliertes V.;asser
pH-V;ert mil; HaOH auf 6,5 eingestellt
* Pho sphatpuifer:
Destilliertes V/asser
10,0 g
1O5O g
2,0 ml
0,05 g
1000,0 ml
91,0 g 95,0 g
1000,0 ml
Der Kolben wurde dann, auf einen Rotationsschüttler bei
220 Upiu 1 Sag bei 28° C geschüttelt. 3 e.1 dieses vegetativen Inocoluias vurden. zur Beimpfung eines Keinkolbens, der 50 ml des folgenden synthetischen Mediums (Medium VII) in einem
mit Unterteilungen versehenen 250 ml-Erlenmeyer-Kolben enthielt, verwendet.
220 Upiu 1 Sag bei 28° C geschüttelt. 3 e.1 dieses vegetativen Inocoluias vurden. zur Beimpfung eines Keinkolbens, der 50 ml des folgenden synthetischen Mediums (Medium VII) in einem
mit Unterteilungen versehenen 250 ml-Erlenmeyer-Kolben enthielt, verwendet.
- 111 -
109839/1836
14305
Medium VII:
L-Asparagin L-Histidin
DL-Phenylalanin Mononatrium-glutamat NaCl
OaOl,
MnSo' FeSO ZnSO
HpO
MgSO,, · 7E„0
Glycerin Saccharose Destilliertei
Wasser
Keimung | ε | Produktion | ε |
5,0 | S | 5,0 | e |
4,0 | 4,0 | S | |
— | 2,0 | ε | |
— | Z | 1,5 | e |
5,0 | ε | 5,0 | g |
2,0 | e·· | 2,0 | |
0,4 | ε | 0,4 | ε |
0,1 | ε | 0,1 | ε |
0,1 | 0,1 | S | |
0,05 | ε | 0,05 | ε |
1,0 | e | 1,0 | ε |
20,0 | S | 20,0 | ε |
2,5 | ml | Eil | |
*1000,O | * * 1000,0 |
* υΗ mit HaOH auf 7,0 eingestellt
** pH mit HaOII auf 7,1 eingestellt
** pH mit HaOII auf 7,1 eingestellt
Der Keimkolben wurde wieder 1 Tag bei 28° C und 220 Upm geschüttelt.
Dieses synthetische Keimaediun wurde dann zur Beimpfung
verschiedener 250 ml-Erleraaeyer-Kolben ohne unterteilung,
die ~$8 Eil des Procluktior-sraediuias VlI bei 1,5 ml
Inoculum je Kolben enthielten, verwendet. Die Produktionskolben wurden bei 220 Upm und 24° C geschüttelt, und ihre
Inhalte wurden dann ζ us aminen gegeben und bei 4- und 5täg;.ger Alterung untersucht. Bei der Untersuchung wurde die gesarate Brülie auf pH 4,0 unter Verwendung von Chlorwasserstoffsäure angesäuert, und die Brühe wurde dann filtriert undaifi: 4 in Phosphatpuffer von pH 5,0 verdünnt. Die Untersuchung erfolgte auf Proteus vulgaris H3-838 unter Verwendung von 15 r;:ra-Sclieiben. Es wurde eine Inhibierungszone von 25,5 irj;i "bei
dieser I'erincntationsbrühe nach 4tl'giger Jiikubi&ruiiC1; erhalten, und das auf diese V/eise erhaltene Produkt wurde als 81CA identifiziert.
Inoculum je Kolben enthielten, verwendet. Die Produktionskolben wurden bei 220 Upm und 24° C geschüttelt, und ihre
Inhalte wurden dann ζ us aminen gegeben und bei 4- und 5täg;.ger Alterung untersucht. Bei der Untersuchung wurde die gesarate Brülie auf pH 4,0 unter Verwendung von Chlorwasserstoffsäure angesäuert, und die Brühe wurde dann filtriert undaifi: 4 in Phosphatpuffer von pH 5,0 verdünnt. Die Untersuchung erfolgte auf Proteus vulgaris H3-838 unter Verwendung von 15 r;:ra-Sclieiben. Es wurde eine Inhibierungszone von 25,5 irj;i "bei
dieser I'erincntationsbrühe nach 4tl'giger Jiikubi&ruiiC1; erhalten, und das auf diese V/eise erhaltene Produkt wurde als 81CA identifiziert.
- 112 109839/ 1836
443
Herstellung des Antibiotikums 810A und Trennung in seine
Bestandteile
Stufe A:_ ffer/uentation
Stufe 1 : Der Inhalt eines lyophilisierten Röhrchens mit
ßtreptomyces griseus (HA-2837) wurde in 2 ml Medium I
(in Beispiel 1 beschrieben) suspendiert, und das erhaltene Inoculum wurde zur Beimpfung von Schrägkulturen des gleichen
Medi.uias verwendet. Diese Schräglculturen wurden bei 28° C
5 Tage oder bis sie gut mit Sporen versehen waren, inkubiert,
und dann wurden 10 ml Medium VIII zu den Schrägkulturen
zugegeben.
Medium VIII:
Fleiπchextrakt 0,3 %
HaCl 0,5 %
NZ Amin 1 % . .
Dextrose 1 % pH 7,0
Der Wuchs auf jeder Schrägkultur vmrde in Suspension gekratzt, und die Suspension wurde als Inoculunr'inN folgenden
Stufe 2 verwendet.
Stufe 2: Die in Stufe 1 erhaltene Suspension wurde zur Beimpfung
eines mit Unterteilungen versehenen 2^0 ml-Erlenmeyer-Kolbens,
der 50 ml sterilisiertes Medium VIII ("beschrieben
in Stufe 1) enthielt, verwendet. Der beimpfte Kolben wurde dan auf einen Eotationsschüttler bei 220 Upni
gebischt und ιΥ'ύ Stunden bei 28° C inkubiert.
- 113
109839/183
14305
2109354
Stufe 5: Der Inhalt eines Impfkolbens aus Stufe 2 wurde zur
Beimpfung eines mit Unter bei lung en versehenen 2-Liter-Erlenmeyer-Kolbens
verwendet, der 500 nl des als Hediun VIII
in Stufe 1 identifizierten Mediums enthielt. Der beimpfte Kolben wurde dann auf einen Rotationssehüttler bei 220 Upia
gebracht und 48 Stunden bei 28° C ixikubiert.
Stufe 4: Ein Inoculum aus 500 ml des aus Stufe 3 erhalt-enen
Wuchses wurde zur Beimpfung eines 750 Litex*-Feriaeritatioa'isbehälters
aus rostfreiem Stahl, der 467 Liter eines sterilen
Mediums YIII (in Stufe 1 beschrieben) enthielt, verwendet.
Man Iiess die Fermentation bei einer Temperatur von 28° C
unter Bewegung X"330 Upm) fortschreiten, während ein Luftstrom
von 280 Ii (10 cfm) während 65 Stunden bei behälter! wurde.
Während der Fermentation wurde ein Antischaummittel, PoIyglykol
2000, in kleinen Hengen zugegeben, usi übermäosiges
Schäumen zu verhindern.
Stufe _5: Ein Inoculum aus J80 Liter (100 gallons) des erhaltenen
Wuchses aus Stufe 4 wurde zur Beimpf ung eines 5700 Liter (15OO gallon) Fermentationsbehältero aus rostfreiem Stahl, der 4500 Liter (1200 gallons) des folgenden
Mediums IX enthielt," verwendet.
Medium IZ:
Maisguellflussigkeit 4 %
Dextrose 2 %
pH-Wert nit ITaOII auf 7,2 eingestellt
Man liess die Fermentation bei einor Temperatur von 28° C
unter Bewegung (120 Upm) fortschreiten, während ein Luftstrom von 1530 1 (55*3 cfra) während 30 "bis 35 Stunden beibehalten
wurde. Während der Fermentation wurde 2000 in kleinen Mengen zugegeben, um überinässiges Schäunen
zu verhindern. Der Ansatz wuroj/a gewonnen und die wiivrGaiu-
- 114 1 0S8JS/1836
keil, durch den Scheiben-Plattenversuch bestimmt. Unter Verwendung
von 1;> ma (0,5 inch.) Scheiben ergab diese Brühe
eine Irihibieruugszone von J2,5 nai gegen Proteus vuigaris
MB-838, bei Gewinnung nach Jistiindiger Alterung.
Stufe B: Isolierung; des Antibiotikungemischs .81OA
Filtrierte Brühe 4050 1 (1075 gallons) aus Stufe A, Stufe 5,
wurde nach 36 Stunden gewonnen und der pPI-Wert in den Ferment
ation sb ehält er durch Zugabe von Phosphorsäure von 7 bis
8 auf 5jC1 eingestellt, Das liycel wurde durch Durch!eiIen
durch eine Filterpresse vom Platten-Siebtyp entfernt und
verworfen. Die filtrierte Brühe wurde dann durch ein 380 1 (100 gallon) Bett aus Amberlite XAJJ-2 Adsorptionsharz mit
einer Fliese-cesehwiiidigkeit von 58 1 (10 gallons) je Hinute
gegeben. l)i - verbrauchte Brühe vrurde untersucht und verworfen,
und. das Harsbott mit 2 Volumen Wasser1 gewaschen. Das
Antibiotikum v;uräe aus dem Harzbett rn.it einer GO^igen Lösung
von I'Ietlianol uiid Wasser bei einer Jb'lieεsgeschwindigkeit
λ^οη 19 1 (5 gallons) Je Hinute eluiert. L\O Fraktionen mit
jevieilr. 19 1 (5 gallons) wurden gesanmelt und untersucht.
Die Fraktionen 2 bis 40 wurden vereinigt und das Methanol durch Eindampfen im Vakuum entfernt. Das Endkonzentrat
(158 1, 41,5 gallons) wurde durch Zugabe von Aunioniujiihydroxid
auf j) H 3,5 eingestellt und gefror engehalten.
Proben wurden nach der Scheiben-Plattenmethode gegen Proteus
vulgaris biologisch untersucht.
Filtrierte 3τί"ΐβ: An 4000 1 (1060 gallons) filtrierter Brühe
durchgeführte "versuche ergaben die folgenden Zonendurchmesser:
- 115 ~
10 9833/1836'
ORIGINAL
14305
Verdünnung
1 : 2 1 : 4 1 : 8
Filtrierte Brühe
/ionen trosse
26,8 Him 23,8 mm 21,1 mm -
Verbrauchte Brühe und Wanchlösun^: 10 Fraktionen von Je vielIs
380 1 (100 gallons) ergaben nach Untersuchung Null ohne Verdünnung.
Das untersuchte Waschwasser ergab KuIl.
El uat f r akt i on en: i Sämtliche Fraktionen \v*urden untersucht.
Die Zcnendurchmesser sind ira folgenden tabellenmäcsig aufgeführ:
E El u atf rakti oji.ce
Fraktion | Zonengrosse |
1 | 0 |
2 | 28 mm |
3 | 35 |
4 | 34 |
5 | 36 |
6 | 36 |
7 | 36 |
8 | 38 |
9 | 38 |
10 | 36 |
11 | 36 |
12 | 38 |
13 | 40 |
14 | 37 |
15 | 36 |
16 | 37 |
17 | 38 |
18 | 36 |
19 | 36 |
20 | 35 |
Fraktion | Zonengröese |
21. | 33 ram |
22 | 33 |
23 | 34 |
24 | 34 |
25 | 33 |
26 | 34 |
27 | 32 |
28 | 33 |
29 | 32 |
30 | 32 |
31 | 32 |
32 | 30 |
33 | 30 |
34 | 30 |
35 | 28 |
36 | 27 |
37 | |
38 | 26 |
39 | 26 |
40 | 26 |
1098 39/1836
14505
Eluatziisainiaensetzunp· und Eluatkonzentrat: Es wurden ebenfalls
Versuche an 740 1 (195 gallons) Eluatzusammensetzung und
1.58 1 (41,5 gallons) Antibiotikum 810A in Form von Eluatkonzentrat
dui'chgeführt.
Eluatzusammensetzung Verdünnung Zonengrosse
Eluatkonzentrat 810A Verdünnung Zonengrosse
1 : 5 | 28,8 | mm 1 | gallons) | Eluatzusammen- | : 16 27,25 mm |
1 : 10 | 27,0 | mm 1 ; | 3οrotion | :N52 24,5 mm | |
1 : 20 | 25,8 | mm | Elusbkonz entrat | ||
1 : 40 | 21,0 | mm | |||
Untersuchung d.er Gesamtfeststoffe: | |||||
illtrierte ] | 119 kg | ||||
irühe | |||||
740 1 (195 gallons) | 7,25 kg | ||||
setzung | 7,20 kg | ||||
158 1 (41,5 | an einem Anionenaustauschharz | ||||
Stufe C: Adf | |||||
Das Konzentrat auf Stufe B (78,5 I1 20,7 gallons) wurde mit
Wasser auf 118 1 (3I gallons) verdünnt und an ein 22,5 1-Bett
eines schwach-basisehen Anionenaustauschliarzes (Amberlite
IEA-68-Harz, Chloridzyklus) bei pH 4,0 und einer Strömung
von 7,6 1 (2 gallons) ,je Minute adsorbiert. Danach folgte
eine Wäsche mit 45 1 Wasser, wonach das Harzbett mit einer
Lösung aus 1 m-Natriumnitrat und 0,1 m-Ratriumacetat bei
pH 7,5 und einer Strömungsgeschwindigkeit von 1,5 l/min,
eluiert wurde. Zehn 19 1 (5 gallons) Eluatfraktionen wurden dann gesammelt und dor pH-Wert mit der aufgefangenen Chlorwasserstoff
säure auf pH 4 eingestellt.
Sämtliche Fraktionen wurden nach der Scheiben-Plattenmethode
gegen Proteus vulgaris biologisch wie folgt untersucht:
- 117 -
109839/1836
14305 | Zonengrösse | El uat fraktionell | grosse | 2109854 | 10 | je |
Fraktion Zonen- | 27 mm | , V er du nr. um? 1 : | Z 0 li en | mm | ||
Beschickungslösunp; | 28,5 mm | 30 mm | Fraktion | gross | mm | |
Verdünnung | 26,5 nun | 1 | 28,5 mm | 25 | mm | |
24 mm | 2 | 26 mm | 6 | 23 | mm | |
1 : 10 | 3 | 7 | 22 | |||
1 : 20 | 4 | 8 | 21 | |||
1 : 40 | 9 | |||||
5 26 mm 10 1715 m
Der verbrauchte Strom ergab nach Untersuchung 25 mm ohne
Verdünnung und das Waschwasser ergab nach Untersuchung 23 mm
ohne Verdünnung.
Stufe D: Adsorption an Arti onenaus tauschharz
Die Fraktionen 1 bis 1Ό aus Stufe C wurden kombiniert und
einem 45' Liter-Bett aus Amberlite XAD-2 Adsorbens bei pH
3,0 und einer Strömungsgeschwindigkeit von 5 l/min, zugeführt.
Das Harzbett wurde mit 90 1 Wasser bei der gleichen
Geschwindigkeit gewaschen. Das Antibiotikum wurde dann aus dem Harz durch eine 25%ige Lösung aus Aceton und Wasser
bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 5 l/min, eluiert.
Sechzehn 19 1 (5 gallons) Fraktionen wurden gesammelt.
Sämtliche Fraktionen wurden nach der Scheiben-Plattenmethode
gegen Proteus vulgaris wie folgt untersucht: Die Beschikktfng (190 Liter) ergab die folgenden Zonendurchmesser:
Beschickunprslb'sung
Verdünnung Zonengrösse
1:5 30 mm
1 : 10 27,5 mm
1 : 20 24,2 ram
- 118 -
109839/1836
Die Zonendurehmesser der Eluatfraktionen wurden in der folgenden
Tabelle zusammengefasst:
L'luatfraktlon
Eluatfrakti on
Fraktion Verdünnung Zonengrösse Fraktion Verdünnung Zonengrösse
1
2
2
5
6
6
7
δ
δ
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
10 10 10 IO
10 10 10 10
20,5 mm
29
29
29
28
27 26
26
mm mm mm mm mm mm mm
1 | : 10 | 25 | ,5 | mm |
1 | : 10 | 26 | mm | |
1 | : 5 | 26 | ram | |
1 | ! 5 | 28 | ,5 | mm |
1 | ! 5 | 27 | mm | |
1 | ! 5 | 25 | mm | |
si | . 5 | 25 | ,5 | mm |
1 | VJl | 24 | mm | |
Die obigen Eluatfraktionen 2 bis 16 wurden kombiniert und
das Aceton durch. Eindampfen im Vakuum auf ein Endvolumen
von 17.^! liter entfernt. Das 17 j4 Lit er-Konzentrat wurde
durch i.T.7-:ioniuinhydroxid auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellt
und [rel'riergetrocknet, v,robei 620 g Antibiotikum 810A, d. h.
ein Gemisch, bestehend im wesentlichen aus 7ß-(D-5-Amiηο-5-c
a-vboxyvnleraiui Uo)-^C a-nethoxy-p-sulf ooxy cinnamoyloxyinethyl)-7-iaet}io:-:y-J-ceplien-4-carbonsäure
und 7ß-(I»-5-Amino-5-carbc::,vval
erar^ido )- 5- ( a-niethoxy-p-hydro:-cy cinnainoyloxjrlaoth.;/!)-7-methoxy-J-cöpheat-4-carbonsäure
erhalten wurde. läeses trockene rrodul-cc hatte eine Wirksamkeit auf Grund
der biclc-giGchon Untersuchung von 520 scg/ml für eine
25 i:ni-Zone.
Stufe b: 7ß- (D-5-Anino-5-carboxyvaleraxido )-3- (α-metiioi";-4-carbonsäure
Ei.Ti(j Chromatographie-Kolonne von 2,5 cm Durchmesser wurde
auf eine Betthöiie von 100 cm mit DJSAE Sephadex A-25
Anionenaustf-uschliarz in einera ö,5 m- Amiaoniumbromid und
C,ü5 ;■;-Kgsigcluire enthaltenen bystera gepackt. Das in
- 119 109839/1836 .
Stufe D erhaltene Gemisch des Antibiotikums 810A (10,0 g)
wurde in 18 ml einer Lösung aus 0,5 m-Amraoniumbror.iid und
0,05 m-Essigsäure gelöst und in die Kolonne eingebracht. Die Eluierlösung wurde durch das Bett mit einer Geschwindigkeit
von 81 ml/h gepumpt, und es wurden.· 10 ml Fraktionen
des Eluats maschinell gesammelt. Der Eluatstrom wurde durch ein Differential-liefraktometer überwacht. Die
Refraktometer-Aufzeichnung zeigte Massenpeaks bei den
Röhren I9, 36, 79, IO9 und 206. Scheiben-Platteriversuche
gegen Proteus vulgaris (IIB-83S) wurden bei jeder dritten
Fraktion unter Verwendung von bei pH 7?t) gepufferten
13 mm.-Scheiben durchgeführt. Die Zonendurchr-ie&ser sind in
der folgenden Tabelle aufgeführt: (Die Fraktionen 1 bis 66 ergaben auf Grund der Untersuchung Null).
Fraktion | Zonen | Fraktion | Zonen | Fraktion | Zonen- |
durch | dur ch- | durch- | |||
messer | messer | mes β er | |||
69 | - 18 mm | 122 | 29 | 204 | 40 + |
72 | 24 | 125 | 28 | 207 | 40 + |
T? | 26 | 128 | 27 | 210 | 40 + |
78 | 51 | 131 | 26 | 213 | 40 + |
81 | 124 . | 24 | 216 | 40 + | |
83 | 35 | 137 | 21 | 219 | 40 |
86 | 37 | 140 | 20 | 222 | 38 |
89-- | 38 | 150 | 18 | 225 | 35 |
92 | 38 | 160 | 20 | 223 | 32 |
95 | 40 + | 170 | 29 | 23I | 31 |
98 ■ | 40 + | 180 | 35 | 234 | 27 |
101 | 40 + | 183 | 38 | 237 | 24 |
104 | 40 + | 186 | 40 | 240 | 23 |
107 | 40 + | 189 | 40 + | 243 | 19 |
110 | 40 + | 192 | . 40 + | 246 | 17 |
113 | 40 | 195 | 40 + | 249 | 0 |
116 | 38 | 198 | 40 + | 252 | 0 |
119 | 33 | 201 | 40 + |
Die Fraktionen 80 bis 133 wurden kombiniert und die Frak
tionen I70 bis 230 wurden kombiniert.
- 120 109839/1836
AJL 4
Eine Wiederholung des obigen Versuchs erfolgte,.und die Fraktionen
82 bis 130 wurden kombiniert und die Fraktionen 1SO bis 234 wurden kombiniert.
Die die erste aktive Komponente enthaltenden Fraktionen aus
den obigen Versuchen wurden kombiniert und an ein 100 ml-Bett
aus Amberlite XAD-2 Harz adsorbiert. Das Bett wurde mit
1 Volumen Wasser gewaschen und dann mit 3 Volumen einer
9OJkLgen Lösung aus Methanol und Wasser eluiert. Das Methanol
wurde durch Verdampfen im Vakuum entfernt, und das wässrige Konzentrat wurde gefriergetrocknet, wobei 810 mg eines
Produktes erhalten wurden, das als 7ß-(D-5-Amino-5-carboxy- ·
valeramido)-3-(oc-methoxy-p-hydroxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
identifiziert wurde. Die biologische Wirksamkeit dieses Produktes, bestimmt nach der
Scheiben-Plattenuntersuchungsmethode gegen Proteus vulgaris '
betrug 18 yig/ml und ergab eine 25 mm-Zone. Analyse auf Grund
von Ultraviolett-Adsorption ergab die folgenden charakteristischen
Daten:
UV-Adsorption in 0,1 n-HCl } nax 305 E^cm 524
UV-Ads orp ti on in 0,1 n-Na0H^max 328 E^cm 564
Stufe ff: 7ß-(D-5~^ino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxy
p-sulfoxycinnamoyloxymethyl)~7-methoxy-3-cephem 4-carbonsäure
Die Fraktionen aus den beiden Versuchen auf Sephadex A-25,
welche die zweite aktive Komponente enthielten, wurden vereinigt und an ein 100 ml-Bett von Amberlite XAD-2 Harz
adsorbiert. Das Bett wurde mit 1 Volumen V/asser gewaschen und dann mit 3 Volumen einer 90/&Lgen Lösung aus Methanol und
Wasser eluiert. Die angereicherten Eluate wurden kombiniert, und das Methanol wurd durch Verdampfen im Vakuum entfernt.'
Das wässrige Konzentrat wurde gefriergetrocknet und ergab 720 mg '/ti-(D-5-Amino~5-carboxyvaleramido)-3·-(α-methoxy-p-
- 121 109839/1836
sulfooxycinnanioyloxyiiiethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carborxsäure
(Ic). Analyse auf Grund von Ultraviolett-Absorption ergab
die folgenden Kenndaten:
UV-Adsorption in 0,1 n-HCl ,\ max 287 mm E^ 432
UV-Adsorption in 0,1 n-iiaOH Λ max 280 mm S?? 432
Beispiel 6
Abtrennung der 7ß-(D-5-Aiiiino-5-carboxyvaleraruido)-3-(a-
me thoxy-p- s ul f ο oxy cinnamoy loxyai ethyl) - 7-me thoxy- 3- c ephem-4-
carbonsäure aus dem Antibiotikumgesisch 810A
Das 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(cc-methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-i'iLethoxy-3-cephera-4-carbonsäure
(Ic) und 7ß-(D-5-AmiriO-5~carboxyvaleraaido)-3-(a-methoi^7-phydroxycinnaraoyloxymethyl)-7-Hiethoxy"3-cepheia-4-carborLGäure
enthaltende Antibiotikum^:episch 810A (20,0 g) aus Beispiel 5,
Stufe D, wurde in 200 ml Wasser gelöst und der pH-Wert der Lösung auf 3»5 eingestellt. Liese Lösung wurde durch ein
200 ml-Bett von Anberlite IEA-68 Anionenaustauschiiarz
(Chloridzyklus) gegeben und anschliessend durch Zugabe von 300 ml V/asser gewaschen. Das Bett v/urde dann nit 1 Liter
1%iger (V/V) Ameisensäure in V/asser eluiert. Anschliessend wurden zwei Portionen verdünnte Chlorwasserstoffsäure (pH
0,95) zugegeben. Die Beschickungslösung, verbrauchte Lösung und Waschlösung und Eluate 1, 2 und 3 wurden durch Papier-Elektrophorese
bei pH 4,0, durchgeführt während 1 Stunde bei 1000 Volt Gleichstrom, analysiert. Bas Papierchromatogramm
wurde getrocknet, gegen Ammoniakdampf ausgesetzt u.m die Säure zu neutralisieren und auf einer ITähragar-Platte,
die mit Proteus vulgaris (KB-838) beimpft war, inkubiert.
Die überprüfung nach 17stündiger Inkubierung bei 37° C zeigte zwei Inhibierungsaonen in dem Bes hickungsmaterial
(in der Richtung der Anode), lediglich eine Einselkoniponorito
- 122 109839/1836
(die langcinaere der beiden) in der verbrauchten Lösung und
den A.'-ieisejjLGilure-riluaten und eine Einzelkomponente in dem
zweiten Chlom-rasserstoff_.?;äureeluat, das der schnelleren
Komponente in der Beschickung entsprach. Die folgende Tabelle zeigt den Gesanitfeststoff und die biologischen Versuchsdaten:
Masse Volumen Gesamte biologische Produkt(e)
Einheiten
Beschickung Verbrπuchte
LOf-UIi1": und
20
ι J. ο s uii iv 11,15 S
Aneiöonsö.ureeluat
Ersten ChlorwasserstoffsUui'eeJ.unt
Zv:oil-cε Ghlor-was£-v
τ"?;"!;■ of Γ-säurscluat
200 ml 60 000 Einheiten
500 ml 7 500 "
4,52 g 1000 ml 20 000 "
500 ml 1 000 "
Ia und Ib
Ib Ib
2,10 g 500 ml 10 000
la
Diese Fraktionen wurden durch Adsorption an Amberlite ZA.B-2
Harz cevionnen, u^. 7'L-(B-5-A]nino-5-carboxy\TaIeranido)-3-(
a-ru c-:t]ioxy-p- suif ooxy ciimanoy 102-ym ethyl) - 7-in. ethoxy- 3- c epheni-4-cai"-bor.säure
(Ic) abzutrennen, und diese wurde durch eine
50?uige Lösung \?on liotliar.ol und Wasser eluiert, wobei im
wesentlichen reines Produkt (Ic) erhalten wurde.
B e i s ν i e 1 £
Ab tr en!i ung von 7-S (D- 5-Ami no- 5- c arb oxyval er aiii do ) - 5- ( α-π ethoxy
ρ- sulf oo>:yciBz:3n;oylc3::;T:;. o thy l)-7-r'iethoxy-5-ccph.eai-4~ carbonsäure
aus ce:n A:iti"bict;iku:u SIOA
Das antibiotisclie 81OA-Genisch aus 7ß-(D-5-Ai.iino-5-carboxyval
eraai do ) - J- (α-aetlioxy-p- sul f ooxy cinnamoy 1 o^yiaethy 1) -7-metho^1--3-ceene.u-4-carbonsäure
(Ic) und 7ß-(D-5-Amino-5-carbox7^roierani
do )-5-(uL-iaethoxy-p-hjTdroxycinnainoylo3^nTi ethyl )-
- 123 109839/1836
14-505 . 210985
42*
~7-i2ethoxy-5-c.ephem-4-carboiisuu.r-e (5?O g) >
das nach Beispiel 5? ktufe Ii, erhalten v/urde, wurde in 20 ml einer
20/oigen Lösung aus Aceton und Wasser gelöst und dt r· pH-Wert
auf 4,0 eingestellt. Diese Lösung vrurde auf ein Bett
aun Anberlitc ZAD-2 Adsoroens voji 5 ^m ivurciriCBser· χ 100 cjb.
Höhe in 20/iiger Aceton- und V/aGserlÖGu:;£ gegeben.. Eine Löcurig
aus 20 % Aceton und Wage-er wurde durch O.-r-c Bett mit einer
Geßohv.'indigkeit von 880 ral/h gopunipt, und 20 ml-Praktionen
v;ux'ücn autoinatiecii gena^
Schcdben-Plattonuntersuchungen gegen Proteus vulgaric
(MB-838) vmrden. "bei jeder dritten fraktion ujrGcr Vcrv/enduixg
von 6s.ni-ijchei"bcn durchgeführt. Die Zonendurcl'üTiecser sind in
der folgenden Tabelle aufgeführt;
1098 3 S /1836
BAD ORIGINAL
14305
Frakti or. | Zonen— J | hcr.ktior | Zonen- | Fraktion | Zonen |
durchmesser | durchmesser | durchmesser | |||
1-41 | 0 | 131 | 0 | 221 | 18 |
44 | 12 ram | 134 | 0 | 224 | 18 |
47 | 22 | 137 | 0 | 227 | 18 |
50 | 25 | 140 | 8 | 23Ö | 17 |
53 | 2'i | 14$ | 11 | 233 | 17 |
56 | 31 | 1-46 | 13 | 236 | 15 |
59 | 35 | 149 | 13 | 239 | 15 |
62 | 50 | 152 | 15 | 242 | 15 |
65 | 28 | 155 | 15 | 245 | 15 |
68 | 27 | 158 | 16 | 248 | 14 |
71 | 25 | 161 | 17 | 251 | 14 |
74 | 24 | 164 | 18 | 254 | 14 |
Ti | 21 | 167 | 17 | 257 | 13 |
80 | 20 | 170. | 18 | 260 | 13 · |
83 | 19 | ,173 | 20 | 263 | 12 |
66 | 16 | 176 | 21 | 266 | 12 |
89 | 14 | 179 | 21 | 269 | 12 |
O1O | 13 | 182 | 21 | 272 | 11 |
95 | 13 | 185 | 21 | 275 | 11 |
98 | 13 | 188 | 22 | 278 | 10 |
101 | 13 | 191 | 23 | 281 | 10 |
104 | 14 | 194 | 2$ | 284 | 9 |
107 | 13 | 197 | 23 | 287 | 8 |
110 | 13 | 200 | 22 | 290 | 0 |
113 | 11 | 203 | 24 | 293 · | 0 |
116 | 10 | 206 | 24 | 296 | 0 |
119 | 9 | 209 | 24 | 299 | 0 |
122 | 8 | 212 | 24 | 302 | 0 |
125 | 8 | 215 | 24 | ||
128 | 8 | 218 | 19 | 330 | 0 |
Lie Fraktionen 44 bis 90 wurden vereinigt, Aceton wurde
durch At'6'amp fen in V&kuurn entfernt <
und das vc.ssrige Konzentrat
wurde gefriergetrocknet, wobei 3?3 S rohe 7-&-(ß-5-A-iino-5-c
arboxy vüsl erani do ) - 3- (ct-:a etlioiry-p- s ul f ooxy cinna:noy 1-ϋΧ7πιοΐ1^7.ΐ)-7-Γ·ι6ΐ^οζ7,τ-3-θ6ρίαβ·ίΐ-4-carbonsäure
(Ic) erhalcen \«mrcien.
jjxe I''rr;2itionGB 150 bis 225 wurden vereinigt und ergaben bei
f.;hr:Iiehe::· Behandlung 7OO rag 7ß~(-ü--5--Aniino-5-carbox:yvaler-
- 125 109838/183 6
BAD ORIGINAL
42b
Eine Wiederholung des obi gen Versuchs ex-gab 3,1 E rohe
cxycirmanioyloxyinefch3/l)-7-:iethcx3T--3-ceph£;2-^—cai-L-oiisiiure (ic)
und 4-00 mg 7ß-(^-5-"sl"'-no-5-carbo::yvalera7.iido)-3-(a--Ket;rio:iyp-hydroxycinnamo7loii3^aothyl)-7-i'iOoh.oxy->-"&plic-a-i{—carbonsäure.
Die beiden !!engen an
4-carbonsäure (Ic), die nach, der vorangehenden Xethode erhalten
wurden, wurden vereinigt, und die 6,J! g Haterial
v;urden in ein Bett aus Ar1Tb erlite ZAD-2 Aisorfoens von 5 cn
Durchmesser χ 100 era Höhe in einer 5^iGen I-'Jcur jr aus Kothanoi
und V/csser eingebracht. Eine 5^'-C-- Methanol- an-Ί V/csserlösung
wurde durch das Bett rait einer lliessgericliv.'indi^lcoit
von 880 ml/h gepuript und 20 ml Prakbios.cn i.":;r-dcn autc;.io.tiach
gesammelt. 287 Fraktionen wurden ^rcsariiraelt, uiid t1ede vierte
I'raktion wurde nach der- Laheiben-riatten^vthodo ^j&rcen Protcj'-".
vulgaric (riB-838) unter "verwendur.g vcn 6 irü »icjjsibon untersucht.
Die Uiitersuchungsergebnisse sind in cer folgc-ndcn Q'abelle
aufgeführt. Die Fraktionen 1 biß 50 murder, rieht untersucht.
JB'r akti on | Zonengrösse | Fraktion | Zonerg: |
51 | 23 ii'ilü | 115 | 20 |
55 | 26 | 119 | 20 |
59 | 23 | 123 | 19 |
63 | 18 | 127 |
Λ -J
J S-J |
67 | 12 . | 131 | 19 |
71 | 0 | 155 | 16 |
75 | 0 | 139 | 17 |
79 | 0 | 143 | 15 |
83 | 7 | 147 | 16 |
87 | 9 | 151 | 15 |
91 | 13 | 155 | 15 |
95 | 19 | 159 | 11 |
99 | 21 | 1b3 | q |
103 | 22 | 167 | 0 |
107 | 22 | 171 | 0 |
111 | 21 | 287 | O |
- 126 -
109839/1836
«AD ORIöiNAL
Die I'x'alLtioTicJ-j 95 t>is 159 wurden vereinigt, Methanol wurde
im Vacuum abrodaripft, und das wässrige Konsentrat wurde
gefri eingetrocknet, wobei 700 mg 7ß-(D-5~^i'r:i-rxO~5~carboxyvai
(-•raL'iido)-;-3-(a-metho>~>r-p-sulfooxycinncaToylo2C3,TJoi;hyl)-7-iaethc'xy-J-ccpheri—^-carb-onsäure
(Ic) erhalt&n wurden. Das Ultraviolett-iSpelitrum von 7ß-(ü-5~Amino-5-ca??bo:-ryvaler~
ami Uo)-J- (a-!,iei-ho::y-p-sulfoo::ycinj.anoylo;vy;r: ethyl )-7-™iethoxy-3-crpbein-4-carbonsäure
(Ic) ergab die folgenden Adsorptionsdateri:
UV-A:".,norption in 0,1 ii-HCl ,7m->: 285 r^ 160
UV-Ac:sorption in 0,1 n-KaOH |::ax 277 ^Ρ~ ^&δ
J3ci Uj;terr.:ichUi!r: mit 1J ir-ja-bchei-bcn -räch c or Lchoit&n-Plattcji^othode
{ζγ:£;λ:ώ. Proteus vulg^ris ex"£;at die 7ß~C^-I3-Ar.ino-
l)~ c ar :.;co:y va J. er; 'ini do ) - J- ( α-κι e thoi:y~p- guI Γ ο oxy cd nna:;.oy loxymethyl)-7-sicthox;v-5-cepl"ieai-4-carbonsäure
(Ic)-i-roue eine
25 r.ii-Zone bei 88 ncg/nl und 7^-(2-5-Ar-iiriO-5-c
3-cepliL"i-'4-eai"bor:säure ergab eine 25 ra-Zone bei 167 mcg/r.l
E e i β t> i e 1 8
AntibJotiku- V \2k
AntibJotiku- V \2k
St t; Γc A; £>chii t r ellzo 1 b en-Prο aul: ti on
'£±n lyophilisiert.es Höhrchen mit Streptoruycec lactar.;duran&
Kultur (rlA-£90c>) vrux^de aseptisch {reöf2?net. !Das rcoh.reh.en v;urde
danr. sum ieir.pfen eines nit ünterteilunperi versehenen
250 r:l-ürleimeyer-Iiclbens verwendet, der 50 ml ITrüirmediurii V
enthielt, inäer. das Röhrchen in steriler Gaze zerbrochen
vjurde und der Klumpen aseptisch in den Kolben überführt wurde.
Pas Heciun V besass die folgende Zusairinensetzung-
- 127 -
109839/1836
BAD OBiQiNAL
14-305
Medium V:
Hefe-Autolysat (Ardamin) Glucose *Phosphatpuffer
MgSO,. ·7Ηο0 Destilliertes V/asser pH 6,5 *"Phosphatpuffer-:
KH2PO4
Destilliertes V/asser
10,0 s 10,0 g 2,0 ml 0,05 g 1000,0 ml
91,0 g
95,0 g
1000,0 ml
Dieser Keimkolben wurde bei 28° C auf einen Ro tat! ons schüttler
"bei 220 Up in mit einem Hub von 5 cm 3 '-Page geschüttelt.
Aliquote H eng en von 5 ml (10 °/o Inoculum) dieses Y/uchses
vmrden dann unter Vervendung steriler lipetten in vier
Keirakolben der zweiten Stufe von der gleichen Grosse überbracht,
.v.Telche das gleiche Medium wie vorstehend beschrieben
enthielten, und diese Kolben wurden dann in der oben angegebenen V/eise geschüttelt. Die Keir.ikolben der zweiten Stufe
vmrden dann in einen Kolben aseptisch zusammengegeben und zur Beimpfung von 11 mit Unterteilungen versehenen 2 Liter-Erlenmeyer-Eolben,
die Jeweils 350 ml Medium IX mit 2 bis
3 % Inoculum enthielten, unter Verwendung sterilei1 Pipetten
beimpft. Das Medium IZ hatte die folgende Zusammensetzung:
Medium IX;
AiPber-Hefe Hr. 3OO
Lösliche Brauereirückstände Dextrose
Destilliertes Wasser pH 7,0.
10,0 g 20,0 g 10,0 g 1000,0 ml
Die Produktionskolben vmrden dann bei 28° C auf einem
Schüttler bei 14-5 Upra mit einem Hub von 5. cm 4- Tage geschüttelt.
Nach Beendigung des InkubierungsZeitraums wurde der
Inhalt von 10 derartigen Kolben vereinigt, und eine Probe
109839/1836
wurde zur Entfernung des Hycels zentrifugiert.
Das Vorhand ens ein des Antibiotikums 84-2A, d. h. des Produktes
7ß-(^-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbaaioyloxy- "
methyl)~7-methoxy-3-cephe!n-4-carbonsäure (Ib) in der Brühe
wurde durch Agar-Diffusionsversuche bestimmt, die mit
13 mm-Filterpapierscheiben durchgeführt wurden, welche in
der Brühe getränkt wurden" und auf die Überfläche der Versuchsplatten gebracht würden, die 10 ml Medium aus Nähragar
(Difco) plus 0,2 % Hefeextrakt (Difco) enthielten, und
mit dem Bakterieninoculum geimpft war. Die Inhibierungszonen
wurden nach Übernaclit-Inkubierung bei 28° C in mm gemessen.
Die Untersuchungen der nach 4tägiger ü'erm ent ation gesammelten
Brühe zeigte eine Inhibierungszone von 31,5 mm Durchmesser
auf mit Vibrio percolans (MB-1272) beimpften Platten.
Stufe B: Adsorption an ein Anionenaustauschharz
Die filtrierte Brühe wurde mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure auf pH 7»0 eingestellt, und 2900 ml wurden auf 100 ml
eines stark-basischen Anionenaustauschharzes mit einer Styrol-Divinylbenzol-Matrix
(Dowex 1x2 Harz, Chloridzyklus) bei 10 ml/min, adsorbiert. Die verbrauchte Lösung wurde in
500 ml-ffraktionen gesammelt. Die Harzkolonne wurde mit
Wasser gewaschen und mit 3%igem UH^Cl in 90%igem Methanol
eluiert. Das Eluat wurde in 100 ml-Fraktionen gesammelt.
Scheiben-Plattenversuche gegen Vibrio percolans (MB-1272)
wurden bei sämtlichen Fraktionen durchgeführt; die Zonendurchmesser sind in der folgenden Tabelle aufgeführt:
- 129 -
109839/183 6
Filtrierte Brühe Yerbrauclrfce !fraktion JSlunt^rakfion
Verdünnung | ^oneii- l'raictxon | 1. | ZiOIi en- | jiraKtiiou i | 1. | aoLeii- |
grösse | 2. | grösse | £ | 2. | "1T1H c: 0 Λ _>X W O J^i V-· |
|
keine | 26,5 ram | 3- | 0 | 3. | 25 | |
1 : 2 | 24 | 4. | 16 | 4. | 29 | |
1 : 4 | 20 | 5. | 23 | 5- | 29 | |
6. | 25 | 6. | 26,5 | |||
27 | 7. | 22 | ||||
27 | 8-10. | 18 | ||||
15 | ||||||
0 | ||||||
Diese Versuche zeigen, dass etwa 60 % der Wirksamkeit in der
verbrauchten Fraktion und etwa 18 /» in den Eluaten vorliegen.
Ferner zeigen sie ari, dass die Harzkapazität lediglich zwei
Fraktionen oder 10 Säulenvolunen Brühe beträgt. Die Eluat-·
fraktionen 1 bis 4 wurden kombiniert und unter Entfernen des Methanols konzentriert. Die verbrauchten Fraktionen 3 bis 6
wurden unter Erzielung von 1960 ml Lösung kombiniert. Ein
1860 ml-Anteil der Lösung wurde mit verdünntem Natriumhydroxid von pH 7»2 auf 8,0 eingestellt und an ein stark-basisches
Anionenaustauschharz mit einer Styrol-Divinylbenzol-Hatrix
(Dowex 1x2 Harz, Chloridzyklus) bei 14 nil/min. adsorbiert.
Die verbrauchte Lösung wurde in vier gleichen Fraktionen gesammelt, und Versuche ergaben, das 5 % der
Wirksamkeit vorlag. Die Kolonne wurde mit V/asser gewaschen und mit 5%ige31>
wässrigen Uatriuiachlorid eluiert. Das Eluat
wurde in 50 ml-Fraktionen gesammelt und untersucht. Die
Untersuchungen zeigten, dass 90 % der Wirksamkeit in den
Schnitten 3 bis 16 vorlag, so diese kombiniert wurden.
Stufe Ci Adsorption an ein Kation enaustauschharz
Ein 50 ml-Anteil eines gemäss Stufe B hergestellten Konzentrats,
wurde auf 5OO ml verdünnt, der pH-Wert von 8,8 auf pH 2,0 mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure eingestellt und
an 25 ml eines stark-sauren Kationenaustauschharzes vom
Sulfonat-Typ mit einer Styrol-Idvinylbenzol-Matrix (Dowex 50
- 130 109839/1836
1*505 . .
χ 2 Harz, Wasserstoffz;/klus) bei 2,5 ml/min, adsorbiert. Die
Kolonne wurde mit 25 κ.1 Wasser gewaschen, dann mit 2JkLgem
Pyridin eluiert, bis der pH-Wert des Kolonnenauslaufs auf
pH 7 anstieg (54 ml). Untersuchungen der verbrauchten Fraktion
und des Eluats »zeigten 9 /^ der Wirksamkeit in der verbrauchten
!Fraktion und 90 °/o im Eluat an. Das Eluat wurde als das
Pyrldiniumsalz des Antibiotikums 842A identifiziert.
Dor; 84 2A--Produkt ist amphoter mit einem scheinbaren isoelektrischen
Punkt bei etwa pH-3,5· Das Produkt ist oberhalb
pH 7 instabil, jedoch bei pH 1,5 stabil. Das so erhaltene EIu:: t wurde auf pH 8,0 mit verdünntem !Natriumhydroxid eingestellt
und unter.Vakuum sur Entfernung des Pyridins konzentriert.
Das co erhaltene Produkt wurde als das liononatriumsalz
des Antibiotikums, 842A identifiziert. Das Ko lekul ar gewicht
beiträgt 4-68, bezogen auf die empirische Formel.
Analyse für C16H21H4UU0ITa:
ber.: C 41,0*>; H 4,5%; N 12,0 #· S 6,8;
0 30,8js>s ITa 4,9;ό
gef. : C 39,5^5 H 4,76^5 Ή 11,16^; S 6,46^;
0 34,12>α; ITa 4,19%.
Bei in vitro Untersuchungen inhibierte dieses Produkt, d. h. das Antibiotikum 842A, das Wachstum der folgenden, gramnegativen
Bakterien: Escherichia coli, Proteus vulgaris, Alcaligenes faecalis, Brucella bronchiseptica, Salmonella
gallinarum, Vibrio percolans und Iianthoiaonas vesicatoria.
Das I-2"odukt inliibiert auch das Wachstum der folgenden grampositiven Bakterien: Staphylococcus aureus, Sarcina lutea
und Bacillus subtilis.
Auch bei in vivo Untersuchungen in Mäusen ergab das Antibiotikum
842-A. die folgenden V/irksamkeiten. Die Verabreichung erfolgte
durch subkutane Injektion. Kach Beendigung des Test-
109839/1836
432,
Zeitraums, gewöhnlich 7 Tage nach Verabreichung, wurde die
Menge des Produktes, die erforderlich war, um 50 % eier Mäuse
vor der sonst tödlichen Injektion zu schützen (EDnQ), berechnet:
EDj-n auf subkutanem Wege
χ zwei Dosierungen
Proteus vulgaris Proteus mirabilis 1 Proteus morganii 3202
Salmonella schottmuelleri IClebsiella pneuinoniae AD
Klebsiella pneumoniae B Paracolobactrura arizoniae
Escherichia coli
Aerobacter aerogenes Pasteurella multocida Salmonella typhosa
Diplococcus pneumoniae E400
276
276/Ug 103 /ig 125/G 125 ^E
276/Ug 103 /ig 125/G 125 ^E
125/ie
200 'ug
49 ^g
57 /B
34 UG
566 ng
* Cephaloridin und Cephalothin versagten hinsichtlich des
Schutzes bei 4000 mg χ 2 Dosierungen
Ausser den vorstehend erwähnten in vivo Untersuchungen des
Produktes wurde ein klinisches Isolat von Proteus norganii 356,
das gegenüber Cephalosporine resistent ist und Cephalosporin C abbauen kann, in einem Häuse-Schutztest verwendet, der in
der gleichen Weise wie oben angegeben, durchgeführt wurde. Die EDj-Q-V/erte für diese Versuche sind wie folgt:
132
1098 3 9/1836
Infektion Antibiotikum
Wege χ 2 Dosierungen
(Mittelwert von.zwei Versuchen)
Proteus morganii 356 84-2A 273 /ig
Proteus inorganic 356 Cephalothin 20 000 ug
Proteus morganii 356 Cephaloridin 9 270 .ug
Beispiel 9
Antibiotikum 842A
Antibiotikum 842A
S chütt elkoIb cn-Prο duktion:■
Das Inoculum wurde wie in Beispiel 8 beschrieben hergestellt.
Zwei Keimkolben der zweiten Stufe wurden ζusammer gegeben und
die Brühe verwendet, um 62 250 ml-Erlenmeyer-Kolben (bei
1 ml/Kolben), die jeweils 50 ml Medium X enthielten, zu beimpfen.
Das Medium X besass die folgende Zusammensetzung:
Medium Z:
Staley's 4S-Sojebohneniaehl 30,0 g
Lösliche Brauereirückstände 7>5 S
Cerelose 20,0 g
NaCl 2,5 g
CaCO5 (nachher pH-Wert auf 7,0) 10,0 g
Destilliertes Wasser 1000,0 ml
Die Kolben wurden bei 28° C auf einem Schüttler bei 220 Upm
mit einem Hub von 5 cm 5 Tage geschüttelt. Nach Beendigung
des Inkubationsseitraums wurde der Inhalt von 60 dieser Kolben vereinigt, und eine Probe zur Entfernung des Mycels zentrifugiert.
Das Vorhandensein des Antibiotikums 842A wurde gemäss dem
. - 133 -
109839/1836
in Beispiel 1 "beschriebenen Verfahren über Agar-Diffucionsuntersuchungen,
die an 15 πιπί Eilterpapier-Versuehsscheiben
durchgeführt wurden, bestimmt. ITach 4tägiger Inkubierung
ergab die Untersuchung der Brühe eine Inhibierungszone von
53 inia gegen Vibrio percolans (KB-1272).
Bei s ρ i el 10
Antibiotikum 8*i-2A
Fera enta ti on:
Fera enta ti on:
Stufe 1: üin lyphilisiertes Köhrclien von ßtreptorayces lactamdurans
Kultur (i-iÄ-2908) wurde zur Beiiapfung von 50 κιΐ cterilem
Medium. V in einem unterteilten 200 ml-Erlenmeyer-Kolben
verwendet.
Medium V:
Hefe-Autolysat (Ardamin) 10,0 g
Glucose 10,0 g
*Phosphatpuffer 2,0 ml
MgSO4 · 7H2O 0,05 g
Destilliertes Wasser . 1000,0 ml
pH unter Verwendung von KaOH auf 6,5 eingestellt
*Phosphatpuffer:
KH2PO4 91,0 ß
Na2HPO4 95,0 g
Destilliertes V/asser 1000,0 ial
Der beimpfte Kolben wurde auf eineniBotationsschüttler bei
220 Upm mit einem Hub von 5 era gebracht und 72 Stunden bei
28° C inkubiert.
Stufe 2: Bin Inoculum von 10,0 ml des erhaltenen, vcgeta-
_ 134 _
109839/1836
t'iven Wuchses wurde dann zur B ei nip lung eines unterteilten
2 Liter-Erlenrieyer-ivolbens, der 50 ^l des oben b escliri ebenen
steril! ei ex't en Iiediums V enthielt, verwendet» Der beimpfte
Kolben wurde dann auf einen Hotationsschüttler bei 220 Upm
gebi'acht und 48 Stunden bei 28° C inkubiert.
Stufe 7: Der Inhalt des Inoculuia-iLolbens wurde dann zur Beimpf
ung eines 190 1 (50 gallons) rostfreien i'ermentaticnsbehälters,
der 160 Liter des gleichen vorstehend beschriebenen Ilediuriö V enthielt, verwendet. Das beimpfte Kediuin
wurde bei 20° C 48 Stunden unter Bewegung inkubiert, während
eine Luftströmung von 85 l/min. (3 cfm) durch die Perm ent ationsbrühe
"beibehalten wurde. Während des Fermentationszeitraums wurden kleine Mengen Polyglykoi 2000 zur Regelung der
i'ig zugegeben.
^tufe__4: Ein Inoculum von 43 Liter des erhaltenen Wuchses
wurde dann zur Beiiapfung eines 750 1 (200 gallons) i'ernentationsbehälters
aus rostfreiem. Stahl verwendet, der 467 Liter
eines sterilen Mediums XII der folgenden Zusammensetzung enthi elt:
Medi 1 in ,XI;
Amber-Hefe Kr. 300 r 10,0 g
Lösliche Brauereirückstände 20,C g
Destilliertes Wasser 1000,0 m 7,0
Han Hess die Fermentation bei einer Temperatur von 28° C
unter Bewegung fortschreiten, während eine Luftströmung von
280 1/nin. (10 ein) während 72 Stunden beibehalten wurde.
Während der 5'ersientation wurde ein Antischaummittel, FoIyglykol
2000, in kleinen Mengen zugegeben, um übermässiges
Schäumen zu verhindern. Der Ansatz wurde gewonnen und die Wirksamkeit durch Scheiben-Piattenversuche ermittelt. Die
iferiuentationsbrühe wurde dann durch Diatomeenerde bei einem
■ - 135 -
109839/1836
Ai*
pH-Uert von 7?8 filtriert, und daß so erhaltene Produkt wurde
als 842A nach, dein in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren identifiziert.
Scheiben-Plattenversuclie einer 1 : 10-Verdünnung
ergaben eine Inhibierungszone von 21,5 Ifim E&Sen Vibrio percolans
(MB-1272).
Beispiel 11
Reinigung, ilononatriumsalz der 7i~
amido)-5- (carbaraoyloxyiaethyl )-r'/-iii
Adsorption an Kohle: Vier Peraentationsaucö-tze, die gemäss
Beispiel 8 gewonnen wurden, wurde;, jeweils an 100 ml eines
stark-basischen Anionenaustauschharzes mit einer fctyrol-Divinylbenzol-rlatrix
(Dowex 1x2 Iferz, Chloridzyklua) adsorbiert
und mit ifcLgem, wässrige:;: Katriumchlorid eluiert.
Das Eluat wurde in ^O lul-iraktionen gesammelt und untersucht.
Eluatfraktiorieii von sämtlichen vier Ansätzen wurden auf pK
5 mit verdünnter ChloiT.rai:serstol'fS'iure eingestellt und unter
Erzielung von 4-500 ml Lösung vereinigt. 4-200 ral dieser .Lösung
wurden mit 4-2 g Kohle (Darco G-60) 1/2 Stunde gerührt. Die
Kohle wurde abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Das Piltrat
und die Vaschlösung zeigten keine Aktivität. Der Kohlekuchen wurde zweimal .mit einer 1 Liter-rler.ge 60/iLgcir., wässrigem
Aceton eluiert, indem das Gemisch 1/2 Stunde gerührt und jeweils filtriert wurde» Die Eluate wurden unter Vaku-jr; auf
108 ml bzw. 100 ml konzentriert. Versuche zeigten, dass das
erste Eluat 76 % der Aktivität enthielt, 18;:ial so v/irksam
wie das Ausgangsraaterial war und dass das zweite Eluat 17 V°
der Wirksamkeit enthielt und 14-r.al so wirksam wie das Ausgang
smateri al war. Die beiden Konzentrate wurden voreinigt
und weiter auf 61 ml konzentriert und von pH 4- auf pH 5 r-;it
verdünntem Hatriurahydroxid eingestellt. Dieses Konzentrat
enthielt 40 mg/ml trockene Peststoffe und ergab eine 25 mm-Zone
gegen HB-1272 bei einer Yerdünnurg von 1 : 100
(400 mcg/ml). Das Produkt wurde als das liononatx-iunsaiz der
- 1J6 109839/18 36
7ß-(D-5-Arnino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cepheni~4-carbonsäure
(Ia) identifiziert.
Beispiel 12
Reinigung; Hononatriumsalz der 7-ß(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3~(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
Adsorption an fiel: Ein 22 ral-Anteil des oben geinäss Beispiel
8, Stufe B, erhaltenen Bluats wurde mit verdünntem Natriumhydroxid
auf pH 7>° eingestellt und auf einer 388 ml Biogel
P-2 enthaltenden Kolonne Chromatograph!ert. Die Kolonne wurde'
mit Wasser entwickelt, das ausströmende Gut mit einem Differential-Refraktometer
aufgezeichnet und 5 ml Fraktionen automatisch gesammelt und biologisch untersucht. Die biologische
Wirksamkeit trat in den Fraktionen 47 bis 63 auf,
während Natriumchlorid in den Fraktionen 62 bis 72 auftrat.
Die Fraktionen 50 bis 60 wurden zusammengegeben, wieder untersucht
und zur Trockene eingeengt, wobei 10,8 mg Rückstand erhalten wurden, der als das Mononatriumsalz ' der 7ß-(^-5~
ALiino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
(Ia) identifiziert wurde. Nach Untersuchung mit Vibrio percolans ergab dieses Produkt eine 25 mm-Zone
bei-8 mcg/ml.
7ß-(D-5~Anino-^-carboxyvaleramido)~3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
Modifiziertes Fermentationsverfahren:
Btufe i A: Schrägkul türen
Ein lyophilisiertes Röhrchen von Streptoniyces lactamdurans
Kultur (M-2908) wurde aseptisch geöffnet und der Organismus
- 137 109 8 33/1836
AU
in ein Medium der folgenden Zusammensetzung überfuhrü:
Medium XII:
-1 % Eestmelasse
1 % Nationale Brauereihefe 2,5 % Difco-Agar pH 7,0
Wasser zur Auffüllung des Volumens
Die Schrägkulturen wurden 7 Tage bei 28° C inkubiert. Wenn
sie in der Kälte gelagert wurden, waren die Schrägkulturen mehr als 13 Wochen stabil.
Stube B: Keirastufen: Zweistufiges S7/stern
Erste Keimung: Me erste Keiinkultur wird direkt aus der ßchrägkultur
der Stufe A zu 40 ml 1%iger· primärer, getrocknet erliefe H.i'. , pH 7iO (von der Yeast Product Corporation erhalten)
in einen unterteilten 250 ial-Erlenmeyer-Kolben eingeimpft.
Die Kolben wurden dann auf einem Rotationsschüttler
bei 220 Upm mit einem Hub von 5 cm bei 28° G während eines
Zeitraums von 2 bis 3 Tagen geschüttelt.
Zweite Keimunp: Ein 2,5/*iges Inoculum aus der ersten Keinistufe
wurde in einen Kolben gegeben, der ein 2%iges Fleischmann
S-I50 Hefeautolysat, pH 7»0 enthielt. Der Wuchs in dieser
Stufe ist in charakteristischer Weise hell, und die Inkubierung, die wie in der ersten Stufe erfolgte, wurde
nicht über 48 Stunden ausgedehnt.
Stufe C: · Produktionsmedium
Das Produktionsmedium enthielt je Liter destilliertes Wasser:
30 g lösliche Brauereirückstände, 7?5 S Primäre, getrocknete
Hefe N.i1. und 0,25 % v/v ftobilpar-S Entschäumungsmittel. Das
Kedium wird mit einer geringen Kenge konzentrierter NaOH-
- 138 -
109839/1836
Lösung auf pH 7»O eingestellt, in Erleruneyer-Kolben verteilt
und 15 oiar 20 fänuten bei 121° C autoklaviert. Mach Abkühlen
erhielt das Medium ein 2,5/ciges Inoculum der in Stufe B erhaltenen
Keiiakultur. Die Inkubationszeit kann zwischen etwa
50 Stunden und 100 Stunden variieren, jedoch wird ein InkubationsZeitraum
von etwa 72 Stunden bevorzugt. Das Volumen des Mediums in federn Kolben kann zwischen JO und 50 ml variieren,
jedoch wurden routinemässig 40 ml verwendet. Das Aus-Dass
an Inoculum, kann zwischen 1 bis 5 % variieren, jedoch
wird in der Fx^axis im allgemeinen ein Betrag von 2,5 % verwendet.
Nach beendeter Keim entation wurden die Zellen abzentrifugiert
und die LrUIie siit Phosphatpuffer, pH 7?^ verdünnt. Die lionz
en tr a ti on an 7ß(D-5-^iiio-5-carboxyvaleraT.ido)-3- (carbamoyloxyiaeth7l)-7-iaethoxy-3-cephea-4--carbon.or.i
ure i η der ¥ez'~
rieiLtr-tionsbrühe wurde nach der biologischen Standard-Scheiben-Untersuchungeinethods
bestimmt. Der verwendete Untersuchungsorcanisraus
war Vibrio percolaiic (ATCC 8461). Filterpapier
scheiben werden in die verdünnten Brühen eingetaucht
und auf die Oberfläche von A.gar enthalt end en Petri-Schalen
gebracht, die mit der:i Versuchsorganismus Vibrio percolans
(A1TCC 8461) inokuliert worden waren. Auch wurden auf diese
Petri-Schalen Scheiben gebracht, die vorher in otandardlösungen
getaucht worden waren, welche bekannte Konzentrationen an 842A enthielten. Die Scheiben wurden Übernacht bei
28° C inkubiert und die Durchmesser der Inliibierungsaonen
aufgezeichnet. Die Konzentration an 842A und die fermentierte
Brühe werden durch Interpolieren aus der Star;dardkurve erhalten,
die Zonendurchmesser mit den bekannten Konzentrationen
der 842A Standardlösungen in Beziehung sets en. Ii ach diesen
Verfahren wurde berechnet, dass Streptoinyces lactaradurans
H3-2908 78»G Aig/ml 842A in dem inodifi ziert en i'ernentationeverfahren
erzeugte.
- 139 10 9 8 3 9/1836
Beispiel 14 ή Hd^
Lina tri ums al ζ der 7-ß- ("^~ 5-^ffiino- 5- carboxy val er ami do ) - 5-(l<,II-dimet.hylcarbamoylox7/r;iethyl)-7-IHCtIiOXy-J-C
ephem--4-carbonsäu2."e
fctufο ^-; ?ß- ( D- 5-Hith.? loylamino-5- carboxyval crami do ) - J-(
c arb anoy i ozyni e thy 3.) - 7-ra. e thoxy- >- c eph eru-4-carboncäure
2,005 g (4,27 lallol) 7Ir-(D-5~Aniino-5-carbo:-:yvalr;ra!:iido)-5-(carbamoylox7/metliyl)-7~iiietliory~3-ceplien-^-carl)oiieäure
werden in einer Lösung aus 10bigem, wässrigem Likuliiu^aydrorr-ea·-
phosphat (26 ial) gelöst. Lars Geraisch vrird dann filtriert
und dor erhalten» Feststoff ait ΙΟ'/οϊ^ομ, uäcBrifjtm Ldl:aliunhydrogeripliofjpiiat
(2 nl) £-;ev;anob.en.
Zu de';! FiItrat verdo:i 10 nl Aceton zu£eGr.bGn. Lie LcPjUn^ wird
leicht wolkig und. bcsittt einen pli-We:-."·"!; von 8,45» ^u dieser
Lösung v.'urde 50/"i^c-f-;, Viässz'i^er. rilrikaliu:^phon:p}iat, eingestellt
auf pH 9,16 2iun;ef:cben. 1,492 ΰ (C.69 m:io"'.) J'i-i.tho:^.-'-carbonylpiitii"liiuid
in 5/-; ^l Aceton vreraon o.ann über einer·
Zeitraum von 5 ^i^uror zugeecuae, Ber i^il-V/ert värd duron Zu-fvobe
von Anteilen 5^---iGer;: ? wäs&ric;ev:i 'l'riiraj.iur.p.-iorrpliat i;1 er
die nächsten 1,5 .Stunäsn auf 9^1 oiri^tctellt. L'c-r; (ki-ürc;:
i;ird äonn 2,ur lintfemiinc; dee Acetons c-ir.red"."r,prt Vi.d. der τ.Γ).—
V/ert mit 2,5 n-Chlorvicscerotoi'!'säure ruf 2 bi^; ?,5 c-ivjfjer-tell
J)EiG G-enis2li wird mit vier \h:-_ ze hurten. :.-it Ithylaceüat (?5 -^J-)
e;:.ti :-.hi ert, und di.o vc-reinicteii. blcrsreloen L:Li:rr;.l;to t-.T erden
mit £5 E-I Wasser ^Gv-:^£chen, r::it v/annci-froic^ i.atriorunrJ.ri:.i;
übernacht getrocknet und ein^ed?Vipft., '.-roboi 2-,Vy^ r cineo
gelben bchauris erhalten wurd'.-n. ϊ-err.: :·..■■ r, ο ti π el; e j-iesouariz lu.
Elektrophorese bestätigen, dres das auf diene weite erhaltene
Produkt 7ß-(L-5-Pht}:al07lc:nino-5-carbo^./v^lcrr"icx0-5~(carb«
araoyloxynietiiyl)-7-i'iGtho:vT-3-ocpher:i-4-carbon;:-:;ure ist.
- 140 -
1098^-/1836
Stufe B; Dibenzhydrylester der 7ß-(D-5-Pb-thaloylamino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-metlioxy-5~cepb.em-4-carbonsäure
Eine Lösung aus 0,653 m5 7ß~(D-5
val er ami do ) - 3-( c arb amoy 1 o>^na. e thy 1) - 7-m ethoxy-3-c ephem-4-carbonsäure in Methanol wird mit einem geringen überschuss an frischhergestelltem Diphenyldiazomethan behandelt.· Nach Stehen übernacht bei Rauinteiaperatur wird die Lösung eingedampft; und man erhält 1,053 g Bückstand, der als der Dibenzhydrylester der 7ß-(D-5-Pkthaloylamino-5-carboxyvaleraBiido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-earbonsäure identifiziert wird.
val er ami do ) - 3-( c arb amoy 1 o>^na. e thy 1) - 7-m ethoxy-3-c ephem-4-carbonsäure in Methanol wird mit einem geringen überschuss an frischhergestelltem Diphenyldiazomethan behandelt.· Nach Stehen übernacht bei Rauinteiaperatur wird die Lösung eingedampft; und man erhält 1,053 g Bückstand, der als der Dibenzhydrylester der 7ß-(D-5-Pkthaloylamino-5-carboxyvaleraBiido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-earbonsäure identifiziert wird.
Stufe G: Dibenzhydrylester der 7ß-(D-5~Ph.thalQy lamina-5-carboxyvaleramido)-3-(hydroxymethy1)~7-methoxy-3-c
ephem—'-l—carbonsäur e
0,5 g des in Stufe B erhaltenen Dibenzhydryiesters der 7ß-(D-5~Phthaloylamino-5-carboxyvaleraiaido)-3-(carbamoylo2cymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4~carbonsäui*e
werden in 5 nl gereinigtem Dioxan, das 1,5 Äquivalente Pyridin enthält,
gelöst. Eine Lösung aus 1,3 Äquivalenten Nitrosylchlorid
in Methylenchlorid wird zugegeben und die Lösung in einem Eisbad während 1 Stunde gerührt. Das auf diese Weise erhaltene
Produkt ist eine Lösung des Dibenzhydrylesters der 7ß-(D-5-Phthaloylamino-5-carboxyvaleramido)-3-(hydroxymethyl)-7-Diethoxy-3-cephein-4-carbonsäure,
die direkt in der folgenden Stufe verwendet wird.
Stufe I): Dibenzhydry 1 ester der 7ß-(D-5-Phthaloylamino-
5-carboxyvaleraraido)-3-(chlorcarbonyloxymethyl)-7"inetho:-ry~3--cephea-4-carbonsäure
Ein Überschuss an Phosgen v/ird in eine gerührte Lösung der in Stufe G erhaltenen 7ß-(D-5-Pli'fchaloylamirLO-5-carboxyvaler- ·
f1mi do ) - 3- (hydroxyn ethyl) -7-'.ue thoxy- 3- c epb e:a-4— carbonsäur e
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eingeblasen, und man lässt das Gemisch Übernacht bei Raumtemperatur
stehen. Das überschüssige Phosgen wird entfernt, indem trockener Stickstoff durch die Lösung wahrend mehrerer
Stunden durchgeblasen wird. Das so erhaltene Produkt wird als der Dibenahydrylester der 7ß-(E-5-K1khaloylamino-5-carboxyvaleramido)-3-(chlorcarbonyloxymethyl)-7-methoxy-3-cepheiii-4~carbonsäure
identifiziert.
Stufe E: Dibenzhydrylester der 7'ß~(D-5--Phtlialoylamino-5-carboxyvaleraraido)-3-(li?H~dimeth7/lcarbamo;yloxymethyl)-7-iüethoxy-3-cephea-^-carbonsäure
Der nach Stuf e D-erhaltene Dibenzhydrylester der 7-8-(^-5-Phthaloylamino-5-carboxy
valeramido)-3-(chlor carbonyloirymethyl-7-niethoxy-3-cepheni-4-carbonG! :J-ure
wird in einem Eisbad gekühlt, und 2,5 Äquivalente Dimethylainin werden zugegeben.
Das Gemisch wird bei Raumtemperatur 1 Stunde gerührt und
das überschüssige Amin-hydrochlorid abfiltriert. Das so erhaltene Produkt wird als der Dibenzhydrylester der r/ß-(.l)-^~
Phthaloylamino-5-carboxyvaleramido)-3-(N,IT-öim.ethylcarbamoyloxymethyl)-7~methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
identifiziert.
Stufe ff; Dinatriumsalz der 7ß-(D-5-Phthaloylamino-5-csrboxyval
eramido ) - 3- (N, N-dim ethylcarbaraoyloxynethj-l) -7~
methoxy-3-cephon-zi~c&rbonsäure
Der in Stufe E erhaltene Dibenzhydrylester der 7ß-(D-5-Phthaloylamino-5-carboxyvalerar:iido)-3-(li,IT-dimethylcarbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephera-4-carbonsäure
wird in 3,5 dl Anisol gelöst und mit 10 mi Trifluoressigsäure bei
Raumtemperatur 10 Minuten behandelt. Die ü'rifluoreasig'säure
und das Anisol werden dann unter vermindertem Druck entfernt, während die Temperatur unterhalb von 40° 0 gehalten wird, und
der Rückstand wird in 25 ml Chloroform aufgenommen und mit
20 ml Wasser, dae 0,120 g Hatriumbicarbonat enthält, behandelt.
Das Gemisch wird 0,5 Stunden bei Raumtemperatur ge-
- 142 -
109839/1836
14-305
rünrt und die organische Phase abgetrennt und mit Wasser gev-ar.chen.
Lie kombinierte, wässrige Phase wird äann zweimal
mit Methylcnchlorid gewaschen und lyophilisiert, wobei das
LMnatriumεnlζ der ''/Ii-(D-^-PJithaloylamino^-cai-boryvaler-&:.·>!do)-3~(i«
,l^-air.iethylcarbaiiioyloxyiaethyl)-7-niethoxy-3-cephem
t\-c.· rt cn rl" ure erhalten wird.
ptn/'o G-: Hinatriuacals der 7^— (D-y-Amino-ß-y
ani do ) - 3- (^ i Ii-da.ir;ethylc arbancy 1 oxyn ethyl) -7
iii e thoxy- 3~ c cphe:n~}L- c arbonsäuj1 e
Las ii: btu^e ϊ e2?haltone Binai-riunisalü der
7-I-.C l;ho:-,.7.r-^--cephe:.i-i';-c.'.rbon2:Iure v;ird in V/ascex* gelöst.
1 j-c.uivricnt ilydrasinhydrat i;ird d^im. aurorebei:, und man
l;'.r ■-.!:· öc.s Go:-inch bei Kaunl is'ir,eratur übcrnacht stehen. Die
ν::=.;·1 ·::■:■ (~g ->-öf \v. ^ v.'i^'i ^iit iitlrj lacctat vor dem Lyophilisierr'ßn
e;-:ir./"·;-· :.wt, u";d nan erhalt c:a.· ianatrii-.^ftais der r ('ß~(D~5-AirJ
rc— ^-c-'.r-boxyvalera:nido)->-(l',JT-dineG}i7lcarba"icylo3r5'n;ethTl)
i e 1
jJn - ntri'MJT.'ilz üct·· 7^-i3-5-^riJ1o~5-carbo:^.-v.'lera'i3 c1o)-5~
r L, cridinc :·arυο:"..7*.:.ο>ς;.':..ethyl )-7--ßtiio::y-3-ccpheui-^--carbon
7-r. r/i;r. o:c:- ^- c epho:::-A— carbon^" .ur -·ο-
Vrtcr I^rsatr: eir:a.v i:.ruiv:alcrLte:i rieiip'e i-iperidin cncteile des
ÜT.'e'^-:yla~iii:3 ["eTiD.sc Eeispiel 14, Stufe E, und unter ICacL-aibc:
tunr des dort beschrieb en en VerfFlireüs v.-ird somit der
l-ibci:zh7'ärylestor der 7ß-(i>-5-^-1th.alcyla
'■}-c-rit οηε;iure erhalten.
_ λ L 7V „
10 9339/1836
BAD ORIGINAL
14Ϊ05
AMH
21098 5 A
1C1 B-:. DiIiο triurasal", der· r/P. -■■ (j.'- 5-Air.i11o~^-carbo;-,.,. v:· 1 er-
airii do ) - J- (pip cri. dir: ο c; ebony 102;v:,; ethyl) - V~;-'::: i-hory ·-
5-ccTilie:a-y{—carbon "Vi1. f/'i-;
u er Einsatz dos nach Stufe A erhalten cn JJiber..zhy aryl esters
der 7ß-(D-5-Wvbhaloyliiriir;o-^-caT-":.joj'yvalcri;:"ido)-;>
(piperidi·- nocarbony loxy:n ethyl) -'/-v, ethcxy-;. - c cph cm-''! - er :r'borin.::' ure an c. t ei 1
dos in Beispiel "14, Stufe J?, an[v<-gebeten Libcη7.}C/-'·;Γ1ο?:tern
d or V Ii ~ ( D-- 5ί-Κ ι tlia loy 1 a-:. in ο - 5™ c ar b ο xy ν a 1 ere,-. -. i do ) - Z-- (J· ·»1»'-
säure und unter liaoJiarbc-itun^: dc-r dort boychri^berie::: Knt~
veroßterungEinethode wird sorbit d-r.a Jjiuatriu icalz d-?...-· 7^-(-J-
} o:ry;n ethyl)-7-s etho::y- 5- c ephe:r ~>-\ - c °.r'bor. r:.üure crho 1 t on ,. das,
nach 13ehandlUi-[C mit Hydrar.inirydr·-rl gei.^cv der in -Jioinpiol 14.
iStufe G, boscJ-x-iebenen re^uocle c;as Dinatriuu'i.-ial" oor Γ/£>~(.ϊ:~
^-Aininü-S-carbOy^'valcrarrjido)-^;- (}ripcridinocarbonylc::.yr; ethyl)-7~raetho2^-5-f-eplie''a-4-carbonr-,;iuro
oi'cibu.
!B e i π ρ i e 1 1G
Dinatri.unisalz; der r/B~(D-5-Amino-i>~cax>bc::.yvalcrT.r:J.do)-3-(pyr
r oi i diny 1 c ar D ony 1 ory rr. e thy 1) - 7 -^ etr. oxy— 5~ c ep V: cm -4- carb on-'
säure
Stufe_A.£. DibenzLydrylenter der 7.7-(L-S-Pb bhal oyl a-:i-o-5-carbo::Tvalerai;.ido/)-2~(pyrrolidir..7lca:-:-uonylo:-;ym
ethyl) - 7-"ieth.oxy-· J- c ep;:1- ci;:.-A — c ar;b on.'.-ä ure
Unter Einsatz einer äquivalenten Henge Pyrrolidin oRctelle
des Diraethylsruins ge^äcs Beispiel 14, Ltuf.c L·, und unner
Nacharbeitung des dort beschriebenen Verfahrens wird somit
der Dibenshydrylester der 7ß-(L-5-^ntni;loylanino-!;--carbo:vyval
er ami do ) - J- (pyr rolldiny !carbonyl o::(-;. e bhy 1) - 7-Lie tho:cy- '$-·
cephera-4-carbonsäure erhalten.
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ö_tufe_I3^ Dinatriumsa3 κ dor yß-(D-5-Arriino-5-carboxyvaleraiiiido)-5-(p,yrrolidiii7/icbltll)7th
3- c ophera—/-!— c a rbonsäur e
Unter Einsatz des nach Stufe Λ erhaltenen Dibenahydrylesters
der 7ß~(O--5-PhtIialoylauiino~5-carbüxyvalci">amido)-3-pyriOlidinylcarbonylor,y:uothyl)-7-niethor.y-$-cepheni-4~carbonsäure
anstelle den in Beispiel 14, Stufe 1·', angecebenen Dibenzhydi^lesters
dor 7ß"(l)-i>-i)hthalo2'liinijio-5-carboxyvaleraiiiido)--3-(N,
Ιϊ-üimethylcarbamoyloxyiii ethyl )-7-iaethoxy-3-cophem-4-carbonsäure
und unber ITachrrboitung der dort beschriebenen EntvereßtorLvagsniet.uode
v/ird aora.it das Dinatriumsalz der 7-ß~(D-5-Ph
ülia 1 oy 1 arai.no- 5- c arb oxy val er am i do ) - 3- (py rr oli diny 1 c arbony 1-oxyiiiethyl)~7-Taothoxy--3-ceijhei!i-4-carboneäure
erhalten} das , nach Behandlung mit Ir/dra^inhyar-at nach der in Beispiel 14,
Stufe G, beschriebenen Methode das Dinatriumsalz der 7ß-(D-5-Amirjo-5-carboxyvalerGiiiiclo)~3-(pyrrolidinyicarbonylo5^yiaethyl)-7-Biethoxy-3~cophem-4-carbonsäure
ergibt.
B e i G ρ i. e 1 1?
Dinatriurnsalz der 7ß- (i-'-^-Arnino-^- carbox33rvaleramido)-3-
CmoipholiriocRrbonyloxyioethyl)-7-raethoxy-3-cepheni-4-carbon-
säurc
Stufe A; Dibenzhycirclester der 7ß-(D-5-Phthaloylaiaino-5-
carbG;t7/Vc,lcraniido)--3-(iaorpholi.Docarbonyloxymethyl)-7-i>iüthoxty-3~ccphein-zi—
carbonsäure
Unter Ersatz einer äquivalenten Menge Korpholin anstelle des
Dimethylamine p:eniäss Beispiel 14, Stufe E, und unter Kacharbeitung
des dort beschriebenen Verfahrens, wird somit der Dibenzliydryleator dor '~/il-(D-5-iJhthaloylfimino-5-carbox7/valeranido)-3-(worpliolinocrj.rbon7/lo.-::yriLethyl)-7-riiethoxy-3-cepheiii-4-carbonsäurij
erhalten.
- 145 -
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14-305
Stufe B: Dinatriurisalz, der 7jr-;-(D-5-Ani57
ami do ) - J— ( ε ο it, ho 3. i.·; ο f. arc or.;/ J. ο xy:i c thy J.) - 7-·» £:- fch ο iiy-3-c
ep h evi ~ ·Ί - c a rb ο ι.: ε ? ΐ u r c
Unter Ersatz des nach Stufe A erhaltenen Dibenzhydrylouters
der 7-ß- CD-5-Phthaloylam.Ko- 5-carboxyvaleramido)~3-mor .-;holinocarboiiy
1 oxy.".et.hy 1)-r/-v.\cthe-xy-5-cephe:a-4»cατ·ΐ>oi-.ßllur·'? anstelle
dec in Beispiel 1^1I-, Stufe i', anccGeber.er. Liberiahydrylestors
der 7^-(3-5-i:hth:aloyleii.ixio-5-ci'.x-';.'Oxyvfilerai i'i oo)
carbonsäure und unter llach^rboituriy der dort bt-'-jciirieb^rc^
Entvere3terurx{2Evaev":.O'J-e viira somit dan Dir.atriurica.lv; aex1
);r'rr:iethyl)-7-rnetho:-:'T~>-coT)hen-4~carboiL£.r.u.Te crli^li.
das, nach j3chs.nalur:g; aiit Ilydrasinhydrat nach dc:.i iii Beispiel
14, Stufe G, beschrieb on on "verfahren das liinatriunisalz der
7ß-(D-5-Amino-5~ carboxyvaleramido)-J-(norpholii ι ο c arbonyloxymethyl)-7-eethoxy-3-copheni-·'!
— carbonsäure ei-rfht.
B e i s ρ i el 18
Dinatriumsalz der 7-3-(U-fJ-Anano-^-carbo^'valc??a:iido)-(
ac etoxyraethy 1) -7-f- othoxy- 3~^ ephe.i-z!· - carbonic, ur e
Stufe A; Dibenshydrylecter der 7ß-(lJ-5-Phthalcyl!3.nino-5-carb
oxy valer a::ii do ) - 3- ( ac etoxyiae thyl) -7-rae thoxy-
Ein überschuss an Acetyichlorid \tfird unter Hüha^en zu den
in Beispiel 14·, Stufe C, erhaltenen Dibenahydryloster dex'
Kiethyl)-7~i7iethoxy-3-cephera-4-carboEBäuive zubegeben. Ilan
lässt das Gemisch mehrere Stunden bei iiauiatcnperatur ste)ien
Das Gemisch wird dann im Vakuum konzentriert, an überschüssiges Acetylchlcrid und Lösuitcsinittel zu entfernen. Der ;:o
erhaltene Eückstand ist der Dibenshydrylecter der 7-i-(j"'~?~
- 146 -
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BAD OBiGtNAl.
ϊ-h tr, -.1 ογ 1 "·:;ιζ Jio- 5~c arboxy val or ar iido ) - J- ( ac etorsyi iethyl) -7-ΐ:ΐϋι.ηο;:;7-;.-ο^'"ί:ο·ΐ:ί-''ί—c?:3'bon.Gt;ure.
box· Libcx:::r7,'cl.:?yloctcr der 7£-0)-i?-Hithaloyla:iiiiio-5-carbor,y-
cäure kam1 auch durch Einsatz von Keton anstelle von Aeetyl
ohlorio" und ini übrigen unter L'α einarbeitung des in Stufe A
ViOr-CrLi1IOi)OnCJ-' Verfahrens erhalten werden.
i-L·.!1 "ϊλ-Ji1 vi-"" J--.ri.ir:r.al:: der 7ß-('^--!3-i"1hth.aloyla,r.ino-5~C''"-rbo;v
λ a ] (.-..: τ.*·:ί cio ) -- 'j- (. ac e t ο;:;·,'':ΐ e thy 1) - 7 -m e th.ox;,7~ ''J-Q, eph cd Ab:"
i-'c-T? :irj otui'c A erhalt one Dibensbydrvlenter der 7ß-oy^-'-vi/iC-^-oarbo^yvalcir^/iiflo)-^
cet^u:::i—/:-c:.3:bo;is^ure \;ira in l)io:ran f_tflJ-öst, und das üer;ii.,:.ch
νπ τύ der ir J-oir;piel Ί;Ι-, btufe J1', bcrcliriebeneri Jintop.terur.ce-7:iei.hc:,.O
uiito.Vw'ori'eii. Auf dieco V/c-Imc wird ein ia'ickctand er-]iai;,e::,
der dar. Linatriuaralr: der 7ß-(E-5-i'i-thalcyl'-.rii]".o-5-c£:r:·L;::i.yvalor·-·".j.do)-ί·-
(aceto;;:yi.ict3:y 1)-7-nio tlio::y-Z— cei^he^i-^!-
ciirV-oiicäure r.ui'v;oist.
§-t:lL'."iL.5i_ I-'ir: tri uncals dor 7ß-(^7.t3-A:.d.rc-^-c£-.rbo::yvalera:;iioo)-J-(
ac et οζγϊ.λ ethyl )-7-netIio::y~5-c e:phtr;;-^—
c ar roiic"". u^e -----
Das in Gtufe B erhaltene Biiiatriunsals der 7^"(-iJ-5--i-'--^"1-sloyiaiuir
o~ 5-corboxy val eraiuido )- 5- ( ac etcoiymeth;; Ί ) -7-"i6 tho^y-J-cer-hen-1'.—carbonsäure
wird in iiethylenchlorid gelöst und die 10.1'U-Vi-^ Liit 5;uiger I\atriunibicarbonatlösunr: extrahiert. Das
erhaltene Gemisch wird dann- mit i3chv.ref ölsäure auf pH 2
angesäuert "und nit J'lthylace tat extrahiert. Kach Trocknen, wird
der Extrakt im Vakuum konzentriert und der Rückstand in
Wasser gelöst. 1 äquivalent Hydrazinhydrat wird dann zugegeben,
und nan lässt das Gemisch übernaeht bei Eausiteinperatur
stehen. Die wässrige Lösung wird nit iithylacetat vor dem
1098 39/1836
BAD ORIGINAL
Lyophilisieren extrahiert, und man erhalt das liiina
der 7ß- ( ti " 5~Amino-5- carboxyva 1 er; ir<ddo ) - 3~ ( a ο e tor.yrn ethyl) -7~
m e tlioxy- 3- c cph eifl-4- ccrb onsä ure .
In. {gleicher V/^ico wie der in Beispiel -'1C beschriebonen könne
sän11 iohe *-■£c,y 1 ο:ry~gut.-ntituieri;en 1)eriν■ ν.e der Erfiηdtu.:{ν
erhalten Vicrd.cn. So kenn cn "bei:;;;>iele^eir:c durcli i'rjnc.atz den
ent r;p r ο ch en d en A c ty 1ha 1 ο [: en ids c \ >
c, t e 11 ο el c. ε A c e ty 1 e"u. 1 οri dε
ßc-Til"on Bei ppi öl 18, Otufe A, una uirter L'.'.chnphei tur.'y des in
den stufen A, B und C dieses Beispiels l;ef;chri eb er γϊι Verfahrens Eömtlicho entsprechender.! >".-'.iliano;;lo2.7- ·>
5-Aruriatir-chcarTjonvloxy-^
>-Aralk:-i:ioylcx,y- α:.ι>-; J-C-c] c-!'.liiiuicKrhori^loXysulxstituiertcn
Derivate der Kivlnäun·; trL^lter. v/erdcai. Lie
fol^er.ae Gleichung ur,.d 'Ja^ellc 1 v'Ill c^li-nteavi di cnea Verfahren
und die dabei erhaltenen Produkte.
1 0 9 c .. .- / i 8 3 6
BAD
-CH-(CH0;
ι "
O=C
f»3 „
ν Λ
COOClI>«i-
.CIIOOC-CII-
O=C
ο ecii3
) ,,-CHH—\-S
COOCH.
CF3COOH
QCH3
-CH-(CII0)-,-CNIl
O=C.
COONa NH2NH3H2O
NaHCO-
Il
NaoOC-CH-(CH2)3-CNH- h
Dl
O1 cH0OCR19
COON a
- 149 -
109839/1836
ORIGINAL INSPECTED
Beispiel
19
19
X
Cl
Cl
xyjIi
~C2H5
20 Br
21 Cl
22 Br
-CH:
23 Cl
-CH:
24 Cl
25 Cl
26 Cl
27 Br
- 150 -
109833/1836
4S4
c. i :: τ- -j e 1 28
L-:";.t.id L-:r;al7, der 7J--~
P^/ilJLi. -iibf/ns^yclryJ este:\ der 7β-(·^--5-'^ΐ1'<--θ;7ΐαπι1υο--^-
li])(itlbit]
■.-.r.Q r..„ ,}o,. Di-ben.r;li;,-c1i7/loatorfj der 7^--(ΰ-5-^1;ίί^1θ7ΐ3::ιχ:ϋο»-5-·
ί·.Γ:ι·. o::y-,·.· IcraMiao)-i>-(l:^dro;:;.methyl )--7-^Gtho:;y-p-cei)ii.or;·-
/l.-c:\F~UG~rii:.l'.\ive ν/οΐ'άόη in 5 ]r-- i'-'iif-etliyiroj'rnai.iid sUbpeiudi^rt.
kic iceal.i.ioJir^err.ir.'Oi v/ird ur:ler oticusGOif {yc-lM-acht uud durch
bli ■- "caaj.lv:olion lnv-vregt. 0,20 v.l. !Triiithylaiiiiu ur..d C,625 J-I
iit.-^i.rlif.ojyiii::.!' vcidon darm auccre'üe::, und rjach J.v.fIc£:ujjq· dos
Gc-iccho 1;1;;gu .Ίαη c^a 0,5 Ktiixden stehen.
"JIt^yIiIti:!-τ wird zu dc-:i Geraisch zugegeben, und nach Zeritrii'urierer>
wird der J-tliei1 dekantiert. Zinc zusätzliche Hen^e
i'%tLA lclbher wird zu dea öligen Rückstand sugercbev;, und die
Yer.■?'':■£vi£ung den Produktes v.rird durch Kratzen oeröx*dert. 13c;r
crhrJ i;one iei:tstoiT viird aus eino::i heiosen Gordisch aus
iietlia::Cil u;id Isopropoüol (180 ng) in ::;-.·ei Ausbeuten uinkristallii-ierb,
ur.d die Kombination cicr.cx* "beidexi --UGbeuten vrerc'c:i
v:iecrru:r. u^^ristallisiex-t, un ein Produ3:t i:u erhalten.
a^r als der 'Dil-cnnhyärylooter der 7-ß-(·;--■ 5-^"^haloyla.-inc— lj-·
2-eop::c::i-^--carbo22ci/.ure ic"e^tifiriert wurde.
vil er r\';- i c c ) -'}- {Γ.-' \:- thy 1" ::.ΐ"·ΐ- ν :.C7*1 o::y.:: ethyl) -']-κ
o'Gho^-y- p-c eplieri—'r—c ar b ν::.^ϊ ure
Der ir- Stare A erhaltene DibensLydryleHter der ?il-\ij-y-
lose;:/1836
2103854
methyl)~7-T.iεtlioxy-4; -c ephe.;i---'; — ca.rbon -:' urc v.'ir d i η j>, 5 i··-1
Anisol gelöst und rut 10 ml Tj :i .Quo:?·'.-,-vifj.;::Aure bei Iiourctemperatur
10 Hinutun beh.aiio.el I, Die 'Vriiluoror::. ifräure und
das Anisol werden dann unter ve;:;:iii3df-:!i1":c;n JJ:rucln i,riti'ei'nt}
VfJhrGiid die Temperatur unLcrh^lb voü '.(j° C geL?.i ί;ο:ο. v.'ira,
U]1Ci der-Hückritr.-xd \rivd Ir- 2:::>
:..>- Ch lore J ^i='* ααΓρα.ο-ίι.ΓΌ.α und
nit 20 iül \/acr;cr, de;; 0,120 {■ ".^t-ri'Ji'.Lir.arLor",', enthielt,
bciif.iidclt. Das Gerd Geh vrirö OJ;; Ltundoü 'boi IiüL.-i^o.'.-pcro-iiUj·
gerührt", η::ο die orj-j^r.-ircho 1-.:.-..γ·.ο α1;{_·ο'(;Γο:·ιΐ:1; ur^ ;·.ι:; t V/acocr
Coun. c ch.cn. Lie lro^l'i..ioiite, T..'i'; ,^rige 10·.-; mo vird d;;r,vi. r"/(,i;·.-iiiit
i-ie'i;hvlf2-:chlorid r?cv.;oc chen i:'-,d l'/cob.i lirior-t, voboi da,.-;
Linutriu^irül?: der r,'&~ (I'-^-In'vh-loyiai.iio-^-caarLo^^'Vi-lor-
car'bonsüurö iirlialtor. v/urdc
^ü_u/r_C: Di:-iRtriii:;r.-;l" öcr 7'--*— C^-!3·—--:-":"-:'-■ ο—f^—ο-·ο:·Τ.Γ-.;--;/ν?;!or-
Us η in Stufe E erLalteho i-iiVitr.i u:i;.a] ζ Λογ Vfi-ClJ-^-ih^La] oyl
Gph":n
^^pcü:?bcni;äuri v;ird in V.!üi.;cf>r {^ol'Jryi. Ein
iiouivGle:::t L^d^'a^inh^rirat v:i r-'i dr .un au'"or;cben, ur;d nan läc^
da« Gemisch ^-oi Kzii::.J:.c-:.r)ev-:,O.r iibemaca^ £tf,hen. nie uäsüri
GC Lösung vrird rnit Athylacc-tai; vor deT: L--ürjhi Ii r.i er en c"ctrahiert,
und nan erlialt dan Idj-\atriu:::^alz dei· 7^-(^-5~
Ardi: o-^-carboxy val era iido )- y- (λ-::: e tny 1 oarba.':i o-rln;;^ etiiyl) -
Unter hach.arbeitur.-j des in Beispiel 20 beschriebenen Verfahrene
können cant Ii el. e 5~ ί--""-on o--substituier ten Carba'aoylo::v-
du2:.:h Eincatc des entsprechenden T-ncoy-n.-·^'jg ancoelle deo
hetlpvlzsGcyanats P'enäec Beispiel 28, L;;';fe A, une u;iter
ilaeharbeitunr" de^ in den Lzu^ori At 3 sn..ä CJ diecor; i-eispiels
- 152 1 O 9 3 ■: Γ /Ι δ 3 6
BAD ORIGINAL
4o J
"b'eschriebenen Verfahren sämtliche der entsprechenden J-car"ba:i;cyloxv;i
crth^l-Eul:).,: !.;ituierten Derivate der Lr .findung
synthetisiert- werden, nie fol^or.'de Gleichung erlaub er t die
Uli: i3 et sun β ^e;" j; £.··." ijoii-pi«..·! SB, /Jbufon-A, B und G und erläutert
zusammen nit i^belle 1;C die AuGnan^sinaterialien cji.e"es Verfahrens
und die danach erhaltenen l-rodulits:
- 1:/'' 1093
,3/ t 8 3 6
BAD ORiGiNAU
Ζ.——Λλ Il ζ'
[<ζ ^r-CHOOC-CH- (CH9) ,-cnh4
I9) -
c=o
^mJI
98«
^-J? UIa
Χ2
OCH.,
-CHOOC-CH-(CH0 2 I
Ü ί
O=C C=O
rf^-S
IiOOCCF3
Base
O OCH.
0 CH2OCNHR17
• NH.
COOM
- 154 -
109839/1838
ORIGINAL INSPECTED
Bei spiel |
O=C=NR3 | R17 | Base | M |
29 | 0-C=NCH2CII2Cl | -CII2CH2Cl | NaHCO3 | -Na |
30 | C=C=NCH2Cl | -CH2Cl | KHCO3 | -K |
31 | O=C=NC(CH3) 3 | -C(CII,), | NaFiCO3 | -Na |
32 | O=C=NC2H5- | -C2H5 | KHCO3 | -K |
33 . | O=C=NC(CH3)?CH2Cl | -C(CH3J2CH2Cl | NaIiCO3 | -Na |
34 | O=C=NCOOC2H5* | -COOC2II5 | NaIICO3 | -Na |
35 | 0-C=NSO2-^-CH3 | -SO2^-CH3 | NaHCO3 | -Na |
36 | 0=C=N-<£) | Ό | NaIICO3 | -K |
37 | O=C=NCH -hQJL | -H-O)2 | NaHCO3 | -Na |
-155 -
109839/1836
45 ί
BeisBJel 58
7ß-(D-5-Amino-5-carbo^valeraLiido)-3-(pyridiniuniniethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
Eine Lösung aus 1,0 g 7ß-(D-5--A-mino-5-carboxyvaleramido)-3-(acetoxyinethyl)-7-niethoxy-3-cephem-4-carbonsäure
wird auf pH 2,5 gebracht. 8 ml Pyridin werden zugegeben, und die Lösung wird 2 Stunden auf 60° C erhitzt. Das Reaktionsge-·
misch wird dann lyophilisiert und der !Rückstand in Wasser gelöst und durch ein PolystyioL-Trimetliylbenzylammoniuiii-
-Anionenaustauschharz (43 % HpO) geleitet. Das erhaltene Gemisch der 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido*)-3-(pyridiniummethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
wird mit Wasser verdünnt, und ausgewählte Fraktionen worden lyophilisiert,
wobei praktisch reine 7-ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3"-(pyridiniummethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
erhalten wird.
Unter Einsatz einer äquivalenten Menge Trimethylamin und
Triethylamin anstelle von Pyridin in dem vorangehenden Verfahren
und im übrigen unter liacharbeitung des dort beschriebenen
Verfahrens wird somit 7ß-(D-5~Aniino-5-carboxyvaleramido)-3-(trimethylammoniunuaethy
1 )-7-methyl-3-c ephem-4-carbonsäure
und 7ß-(I!-5--A-niino-5--carboxyvaleramido)-3-('feriäthylammoniusimsthyl)-7-2iethoxy-3-cephem-4-carbonsäure
erhalten«
-1- ^ "Ll, ^c 3-=ryriäi2Hömnietl3yl"Deri^/ate 4er Erfindung können
C, * -1 ~ „idcr j ind^m das geeignete sononuklear-substi-
t -its ix. 1.-2. v-'-'-^rgehenden Beispiel
■' , [ρ v. läutern die-
OOC-CH- (CH2) 3-CNlI-NH,
COOH
O OCH, ι
HOOC-CH-(CH0)
2
. NIU
Il \
0) ,-CMII-4-2 3
:h
COOH
Beisp. | χΐ | Belsp-· | 3-COJi(C2H5) 2 3-CH2COOH 3-COCH3 4-COCH3 2-CH3 · 2-C0H5 3-CH3 4-C2H5 3-CH2OH " 4-CH2OH 4-CH2CH2CH3 3-SO3H 3-CN |
39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 |
3-F 3-C1 3-Br 3-1 4-CF3 3-COOH 4-COOH 3-CONH2 4-CONH2 3-CONHCH3 4-CONHC2Hs 4-CONHCH(CH3J2 4-CON(CH3)2 |
52 53 54 55 56 57 58 59 to 61 62 63 64 |
|
- 157 -
1Ü9833/1836
ORIGINAL INSPECTED
Λ5$
Beispiel 65
S-/?ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-4-carboxy-7-methoxy-3-cephem-3-yInethyl/-isothioharnstoff
Eine Lösung aus 1,0 g 7ß-(D-5-Ämino-5-carboxyvalera-ciido)-3-(acetoxy2iethyl)-7-metho^-5-cephem-4~carbons£lure
und 1,0 g Thioharnstoff in 25 ml Wasser wird'5 iage bei 27° G gehalten.
200 ml Aceton werden zugegeben, und das Gemisch, wird
in einen Msbad gekühlt. Das erhaltene Produkt wird darm filtriert
und durch Polystyrol-i'rirtiethylbenzylar.nionion-Anionenaustauschharz
(43 ?ό EUO) fraktioniert. Ausgewählte Fraktionen
werden lyophilisiert, und das rohe Produkt wi-rd darm aus
einem Gemisch aus Methanol und Wasser urakristallisiert, wobei
praktisch reiner £-Z7ß-(D-5-^ino-5-cafboxyvaleräi:ja.do)-4-carboxy-7~aethoxy-3-cephem-2-ylmethyl/-isothioharnstoff
erhalten wird.
Nach Ersatz einer äquivalenten Menge N-Methylthioharristoff,
N-Ätiiylthioharnstoff, N-Propy!thioharnstoff, N,N-Dinethylthioharnstoff,
N,N-l»iäthylthioharnstoff und N,N-Dipropylthioharnstoff
anstelle des in dein vorangehenden Verfahren angeführten
!Thioharnstoffe und im übrigen unter Nacharbeitung
des dort beschriebenen Verfahrens wird auf diese Weise N-Methy1-S-Z^B-(D-5-amino-5-carboxyvaleramido)-4-carboxy-7-methoxy-3-cephem-3-ylmethyl7~isothioharnstoff,
N-Äthyl-S-/^ß-(D-5-aiaino-5-carboxyvaleramido)-4-carboxy-7-'nethoxy-
3~cepheni-3-ylmethxl7-isothioharnstoff, iT-Propyl-S~Z7ß-(D-5-amii3io-5~carbo3qyvaleramido)-4-carbox7-7-niethoxy-3-cepheni-3-
ylmethyl7-i so thioharnstoff, H,N-Dimethyl-S-r/?ß-(D-5-amino-5-carboxyvaleramido)-4-carboxy-7-Q
ethoxy-3-c ephem-3-ylmethyi7-isothioharnstoff,
K,K-Diäthyl-S-Z!?ß-(i-5-amino-5-carboxy
val eramido )-4- carboxy- 7-m ethoxy- 3-cephe:u-3-y lnie thyl7-isothioharnstoff
und N,N-Dipropyl~S-Z!?ß-(l>-5-amino-5-carboxyvaleraniido)-4-carboxy-7-ciethoxy-3-cepheni-3--yliiiethyl7-iso
thioharnstoff erhalten. - ·
- 158 109839/1836
Beispiel 66 ' 45" 9
7ß-(D-5-Amino-5-cart)oxyvaleraniido)-3-(äthylthiomethyl)-7-methoxy-3-cephe!n-4~carbonsäure
Ein Gemisch aus 0,654- g 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(aceto3cymethyl)-7-methoxy-J>~cephem-4-carbonsäure
und 0,37 dl Athanthiol in einem Gemisch aus einem Teil Aceton
und einem Teil Wasser (10 ml) wird bei Raumtemperatur gerührt
und 2,0 ml einer 10$oi.gen ITatriumhydroxidiösung unter
Rühren zugegeben. Das Gemisch wird dann in einem verschlossenen Rohr 100 Stunden erhitzt und das erhaltene Gemisch im
Vakuum konzentriert-- Der Rückstand wird in Wasser gelöst und
durch ein Polystyrol-Trinethylbenaylammonium-Anionenaustauschharz
(4-3" % HpO) fraktioniert. Ausgewählte Fraktionen
werden kombiniert und lyophilisiert, wobei 7ß-(ü-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(äthylthiomethyl)-7-methoxy-3-cepheai-4-carbonsäure
erhalten wird.
Unter Einsatz einer äquivalenten Menge Methanthiol, Propanthiol,
Pyridin-2-thiol, Pyridin-J-thiol, Pyridin-4-thiol,
Benzothiazol-2-thiol, 4-MetliylpyrdQidin-2-thi9l und 2-Methyl-3,4-thiadiazol-5-tfciol
anstelle des in dem vorangehenden Verfahren angegebenen üthanthiols und im übrigen unter Nacharbeitung
des dort beschriebenen Verfahrens, werden auf diese Weise 7ß-(Dl-5"Ai3iino-5-carbos7valeramido)-3-(iaethylthioinethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure,
7-3-(D-5
carbonsäure» ?ß-(L>-5-Aiaino-'5"rcarboxyvaleraEiiclo)-3-(2-pyri-
carboxyvaleraraido)-3-(4-methylpyrimi din-2-ylthiom ethyl )-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
und 7ß-(D-5-Amino-5-carbo:x:y
valeramido)-3-(2-methyl~3,4-thiadiazol-5-ylthiociethyl)-7-methoxy-J-cephem-^-carbonsäure
erhalten.
Beispiel 67
/p(55y)y7^
J-cephem-J-ylniethylJ-iTjIi-diEethyldithiocarbainat
Eine Losung aus 6,82 g 7ß-(fr-5-Amino-5-carboxyvalera:nido)-3-(acetoxymethyl)-7-niethoxy-3-ceplieni-4-carbonGäure
und 2,86 g Natrium-N,E-dimethyldithiocarbamat in 60 ial Wasser wird
24 Stunden auf 50° C erhitzt. Das "Produkt wird lyophilisiert
und dann -durch ein Polystyrol-Trirnethylbenzylainnoniurn-Anionenaustauschharz
(43 % H0O) fraktioniert. Ausgewählte
Fraktionen werden dann lyophilisiert, wobei £-/7β-(ΰ-5-Aniino-5-'Carboxyvaleraniido)-4-carboxy-7-raethoxy-3-cephein-3-ylmethyJl7-N,N-dimethyldithiocarbainat
erhalten wird.
Unter Einsatz einer äquivalenten Iienge der folgenden ßeaktionsmittels
Katriam~ii-methyldithiocarbaniat, Natriuin-N,N-diäthylditniocarbamat,
Ifetrium-NjN-di-n-propyldithiocarbamat,
Natrium-N-methyl-N-(2~dimethylaminoäthyl)-cfchiocarbamat,
Natrium-N-äthyl-li-(2-diäthylaminoäthyl)-dithiocarbaiaat,
Natrium-N-(2-di-n-propylaminoäthyl)-dithiocarbamat, liatriualί-methyl-lί-(2-morpholinoäthyl)-ditl·liocarbanlat,
Natrium-lfmethyl-lT~(3-diäthylaaiinopropyl)-dithiocarbaiiiat,
Iiatrium-N-phenyl-K-(2-methylaminoäthyl)-dithiocarba:nat,
Katriun-N,K-tetraBiethylendithiocarbamat,
l»atrium-2T,N-pentamethylendithiocarbamat,
Hatrium-N>H-bis-(2-hydrcxyäthyl)-dithiocarbamät
und das Katriunisalz von 4-Hethyl-piperazinodithiocarboxylat
anstelle des in dem vorangehenden Verfahren angegebenen Eatriuffidimethyldithiocarbamate, wobei das NatriumbicarboiiÄt
weggelassen wird, ,jedoch sonst das dort beschrie-
- 160 -
109839/1836
bene Verfahren nachgearbeitet wird, werden auf diese 'Weise
S-/?ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-4-carboxy-7-methoxy-5-cepheri-4-ylmethyl7-N-^ethyldithiocarbamat,
Ü-/7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-4-carboxy-7-methoxy-3-cepheni-3-ylmethyl7-H,N-diäthyldithiocarbaniat,
b-/7ß-(U-5-Amino-5-carboxyval
erami do )-4-carboxy-7-methoxy-5-cephein-3-ylwethyJ./
K ,N-di-n-propyldithiocarbaraat, S
methyl-l\T-(2-dimethylaninoäthvl)-dithiocarbamat, £)-5-Amino-5-carboxy
VaI erami do ) -4— c arboxy- 7-m e thoxy- 3- c eph e;:i-3-ylmetliyJ.7-N-äthyl-lI-(2-diäthylaüiirioätliyl)-dithiocarbaiiiat,
S-/^ß-(L-5-Anino-5-carboxyvaleranido)-4~carboxy-7-iaethoxy-3-cephei;i-3-ylmetliyl7-^-(2-di-n-propylarninoätliyl)-dithiocarbamat,
S-/1?ß-(^-5-^ino-5-carbox3'valeramido)-4-carbox3/-7-iaeth.oxy-3-cephein-3-ylTaethyl7-N-raethyX-N-(2-morpholinoätliyl)-ditliiocarbainat,
ü-r/Jß-(jJ-5-Aiaino-5-carboxyvaleramido)-4_c.arboxy-7-iaethoxy-3-cepheni-3-ylniethyl7-K-Diethyl-N-(
J-diäthylaniinopropyl)-dithiocarbamat,
S- /?ß-( ^- 5- Ami no- 5-carboxyval
erami do )-4-carboxy-7-ni ethoxy-3-c eph,era- 3-ylniethyl7-N-phenyl-N-(2-methylaniinoäthyl)-dithiocarbaiaat,
S-/pß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleraaido)-4-carboxy-7-nietho:!:y-3-cephem-3-ylmetb.yl7-N,H-tetramethylendithiocarbamatt
S^-^?ß~(B-5-Amino-5-carboxy
val erami do ) -4- carboy- 7-m ethoxy- 3- c ephem-3-ylmethyl7-N»N-pGntamethylendithiocarbamat,
ii-/!?ß-(D-5-Amino-5-c
arboxy val erami άο )-4-c arboxy-7~iii e thoxy-3-c ephem-3-ylaiethyi7-N,K-bis-(2-h.ydroxyäthyl)-dithiocarbamat
und -(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-4-carboxy-7-methoxy-
erhalten.
Beispiel 68
Beispiel 68
7ß-(B-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(benzylthiomethyl)-7-methoxy-3-cepheni-4-carbonsäure
Ein Gemisch aus 0,654 g 7ß-(D-5-Anuno-5-carboxyvaleramido)-
- 161 -
109339/1836
41,2,
3-(acetoxyo.etiiyl)-7-methoxy-3-ccphoin-^— carbonsäure, 0,504 g
Natriunbicarbonat und 0,414 g Thiobenzoesäure in 5ιό ml
Wasser wird bei 50° C übernacht unter einer Gtickstoffatmosphäre
erhitzt.Das Produkt wird durch Zugabe von Aceton ausgefällt und aus eineai Genisch aus Alkohol und Wasser
kristallisiert, wobei 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramiäo)-3-(benzoylthiomethyl)-7-3iethoxy-3-cephea-4-carbonsäure
erhalten wird.
Unter Einsatz e'iner äquivalenten Menge Kaliuiiäthylxarithat,
Kalium-n-propylxanthat, Kalium! sopropylxanthat, Kaliua-nbutylxanthat,
Kalium-n-he:rylxanthat, Kaliunicyclopentylxanthat
und Kaliumcyclohexylxanthat anstelle, der in dem
vorangehenden Verfahren angegebenen Thiobenzoesäure und sonst unter Nacharbeitung des dort beschriebenen Verfahrens,
werden auf diese Weise 7ß~(D-5-Amino-5-carboxyvaleraiaido)-3-(äthoxytbiocarbonylthiomethyl)-7-methoxy-3-cephe;a-4-carbonsäure,
7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvalerarsido)-3-(n-propoxythiocarbonylthiomethyl)-7-niethoxy-3-cepheni-4-carbonsäure,
7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(isopropoxythiocarbonylthiomethyl)-7-niethoxy-3-cepheni-4-carbonsäure,
7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(n-butoxythiocaiftionylthiomethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure,
7ß-(D-5-Araino-5-carboxyvaleramido)-3--(ii-iiexyloxythiocarbonylthioniethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure,
7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(cyclopentyloxythiocarbonylthiomethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
und 7ß~(D-5-Aniino-5-carboxyvaleramido)-3-(cyclohexyloxythiocarbonylthiomethyl)-7-methoxy-3-cepheia-4-carbonsäure
erhalten.
Beispiel 69
7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3"-(toluol-p-sulfonylmethyl)-7-niethoxy-3~cepheni-4-carbonsäuie
Ein Gemisch aus 0,654- g 7ß-(D-5-Anino-5-carboxyvaleramido-
- 162 -
109839/1836
5-(acetoxyniethyl)-7-Eiethoxy-3-cepheni-4— carbonsäure und 1,0 g
Katriumtoluol-p-sulfinat in 5i^ ml Wasser wird "bei 50° C
24- Stunden erhitzt. Das Gemisch wird im Vakuum konzentriert
und aus einem Gemisch aus Methanol und Wasser kristallisiert, wobei 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(toluolp-sulfonylmethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
erhalten wird.
7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(azidomethyl)-7Hnetlioxy-J-cephem-4-carbonsäure
Ein Gemisch aus 2,0 g 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleraraido)-3-(acetoxyinethyr)-7-niethoxy-3-cepheia~^—carbonsäure
und 1,0 g Natriurcazid v;ird in 10 ml Wasser gelöst und bei 50° C übernacht
erhitzt. Das Gemisch wird dann lyophilisiert, und man erhält rohe 7ß~(D-5-Aciino-5-carboxyvaleramido)-3-(azidomethyl)-7-methoxy-3-cephem-4~carbonsäure
.
Anstelle der Behandlung von 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(acetoxymethyl)-7-methoxy-3-Gephea-4»carbonsäure
mit Natriumazid ist es auch möglich, 842A selbst dafür in einem sonst analogen Verfahren einzusetzen, um ein identisches
Produkt zu erhalten. Das folgende Beispiel erläutert dieses Herstellungsverfahren:
100 mg 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-nietJioxy-3-cephem-A«—carbonsäure
in einer 0,5 m-Phosphatpufferlösung (S ml, durch Zugabe von 3»5 S Katriumdihydrogenphosphat
und 3,4 g Dinatriumphosphat in 100 ml
Wasser und anschliessende Zugabe einer ausreichenden Menge Chlorwasserstoffsäure, um den pH-Wert auf 5 zu bringen, hergestellt) wurden in Gegenwart von 20 mg Natriumazid bei
° C 8 flinutsn erhitzt. Präparat!ve Dünnschicht-Chromato-
- 163 1098 30/1 S3 6
14305
graphie ergab 20 mg 7ß-(D-5-Anir;o-5-carboxyvaleramido)-3-(azidomethyl)-7-nietho:x.y-3-cephein—4-carbonsäure,
was durch Infrarot- und kernmagnetische Piesonanz-LoGtimmung ermittelt
wurde. Behandlung dieses Material mit 1,0 ml Trifluoressigsäure
bei C0 C während 5 Minuten und anschliessendes Abschrecken
in einem grossen Volumen Äther und Eina.aripfung dec
Lösungsmittels ergab 15 rag 7^-(^-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(azidomethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonGäure
in I'orm eines weissen Pulvers. Dieses Material besass biologische
Wirksamkeit gegenüber verschiedenen Bakterienstämmen. Dieses
Produkt wurde durch die folgenden Daten charakterisiert:
Dünnschicht-ühroiRatofrraphi e: durchgeführt auf Celluloseplatten
in einem 75/oißem, wässrigem Acetonitril-Lösuiignniittel;
der Rf-Weit für dieses Produkt betrug ü,7; der iif-Vert
für das Dinatriumsalz von 8^-2A lag bei 0,J.
Ultraviolett-Bestiminun^: /\ Maxinum betrug 263 ilillinikrorx
(mil); der molekulare Lxtinctionskoeffizient lag bei etwa
34-00 (theoretischer Wert: 8000); Infrarot-Bestimraung in
Nujol lag bei 1780 cm , was die Anwesenheit eines ß-Lactam
rings anzeigt; das Produkt ergab auch einen positiven I.inhydrintest,
aer die Anwesenheit einer cc-Aniinoadipoyl-Seiten
kette anzeigt.
Biologischer Versuch; Die Scheiben-Zonengrb'ssen in der
folgenden Tabelle sind in mm für 100 γ/ml Antibiotikum ausgedrückt
.
109939/1836
Organismus Dinatriumsalz 7ß-(D-5-Aiaino-5-carboxy-
von 642A valeraiaido)-3-(azidomethyl)-(100
γ/ml) 7-methoxy-3-cephem-4—
carbonsäure (100 γ/ml)
Escherichia
coli W-HB-60 18 21
Pseudocionas
srutzeri 1ΊΒ-1231 22 20
Vibrio percolans
MB-1272 18 16 (5 γ/πιΐ)
Beispiel 71
7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(aminomethyl)-7-methoxy-3-c
ephera-^J—carbonsäure
Die in Beispiel 70 erhaltene rohe Probe aus 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleraniido)-3-(azidoiaethyl)-7-niethoxy-3-cephem-4-carbonsäure
wird über Flatinoxid in einer essigsäurenthaltenden Methanollösung hydriert. Der Katalysator wird abfiltriert
und die Lösung konzentriert. Eine Lösung des Hückstandes wird dann durch ein Polystyrol-Trimethylbenzylammonium-Anionenaustauschharz
( 43 % Hp/) fraktioniert, und ausgewählte Fraktionen werden vereinigt und IyophiIisiert,
wobei *7ß-(D-5-Auiino-5-carboxyvaleramido)-3-(aminomethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
erhalten wird.
Die Acylierung der 7ß-(£-5-Amino-5-carboxyvaleraniido)-3-(aminomethyl)-7-aiethoxy-3-cephein-4-carbonsäure
mit Acetylhalogenid, Propionylhalogenid und 2-Pheny3acetylhalogenid
ergibt die entsprechenden N-ac^ylierten Derivate: 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(acetamidoDiethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure,
7ß-(ü-5-amino-5-carboxyvaleramido)-3-(propionamidomethyl)"7-in3thoxy-3-cepheni-4-carbonsäure
und 7ß-(D-5-Aaino-5-carboxyv!U.eraniido)-3-(2-phenylacetaaiidooethyl)
-7-IDβthoxy-3-cepheπ3-4-carbonsäure.
-- 165 -
103839/1838
Anstelle des vorstehend angegebenen katalytischen Verfahrens
kann 7ß-(^5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(azidonethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
auch zu dem entsprechenden Amin durch molekulare Hydrierung reduziert werden. Das folgende
Beispiel erläutert dieses Herstellungsverfahren.
7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleraniido)-3-(azidomethyl)-7-cietho:q/-3-cephem-4-carbonsäure
wurde in einer Lösung von 90 % Essigsäure
und 10 c/o Wasser gelöst. Das Gemisch wurde auf Ü bis
5° C gekühlt und 30 mg Zinkstaub wurden zugesetzt. Nach
Minuten wurde das Gemisch filtriert und mit Schwefelwasserstoff
behandelt, um lösliches Zink zu entfernen. Das erhaltene Gemisch wurde dann mit einem grossen Volumen Wasser
verdünnt und lyophilisiert, wobei praktisch reine 7ß-(^-5-Amino-5-carbo>^raleramido)-3-(aminomethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
erhalten wurde. Dieses Produkt wurde durch die folgenden Daten charakterisiert:
Dünnschicht-Chromatoprraphie: durchgeführt auf Celluloseplatten
in einer 75/'«igen, wässrigen Acetonitrillösung; der Rf-Wert
für dieses Produkt lag bei 0,2; der Kf-Wert für das Dinatriumsalz
von 84-2A lag bei 0,3.
Ultraviolett-Bestimmunp: /? Maximum betrug 263 nu; der molekulare
Extinktions-Jcoeffizient lag bei etwa 3500 (theoretischer
Wert: 8000); die Infrarot-Bestimmung in NuJoI ergab 1780 cm , was die Anwesenheit eines ß- Lactamrings anzeigt;
das Produkt ergab auch einen positiven Ninhydrintest, der
die Anwesenheit einer γ-Aminoadipoyl-Seitenkette anzeigt.
Biologischer Versuch: Die Scheiben-Zonengrössen sind in der
folgenden Tabelle in mm für gleiche Konzentrationen des Antibiotikums ausgedrückt'
- 166
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14305
Grganismus Dinatriunsalz 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaler-
von 842A amido)-3-(aminoniethyl)-7-
methoxy-3-cephem-4-carbonsaure
Vibrio perco-
lans MB-1272 18 20 (5 γ/ml)
Salmonella
gallinarum
HB-1287 27 21 (100 γ/ml)
gallinarum
HB-1287 27 21 (100 γ/ml)
Pseudomonas
MB-1231 21 21 (100 γ/ml)
7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(2,4-dihydroxybenzyl-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
Ein Gemisch aus 0,654 g 7ß-O)-5-Amina«-5-carboxyvaleramido)-3-(acetoxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure,
1,1 g Resorcin und 10 ml Wasser wurde 2 Tage bei 50° G erhitzt. Das Reaktionsgemisch wird dann lyophilisiert, und man erhält
rohe 7ß-(-ü-5-Amino-5-carboxyvaleramido)~3-(2,4-di-hydroxybenzyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure.
Beispiel 7? ·
7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(N-niethylindol-3-ylmethyl)-7-niethoxy-3~cephem-4-carbonsäure
Eine Lösung aus 0,655 S N-Hethylindol in 5 ml Aceton wird
au einer Lösung aus 0,654 g 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvalerajaido)-3-(acetoxyiaethyl)-7-methoxy-3-cepheni-4-carbonsäure
in 5 ml Wasser bei 50° C gegeben. Das Gemisch wird 48 Stunden
erhitzt, und das Lösungsmittel wird dann im Vakuum entfernt und der Rückstand mit Äther angerieben, wobei rohe
7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(N-methylindol-3-yljnethyl)-7~methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
erhalten wird.
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Beispiel 74
Dinatriumsalz der 7ß-(l>-5-A:aino-5-carbGxyvaleramido)-3-(hydroxyme
thy l)-7-iriethoxy-5-cephe;ii-4-carbonsäur ο
Stufe A: Dibenzylester der 7ß-(l)-5-£'h'khaloylamino-5-carboxyvaleramido)-5-(carbamoyloxynethyi;-7-naetiioxy-3-cepheni-4-carbonsäure
Eine Lösung aus 0,653 mG 7ß-(^-^-ihthaloylamino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbaraoyloxymethyl)-7-methoxy-5-cephe:a~4--carbonsäure
(Beispiel 14-, Stufe A) in Methanol wii'd mit einer
geringen Menge frisch hergestelltem Phenyldiazomethan behandelt.
Nach Stehen übernacht bei iiaumtemperatu^ wird die Lösung
eingedampft, wobei 1,053 g Rückstand erhalten wurde,
der als der Dibenzylester der 7ß~(l)--5-lJk'fchaloylaiuino-5-carboxyvalerarai
do)-J-(carbamoyloxymethyI)-7-m ethcxy-3-c eph em-4-carbonsäure
identifiziert wurde.
Stufe B: Dibenzylester der 7ß-(^-5-I<ti'fchaloylaaino-5-carboxyvaleramido)-3-(hydrc::ymethyl)-7-methoxy-3-cephera-4-carbonsäure
0,5 g dee in Stufe A erhaltenen Dibenzylesters der 7ß
Phthaloylaroino-5~carboxyvalerainido)-3-(carbanioyloxyniethyl)-7~iaethoxy-5-cephem~4—carbonsäure
werden in 5 &1 reinem Lioxaii,
das 1,5 ü-quivaiente Pyridin enthält, gelöst. Eine Lösung aus
Nitrosylchiοrid (1,3 Äquivalente) in Hethylenchlorid wird
zugegeben und die Lösung in einem Eisbad während 1 Stunde gerührt. Das so erhaltene Produkt ist oine Lösung des laben
zy!esters der 7ß-(I)-5-Phthal·oylaτnino-5-carbo>:yvalerami
do)- 3- (fcydroxyniethyl)-7-iaetho:ry- 3- c eph er.i-4- carbonsäure,
welche direkt in der folgenden Stufe verwendet wird.
- 168 -
103839/183
14305
Stufe C: Dinatriumsalz der 7ß-(D-5-Fhthaloylamino-5-
carboxyvaleraraido)-J-(iiydroxyniethyl)-7-peth.oxy-3-cephem-4-carbonsäure
Eine Lösung aus 0,5 E 10%igem Palladium-auf-Kohle wird
zusammen mit 0,5 ml Eisessig zu den in Stufe B erhaltenen
Dibenzylester der 7ß-(D-5-Hithaloylamino-5-carboxyvaleramido)-3-hydroxymethyl)-7-metho:-:y-3-cephera-4-carbonsäure
zugegeben. Das Gemisch wird bei 2,8 kg/cir.'" (50 Ib. per
square inch) unter Bewegen 2 Stunden hydriert, der Katalysator wird durch Diatoiaeenerde ab filtriert und das Lösungsmittel
durch Konzentrierung im Vakuum entfernt. Der Rückstand
wird in Ilethylenchlorid gelöst und die Lösung mit einer ^%1 gen Natriumbicarbonatlösung e:-:brahiert. Das erhaltene
Gemisch wird dann mit Schwefels' j j auf pH 2 ängesäuert
und mit Äthylacetat extrahier^. Nach Trocknen wird
der Extrakt im Vakuum konzentriert, wobei ein Rückstand erhalten wird, der als das Dinatriumsalz der 7ß-(^-5-I;hthaloylamino-5-carboxyvaleramido)-3-(hydroxymethyl)-7-methoxy-3-
cephem-4—carbonsäure identifiziert wird.
Stufe D; Dinatriumsalz der 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(hydroxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
Das Dinatriumsalz der 7ß-(D-5-Hithaloylamino-5-carboxyvaleramido)-3-(hydroxymethyl)-7-mefchoxy-3-cephem-4-carbonsäure,
das in Stufe F erhalten wurde, wird in Wasser gelöst. Λ Äquivalent Hydrazinhydrat v/ird dann zugegeben, und man
lässt das Gemisch übernacht bei Raumtemperatur stehen. Die
wässrige Lösung wird mit Äthylacetat vor dem Lyophilisieren
extrahiert-, und man erhält das Linatriucisalz der 7ß-(L-5-
cephea-4 -ccn'bonn-iare.
I ύ 3 J J 0 i' ] Q 3 6
BAD ORIGINAL
Beispiel 75
Reinigung: Mononatriumsalz der 7ß-(D-5-Aaiino-5-carboxyvaleramido;-3-(carbanioyloxyniethyl)-7-Kethoxy-3-cephe:ti-4-carbori-
1,0 g des nach Beispiel 12 hergestellten Kononatriumsalzes
der 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3~(carbanioyloxymethyl)-7-niethoxy-5-cepheni~4—carbonsäure
wurden in 20 ml 1/üigem,
wässrigem, n-Butanol gelöst und auf eine Kolonne chromatographiert,
die 2550 ml Sephadex G-10 enthielt, ein modifiziertes
Dextrangel in Perl en form. Die Kolonne v;urde mit
1%igem, wässrigem n-Butanol bei 10 ml/min, entwickelt, und
10,5 ml-Fraktionen wurden automatisch gesammelt. Die ausströmende Flüssigkeit wurde mit einem Registrier-.Refraktometer
aufgezeichnet, und die Fraktionen, wurden biologisch untersucht. Die biologische Wirksamkeit trat in den Fraktionen
99 "bis 122 auf, und diese wurden ζusammengegeben und zur
Trockene eingeengt, wobei 670 m. Produkt erhalten wurden, das vorwiegend das Mononatriumsalz der 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxyraethyl)-7-methoxy-3-cephea-4-•carbonsäure
enthielt.
Die Kolonne wurde anschliessend durch Chromatographie auf
einem Gemisch von Blue Dextran 2000 und Natriumchlorid unter identischen Bedingungen geeicht. Blue Dextran 2000 wurde
in den Fraktionen 85 bis 95 und natriumchlorid in den Fraktionen
140 bis 155 ermittelt, was anzeigt, dass das biologisch-wirksame Produkt von Verunreinigungen dieser Art
abgetrennt werden kenn.
Beispiel 76
7ß-(D-5-Amino-5-carbüxy val eraiiido")-3-'niefchyl-7-Eiethoxy-ίο ephem—^-carbonsäure
Ein -lO/üiger PalUtrUiim-auf-Kohle-X^talysator wur-i >
Ln BO r.il
0 D a 3 9 / 1 i) J 8
14305
Wasser suspendiert und mit Wasserstoff "behandelt. Der Katalysator
wurde dann filtriert und wiederum in 50 ml V/asser
suspendiert, und zu 2,6? g dieses Gemischs wurden 1,0 g Nati-iumsalz von 84-2A in 10 ml Wasser gegeben. Das erhaltene
Gemisch wurde 22 stunden box Raumtemperatur geschüttelt.
Der Katalysator wurde ab-filtriert und einmal mit 50 ml
Wasser gewaschen.Die vereinigten Waschwässer und illtrate
wurden dann zur Trockene eingeengt, und man erhielt ein"
52,8%ige Ausbeute an 7ß-(D-5-Aniino-5-carboxyvaleranido)-3-methyl-7-;.iethoxy-5-cephe:a—^-carbonsäure
(528 mg).
Die so erhaltene 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvalera:nido)-3-methyl-7-methoxy-3-cephe.in--</4~carbonsäure
wurde mit Auagangsrnaterial
unter Anwendung· von Dünnschicht-Chromatographie verglichen. Silicagel-Platten wurden verwendet, wobei die obere Phase
aus vier Teilen n-Butylalkohol, einem Teil Essigsäure und
vier Teilen Wasser bestand. Das Hydrogenolyseprodukt ergab
zwei Flecken mit einer höheren Strömungsgeschwindigkeit (Rf-Wert) als das Ausgangsmaterial. Die Flecken wurden durch
Ninhydrin und Ultraviolett-Fluoreszens ermittelt. Die folgende
Tabelle gibt die beobachteten Unterschiede zwischen dem Natriuiasalz von 842A und dem 7-ß-(D-5-Amino-4-carboxyvaleramido)-3-methyl-7-niethoxy-5~cephem-4-carbonsäure-Produkt
wieder.
109839/1836
Iiatriumsals von
Bi c X c ■ei "^ ciis Iv i x?l
SoH* »ν ΘΑ. w
--,/■ "".ρ ng/Fleck
'Xy* 9 ' JU O X S tj ^i
5 jag/'al ergab eine 25nna-Zcne
g^gen Vibrio percolans
(.I-IB-1272)
Rf 0,1 Ninhydrin (positiv)
Ultraviolett (positiv)
A aax 266 mu , S^^
7B-(D-5-AEino-5-carboxyvaleramido)-3-nieth.yl-7-iiiethoxy-5-ceph.ea-z4—carboiisäure
Inaktiv bei pO ug/nl (<
2 % Aufanpsaktivität)
Sf 0,25 Ninliydrin (positiv)
Ultraviolett (positiv)
Hf 0,55 NirJiydrin (positiv) Ultraviolett ()
Hf 0,55 NirJiydrin (positiv) Ultraviolett ()
max 2&5
S~Z?ß- (D-5~ Amino-^- carboxy vale rani do) ~zt~carboxy-7-m etho xy-3-cepheui-3-yl-methyi7-t;hiouroniu;a
100 mg Antiobiotikun 842A wurden 8 Minuten nit 26 ng Thioharnstoff
bei 95° G in 5 ml einer 0,5 m~Phosphatpufferlösung,
die durch Eugabe von 5,5 g l'iatriumdihydrogenphosphat
und 3,^ g Dinatriumphorjphat in 100 ::il Wasser und
anschli ess ende Zugabe von ausreichender Chlorwasserntoffsäure,
um den pH-Wert auf 5 su bringen, erhalten wurde,
erhitzt. Elektrophorese der Lösung bei pH 7 ergab die Thiοuronium-Verbindung als nicht-bewegliche Linlieit, während
842A einen fif-Wert von etwa 0,2 b.esans. Las-Gemisch v;urde
durch Absorption an ein Polystyrolkernsulfonsaure-Kationenaustauschharz
( Vasserstoffsyklus, Dowex 50) unter Entfernen
des Phosphatpuffers gereinigt. Die Eluierung erfolgte
unter Verwendung einer- 0,1 n-Fyridinlösung. Der pK-Wert
wurde mit 1 n-Hatriumhydroxid auf 8 eingestellt und unter Vakuum eingedampft, um restliches Pyridin au entfernen.
Lyophilisierung ergab ein gelbbraunes Pulver, das als S-/7ß-(l>-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-4—
carboxy-7-methoxy-3-ceph.em-3-yl-niethyJ(7-thiouroniuiii
identifiziert wurde. Dieses Produkt wurde durch die folgenden Daten charakterisiert:
Dünnschicht-ChroniatoKraphie: durchgeführt auf Cellulose-Platten
in einem 22;igera, wässrigen Acetonitril-Lösungsmit-
telj der Rf-V/ert für dieses Produkt lag bei 0,15; eier Rf-Wert
für das Dinatriunsalz von 842A lag bei C,3.
Ultraviolett-3estiamlui^: ^Ilaximun betrug 263 nm; der molekulare
E}:tinktionE_,lcoef fizi ent betrug etwa 5700 (theoretischer
Wert: 8000) ι die Inf rarot-Bestiinniung in Nu j öl ergab
—1
1?βΟ esa , was die Anwesenheit eines ß-Lactanrings anzeigt; das Produkt er^ib aurh 15Lr. ei '.,sitiven i;inh /O.v ini, et; c, was
1?βΟ esa , was die Anwesenheit eines ß-Lactanrings anzeigt; das Produkt er^ib aurh 15Lr. ei '.,sitiven i;inh /O.v ini, et; c, was
1 Q 9- - ? 3 / ' 3 3 8
die Anwesenheit einer a-Aminoadipoyl-Seiter;kette anzeigt.
Elektrophorese: Die Einführung einer positiven Ladung in das Produkt vmrde durch Elektrophorese bei 1000 Volt unter
Verwendung eines 0,05 m-lhosphatpuffers bei pH 7 bentvltifru ·,
der Rf-Vert für das Produkt lag bei 0,01; der Rf-Wert für
das Linatriumsalz von S42A lag bei 0,4.
BioIopasche Untersuchung:: Die Scheiben-Zongiigrossen rind
in der folgenden Tabelle in mm bei gleichen Konsentrationen
des Antibiotikums ausgedrückt.
Organismus l)inatriu:asalz 3
von 842A valeramido)-5-carbo:"7-7
(,1OO γ/ηίΐ; methoxy-;'-cephe:a-^-yi-
nethyly-thiouronium
(100 γ/ial)
Vibrio percolans B-1272 |
>35 |
Salmonella galli- narum IiB-1287 |
27 |
Pseudomonas Stutzeri MB-1231 |
22 |
Proteus vulgaris MB-8J8 |
27 |
Beispiel 78 |
23 22
'17
7ß-(D-5-Aniiiio-5-carboxyval.era!aido)-3-(4-methylthiazol-2-ylmercaptomethyl)-7-niethoxy-$-cephera-4~carbonsäure
Stufe A: 7ß-(^-5-N-tert.-Butoxycarbonylamino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbanioylo:cymethyl)-7-niethoxy-3-cephem-4-carbonsäure
1,0 g des DinatriumsalzeB von 8^2A wurden in 31»6 ml
5#igem di-basischem Natriuaiphosphat gelost, und 20,8 al
Aceton wurden urifcer Rühren zugegeben. Ler pH-Wert; der Lösung
109839/1336
BAD
wurde dann mit Natriumhydroxid auf 955 his 916 eingestellt
und 1,0 ml tert.-Butoxycarbonylazid wurde unter Rühren zugegeben.
Das Rühren wurde 4 bis 6 Stunden bei Raumtemperatur fortgesetzt, während der pH-Wert zwischen 9*0 und
unter Zugabe von Natriumhydroxid beibehalten wurde. Das Reaktionsgemisch wurde dann übernacht gerührt, wonach der
pH-Wert auf 8,5 abgesunken war. Der pH-Wert wurde mit Natriumhydroxid wieder auf 9?6 eingestellt und das Rühren
weitere 5 Stunden fortgesetzt, während der pH-Wert zwischen 9,0 und 9>6 gehalten wurde.
Das erhaltene Gemisch wurde dann mit einem halben Volumen
Äthylacetat extrhiert und der Extrakt verworfen. Ein halbes Volumen Äthylacetat wurde zugegeben und die wässrige
Schicht xtfurde mit konzentrierter Chlorwasserstoffsäure auf
ρ H 2,5 in einem Eisbad eingestellt, um die Temperatur
unterhalb von 5° C zu halten. Nach Abtrennung des Äthylacetats
wurde die wässrige Lösung noch zweimal mit einem halten Volumen Äthylacetat bei pH 2,5 extrahiert. Auf Grund
von Ultraviolett-Bestimiuungen lagen 50 % des Ausgangs-Ultra
violett-Absorbens in den Extrakten vor und 22 % in
der verbrauchten, wässrigen Phase. Die Extrakte wurden vereinigt und zur Trockene eingeengt, wobei 645 mg 7-ß-(D-5-N-tert.-Butoxycarbonylamino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-niethoxy-3-cephem-4-carbonsäure
mit einem Zehntel der biologischen Wirksamkeit des Ausgangsmaterials
erhalten wurde.
Dünnschicht-Ohr oma to grarnne wurden unter Verwendung von
Analtech-Silicagel G.ϊ1.-Platten und der oberen Phase aus
einem 4 : 1 : 4 n-Butanol, Essigsäure, Wasser-Ly ε ten: durchgeführt.
Das Produkt besass einen lif-Wert von O,5'4 auf
Grund der Ultraviolett-Bestimaung und war Nirahy-drin-iie[·.:---
tiv« Das Aue£an£siaateriai besaes einen "Rf-Wert von- 0,1
und v;ar ultraviolett- und ninliydrin-positiv.
- 175 -
Das Entfernen der tert.-Butoxycarbonyl-Schutzgruppe aus
einer 10 mg-Probe der 7-ß-(D-5-N-tert.-Butoxycarbonylamino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4—
carbonsäure wurde durch Auflösen des Materials in 0,2 ml Trifluoressigsäure und Stehenlassen der Lösung bei
Eaumtemperatur xrährend 5 Minuten durchgeführt. Die Lösung
wurde dann bei Eaumtemperatur zur Trockene eingeengt. Dünnschicht-Chromatographie, wie vorstehend beschrieben,
ergab einen Fleck für dieses Produkt mit einem Rf-Wert von
0,1, der ultraviolett- und ninhydrin-positiv war.
Stufe B; 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(4--methylthiazol-2-ylDiercaptomethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
100 mg 7ß-(H-5-N-tert.-Butoxycarbonylaiaino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsaure
in 5 ml eines pH 7-Puffers (eine 0,5 m-Lösung eines
Gemischs aus 3 »5 S Natriumdihydrogenphosphat und 3>4- g
Dinatriumphosphat in 100 ml Wasser), der 50 mg 2-Mercapto-4~
methylthiazol enthielt, wird bei 95° C 8 Minuten erhitzt. Auf diese Weise wurde 7ß-(D-5-E-tert.-Butoxycarbonylamino-5-carboxyvaleramido)-3-(4—methyl
thiazol-2-ylmercaptomethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
erhalten, die nach Behandlung mit 0,2 ml Trifluoressigsäure 7-ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(4--methylthiazol-2-ylmercaptomethyl)-7-methoxy-3-cepheia-4-carbonsäure
lieferte. Dieses Produkt wurde durch die folgenden Daten charakterisiert:
Mnnschicht-Chromatographie: durchgeführt auf Cellulose-Platten
in einem 25/^igen, wässrigen Acetonitril-Lösungsmittel;
der Ef-Wert für dieses Produkt betrug 0,6; der Ef-Wert für das Dinatriumsalz von 842A betrug 0,3.
Ultraviolett-Bestimaunp:: J( rlaxiinum betrug 269 in. «.der
molekulare Extinktions^koeffizient lag bei etwa 2000
- 176 -
1 0 9 r .-' : ' G 3 6
14-305
2109S54
(theoretischer Vert: 8000) j Infraro.t-Best-immung in Nujol
ergab 1780 cm , was die Anwesenheit eines ß-Lactamrings
anzeigt; das Produkt ergab auch einen positiven Ninhydrintest, der die Anwesenheit einer a-Amircadipoyl-Seitenkette
anzeigt.
Biologische Untersuchung:; Die Scheiben-Zonengrössen in
der folgenden Tabelle sind in mm für gleiche Konzentrationen
an Antibiotikum ausgedrückt.
7ß-( D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(zl—methylthi
azo 1-2-y Im er cap torn ethyl )■ 7-m ethopcy- 3-c ephem-4-carbonsäure
(100 γ/ml)
Organismus | 1 | Dinatrxumsalz von 842A (100 XVmI) |
79 |
Pseudomonas stutzeri' MB-1231 |
22 | ||
Escherichia coli W-ME-60 |
18 | ||
Vibrio percolans MB-1272 |
23 | ||
B e i s ρ i e | |||
13,5 20
7ß-(D-5-Amino-5-carbo3cyvaleramido)-3-(i ,3»/<~thiadiazol-2-ylm
ercaptomethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
Unter Ersatz von 2-Mercapto-1,3,4~thiadiazol anstelle des
2-Mercapto-4~methylthiazols gemäss Beispiel 78, Stufe B,
und im übrigen unter Nacharbeitung des dort beschriebenen
Verfahrens wird auf diese Weise 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(i
,3>zt~thiadiazol-2-ylmercaptomethyl)-7-methoxy-3-cephem-4~carbonsäure
erhalten.
- 177 -
109?30/1836
Beispiel 80
7ß-( D-5-Amino-5-c arb oxy val erami do )-3-(tlii ο cy ana t om e thy 1)-7-m
e thoxy- 3- c ephem-4- c arbonsä ur e
100 mg Antibiotikum 842A wurden zu 5 ml einer 0,5 m-Pufferlösung,
bestehend aus 3>5 S Natriumdihydrogenphosphat und 3,4 g Dinatriumphosphat in 100 ml Wasser zugegeben und
der pH-Wert des Gemische auf pH 5 durch Zugabe von Chlorwasserstoff
säure gebracht.. 20 mg Natriumthiocyanat wurden zugegeben und das Gemisch wurde 8 Minuten auf 95° C erhitzt.
Es wurde auf diese Weise 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(thiocyanatomethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
erhalten.
Beispiel 81
7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvalerami do )-3-( chlormethyl )-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
Stufe A: Dibenzhydrylester der 7ß-(D-5-N-tert.-Butoxy-
carbonylamino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-niethoxy-3-cephem-4-carbonsäure
Zu einer Lösung aus 15»° g 7ß-(D-5-N-tert.-Butoxycarbonylamino-5-c
arboxy val er ami do )-3-( carbamoy loxym e thy 1) - 7-me thoxy-3-cephem-4-carbonsäure
in 500 ml Äthylacetat werden 5»5 S Diphenyldiazomethan in 70 ml Äther zugegeben. Das Gemisch
wird unter Rühren auf 40° C erwärmt und dann nach 30 Minuten
mit zusätzlichen 5i5 g Diphenyldiazomethan in 70 ml
Ither behandelt. Nach 3 Stunden wird das Lösungsmittel im
Vakuum entfernt und durch ein Gemisch aus 500 ml Methanol und 20 ml Wasser ersetzt. Die Methanol-WasserlÖsung wird
viermal mit Hexan extrahiert und dann im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in Äthylacetat gelöst, über Natriumsulfat
getrocknet und im Vakuum eingedampft, wobei der Di-
- 178 109830/1836
benzhydrylester der 7ß-(D-i^-N-tert.~Butoxycarbonylamino~5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4~carbonsäure
erhalten wird.
Stufe B; Dibenzhydrylester der 7ß-(D-5-N-tert.-Butoxycarbonylamino--5-carboxyvaleramido)-3-(chlormethyl;-7~ni
ethoxy-3-c ephem-4—carbonsäure
ü'.mMol Dibenzhydryl ester der 7ß-(D-5-N-tert.-Butoxycarbonyl
amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4—carbonsäure
wird in 5 &1 Methylenchlorid
gelost und das Gemisch auf 0° G gekühlt. 1 mMol Collidin
wird zugegeben, und anschliessend wird tropfenweise eine Lösung aus 0,6 mHol Phosphorpentachlorid in 5 ml Hethylenchlorid
zugesetzt. Das Gemisch wird dann 1 Stunde in einem Eisbad bei 0° C gerührt und die erhaltene Lösung mit Natriumbicarbonat,
verdünnter Chlorwasserstoffsäure und einer gesättigten Natriumchloridlösung extrahiert. Das Gemisch
wird zur Trockene eingedampft und dann durch Chromatographie auf einer gekühlten Silicagel-Kolonne unter Verwendung
von Chloroform als Eluiermittel isoliert. Das so erhaltene Produkt ist der Dibenzhydrylester der 7ß-(D-5-N-tert.-Butoxycarbonylamino-5-carboxyvaleramido)-3-(chlormethyl)-7-methoxy-3-cepheni-4--carbonsäure.
Stufe C: Trifluoressigsäuresalz der 7ß >.- ^ •
carboxj'valeramido)-3-( chlormethyl )-7-methoxy-3-cephem-4~carbonsäure
Eine Lösung aus 1 mllol Dibenzhydrylester der 7ß-(D-5-N-tert.-Butoxycarbonylamino-5-carboxyvaleramido)-3-(chlormethyl)-7-methoxy-3-cepheni-4-carbonsäure
in 13 ml Anisol wird auf 6,5 ml kalte (0° C) Trifluoressigsäure unter Rühren
gegossen. Nach 5 Hinuten wird die Lösung unter Rühren in 1800 ml einer bei 0 C gehaltenen .ktherlösung gegossen.
Der sich ergebende feste Niederschlag wird dann gesammelt
- 179 -109839/1836
und getrocknet, wobei 7ß-(^5-Aiaino-5-carboxyvaleramido)-3-(chlormethyl)-7Hnetho:^-3-cephem-4-carbonsäure-trifluoracetat
erhalten wird.
Die neuen Verbindungen der Erfindung wurden als Verbindungen
mit dem. 5-Amino-5-carboxyvaleramidorest in der ß-Konfiguration
mit Bezug auf den Cephemkern beschrieben. Obgleich dies auf derzeit verfügbaren Informationen beruht
und als richtig angenommen wird, sollen·die Verbindungen
nicht auf diese spezielle Konfiguration festgelegt sein, falls sie auf Grund weiterer Erkenntnisse als unkorrekt
nachgewiesen würde.
Die in der vorliegenden Beschreibung angeführten Organismen sind in der Kulturensammlung des American Type Culture
Collection hinterlegt, wo sie unter den folgenden ATCC-Bezeichnungen
verfügbar sind:
Escherichia coli W-MB-60 ATCC 9637
Proteus vulgaris MB-838 ATCC 21100
Alcaligenes faecalis MB ATCC 212
Alcaligenes viscosus HB-12 ATCC 337
Vibrio percolans HB-1272 ATCC 8461
Bacillus subtilis KB-964 ATCC 6633
Auch werden in der Beschreibung mehrere verwendete Materialien mit Handelsbezeichnungen bezeichnet. Diese weisen die
folgende Zusammensetzung auf und sind von den folgenden
Bezugsfirmen erhältlich:
Amber Yeast ITr. 3OO: Eine Fraktion autolysierter Brauereihefe;
Aaber Laboratories, Juneau, Wisconsin.
Möbel par-S: Ein Entschäurnungsmittel auf Clbasis (Zusammensetzung
unbekannt); Kobil CiI-Company, 150 E. 4-2nd
Street, ITew York, New York.
- 180 -
0::
14305
Polyglykol 2000: Ein Entschäumungsmittel; Polypropylenglykol-Polymeres
mit einem mittleren Molekulargewicht von 2000; Dow Chemical Company, Midland, Michigan.
Biogel P-2: Ein Gelfiltrationsmedium; ein kugelförmiges Polyacrylamid vernetzt mit Methylen-bis-acrylamid;
Bio-rad Laboratories, Eichmond, California.
Dowex 50i Ein Polystyrol mit im Kern sulfonierter SuIf onsäure-Kationenaustauschharz;
Dow -Chemical Company, Midland, Michigan.
Analtech G.3?. Plates: Silicagel mit Calciumsulfat-Binder
und ein fluoreszierender Indikator, 250 Mikrometer
Stärke; Analtech Inc., 100 South Justison Street, Wilmington, Delaware, 19801.
- 181 -
10 9 3 3 3/1836
Claims (1)
14305
An 2
Patentansprüche
7ß- (D-5-Amino-5-carboxyvaleramido )-3-methoxy-J-c ephem-4-carbonsäure,
die in der 3-Stellung durch Methyl-, Halogenmethyl-, Hydroxymethyl-, Acyloxymethyl-, Carbamoyloxymethyl-,
N-substituierteund Ν,ίΤ-disubstituierte
Carbamoyloxymethyl-, Alkylthiomethyl-, heterocyclische
Thiomethyl-, Trialkylammoniummethyl-, Pyridiniummethyl-,
kernsubstituierte Pyridiniunmethyl-, Thiouroniummethyl-,
Amidinothiomethylreste, in denen die beiden Stickstoffatome mit 1 bis 3 Alkylresten substituiert sein können,
Aminothiocarbonylthiomethyl-, N-substituierte Aminothiocarbonylthiomethyl-,
Aroylthiomethylreste, verschiedene Oxythiocarbonylthiomethyl-Einheiten, AIkarylsulfonylmethyl-,
Azidomethyl-, Aminomethyl-, Amidomethyl-, Folyhydroxybßnzyl-, N-niedrig-Alkylindol-3-ylmethyl-
oder Thiocyanatomethylreste substituiert ist.
2. Verbindung der Formel
HOOC-CH- (CH2)J-CHH-
2 <f
COOH
worin R Wasserstoff, einen Halogen-, Hydroxy-, niederen
Alkanoyloxy-, aromatischen Carbonyloxy-, heterocyclischen Carbonyloxy-, Aralkanoyloxy-, Cycloalkancarbonyloxy-,
a-Methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxy-, α-i'Iethoxy-phydroxycinnamoyloxyrest;
einen Carbamoyloxyrest der Pormel -00CIiR1R2, worin R*1 und R2 Wasserstoff, niedere
Alkyl-, Halogen-niedrig-alkyl-, niedere Alkoxycarbonyl-,
- 182 -
109833/18 3.6
ORIGINAL INSPECTED
W05 210985 A
Aryl-, Alkarylsulfonyl-, Benzhydrylreste oder zusammen
mit dem-Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen
Eeterocyclus aus Pyrrolidi "-.yl-, Piperidino- oder Morpholinoring
bedeuten; einen 'Ihiorest der Formel -SE-',
worin E* einen niederen Alkylrest oder einen Heterocyclus
aus Pyridyl-, alky!substituiertem Thiazolyl-,
1,3,4-5Dliiadiazol-2-yl-, alkyl substituiert em 1,3,4-Thiadiazol-2-yl-,
2-Benzοthiazolyl- oder 4-niedrig-
darstellt^
Alky lpyrimi din-2-ylnngjxri-ni edrig-alkylammoniumrest;
einen Pyridiniumrest der Formel:
worin X ein Wasserstoffatom, einen Halogen-, Trifluor
methyl-, Cyano-, Carboxy-, Carbamoyl-, N-niedrig-Alkylcarbasioyl-,
Ν,Ιί-Di-niedrig-alkylcarbamoyl-, Carboxymethyl-,
niederen Alkanoyl-, niederen Alkyl-, Hydroxymethyl- oder Sulforest darstellt; Thiouroniumrest;
einen Aniidinothiorest der Formel:
-S-C
worin E , E^ und E Wasserstoff oder niedere Alkylreste
darstellen; einen Aminothiocarbonylthiorest der Formel
-SCNE7E8 ,
rp
Q
worin E' und E V/asserstoffatome, niedere Alkyl-,
Hydroxy-niedrig-alkyl-, Di-niedrig-alkylamino-niedrigalkyl-,
Horpholino-niedrig-alkyl-, N-Aryl-iT-niedrig-
- 183 -
1 G & : ."./1836
alkylaminoaTEcyiN oder zusammen mit dem Stickstoffatom,
an das sie gebunden sind, einen Heterocycles aus
Morpholino-, Piperidino-, Pyrrolidinyl- oder Piperazinorest der Formel-darsteilen:
an das sie gebunden sind, einen Heterocycles aus
Morpholino-, Piperidino-, Pyrrolidinyl- oder Piperazinorest der Formel-darsteilen:
\J
worin E7 einen niederen Alkyl- oder Phenylrest darstellt;
Aroylthiorest; einen Oxythiocarbonylthiorest der Formel:
-SCOR10 ,
10
worin E einen niederen Alkyl- oder niederen Cycloalkylrest darstellt; Alkarylsulfonylrest; Azidorest; Amino- oder einen Amidorest der Formel:
worin E einen niederen Alkyl- oder niederen Cycloalkylrest darstellt; Alkarylsulfonylrest; Azidorest; Amino- oder einen Amidorest der Formel:
-EHE11 ■ ,
worin E einen niederen Alkanoyl- oder Aralkanoylrest darstellt; Polyhydroxyphenylrest; N-niedrig-Alkylindol-3-yl-
oder Thiocyanatorest bedeutet, und deren nichttoxische,
pharmakologisch-verträgliche Salze, Ester und Amide, Honoalkylamide, Ilialkylamide, Aralkylamide
und stickstoffhaltige, heterocyclische Amid-Derivate.
3· Verbindung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass R einen niederen Alkanoyloxy-, aromatischen Carbonyloxy-,
4-Pyridylcarbonyloxy-, Aralkanoyloxy-, Cyclopentancarbonyloxy-,
Cyclohexancarbonyloxy-, a-Methoxy-psulfooxycinnamoyloxy-
oder a-Methoxy-p-hydroxycinnamoyloxyrest
bedeutet.
10983 3/1836
4-. Verbindung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass
1 2
E einen Carbamoyloxyrest der Formel: -OQCNR1R bedeutet,
E einen Carbamoyloxyrest der Formel: -OQCNR1R bedeutet,
1 2
worin R und R , die gleich oder verschieden sind, Wasserstoff
,niedere Alkyl-, Halogen-niedrig-alkyl-, niedere
Alkoxycarbonyl-, Phenyl-, p-Tolylsulfonyl-, Benzhydrylreste
oder zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie
gebunden sind, einen Heterocyclus aus Pyrrolidinyl-,
Piperidino-oder Morpholinrest darstellen.
gebunden sind, einen Heterocyclus aus Pyrrolidinyl-,
Piperidino-oder Morpholinrest darstellen.
5· Verbindung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass
R einen Rest der Formel:
f/
bedeutet, worin X ein Wasserstoff atom, einen Halogen-,
Trifluormethyl-, Cyano-, Carboxy-, Carbamoyl-, N-niedrig-Alkylcarbamoyl-, N,N-Di-niedrig-alkylcarbamoyl-, Carboxymethyl-, niederen Alkanoyl-, niederen Alkyl-,
Hydroxymethylrest oder Sulforest bedeutet.
Trifluormethyl-, Cyano-, Carboxy-, Carbamoyl-, N-niedrig-Alkylcarbamoyl-, N,N-Di-niedrig-alkylcarbamoyl-, Carboxymethyl-, niederen Alkanoyl-, niederen Alkyl-,
Hydroxymethylrest oder Sulforest bedeutet.
6. Verbindung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass
R einen Rest der Formel:
-s-c
bedeutet, worin R , BS und R Wasserstoffatome oder
niedere Alkylreste darstellen.
niedere Alkylreste darstellen.
7. Verbindung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass .R einen Rest der Formel:
- 185 -
109839/1836
-SCKR'Rö
rj ο
"bedeutet, worin E' und E Wasserstoffatome, niedere
Alkyl-, Hydroxy-niedrig-alkyl-, Di-niedrig-alkylaminoalkyl-,
N-Phenyl-N-niedrig-alkylaminoalkylreste oder
zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen Heterocyclus aus Morpholino-, Piperidino-,
Pyrrolidinyl- oder einem Piperazinorest der JFormel:
bedeuten, worin Ή/ einen niederen Alkyl- oder Phenylrest
darstellt.
8. Verbindung nach Anspruch 2,der Formel:
HOOC- CH- ( CH2 ) 3- C-HH-
COOH
worin R einen Hydroxy-, niederen Alkanoyloxy-, Carbamoyloxy-
oder !!,li-Di-niedrig-alkylcarbamoyloscyrest
bedeutet, und deren Salze, Ester und Amid-Derivate.
9. Verbindung nach Anspruch 8, worin E einen Carbamoyloxyrest
bedeutet und deren Alkali- und Erdalkalisalze.
10. Mononatriumsalz der Verbindung nach Anspruch 9·
- 186 -
10983 9/1836
11. Verbindung nach Anspruch 8, worin E einen N,N-Dimethylcarbamoyloxyrest
bedeutet.
12. Verbindung nach Anspruch 8, worin R einen Hydroxyrest
bedeutet.
13- Antibiotisches Gemisch, das durch Züchtung eines neuen
Stamms von Streptomyces griseus, Streptomyces viridochromogenes, Streptomyces fimbriatus, Streptomyces
halstedii, Streptomyces rochei, Streptomyces cinnamonensis oder Streptomyces chartreusis in einem wässrigen
Nährmedium unter aeroben Bedingungen erhalten wurde.
Antibiotisches Gemisch, gekennzeichnet durch 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxy-p-sulfooxycinnamoaloxymethyl
)-7-methoxy-3-cephem-4—carbonsäure
und 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(oc-methoxyp-hy
droxy cinnamoy loxym ethyl )-7-methoxy-3-c ephem-4-carbonsäure.
Verbindung nach Anspruch 2 der Formel:
0 OCH, - HOOC-CH-(CH2)^-C-NH-
COOH
worin R einen Hydroxy-'oder Sulfooxyrest bedeutet, und deren nicht-toxische, pharmazeutisch-verträgliche
Salze, Ester und Amid-Derivate.
12 16. Produkt nach Anspruch 15, worin R einen Sulfooxyrest
bedeutet, und dessen Alkali- und Erdalkalisalze.
- 187 -
1 09833/1838
12 17· Produkt nach Anspruch 15? worin E einen Hydroxyrest
"bedeutet, und dessen Alkali- und Erdalkali salze.
18. Natriumsalz der Verbindung nach Anspruch 16.
19. Pharmazeutische Zubereitung, gekennzeichnet durch
einen Gehalt von 15 bis 700 mg einer Verbindung der folgenden Formel in einem pharmazeutisch-verträglichen
Träger:
QCH3
HOOC
- CH- ( CH2 ) 5- CEH-
COOH
worin E ein Wasserstoffatom, einen Halogen-, Hydroxy-,
niederen Alkanoyloxy-, aromatischen Carbonyloxy-, heterocyclischen Carbonyloxy-, Aralkanoyloxy-, Cycloalkancarbonyloxy-,
a-Methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxy-,
a-Methoxy-p-hydroxycinnamoyloxyrest; einen Carbamoyl-
1 ? 1 2
oxyrest der Formel: -OOCNR R , worin E und E Wasserstoff,
niedere. Alkyl-, Halogen-niedrig-alkyl-, niedere.
Alkoxycarbonyl-, Aryl-, Alkarylsulfonyl-, Benzhydrylreste
oder zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen Heterocyclus aus Pyrrolidinyl-,
Piperidino- oder Horpholinoresten darstellen;
einen Thiorest der Formel: -SR-^, worin E^ einen
niederen Alkylrest oder einen Heterocyclus aus Pyridyl-, alkylsubstituiertem Thiazolyl-, 1,3,4—Thiadiazol-2-yl-,
alkylsubstatuiertem 1-3,4-Thiadiazol-2-yl-, 2-Benzothiazolyl-
oder 4-niedrig-Alkylpyrimidin-2-ylrest darstellt; einen Tri-niedrig-alkylammoniumrest; einen
Pyridiniumrest der Formel:
- 188 -
109S33/1836
/r *■
worin X Wasserstoff, einen Halogen-, Trifluormethyl-,
Cyano-, Carboxy-, Carbamoyl-, N-niedrig-Alkylcarbamoyl-,
NjN-Di-niedrig-alkylcarbamoyl-, Carboxymethyl-, niederen
Alkanoyl-, niederen Alkyl-, Hydroxymethyl- oder SuIforest
darstellt; Ihiouroniumrest; einen Ami dinothior eist
der Formel
worin E , E-7 und E Wasserstoff oder niedere Alkylreste
darstellen; einen Aminothiocarbonylthiorest der Formel:
rp ο
worin E' und E Wasserstoff, niedere Alkyl-, Hydroxy-.niedrig-alkyl-,
Di-niedrig-alkylaiaino-niedrig-alkyl-,
Mo rpho Ii no-niedrig-alkyl- , N-Aryl-F-niedrig-alkylaminoalkylreste
oder zusammen mit dem Stickstoffatom, an das
sie gebunden sind, einen Heterocyclus aus Morpholino-,
Piperidino-, Pyrrolidinyl- oder einem Piperazinorest der
Formel:
-N Y-E9
N /
worin e" einen niederen Alkyl- oder Phenylrest bedeutet,
darstellen; Aroylthiorest; einen üxythiocarbonylthiorest
der Formel:
- 189 109839/1836
ίο
worin R einen niederen Alkyl- oder niederen Cycloalkylrest
darstellt} Alkarylsulfonylrest; Azidorest;
Amino- oder einen Amidorest der Formel:
-KHR11 ,
worin R einen niederen Alkanoyl- oder Aralkanoylrest
darstellt; Polyhydroxyphenylrest; ΪΓ-niedrig-Alkylindol-J-yl^est
oder Thiocyanatorest bedeutet, und/oder deren nicht-toxischen, phanaakologisch-verträglichen Salzen,
Estern und Amiden, Mono-alkylamiden, Di-Alkylainiden,
Aralkylamiden und stickstoffhaltigen, heterocyclischen Amid.-Derivaten.
20. Pharmazeutische Zubereitung, gekennzeichnet durch einen Gehalt an etwa 15 bis 700 mg 7ß-(D-5-Aniio-0-5-cart>oxyvaleramido)-7-methoxy-3-cephem-4--earbonsäure,
die in der 3-S"fcellung durch eine Eydroxymethyl-, niederen
Alkanoyloxyniethyl-, Carbamoyloxymethyl- oder einen
NjN-Di-niedrig-alkylcarbamoyloxymethylrest substituiert
ist, und/oder deren Salzen, Estern und Amid-Derivaten
und einen pharmazeutisch-verträglichen Träger.
21. Pharmazeutische Zubereitung, gekennzeichnet durch einen Gehalt an 7ß-(I^5-Aiaino-5-carboxyvalerainido)-3-(carbamoyloxymethyl
)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure oder deren Salz in einer Konzentration von wenigstens 1 bis
2-«-g/ml, bestimmt nach der Scheiben-Plattenuntersuchung mit Vibrio percolans, und einen pharmazeutisch-verträglichen
Träger.
22. Pharmazeutische Zubereitung, gekennzeichnet durch einen
- 190 -
109839/183
Gehalt von etwa 15 ^g bis 700 mg 7ß-(D-5-Amino-5-carboxy
valeranii do )-3- (α-methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4—
carbonsäure und 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido
)-3- (a-methoxy-p-hydroxycinnamoyloxymethyl)-7~methoxy-3--cephem-4--carbonsäure
oder einem Gemisch davon oder einem Salz, Ester und/oder
Amid-Derivat dieser Verbindungen und einen pharmazeutisch-verträglichen
Träger.
23· Pharmazeutische Zubereitung, gekennzeichnet durch einen
Gehalt an 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(oc~methoxyp-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
oder deren Salz bei einer Konzentration von wenigstens 2 bis 4 ^1 g/ml, bestimmt nach der Scheiben-Plattenuntersuchung
mit Proteus vulgaris, und einen pharmazeutisch-verträglichen Träger.
24. Verfahren zur Herstellung einer 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure,
dadurch gekennzeichnet, dass ein zur Entwicklung einer 7-Methoxy-3-cephem-4—
carbonsäure befähigter Tükroroganismus in einem wässrigem liährmedium unter aeroben Bedingungen
gezüchtet wird.
25· Verfahren nach Anspruch 24 zur Herstellung von 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure,
dadurch gekennzeichnet, dass ein zur Erzeugung des gewünschten Produktes befähigtes
neues Actinomycet in einem wässrigen Fährmedium unter aeroben Bedingungen gezüchtet wird.
26. Verfahren nach Anspruch 25* dadurch gekennzeichnet, dass
als Actinomycet Streptomyces lactamdurans verwendet wird.
109639/1836
27· Verfahren nach Anspruch 25? dadurch gekennzeichnet,
dass ein wässriges Nährmedium verwendet wird, das
zwischen etwa 1 und 6 Gew.% Kohlehydrat und zwischen etwa 0,2 und 6 Gew.% verfügbaren Stickstoff enthält.
28. Verfahren nach Anspruch 25? dadurch gekennzeichnet,
dass die Fermentation bei einer Temperatur im Bereich von etwa 20 bis 37° c durchgeführt wird.
29· Verfahren nach Anspruch 25 5 dadurch gekennzeichnet,
dass der pH-Wert des wässrigen Nährmediums im Bereich von etwa 6,0 bis 8,0 liegt.
30.. Verfahren zur Herstellung eines Gemischs aus 7-ß-(D~5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(a-methoxy-p-sulfooxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4~carbonsäure
und 7ß-(ß-5-Amidno-5-carboxyvaleramido)-3-(cc-methoxyp-hydroxycinnamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure,
dadurch gekennzeichnet, dass ein zur Erzeugung des gewünschten Produktes befähigtes Actinomycet
in einem wässrigem lahrmedium unter aeroben Bedingungen gezüchtet wird.
31. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass
als Actinomycet ein neuer Stamm von Streptomyces gri-
f seus, Streptomyces viridochroraogenes, Streptomyces
fimbriatus, Streptomyces halstedii, Streptomyces rochei,
Streptomyces cinnamonensis oder Streptomyces chartreusis verwendet wird.
32. Verfahren nach Anspruch 3I, dadurch gekennzeichnet, dass
als Actinomycet ein neuer Stamm von Streptomyces griseus verwendet wird.
33· Verfahren nach Anspruch $0, dadurch gekennzeichnet, dass
- 192 -
109839/1836
A3
ein wässriges Uährmedium verwendet wird, das zwischen
etwa 1 und 6 Gew.% Kohlehydrat und zwischen etwa 0,2 und 6 Gew.% verfügbaren Stickstoff enthält.
34. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass
die Fermentation bei einer !Temperatur im Bereich von etwa 20 bis 37° C durchgeführt wird.
35· Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert des wässrigen Bährmediums im Bereich von
•etwa 5,5 bis 8,0 liegt.
36. Verfahren zur Herstellung eines Salzes der 7ß
Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(hydroxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure,
dadurch gekennzeichnet, dass ein Biester der 7ß-(I)-5-Aniino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure,
in der die 5-Aminogruppe blockiert worden ist, mit einem Mtrosylhalogenid unter Herstellung des entsprechenden
Diesters der 7ß-(D-5-Amino-5-cärboxyvaleramino)-3-(hydroxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
behandelt wird, die dann der katalytisehen Hydrierung und
der Behandlung mit einem Entblockierungsmittel unter
Erzielung des gewünschten Produktes unterworfen wird.
37· Verfahren zur Herstellung eines Salzes einer Verbindung der Formel:
HOOC-CH-(CH2)5-C-3m-( S N O
LK A. CHoOCN
ΝΗΛ jj*
^ sy* tL
- 193 -
109839/1836
15 16
worin R ^ und R niedere Alkylreste oder zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen mononuklearen Heterocyclus aus Pyrrolidin, Piperidin oder Morpholin bedeuten, dadurch gekennzeichnet, dass ein Diester der 7ß-(D-3M^mino-5-carboxyvaleramido)-3-(hydroxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4--carbonsäure, in der die 5--A-minogruppe blockiert worden ist, mit einem Carbonylhalogenid und dann mit einem geeigneten primären oder sekundären Amin unter Erzielung des entsprechenden Diesters der 7-ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-c ephem-4— carbonsäure behandelt wird, die nach Verseifung und Behandlung mit einem Deblockierungsmittel das gewünsche Produkt ergibt.
worin R ^ und R niedere Alkylreste oder zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen mononuklearen Heterocyclus aus Pyrrolidin, Piperidin oder Morpholin bedeuten, dadurch gekennzeichnet, dass ein Diester der 7ß-(D-3M^mino-5-carboxyvaleramido)-3-(hydroxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4--carbonsäure, in der die 5--A-minogruppe blockiert worden ist, mit einem Carbonylhalogenid und dann mit einem geeigneten primären oder sekundären Amin unter Erzielung des entsprechenden Diesters der 7-ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-c ephem-4— carbonsäure behandelt wird, die nach Verseifung und Behandlung mit einem Deblockierungsmittel das gewünsche Produkt ergibt.
38· Verfahren zur Herstellung eines Salzes einer Verbindung
der Formel:
COOH
17
worin R einen niederen Alkyl-, Halogen-niedrig-alkyl-, niederen Alkoxycarbonyl-, Aryl-, Alkarylsulfonyl- oder Benzhydrylrest bedeutet, dadurch gekennzeichnet, dass ein Disalz oder Diester der 7ß-(D-5- Amino-5-carboxyval erami do )- 3- (hy dr oxymethy 1) - 7-m ethoxy- 3- c ephem-4-carbonsäure, in der die 5-^i110S111PPe blockiert worden ist, mit dem entsprechenden Isocyanat behandelt wird, anschliessend das erhaltene Diester-Zwischenprodukt verseift wird und mit einem Deblockierungsmittel unter Erzeugung des gewünschten Produktes behandelt wird.
worin R einen niederen Alkyl-, Halogen-niedrig-alkyl-, niederen Alkoxycarbonyl-, Aryl-, Alkarylsulfonyl- oder Benzhydrylrest bedeutet, dadurch gekennzeichnet, dass ein Disalz oder Diester der 7ß-(D-5- Amino-5-carboxyval erami do )- 3- (hy dr oxymethy 1) - 7-m ethoxy- 3- c ephem-4-carbonsäure, in der die 5-^i110S111PPe blockiert worden ist, mit dem entsprechenden Isocyanat behandelt wird, anschliessend das erhaltene Diester-Zwischenprodukt verseift wird und mit einem Deblockierungsmittel unter Erzeugung des gewünschten Produktes behandelt wird.
- 194 -
109839/.1836
39· Verfahren zur Herstellung eines Salzes einer Verbindung
der Formel:
-C
OCH
HOOC-QH-(CH2)x-CKH^
-CH^OCR
,18
COOH
worin E einen niederen Alkyl-, Arylrest, einen mononuklearen,
stickstoffhaltigen Heterocyclus, einen Aralkyl- oder Cycloalkylrest darstellt, dadurch gekennzeichnet,
dass ein Diester der 7ß(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(hydroxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure,
in der die 5-Aminogruppe blockiert worden
ist, mit dem entsprechenden Acylhalogenid behandelt wird, anschliessend das erhaltene Liester-Zwischenprodukt
verseift wird und mit einem Entblockierungsmittel
unter Erzielung des gewünschten Produktes behandelt wird.
40. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel:
HOOC-CH-
HIL
QCH
COOH
- PO
in der ü einen Amidinothiorest der Formel:
-S-C
- 195 -
109839/1836
in der R , R^ und R Wasserstoff oder niedere Alkylreste
darstellen·, einen Thiorest der Formel: -SR ,
worin R·^ einen niederen Alkylrest oder einen Heterocyclus
aus Pyridyl-, alkylsubstituiertem Thiazolyl-,
1,3,4-!Thiadiazol-2-yl-, alkylsubstituiertem 1,3i4—
Thiadiazol-2-yl-, 2-Benzothiazolyl- oder 4~niedrigalkylpyrimidin-2-ylrest
darstellt} einen Aminothiocarbonylthiorest
der iOrmel:
worin R' und R Wasserstoff, niedere Alkyl-, Hydroxyniedrig-alkyl-,
Di-niedrig-alkylamino-niedrig-alkyl-,
Morpliolinot-niedrig-alkyl-, N-Aryl-N-niedrig-alkylaminoalkylreste
oder zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen Heterocyclus aus Horpholino-,
Piperidino-, Pyrrolidinyl- oder einem Piperazinorest
der Formel:
/Λ 9
darstellen, worin B7 einen niederen Alkyl- oder Phenylrest
bedeutet; Aroylthiorest; einen Oxythiocarbonylthiorest
der Formel:
-SCOR10 ,
10
worin R einen niederen Alkyl- oder niederen Cycloalkylrest darstellt; Alkarylsulfonylrest; Azidorest; Polyhydroxypnionylrest; N-niedrig-Alkylindol-J-ylrest; Tri-niedrig-alkylammoniuni- oder Pyridiniunrest der Formel:
worin R einen niederen Alkyl- oder niederen Cycloalkylrest darstellt; Alkarylsulfonylrest; Azidorest; Polyhydroxypnionylrest; N-niedrig-Alkylindol-J-ylrest; Tri-niedrig-alkylammoniuni- oder Pyridiniunrest der Formel:
- 196 -
1098 39/1836
worin X ein Wasserstoffatom, einen Halogen-, Trifluor- ·
methyl-, Cyano-, Carboxy-, Carbamoyl-, N-niedrig-Alkylcarbämoyl-,
IT, N- Di-niedrig- alkyl carbamoyl-, Carboxymethyl-, niederen Alkanoyl-, niederen Alkyl-, Hydroxymethylrest
oder Sulforest darstellt, bedeutet, dadurch
gekennzeichnet, dass 7ß(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(acyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
mit dem entsprechenden Thioharnstoff, N-substituierten Thioharnstoff, N,N-disubstituierten Thioharnstoff,
Thiol, Dithiocarbamat, Thiobenzoesäure, Dithiocarbo-.xylat,
Alkalisulfinat, Azid, Polyhydroxybenzol·,· 2T-niedrig-Alkylindol,
Tri-niedrig-alkylamin oder Pyridin behandelt wird.
41. Verfahren nach Anspruch 39» dadurch gekennzeichnet, dass
als Ausgangsmaterial eine 7ß-(D-5-Amino-5--carboxyvaleramido)-3~(ni
edrig-alkanoyloxymethyl)-7-methoxy-3-c ephem-4—carbonsäure
verwendet wird.
42. Verfahren nach Anspruch 39·>
dadurch gekennzeichnet, dass
•als Ausgangsniaterial eine 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(acetoxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
verwendet wird.
43· Verfahren nach Anspruch 39» dadurch gekennzeichnet, dass
die so erhaltene 7ß-(Ö-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(azidomethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
unter 'Bildung der entsprechenden 7ß-(D-5-Aniino-5-carboxyval
erami do) - 3-( aminoniethyl)-7-Diethoxy-3-c ephem-4-carbonsäure
reduziert wird.
- 197 -
109839/1836
14305
44. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der i'ornel:
HOOC-CH- (CH2) ,-ClIB
45-
11
worin R einen niederen Alkanoyl- oder Aralkanoylrest darstellt» dadurch gekennzeichnet, dass eine 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(aminomethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure mit dem entsprechenden Acylhalogenid behandelt wird.
worin R einen niederen Alkanoyl- oder Aralkanoylrest darstellt» dadurch gekennzeichnet, dass eine 7ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(aminomethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure mit dem entsprechenden Acylhalogenid behandelt wird.
Verfahren zur Herstellung von 7-ß-(D-5-Amino-5-carboxyvalerami
do )-3-niethyl-7-niethoxy-3-CePhCDi-^-CaTbOnSaUrO,
dadurch gekennzeichnet, dass 7ß-(I)-5-^nii°.o-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
oder ein Salz dieser Säure reduziert wird.
46. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel:
0 OCE75 ' 3
HOOC-CH-
-CH-NH,
COOH
worin E einen Thiouronium-, Azido-, Thiazolylniercapto-,
Thiadiazolylmercapto-, 3-f^ki°cyanatorest oder einen
Eest der JOnael:
- 198 -
109839/1836
-S-C
darstellt» dadurch gekennzeichnet, dass ?ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3~(carbamoyloxymethyl)-7-niethoxy-3-cepheni~4—carbonsäure
mit dem entsprechenden Thioharnstoff, Alkaliazid, Mercaptothiazol, Mercaptothia*-
diazol, Alkalithioxyanat·, 2T-substituiert en Thioharnstoff
oder N,N~disubstituierten Thioharnstoff behandelt
wird.
47- Verfahren zur Herstellung von 7ß-(D-5~Aniino-5-carboxyvaleranido
)-3-(aminomethyl)-7-niethoxy-3-cepheia-4-carbonsäure,
dadurch gekennzeichnet, dass 7&-(B-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(azidomethy1)-7-methoxy-3"-cepheui-4-carbonsäure
reduziert wird.
- 199 109839/1836
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