DE2035118A1

DE2035118A1 - Vaccineherstellung

Info

Publication number: DE2035118A1
Application number: DE19702035118
Authority: DE
Inventors: Philip Peter Willingboro N J Machlowitz Roy Alan Glenside Pa VeIIa, (V St A ) P
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1969-07-16
Filing date: 1970-07-15
Publication date: 1971-02-11
Also published as: JPS4823892B1; CA957279A; SE386075B; FR2059515B1; US3627874A; CH535281A; GB1274993A; FR2059515A1

Description

_Dr Dieter F. Morf. ^.U JS) I I 8

Dr: Hans-A. Brauns

ahn86w««»^uer>w;aB

15. Juli 1970 12 200

MERCK & CO., INC. .

126 East Lincoln Avenue, Rahway, N.J., V.St.A.

Vaccinehersteilung

Die Erfindung betrifft die Herstellung von Vaccinen, bei denen das Antigen von einem pleuropneumonieerregerartigen Organismus (nachfolgend auch abgekürzt: PP1O) gebildet wird, der in einem"eine fraktionierte Serumkomponente, wie eine aus Kalbsserum erhaltene Komponente, enthaltenden Kulturmedium gezüchtet worden ist. PP1O für die Zwecke der Erfindung sind Mycoplasma pharyngis, M. hominis, M. salivarium, M. fermentens, M. orale (Typ 2), "T"~Stämme, M. arthritidis, M. bovigenitalium, M. gallisepticum, M. canis, M. mycoides, M. agalactiae, M. spumans, M. plumonis, M. neurolyticum und insbesondere M, pneumoniae.·Speziell sieht die Erfindung die Reduzierung oder Entfernung des anaphylaktischen Faktors aus dem Kalbsserum vor, der in diesem inhärent vorliegt und sonst in die Vaccine gelangen kann.

Es ist seit langem bekannt, dass verschiedene, unter pneumonieartigen Synptomen Leidende nicht mit den klassischen

■-. 1 -

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Pneumonokokken-Bakterien infiziert sind, sondern ein Syndrom einer "primären, atypischen Pneumonie" zeigen. Ausgedehnte Untersuchungen in den letzten zwanzig Jahren haben gezeigt, dass diese Erkrankung von einem pleuropneumonieartigen Organismus (PP10) hervorgerufen wird, den man als Mycopla3ma pneumoniae oder Eaton's Agent bezeichnet. Dieser Organismus igt klein genug, um der Filtration zu entgehen, weist aber eine zellulare Organisation auf und ist nicht als Virus eingestuft. Die Sterblichkeitsrate der Krankheit ist zwar ausserordentlich gering, aber die Erkrankung zeitigt bei Befallenen häufig einen Inaktivierungseffekt. Man hat dementsprechend Versuche unternommen, das M. pneumoniae zur Herstellung einer Vaccine für die Immunisierung gegen den auslösenden Organismus in entsprechender Menge zu reproduzieren*

Frühe Untersuchungen des Wachsens von M-. pneumoniae für die Vaccineherstellung haben beste Züchtungsergebnisse mit Pferäe-3erum enthaltenden Medien erbracht. Da.jedoch dieses Nährmaterial nicht allgemein als für die parenterale Injektion beim Menschen voll akzeptabel betrachtet wird, ist man bemüht gewesen, -es durch andere Nährmedien zu ersetzen, die aber zu einem schlechten Inkubationswachstum des M. pneumoniae geführt oder andere Probleme- ergeben haben, durch 4ie sie als nicht praktikabel betrachtet werden mussten.

Ein solcher Versuch ist in einem Artikel von K.E. Jensen u.a., "An Inactivated Mycoplasma Pneumoniae Vaccine" in JAMA 19^, 248 bis 252 (1965)» beschrieben. Dabei wurde ein Kulturmedium eingesetzt, das den Chloroformextrakt der Dotter Embryonen enthaltender Hühnereier enthielt*und auch ein recht gutes Wachsen des M. pneumoniae ergab, aber eine medizinisch akzeptable Vaccine ist aus dieser Quelle der Öffentlichkeit nicht

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verfügbar geworden. Andere Versuchsvaccinen sind durch Züchten des M, pneumoniae in einem Kulturmedium hergestellt worden, das. Kalbsserum als wesentlichen Bestandteil enthält, wobei aber ein Gehalt des Kalbsserums an einem oder mehreren, sensibilisierenden Paktor(en) in Erscheinung trat, der häufig mit in die Vaccine übergeht. Prüfungen bei Meerschweinehen haben gezeigt, dass diese letztgenannte Vaccineart eine tödliche anaphylaktisehe Schockreaktion hervorrufen kann und für die Regelinjektion beim Menschen ungeeignet sein würde.

Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass sich der oder die zu tödlichem oder paralytischem Anaphylaxiesehock führende(n) Paktor(en) im Kalbsserum unter die Peststellbarkeitsgrenze, bestimmt mittels einer ausserordentlich empfindlichen in-vivo-Anaphylaxiebewertungsmethode, reduzieren lässt, indem man eine Reihe sorgfältig gelenkter Stufen. bzw. Schritte in vorgeschriebener Reihenfolge durchführt. Jeder der Schritte allein erscheint als zur Entfernung des oder der anaphylaktIschen Paktors/en unwirksam, aber ihre aufeinanderfolgende Anwendung führt, wie sich gezeigt hat, zur Bildung einer PPIO-Vaccine, die von der Kalbsserum-Komponente, die in dem Vaccinebildungsmedium eingesetzt wird, oder der Pferdeserum-Komponente, die in dem zur Zeit der ursprünglichen Isolierung vom erkrankten Menschen· angewandten Medium Verwendung findet, zuzuschreibender Anaphylaxie frei ist. Die wesentlichen Schritte bzw. Stufen des Verfahrens gemäsa der Erfindung sind

1. Vorbehandlung des Kalbsserums,

2. Züchtung des PP1Q in einem bestimmten pH-Wert-Bereich und 3· gelenktes Waschen des PPIO-Wachstumsgutes.

- 3 - . ' 009887/2045

12 200 · . '. 2035Π8

Das bei der Durchführung der Erfindung eingesetzte Kalbsserum stellt das gewöhnliche, kommerziell erhältliche Material dar. Vorzugsweise wird es inaktiviert, indem man in herkömmlicher, dem Stand der Technik entsprechender Weise 20 bis 60 (vorzugsweise 30) Min. bei etwa 56° C erhitzt. Mit Ausnahme dieser Erhitzungsperiode und der Behandlung gemäss der Erfindung soll das Serum bei 0 bis -20 und vorzugsweise bei etwa -20° G gehalten werden.

1. Vorbehandlung des Kalbsserums

Die Vorbehandlungsmethode gemäss der Erfindung hat die Aufgabe,' so viel wie möglich an Paktor(en) im Kalb,sganzs.erum zu entfernen, die ein anaphylaktisches Ansprechen im Wirt bewirken. Man erreicht dies im allgemeinen mit einer Fraktionierung, die zur Abtrennung bestimmter, proteinartiger Stoffe aus dem Serum führt, ohne das Vermögen des fraktionierten Serums zur Stützung des Wachsens des PPlO zu beeinträchtigen. In der Tat hat sich als ein weiteres Merkmal der Erfindung gezeigt, dass die Vorbehandlung das Vermögen des Serums, das Wachsen des PP10 zu stützen, durch anscheinend Entfernung wachsturnsinhibierender Paktoren aus dem Kalbsganzserum wesentlich verbessert. Während Konzentrationen des letzteren in dem Wachstumsmedium von über etwa 10 i<> das Wachsen des PP10 vermindern, führen Konzentrationen des behandelten Kalbsserums gemäss der Erfindung von über 10 $ zu einem verstärkten Wachsen des PP10.

Die Vorbehandlungen im lähmen der Erfindung sind z.B. eine Proteinfällung mit(a) Salzen wie Ammoniumsulfat oder durch (b) Wärmebehandlung:

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200 ■ . ·λ . ■■■·■■

a) In der Praxis wird man zur Vorbehandlung mit Ammoniumsulfat gemäss der Erfindung etwa 250 bis 300 mg Ammoniumsulfat/ml Kalbsganzserum hinzugeben, vorzugsweise etwa 278 mg/ml im Verlaufe von 1 bis etwa'5 Min. allmählich einrühren. Nach fortgesetztem Rühren v.on 2 bis 10, vorzugsweise etwa 5 Min. Dauer stellt man den pH-Wert unter Verwendung konzentrierter Mineralsäure, wie 5 bis 12 η Salzsäure, auf einen Wert im Bereich von 6,0 bis 8,0, vorzugsweise auf 6,8 ein.

Diese Suspension wird dann 1 bis 24» vorzugsweise etwa 4 Std. bei mittlerer Geschwindigkeit gemischt oder gerührt, um eine maximale Fällung durch das Ammoniumsulfat sicherzustellen, worauf man die Ausfällung abfiltriert und bzw. oder abschleudert. Das Schleudern erfolgt 5 bis 20 Min. bei etwa 8000 bis 12000 S in einer Vorrichtung in Art einer Zentrifuge der Bauart'Spinc ο, Modell L2-65, unter Einsatz eines Rotors Nr. 19 bei etwa 10 000 U/Min.

Man diälysiert nun dasüberstehende Gut 12 bis 48, vorzugsweise 24 Std. an laufendem Leitungswasser unter Verwendung einer herkömmlichen, auf Ammoniumsulfatpassage ausgelegten Cellulosehülle, und hierauf an phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit einem pHrWert von 6,5 bis 7,5, vorzugsweise etwa 6,8, und einer ionischen Stärke von etwa 0,15, bis unter etwa 10 jag/ml an (NH.)"¹" verblieben sind, was normalerweise etwa 16 bis 48 Std. erfordert.

Nach dieser Dialyse wird die Serumfraktion durch Filtrieren sterilisiert. Nach einer zweckentsprechenden Arbeitsweise setzt man zuerst ein Millipor-e-(g,^% -Vorfilter und darauf Millipore-(R)-Filter von 0,45 bis 0,22 η ein. Diese

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Serumfraktion wird, wie später beschrieben, in dem Kulturmedium eingesetzt. .

Beispiel 1,a

In 1075 ml Kälbsserum von 5° C (zuvor wärmebehandelt) wurden allmählich 299 g (278 mg/ml) Ammoniumsulfat eingerührt.

Nach 5 Min. Rühren wurde der pH-Wert mit 10 η HCl auf 6,8 eingestellt, die Suspension 4 Std. bei 5 C gerührt und dann in einem Rotor Nr. 19 bei 11 000 U/Min.⁺'geschleudert. Das überstehende Gut wurde jeweils dekantiert, zus'ammenge geben und das Gesamtgut in 4 Beuteln· (68,6 χ 2,5 cm, flach) 24 Std, an laufendem Leitungswasser und dann 16 Std. bei 5° G an phosphatgepufferter Salzlösung (aus 7 g NaGl, 1,7 g Na₂HPO,.' •12H₂0, 0,2 g NaH₂PO₄-H₂O pro 1 Wasser) dialysiert, hierauf der Inhalt der Dialysebeutel zusammengegeben, (Endvolumen etwa 1600 ml) und dieses Gesamtgut dann durch eine 142-mm-jZi-Vorfilter/0,45-ju-Millipore-(R)-Kombination filtriert und das Piltrat mit ungefähr 75 ml/Ampulle in Ampullen abgefüllt.

Die Auswirkung der Ammoniumsulfat-Vorbehandlung auf das Vermögen des Kalbsserums, das Wachsen von PP1Ö in einem Wachstumsmedium der in Beispiel 2 beschriebenen Art zu stützen, bestimmt durch Analyse auf DNA, wird von Tabelle I erläutert.

Tabelle -I

Auswirkung der Ammoniumsulfatvorbehandlung auf das Wachstumsstützungspotential von Kalbsserum

Medium DNA, :·Υ1ΟΟ ml, bei einer Serumkonzentra-

^von

5,0 Tu. 0~

Kalbsganzserum 123 103

Vorbehandeltes 83 180

Kalbs3erum ·

,+) 10 Min.

009βΙ?72045

12 200 *

b) Bei einer alternativen- Vorbehandlung gemäss der Erfindung zur Eliminierung des anaphylaktischen Faktors aus Kalbsganzserum erfolgt eine Erhitzung auf erhöhte Temperatur, Das Serum wird, wie oben beschrieben, in herkömmlicher Weise 20 bis 60 Min. bei etwa 56 bis 60° C erhitzt. Als Merkmal der Erfindung hat sich gezeigt, dass ein Erhitzen von 30 bis 60 Min., vorzugsweise etwa 60 Min., auf 65 bis 70° C eine starke Keduzierung des oder der vorliegenden, anaphylaktisehen Paktors/en ergibt. Zwar eliminiert diese Wärmebehandlung nicht den oder die gesamten toxischen Faktor(en), aber das Produkt ist, ähnlich dem bei der oben beschriebenen Aramoniumsulfatfällung erhaltenen, den weiteren Enttoxikationsstufen gemäss der Erfindung besser zugänglich.

Die Wirksamkeit der Wärmebehandlung gemäss der Erfindung zur Verminderung des oder der in Kalbsganzserum vorliegenden, anaphylaktischen Faktors/en zeigt klar die Tabelle II an einem Vergleich der Sensibilisierungskapazität von Kalbsganzserum, das der herkömmlichen Inaktivierungs-Wärmebehandlung bzw. der Wärmebehandlung gemäss der Erfindung unterworfen worden ist, bestimmt an den reziproken Serumverdünnungen, bei denen 50 % sensibilisierter Meerschweinchen eine tödliche Anaphylaxie erleiden.

Tabelle II

Sensibilisierungsmaterial: Belastung mit Kalbsganz-Kalbsganzserum serum

' 30 Min. ' 60 Min.

■■'■■"' ^:~ ⁵⁶° ^c - ⁶^° ^c

30 Min. bei 56° C erhitzt 1:1000 -1:325 60 Min. bei 65° C erhitzt 1:199 1:159

■ ■- 7-009887/20 4 5

Wie oben festgestellt, ergibt die Wärmebehandlung eine starke Reduzierung des oder der vorliegenden, anaphylaktischen F^ktors/en. Sie ergibt auch eine Eliminierung von Wachsturnsinhibitoreh aus dem Ganzserum, wie sie bei der Ammoniumsulfatvorbehandlung eintritt, was somit eine höhere P?1O~Wachstumsausbeute je Raumeinheit Kalbsserum und auch höhere Seruiskonzentrationen je Raumeinheit Wachstumsmedium erlaubt«

Die Tabelle III erläutert die Auswirkung von Temperatur und Erhitzungszeit auf das Vermögen des behandelten Kalbsserums, PP1O-Wachstum in einem Medium der später unter 2. beschriebenen Art zu stützen, bestimmt an Hand einer Analyse auf DNA.

Tabelle III

Auswirkung der Wärmevorbehandlung auf das Wa-chstumsstützungspotential von Kalbsserum für M. pneumoniae

Behandlung Temperatur, ⁰ C	Zeit Min.	DNA, //10O ml konzentration,	81	_b ·	·'.	10	bei einer Serum- fo_% von
56	30	5	116			71	20
60	30 ·	106		46	48
65	30	100		186	16
65	60	—		223	—
70	30		187
B e i s ρ i	el 1,		272

Eine Flasche Kalbsganzserum von -20° 0 wurde in ein auf 65° C gehaltenes Wasserbad getaucht und nach 1 Std. die mo-

- 8

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bile Phase des Serums, die etwa 75 % des Gesamtvolumens ausmacht, von einem gelatinösen, proteinartigen Rückstand dekantiert. Die mobile Phase stellt das vorbehandelte Serum dar, das in dem Nährmedium zur Propagierung des PP10 eingesetzt wird.

2. Züchtung von M". pneumoniae

In der zweiten Stufe des Verfahrens gemäss der Erfindung erfolgt die Züchtung des PP1O in einem ein vorbehandeltes Kalbsserum enthaltenden Medium. Diese vorbehandelten Kalbssera, werden in herkömmlicher Weise in einem an sich bekannten Nährmedium zur Züchtung des PP1O eingesetzt. Ein solches Nährmedium stellt das von R. M. Chanock u.a. in "Proe. Natl. Acad. Sei.", 48, 41 bis 49 (1962), besprochene dar. Anstelle des von Chanock benutzten Pferdeserums gibt man das vorbehandelte Kalbsserum gemäss der Erfindung in einer Volumenkonzentration von 5 bis 20 $ des Endvolumens des Basismediums hinzu. ■

Die Inkubation wird in herkömmlicher Weise durchgeführt, z.B. nach der in der vorstehenden Literaturstelle beschriebenen Arbeitsweise.

Man kann den PP1O auf Glas oder anderen Flächen, z.B. Glasflasehen nach Blake oder Brockway, oder in Glasperlen von 4 bis 5 mm Durchmesser enthaltenden Flaschen dieser Art züchten oder auch eine Massenkultivierung in einer Etagen-Mehrboden-Kulturapparatur durchführen. Der PP10-Organismus kann auch unterlagelos in einer herkömmlichen Submerskultur gezüchtet werden.

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Unabhängig von den mechanischen Gegebenheiten erfolgt nach einer der Ausführungsformen der Erfindung die pH-Einstellung des Fermentationsmediums. Wie in Tabelle IV gezeigt, wird der Wachstumsbetrag von kleinen pH-Wert-Änderungen deutlich beeinflusst. Wie sich gezeigt hat, wird ein maximales Wachstum bei einem Anfangs-pH-Wert von etwa 7,0 bis 8,0, vorzugsweise bei etwa 7,5 bis 8,0 erhalten.

Als Agens für die pH-Wert-Einstellung wird Alkalibicarbonat bevorzugt, wie Kalium- oder Natriumbicarbonat, aber auch andere Methoden zur pH-Wert-Lenkung sind anwendbar, wie ein verträgliches Puffersystem.

Tabelle IY

Auswirkung des pH-Wertes auf das Wachstum von M.pneumoniae im 5,0 io Kalbsganzserum enthaltenden Medium

Probenbezeichnung DNA, /*/i00 ml pH-Wert der Ernteauflageschicht

W-1,	kein	Bicarbonat	Bicar.bonat	>	Il	36,5	6,7,	6,75
W-2,	It	Il		Il	58,5	6,8,	7,0
W-3,	It	Il		ti	48,0	6,75,	6,8
W-4,	It	Il		Il	54,5	6,9,	6,9
W-5,	Il	It	51,5	7,0,	7,1
W-6,	170,0	7,5,	7,5
W-7,	161,5	7,15,	7,25
W-8,	150,0 ·	'7,2,	7,4
W-H₁	118,0	7,65,	7,7
W-12.	123*0	7,5,	7,55

Der pH-Wert hat neben dem in Tabelle IV gezeigten Effekt bezüglich des Wachstumspotentials des Serums auch eine ein-• deutige, demonstrierbare Auswirkung auf die Antigenwirksamkeit. Zur Sicherung einer maximalen Antigenwirksamkeit bei der Vaccindarstellung ist es wesentlich, den pH-Wert des Wachstumsmediums zur Zeit der Ernte auf 6,8 oder darüber, vorzugsweise im Bereich von 7,0 bis 7,2 zu halten.

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Tabelle

	t ro	•	Versuch	-	Auswirkung des pH-Wertes Wirksamkeit von M.	DNA, /7¹⁰⁽ (an Glas)	auf die Antigen- pneumoniae	Antigen-Extinktions- t'iter bei Meerschwein- "chen (CR₅₀)	^o O O
	I		1. Antigen- Untersuchung MA-IV	Inkuba tionszeit bei 36⁰C, Tage	36,0 44,5 42,0	) ml Ernte- pH ■	1:263 ■ . 1:83 1:32 ·. .
			2. Pl-gc Nr.17 Bicarbonatzusatz (7,5$ Gew./Vol.) 3,0 ml/100 ml	4 6 8	0 0 8,0 7,5	6,8 5,8 5,4	O 1:2 O
600		1 (Bicarbonat) (kein Bicarb.) 2 (Bicarbonat) (kein Bicarb.)	60,0 58,0	7,5 7,8 7,1 7,85	1:3 1:10
ce ' co		3 (Bicarbonat) (kein Bicarb.)	54,0 80,0	6,7. . 7,5	1:5" * 1:27 f¹
O		4 (Bicarbonat) (kein Bicarb»)	• 30,0 109,0	5,9 7,1	O 1:40
		5 (Bicarbonat) (kein Bicarb.) .	130,0	5,5 6,85	• 1:25
	6 (Bicarbonat) (kein Bicarb.)	145,0	6~7	1:13
	7 (Bicarbonat) (kein.Bicarb.)	'5,9

Nachfolgend sei eine typische Permentationsmethode unter Verwendung, des Produktes von Beispiel 1,a oder 1,b beschrieben. ·

Beispiel 2

Es wurde ein Kulturmedium folgender Zusammensetzung hergestellt:

ml

Difco-PPiO-Brühe 70,0

Hefeextrakt, 25gew./vol.$ wässrig 10,0 '

Kalbsserum von Beispiel 1 "20,0· ■ NaHCO₅, 7,5 gew./vol.$> wässrig 4,0 Glucose, 50,0 gew./vol.$ wässrig 2,0

Dieses Medium wurde keimfrei so in 0,9-1-Plaschen mit flachen Seiten (wie nach Brockway oder Blake) abgefüllt, dass jede Flasche 100 ml enthielt. Der hier eingesetzte PP10 war ursprünglich von einem an atypischer- Pneumonie (Stamm 14,82, Pr. 4) Erkrankten gewonnen worden, wobei eine Folgepassage die Bezeichnung MAS-27 trug; vor der Züchtung in dem obigen Medium erfolgten 5 Passagen. Jede Flasche wurde mit 10 ml des Organismus (P5) beimpft und die Inkubation bei horizontaler, stationärer Anordnung der Flaschen bei 36 bis 3.7° 0 durchgeführt. ■

Nach zweitägiger Inkubation zeigte die mikroskopische Beobachtung dieser 6-Passagen-Kultur (P6) eine massige Zahl von an der Glasoberfläche des Züchtungsgefässes sitzenden PPIO-Kolonien (von geringer und von mittlerer Grosse). Die infizierten Fluid· von Passage 6 wurden In frisohes Medium (P7)

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der obigen Zusammensetzung geleitet. Die Passage 8 erfolgte mit Passage-T-Pluiden nach 3tägiger Inkubation. Eine mikroskopische Untersuchung von Passage 7 zeigte eine Schicht an der Glasoberfläche sitzender, zusammengewachsener PPIO-Kolonien (von geringer bis erheblicher Grosse). Nach viertägiger Inkubation bei 36 bis 37° O in horizontaler, stationärer Lage wurden die Flaschen der 8. Paaaage abgeerntet.

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Tab e lie

VI

Züchtung von Ii. pneumoniae in den genannten
Medium nach Inkubation bei 36° C

	Ver	ι	GB-2	Medium	Inkubations
	such	_»			zeit bei 36⁰G
		^ GB-IB'			Tage
	GB-1A	ι		.5 ■# Kalbs	7 .
	ganzserum
O
	5 i» Kalbs	7
iß OO	ganz serum
OO •ο	20 <fo KaIb-	4
	Ammonium-
	aulfat-
O	fralction

33NA, /7i00 ml Brühe .+
Glas

■3Ο8
305
438

Brühe

100

200

Glas

162

205

143

Erntewaschgut

18

22

3. Waschen des

Zur Ernte des· PPiO-Gutes dekantiert man das darüberstehende Medium und' wäscht das am Glas haftende Wachstumsgut mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung, die Thimerosal und Formaldehyd enthält. Mit Ausnahme einer kleinen Menge an Restfluid bei der zweiten Waschung, in dem die Kultur suspendiert ist, werden das darüberstehende Medium und die Waschflüssigkeit verworfen. Im allgemeinen erfolgen zwei weitere Waschbehandlungen der PPIO-Suspension in der Ultrazentrifuge bei 15000 bis 30000 α und bei 0 bis 10° C.

Beispiel 3

Das überstehende Medium in jeder der 27 Flaschen (0,9-1-Flaschen nach Brockways) wurde abgegossen und verworfen. Die an der Glasoberfläche sitzenden Organismen wurden zweimal (100,0 ml je Flasche je Waschbehandlung) mit der phosphatgepufferten Kochsalzlösung nach Beispiel 1,a gewaschen, die zusätzlich Formaldehyd und Thimerosal in ungefähren Endkonzentrationen von 90 bis 100 bzw* 50 bis 60 ^ml enthielt. In jeder der 27 Flaschen wurden 3 bis 4 ml des zweiten Waschfluides belassen, und die am Glas sitzenden Organismen wurden von der Oberfläche unter Anwendung keimfreier Techniken mit keimfreien, an Glasstäbe angesetzten Gummifahnen abgekratzt. Das verbleibende Fluid wurde aus jeder Flasche mit einer keimfreien^ serologischen Pipette entnommen und vereinigt. .

Das vereinigte Produkt .wurde in einer Ultrazentrifuge (Bauart Spinco, Modell L, Rotor Hr« 21) zweimal 1 Std. bei 4° C

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12 200 .

und 15 000 U/Min, gewaschen. Nach der letzten Waschbehandlung wurde das Fluidvolumen unter Verwendung der formaldehyd- und thimerosalhaltigen, phosphatgepufferten Kochsalzlösung auf 45 ml (1/60 des ursprünglichen Erntevolumens) eingestellt. ' ■

Die Vor- und Nach-Zentrifuge-Konzentrate wurden auf sedimentierbare DNA und nichtdialysierbares Gesaratprotein bestimmt:

DNA, /ftnl, Protein, <f7ml

Vorkonzentrat (20 x) 51»8 nicht verfügbar Nachkonzentrat (60"x) 148,0 2304,0

Die Ergebnisse der DNA- und Protein-Bestimmungen geben einen Hinweis auf den Gesamtgehalt an an der Oberfläche sitzendem PP10-Organismus.

Das obige Nachkonzentrat ist direkt als Vaccine verwendbar. Man kann hierzu 0,5 oder 1,0 ml intramuskulär injizierten bzw. dieses Konzentrat in Einzeldosis- oder Mehrfachdosis-Behälter abfüllen und verschliessen.

Zum Nachweis des völligen oder wesentlichen Preiseins einer Vaccine, die aus in einem die Kalbsserumfraktionen gemäss der Erfindung enthaltenden Medium gezüchteten PP10 hergestellt worden ist, von dem oder den Kalbsserum-Sensibilisierungsfaktor(en) aind Anaphylaxieversuche bei Meerschweinchen beider Geschlechter von 375 bis 450 g Gewicht durchgeführt worden. Die Tiere wurden hierzu durch subcutane Injektion der Vaccine aensibilisiert. Zwischen den insgesamt 3 Sensibilisierungs-Injektionen lag jeweils ein Zwischenraum von 4 bis 6 Tagen.

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30 bis 35 Tage nach der letzten Sensibilisierungsinjektion erhielten die Tiere eine vorbestimmte Belastungsinjektion mit Kalbsganzserum oder Pferdeserum unter intracardialer Verabreichung, worauf die Tiere auf die üblichen anaphylaktischen Schocksymptome, Reiben der Nase, Niesen (1 ), Husten/Schweratmen und Unvermögen zum Geradeauslauf (2⁺),. Paralyse irgendeines Gliedes oder aller Glieder (3⁺) und Tod (4⁺), beobachtet wurden., Der Versuch umfasste zu Kontrollzwecken auch Meerschweinehen,, denen bekannte Sensibilisierungsmittel injiziert worden waren, wie auch Tiere ohne Injektion. Die Ergebnisse dieser Versuche nennt die Tabelle VII. .

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T a b e 1 1 e

VII

ο ο co co

VD I

Sensibilisierungsmaterial

A)

PPIO-Züehtung in fraktioniertes Kalbsserum enthaltendem Medium; (NH_d)₂S0₄-ge-

fäiit?

Anaphylaxie-SchockreaktiOn von mit den genannten Eaton-PPTO-Vaccinen sensibilisierten Meerschweinchen

Belastung3- Anaphylakbischer Schock Reaktionen material tödlich ■ nie it, tödlich

ZähTT

Zahl⁺)

DNA pH-Wert

,-; ^bei

/7ml Ernte

0/11	0	0/11	0	11/11	100	37,5	6,8
0/10	0 ,	2/10	20	8/10	80	35,8	7,35
0/12	0	1/1.2	8	11/12	92	34,0	7,0
0/12		0/12	0	12/12	100	35,7	5,6
0/12	0	0/12	0	12/12	100	35,6	6,1

1. Probe.-SV-1/6· Kalbs-

2. Probe SV-17 . fS55S

3. Probe 171-1

4. Probe 171-2

5. Probe 171-3

B)

PPIO-Ziichtung · Pferdein Pferdeganz- ganz- ■ serum enthalten- serum dem Medium

+) Zahl der ansprechenden Tiere/Zahl der .belasteten Tiere

6/6 100

5,0

.ro ο O

Tabelle VII (Forts.)

PO

Sensibilisierungsmaterial

C)

Kontrolle

1. Kalbsganzserum

2. Pferdeganz -

serum

3. ohne Injektion

Belastung?- Anaphylaktischer Schock Reaktionen DUA

material tödlich ^icht'tQdlicn

Zahl-f) jo Zahl^) % Zahl ) %

Kalbsganzserum

Pferdeganz-

serum

Kalbsganzserum 5/6 83 1/6 17 0/6 0

6/6 100 0/6 0/12 0 0/12 0/6.0
12/12 100

pH-Viert

bei
Ernte '

to ο ο

+) Zahl der ansprechenden Tiere/Zahl der belasteten Tiere

Die Tabelle IV zeigt, dass bei Verwendung einer durch Züchten des PP10 in der Kalbsaerumfraktion gemäsa der Erfindung hergestellten Vaccine sich kein Exitus einstellte. Gelegentlich trat eine nichttödliche Reaktion auf, die aber nur dem unbedeutenden Typ 1⁺ oder 2⁺ angehörte. .

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur .Herstellung einer nichtanaphylaktischen. · PPIO-Vaccine, dadurch gekennzeichnet, dass man

(a) von Kalbsganzserum anaphylaktische und wachstumsin» hibierende Paktoren abfraktioniert,

(b) den PP10 in einem das fraktionierte Kalbsserum enthaltenden Züchtungsmedium bei gelenktem pH-Wert propagiert,

(c) den PP1O wäscht, sammelt und konzentriert.

2. Verfahren nach Anspruch 1., dadurch gekennzeichnet, daoi man als PPIO Mycoplasma pneumoniae einsetzt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man in Stufe (b) in einem Uährmedium mit einem Gehalt an dem fraktionierten Kalbsserum von 5 bis 20 $ arbeitet.

4. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 öl;·, . dadurch gekennzeichnet, dass man in Stufe (b) bei ei.-::.. pH-Wert von 6,0 bis 8,0, insbesondere 7*0 bis 8,0 arl.iitet.

5. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis '. dadurch gekennzeichnet, dass man in Stufe (a) das Kalbsganzserum mit 250 bis 300 mg Ammoniumsulfat/ml Kalbsg^-izserum behandelt,, das Präzipitat von dem überstehenden Gut abtrennt und das letztere als Serumfraktion in Stufe (b) einsetzt.

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Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 oio 4 dadurch gekennzeichnet, dass man in Stufe (a) das KaIxsganzserum 30 bis 60 Min. auf 65 bis 70° C erhitzt, die mobile Phase dekantiert und diese in Stufe (b) als Ser-.r.-fraktion einsetzt.

Fraktioniertes Kalbsserum zum Einsatz beim Züchten vor PP10, erhalten durch Behandeln von Kalbsganzserum mi; 250 bis 3OO rag Ammoniumsulfat/ml Kalbsganzserum bei pH-Wert 6 bis 8, Abtrennen des Präzipitates und Dialyse des überstehenden Gutes.

8. Fraktioniertes Kalbsserum zum Einsatz beim Züchten vor. ?P10, erhalten durch 30 bis 60 Min. Erhitzen von Kai..2-ganzserum bei 65 bis 70° C und Abtrennen der anfaller.c ei einzusetzenden mobilen Phase von einer gelatinösen Ph.? ^

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