SU520055A3 - Способ получени противоопухолевого препарата - Google Patents

Description

опухолева  активность клеток гемолитического стрептококка увеличиваетс  независимо от того,  вл ютс  ли кокки вирулентными или авирулентными, одновременно вирулентность кокков сильно снил аетс  и способность их к образованию стрептолизина S полностью исчезает .

Дл  получени  препарата в форме, пригодной дл  введени  его в организм, суспензии кокков 1после выращивани  сообщают асептические свойства, и полученную асептическую суспензию разбавл ют до желательной концентрации .

Пример 1. Определение оптимальной концентрации пенициллина в суспензии стрептококков (опыты с лротивораковьими клетками in vitro и in vivo).

Живые клетки гемолитического стрептококка , выделенные из 100 мл 20-часовой бульонной культуры, промывают два раза физиологически .м раствором (солевой раствор) и взвешивают в 5 мл основной среды Бернгеймера (ОСБ). Полученную суспензию кокков дополнительно разбавл ют ОСБ так, чтобы получить суспензии с концентрацией 1/5 и 1/10.

К 0,5 мл солевого раствора пенициллина (от 2 до 32X10 ед./мл) приливают 2,5 мл суспензии кокков в разбавлении 1 :10. Пробирку с этой смесью помещают затем на 20 мин в термостат с темлературой 37°С.

С другой стороны, подвергают центрифугированию в течение 5 мин при 1500 об/мин молочно-белую асцитичеакую жидкость (30 мл), откаченную из мышей с 8-днев1Ной асцитической карциномой Эрлиха. Отделенные раковые клетки промывают один раз охлажденным солевым раствором, зате.м охлажденной ОСБ и вновь взвешивают в ОСБ так, чтобы получить концентрацию клеток 60x10 ед./мл.

1 мл суспензии раковых клеток приливают к 3 мл суспензии кокков, предварительно обработанной пенициллином, и смесь став т в термостат с температурой на 90 мин. Инкубированную суспензионную смесь используют дл  Бнутрибрюшинной инокул ции мышам , на каждую .мышь берут Ио 0,5 мл раствора .

Животных, которые погибают в течение опыта , вскрывают дл  определени  причии смерти , животных, которые выживают в течение 50 дней после инокул ции, забивают и вскрывают .

Одновременно провод т контрольные олыты с применением смеси из 0,5 мл раствора пенициллина (32X104 ед./мл), 2,5 мл ОСБ и 1 мл суспензии раковых клеток.

Суспензии кокков, предварительно обработанные пенИЦиллиНОм в концентраци х выше 2,7X10 ед./мл, очень активны с точки зрени  угнетени  инвазивности раковых клеток у мышей . При малых концентраци х пенициллина, а именно от 0,7 до I,i3xl0 ед./мл, только одна мышь из шести не заболевает раком.

Пример 2. Длительность лреинкубации гемолитического стрептококка в сзспензии в ОСБ, содержащей пенициллин.

Концентраци  пенициллина поддерживаетс  на уровне 2,7X10 ед./мл. Олредел ют противораковую активность in vitro и in vivo в зависимости от длительности времени преинкубации .

Пример 3. Противоракова  активность in vitro у различных препаратов стрептококков в отношении мышей-носителей рака.

Живые клетки ге.молитического стрептококка из 300 мл 20-часовой бульонной культуры промывают дважды солевым раствором и затем взвешивают в 15 мл ОСБ. Начальную суспензию кокков разбавл ют затем ОСБ в отношении 1 : 5.

1.К 30 мл разбавленной суспензии кокков (1:5) приливают 6 мл раствора пенициллина (16x10 ед./мл солевого раствора).

2.К 30 мл раз)бавлвнной суспензии кокков (1:5) добавл ют 6 мл солевого раствора:

а) суспензию кокков, содержащую солевой раствор, инкубируют 20 мин при 37°С (А); б) суспензию кокков с солевым раствором инкубируют в течение 20 мин при 37°С и дополнительно нагревают в течение 30 мин при (Б).

в)суспензию кокков с содержанием пенициллина инкубируют 20 мин при 37°С (В);

г)суспензию кокков, содержащую пенициллин , инкубируют 20 мин при 37°С и дополнительно нагревают 30 мин при 45°С (Г).

В контрольных опытах мыши-носители раковых клеток получают смесь ОСБ - солевой раствор, ОСБ - раствор пенициллина и 4 суспензии:

1) смесь ОСБ с солевым раствором инкубируют 20 мин лри 37°С (а); 2) смесь ОСБ с солевым растворо.м инкубируют 20 мин при 37°С и затем нагревают 30 мин при 45°С (б);

3) смесь ОСБ с пенициллином инкубируют 20 мин при (в);

4) смесь ОСБ с пенициллином инкубируют 20 мин лри 37°С и затем нагревают 30 мин при 45°С (г).

Противораковую активность определ ют следующим образом.

Откаченную молочную асцитическую жидкость мыше с 8-дневной карциномой Эрлиха разбавл ют солевым раствором до концентрации 23x10 раковых клеток на 1 мл. Мышей (в каждой группе 6 штук) подвергают внутрибрюшинной инокул ции 0,2 мл суспензии раковых клеток и через 24 час им инъектируют по 0,5 мл испытуемого стрептококкового препарата, эту же дозу ввод т дополнительно в течение 4 лоследующих дней.

Из четырех стрептококковых препаратов препарат г, полученный путем нагревани  суспензии кокков, предварительно обработанной пенициллином, более эффективен, чем все другие .. ,

Пример 4. О.ПЫТЫ по вирулентности различных стрептококковых препаратов.

Приготовл ют 4 суспензии кокков в ОСБ так же, как и в примере 3.

После этого приготовл ют 4 стрептококковых препарата, обработанных различным Образом:

а)суспензию кокков в ОСБ инкубируют 20 мин при (препарат Б);

б)суспензию в ОСБ с содержанием 2,i5x ХЮ ед./мл пенициллина, инкубируют 20 мин при 37°С (препарат Я-Б).;

в)суспензию кокков в ОСБ инкубируют 20 мин при 37°С и затем нагревают 30 мин при 45°С (препарат Б-45);

г)суспензию кокков в ОСБ с содержанием пенициллина 2,5x10 ед./мл инкубируют 20 мин при 37°С и затем нагревают 30 мин при 45°С (Препарат Я-Б-45).

Каждый препарат разбавл ют ОСБ и затем ввод т мышам внутрибрюшинно. Мыши, которые получили препараты Б, П-Б, и Б-Я-46 в разбавлении 1:2 млн, погибли, тогда как препарат Я-Б-45 при разбавлении всего 2000 раз не был вирулентным дл  мышей.

Пример 5. Вли ние пенициллина на способность к образованию стрептолизина S суспензией стрептококков (SZS-образовательна  активность).

В серию пробирок, в каждую из которых наливают по 3 мл смеси из 2,5 мл исходной сустгензии кокков (в ОСБ) и 0,6 мл раствора пенициллина (24x10 ед./мл); в другую серию пробирок - контрольных - наливают по 3 мл смеси из 2,6 мл исходной суспензии кокков (в ОСБ) и 0,5 мл солевого раствора. Все эти пробирки паме1Ш,а-ют на 20 мин в термостат с температурой 37°С. Затем по одной пробирке из каждой серии (с содержанием суспензии кокков 4X10 ед./мл пенициллина- из первой серии и суспензии кокков без пенициллина - из второй серии) помещают в вод ной термостат с температурой О, 37, 45, 66 или 70°С на 30 мин. Обе смеси, обработанные указанным .путем, подвер гают испытанию на SZS-образовательную активность кокков.

Нагревание при 45°С в течение 30 мин полчостью лишает кокки, взвешенные в ОСБ с

содержанием 4X10 ед./мл пенициллина, способности к образованию стрептолнзина S.

Пример 6. К 100 мл бульона м сного насто  с содержанием 1 г лептана и 0,6 г хлористого натри  добавл ют РНС в таком количестве , чтобы получить 0,8%-ный раствор РНС в литательной среде. Среду стерилизуют, рН7 ,56.

Бульонную 20-часовую культуру гемолитического стрептококка (штамм Sn) пересеивают в эту же среду и инкубируют 20 час при 37°С. Затем бульонную культуру охлаждают, центрифугируют, осажденные кокки дважды промывают солевым раствором и взвешивают

в 5 мл ОСБ следующего состава: 675 мл лтальтозы , 6 мл 20%-ного раствора монокалийфосфата , подш,елоченного NaOH (до рН 6,9), 12 мл 2%-ного раствора семиводного сернокислого магни  и 66 -мл дистиллированной

воды.

Полученную суспензию кокков разбавл ют ОСБ так, чтобы образовалась суспензи  с дес тикратным разбавлением, и к 2,6 мл этой разбавленной суспензии приливают 0,5 мл

раствора пенициллина. Дл  получени  этого раствора отдельно раствор ют пенициллин G как калиевую соль в солевом растворе до концентраци-и 16x10 ед./мл, и смесь инкубируют 20 ми« при 37°С и затем нагревают

30 мин при .

К полученной кокковой суспензии приливают 1 мл той же суспензии раковых клеток, которую используют в примере 1. Смесь инкубируют 60 мин при. каждой мыши инъактируют внутрибрюшинно по 0,5 мл смешанной суспензии.

Через 50 дней .после инокул ции определ ют число выживших животных. От рака погибла одна мышь, остальные 5 - живы. Их забива .ют и вскрывают, признаков опухоли не обнаружено.

Ф о р .м у л а изобретени 

Способ получени  противоопухолевого пре .парата путем нагревани  клеток гемолитического стрептококка, отличающийс  тем, что, с целью повышени  специфической активности , клетки предварительно инкубируют с пенициллином в концентрации 25000-60000 ед./мл при температуре 30-i38°C в течение 10-30 мин, а потом нагревают при температуре 38-50°С.