DE4335366A1

DE4335366A1 - Verfahren zur Herstellung eines kristallinen Typ A Botulinum Toxins als therapeutische Arznei

Info

Publication number: DE4335366A1
Application number: DE4335366A
Authority: DE
Inventors: Genji Sakaguchi; Tomoko Shimizu
Original assignee: Chiba Prefectural Government
Current assignee: Chiba Prefectural Government
Priority date: 1992-10-28
Filing date: 1993-10-16
Publication date: 1994-05-05
Also published as: FR2697163A1; DK112793A; JPH06192296A; DK112793D0; SE9303323D0; GB2272697A; FR2697163B1; SE9303323L; GB9321794D0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Er zeugung eines kristallinen Typ A Botulinum Toxins als therapeutische Arznei und sie betrifft im besonderen ein Verfahren zur Erzeugung eines kristallinen Typ A Botuli num Toxins von einer natürlichen Substanz wie z. B. Chi toxan (Handelsname von Produkten, die von Dainippon Sei yaku Co. erzeugt werden) durch Einsatz eines Nukleinsäu re-Entferners.

Botulinum Toxin als typisches Beispiel eines von Bakte rien abgesonderten Nervengiftes ist ein Proteotoxin, das von Clostridium Botulinum erzeugt wird. Botulinum Toxin wird in acht Serumgruppen wie A, B, C1, C2, D, E, F und G in Abhängigkeit ihrer Antigenität klassifiziert. Unter ihnen war das Typ A Toxin das erste, welches purifiziert und kristallisiert wurde (Lamnna, C.O.E. NcElroy und H.W. Eklund: Science, 103: 613-614, 1946).

Bisher erfordert der Herstellungsprozeß für kristallines Typ A Botulinum Toxin komplizierte Verfahren, die in der Reihenfolge durchgeführt werden: Säurefällung (1), Was serwaschen, Extraktion mit Calcium Chlorid und Säure fällung (2), Extraktion mit Phosphatpuffer, Fällung mit Ethanol und Extraktion und Absetzung in einer Ammonium- Sulfat-Lösung. Da die Herstellung kompliziert ist, er fordert sie zusätzlich geschickte Ingenieure, die Erfah rung in Beobachtung haben, und gibt nur niedrige Toxin gewinnungsraten, und die erforderliche Menge und die Wir kung dieses Verfahrens bleibt hinter den Erwartungen zu rück. Obwohl zusätzlich ein Verfahren angewendet wurde, das z. B. die Kombination einer Protaminbehandlung, Ionen austausch-Chromatography und Gelfiltration aufweist, ist die Kristallisationswirkung nicht vorteilhaft.

Eines der Probleme bei der Kristallisation des Typ A Botulinum Toxins liegt darin, möglichst viel eines leicht kristallisierbaren Macromoleküls zu erhalten, und das andere Problem liegt darin, Substanzen zu vermeiden, die die Kristallisierung verhindern, und die hauptsäch lich Nukleinsäure enthalten, die in einer Kulturenlösung enthalten sind, ohne das Toxin zu denaturieren. Das erste Problem kann dadurch gelöst werden, daß man einen Stamm auswählt, der Botulinum Typ A Toxin abgibt mit einem Molekulargewicht von 500000 bis 900000, und die Lösung des zweiten Problems hängt davon ab, wie die Nukleinsäure unter milden Bedingungen entfernt werden kann.

Die vorliegende Erfindung wurde angesichts der vorste hend geschilderten Nachteile des Standes der Technik aus geführt und ihre Aufgabe ist, ein Verfahren zur Herstel lung eines kristallinen Typ A Botulinum Toxins, welches die Stabilität und die Wirksamkeit als therapeutische Medizin verbessert, wie für Schielen und Blepharospas mus, durch Erhalten eines reinen Toxins zu schaffen.

Die vorliegende Erfindung wurde ausgeführt auf Grundlage einer Verbesserung des oben beschriebenen Standes der Technik und eine Aufgabe liegt darin, die Stabilität und die Wirksamkeit als therapeutische Medizin wie für Schie len und Blepharospasmus zu verbessern.

Um die oben genannte Aufgabe zu lösen, wird erfindungs gemäß das Typ A Botulinum Toxin ohne Verlust von Toxizi tät kristallisiert durch Einsatz eines Nukleinsäure-Ent ferners, der eine natürliche Substanz wie Chitoxan ent hält.

Zuerst werden von Stämmen, die Botulinum Typ A Toxin ab geben, Stämme selektiert, die L Toxin eines Molekular gewichtes von 500000 und LL Toxin eines Molekularge wichtes von 900000 mit einem hohen Hämoagglutinations- Titer und hoher Toxizität abgeben. Die Stämme werden in einem geeigneten Kulturenmedium kultiviert, z. B. einem NZ-Amin Kulturen Medium, eine Säure wird zu einem Kul turenfiltrat hinzugefügt, um eine Fällung zu bewirken, und eine Phosphat-Pufferlösung, in der die molare Konzen tration geändert ist, wird anstelle von Calciumchlorid eingesetzt, um die toxischen Bestandteile wirksam von der Fällung zu extraieren. Weiter wird der flüssige Extrakt wiederholt einer pH-Kontrolle unterworfen, einem über Nacht Stehenlassen, einer Zentrifugierung, einer Lösung in einer Acetat Pufferlösung, einer pH-Modifizie rung und Zentrifugierung, um eine klare Überschicht zu erhalten. Ein Nukleinsäure-Entferner wird der Über schicht unter einer sehr wirksamen Bedingung hin zuge fügt.

Bisher wurden gewöhnlich Calcium und Alkohol eingesetzt, um die Nukleinsäure zu entfernen. Jedoch kann kein bemer kenswertes Ergebnis erhalten werden, selbst wenn die Be dingungen wie Konzentration und pH-Wert des Nuklein säure-Entferners geändert werden. Weiter ist Protamin be kannt als Nukleinsäure-Entferner, jedoch verursacht es Ausfällung nicht nur der Nukleinsäure sondern auch not wendiger Proteine, obwohl es als Entferner ausgezeichnet funktioniert. Zusätzlich erzeugt es ein Problem unter schiedlicher Homogenität zwischen den Partien, welches ein fötaler Nachteil natürlicher Produkte ist. Außerdem muß ein Verfahren hinzugefügt werden, um überschüssiges Promatin von dem sich ergebenden Niederschlag zu entfer nen. Auf der anderen Seite ist das Chitoxan (Handelsname von Produkten, die von Dainippon Seiyaku Co. erzeugt wer den) eine Substanz mit natürlichem hohen Molekularge wicht, eine natürliche Substanz, die dadurch erzeugt wird, daß Chitin (Poly-N-Acyl-β-D-Glucosamin), das in den äußeren Schalen z. B. von Krabben und Garnelen enthal ten ist, deacetyliert wird, und C 7 und C 9, das durch Reduzieren des Molekulargewichtes davon erzeugt wird, kann wirksam Nukleinsäure entfernen, ohne daß ein Ver lust des Toxins auftritt. Wenn Aussalzen mit Ammonium- Sulfat nach dem Entfernen von Nukleinsaure mit Chitoxan ausgeführt wird, fällt das überschüssige Chitoxan nicht aus, und nach Lösen des ausgesalzenen Toxins in einer Phosphat-Fufferlösung wurde schrittweise Ammonium-Sulfat hinzugefügt und stehen gelassen, um das Toxin leicht zu kristallisieren.

In dem Herstellungsverfahren nach der Methode von Duff war die Ausbeute von kristallinen Typ A Botulinum Toxin nur 1,4-3,1, wobei die Kulturenlösung als 100 angenom men wurde. Wenn sie auch um etwa 5% durch Verbesserung des Extraktionsverfahrens angehoben werden konnte, konn te die Ausbeute der toxischen Aktivität auf 10% mit dem Verfahren nach der vorliegenden Erfindung erhöht werden, bei der der Nukleinsäure-Entferner Chitoxan ist.

Erfindungsgemäß kann angesichts des oben stehenden die Nukleinsäure wirksam nach der Erzeugung des kristallien Typ A Botulinum Toxins entfernt werden, die Ausbeute der toxischen Aktivität kann verbessert werden und im Ergeb nis kann eine merkbare Wirkung als therapeutische Arznei für Schielen und Blepharospasmus erreicht werden.

Andere Eigenschaften und Vorteile der vorliegenden Erfin dung gehen aus der folgenden Erklärung hervor.

Beispiel

Die Beschreibung wird nun in Einzelheiten mit Hinweis auf die folgenden Beispiele ausgeführt.

Kultivierung

Clostridium Botulinum, Stamm Hall, NZ-Aminkulturenme dium, Stehenlassen der Kultur bei 35°C über 4 Tage.

Säurefällung 1

Schwefelige Säure hinzugefügt: pH auf 3,5 adjustiert mit 3N H₂SO₄, stehenlassen über Nacht bei 4°C.

Überschicht entfernt (Siphon) Zentrifugierung

Fällung: Aufgelöst in destilliertem Wasser, pH adju stiert auf 5,0 mit 0,1 N NaCl.

Zentrifugierung Extraktion

Fällung: 0,2 M Phosphat-Pufferlösung (pH 6,0) hinzu gefügt.

Zentrifugierung Überschicht

Fällung: 0,5 M NaCl enthaltend 0,1 M Tris-HCl Pufferlösung (pH 7,5) hinzugefügt.

Zentrifugierung Säurefällung 2

HCl hinzugefügt: pH adjustiert auf 3,7 mit 2 N HCl, über Nacht stehenlassen bei 4°C.

Überschicht entfernt (Siphon) Zentrifugierung

Fällung: Gelöst in 0,05 M Acetat-Pufferlösung (pH 5.0).

Zentrifugierung C-9 Behandlung

Überschicht: 5% C-9 Lösung zu 0,1% während 1 Min. hinzugefügt, über 10 Min. lang in einer Eiskiste gerührt.

Zentrifugierung Überschicht

Ammonium-Sulfat hinzugefügt: Festes Ammonium-Sulfat hinzugefügt, um eine 50%ige gesättigte Lösung herzu stellen. Stehenlassen über Nacht bei 4°C.

Zentrifugierung

Fällung: Fällung aufgelöst in 0,03 M Phosphat-Pufferlösung bei einem pH-Wert von 6,8.

Dialyse: Dialysiert mit 0,03 M Phosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 6,8.

Kristallisation

Ammonium-Sulfat hinzugefügt Ammonium-Sulfat zuge fügt, bis die Lösung eine fischsilbrige Farbe auf weist, achtgeben, daß die Endkonzentration nicht ei ne 0,9 M Konzentration überschreitet.

Kristallabsetzung: Bei 4°C belassen

Zubereitung der 5%igen C-9 Lösung

Destilliertes Wasser wird dem C-9 (Kurimover, herge stellt von Dainippon Seiyaku, Partie-Nr.: K143) im Ver hältnis von 10 : 1 zugefügt. Weiter wird 1 N HCl in ei nem Verhältnis von 2 zugeführt und mit einem Rührer über zwei Stunden gerührt. pH wird ausjustiert mit 1 N Natrium hydroxid auf 4-6. Die Lösung wird mit destilliertem Wasser zu einer 5%igen Lösung verdünnt.

Es ist offenkundig, daß mit dieser Erfindung ein weiter Bereich von verschiedenen Arbeitsmethoden umfaßt wird, ohne vom Geist und dem Bereich der Erfindung abzuwei chen. Diese Erfindung ist nicht durch die besonderen Ar beitsweisen eingeschränkt, außer daß sie durch die anhän genden Ansprüche eingeschränkt ist.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines kristallien Typ A Botulinum Toxins als therapeutische Arznei, dadurch gekennzeichnet, daß das Botulinum Typ A Toxin ohne Verlust von Toxi dität durch Benutzen eines Nukleinsäure-Entferners kristallisiert wird.

2. Verfahren zur Herstellung eines kristallinen Typ A Botulinum Toxins als therapeutische Arznei nach An spruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Nuklein säure-Entferner eine natürliche Substanz wie Chi troxan (Handelsbezeichnung von Produkten, die von der Dainippon Seiyaku Co. hergestellt werden) enthält.

3. Verfahren zur Herstellung eines kristallien Typ A Botulinum Toxins als eine therapeutische Arznei, ge kennzeichnet durch die Schritte:
Kultivieren eines Bakterienstammes, der Botulinum Typ A Toxin abgibt,
Fällen eines Kulturenfiltrats mit einer Säure,
Extrahieren der Fällung mit einer Phosphat-Pufferlö sung,
Einstellen des pH-Wertes des flüssigen Extraktes, Stehenlassen der eingestellten Lösung über Nacht,
Trennen der eingestellten Lösung durch Zentrifugie ren,
Auflösen der getrennten Fällung mit einer Acetat- Pufferlösung,
Modifizieren der pH-Wertes der aufgelösten Lösung, Trennen der modifizierten Lösung durch Zentrifugieren und Hinzufügen eines Nukleinsäure-Entferners zu der Überschicht.

4. Verfahren zur Herstellung eines kristallinen Typ A Botulinum Toxins als eine therapeutische Arznei nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Nuklein säure-Entferner eine natürliche Substanz wie Chitoxan enthält.