PT85573B

PT85573B - Processo de preparacao de compostos a partir de tecidos de tubarao e de composicoes que os contem

Info

Publication number: PT85573B
Application number: PT85573A
Authority: PT
Inventors: Takuo Kosuge; Kuniro Tsuji; Hitoshi Ishida
Original assignee: Broadbent James Meredyth; Yoshiki Kosuge
Priority date: 1986-08-21
Filing date: 1987-08-21
Publication date: 1990-05-31
Also published as: EP0329656A1; US5632997A; GR871312B; JP2647882B2; ES2007401A6; HK149394A; EP0329656A4; DK218388D0; CA1296322C; US5026883A; DE3787971D1; EP0329656B1; US5470574A; WO1988001274A1; DK218388A; PT85573A; NZ221527A; ZA876171B; DK168742B1; JPH02503554A

Description

Numa primeira perspectiva do invento, proporciona-se um composto de fórmula geral I, na forma substancialmente pu.

ra,

onde A é um catião tal como um ião sódio, potássio, cálcio ou amónio ou uma amina orgânica.

Noutras perspectivas, o invento proporciona um proces. so de preparação de um composto de fórmula geral I na forma substancialmente pura, assim como de composições para fins farmacêuticos, dietéticos ou cosméticos, contendo esse compos. to.

Usando ensaios de actividade que são descritos em deta lhe adiante, mostrou-se que o princípio activo ê solúvel em água e não existe no componente solúvel em óleo do fígado de tubarão. Estes ensaios foram usados numa série de testes pa. ra averiguar se o princípio activo existe apenas no fígado. Foram investigadas todas as partes do corpo do tubarão, tais como ossos, carne, vesícula biliar, ovários, tubo digestivo, etc. e verificou-se que nos ensaios a vesícula biliar exibia as mesmas actividades. Este resultado indica que o princípio activo existe apenas no fígado e na vesícula biliar.

Em termos gerais, os dois bioensaios referidos e usados para identificar as fontes do princípio activo e para de. terminar o grau de pureza do extracto destinavam-se a identi ficar as actividades farmacológicas características da subs-

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-4tância. Em particular, os bioensaios, designados por (A) e (B), são baseados nas seguintes actividades:

(A) o princípio activo evita problemas de fígado em ratos, causados por tetracloreto de carbono, (Β) o princípio activo aumenta a velocidade de respi. ração em ratos quando é administrada uma substâri cia tóxica tal como a nicotina.

presente invento também proporciona um processo para preparar um princípio activo como descrito anteriormente, que compreende os passos de preparar um extracto aquoso do fígado e/ou da vesícula biliar de um tubarão e isolar o princípio ac tivo do extracto aquoso.

A descrição que se segue estabelece os procedimentos gerais para o isolamento do princípio activo a partir do extracto aquoso do fígado e/ou da vesícula biliar de um tubarão, envolvendo os passos de extracção com solventes orgânicos poi lares, adsorção em adsorventes adequados e/ou técnicas de cro matografia.

Para determinar se o princípio activo é solúvel em sol. ventes orgânicos polares, tais como metanol, etanol, acetona, etc., o pó obtido por congelamento-secagem da bílis do tubarão foi extractado com solvente orgânico polar e em seguida aplica, ram-se os ensaios (A) e (B) tanto à parte solúvel como à parte insolúvel. Observou-se actividade apenas nos ensaios à porção solúvel, estabelecendo-se assim que o princípio activo é solú vel em solventes orgânicos polares.

Quando se ensaiou para determinar se o princípio acti. vo pode ser isolado utilizando adsorventes, examinaram-se vá rios adsorventes e verificou-se que o princípio activo pode ser adsorvido por resinas de fórmula iónica do tipo de permu. ta aniónica básica ou por adsorventes sintéticos tais como XAD, HP-20, Sep-pak cl8, etc», ou por carvão. Este teste de adsorção foi realizado extractando o fígado e/ou a vesícula biliar de tubarão com água. Cada adsorvente sob teste foi adicionado ao extracto e deixado repousar durante a noite.

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-5Filtrou-se então a mistura e cada filtrado foi testado relatiuamente à actividade, com os ensaios (A) e (B). Os resultados indicaram que a substância activa é adsorvida pelos adsorventes mencionados acima. 0 princípio activo pode ser recuperado das resinas adsorventes por extracção com ácido, base ou sais e dos adsorventes sintéticos e do carvão por ex tracção com solventes orgânicos polares.

Consegue-se uma maior purificação do princípio activo por cromatografia, por exemplo numa coluna de sílica, numa coluna/^ephadex LH-20 ou por TLC preparativa (cromatografia em camada fina) ou por HPLC (cromatografia líquida de elevada eficiência), etc.. Todos os métodos deram resultados satisfatórios mas com HPLC conseguiu-se a maior purificação, 0 princípio activo isolado por HPLC era praticamente puro porque dava um só pico muito aguçado e também uma só mancha com valor Rp representativo aproximado de 0,36 em TLC. 0 princí pio activo na sua forma purificada é um pó branco de ponto de fusão de 1402C.

teste ao princípio activo purificado com ácido sulfúrico-vanilina deu uma cor púrpura indicando que contém na sua estrutura ácido de bílis ou álcool de bílis. Tinha-se já verificado que a bílis de tubarão contém um álcool de bílis designado por cimenol. Após acetilação parcial do princípio activo com anidrido acético, seguida por tratamento do prodii to bruto com ácido dioxano-tricloroacético durante vários d_i as, identificou-se o cimenol a partir da mistura reaccional. 0 resultado indicou que o princípio activo é um derivado de cimenol. Foi o primeiro isolamento do derivado puro de cime nol contido na bílis de tubarão, como princípio activo.

Um procedimento preferível para o isolamento do princípio activo da bílis liofilizada de Rhizoprinodon acutus (obtida por homogeneização e secagem-congelamento de vesículas biliares) é apresentada na tabela seguinte:

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Order n2. 3290-0MS

-6Bílis liofilizada de Rhizoprionodon acutus extractada com 1. n-Hexano (100mlx3)

2. MeOH (lOOmlx?)

Fracção I (extracto de MeOH)

1. dissolvido em H₉0

2. Amberlite XAD-2 cm , eluindo com

i. H₂0 (400ml) ii. MeOH (400ml)

Fracção II (eluido de MeOH)

1. dissolvido em CHCl-?-MeOH(l: 1)

2. Sephadex LH-20 cm eluido com

i. CHC1 -Me0H(l:l) (300ml) ii. MeOH (500ml)

Fracção III

HPLC: YMC-Pack A-324 (ODS)

Pó incolor (composto I)

Como se disse acima, neste procedimento o material lio filizado é desengordurado com n-hexano e em seguida extracta do com metanol. 0 concentrado assim obtido é aplicado a uma coluna Amberlite XAD-2 em lotes, usando H₂0 e etanol como elu entes. Como o eluido de etanol contém o principio activo (co mo se determinou com reagente corante) esta fracção é submeti, da sucessivamente a filtração por gel em Sephadex LH-20 com clorofórmio-metanol e metanol. 0 princípio activo está tão eficazmente contido no eluido de metanol que a sua purificação final é conseguida por aplicação sucessiva de HPLC com uma coluna de fase inversa.

Foi sugerido que o cimenol pode estar na forma de éster sulfato, mas não foi publicada nenhuma informação acerca da posição da ligação do éster sulfato, uma vez que o cimenol tem seis grupos hidróxilo onde o grupo éster sulfato pode estar ligado. 0 presente derivado de cimenol nunca foi isolado como substância pura. 0 pó activo purificado por HPLC foi submetido a análises elementares. Os resultados foram, anal: calc. para ^c27^H510_gNS, C 57,34, H 9,02, N 2,47, S 5,66.

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Order nS. 3290-0MS

Encontrado C 57,23, H 8,92, N 2,45, S 5,30. Estes resultados sugerem que o composto activo tem na estrutura éster sulfato de amónio. A espectroscopia de ressonância magnética nuclear do pó activo mostrou as seguintes propriedades:

(em d^-MeOH) ê (ppm):

4,22	(dd,	IH, 0=4,5	e 10,0Hz),
4,11	(dd,	IH, 0=10,0	1 e 16,7Hz),
4,00	(bs,	IH), 3,80	(d, IH, 0=1	,2Hz)
3,60-	-3,80	(m, 4H), 3	30-3,45 (m	, IH)	, 0,72 (s,	3H).
¹³C-I	3MN (	em d^-MeOH)	6 (ppm):	74,1	(d),	72,9	(d),
71,3	(d),	69,1 (d),	66,7 (t),	61,2	(t),	48,4	(d),
47,8	(d),	47,5 (s),	43,1 (d),	43,0	(d),	41,0	(d),
40,4	(t),	37,0 (d),	36,5 (t),	35,9	(s),	35,8	(t),
33,3	(t),	32,1 (t),	31,2 (t),	29,6	(t),	28,8	(t),
27,9	(d),	24,3 (t),	23,2 (q),	18,1	(q),	13,1	(q) ·
	0 ι	espectro do	¹⁵C-RMN mo;	atra í	que o	composto activo tem

átomos de carbono constituídos por três carbonos de metilo, 11 de metileno, 11 de metino e dois terciários. Os sinais em campo baixo (0,72-2,35) no espectro ^H-RMN sugerem que se tra ta dum derivado coprostano. Em campo alto no espectro ^C-RMN os sinais a 74,1 (d), 72,9 (d), 71,3 (d) e 69,1 (d) são atribuíveis ao carbono de metino com grupo hidróxilo. E os dois sinais a 66,7 (t) e 61,2 (t) são atribuíveis ao carbono de me tileno substituído com 0. 0 espectro 2D0C0SY0RMN e a relação

C-H-desvio-COSY indicam que estes dois carbonos se ligam a um carbono de metino e que um deles com desvio químico baixo (66,7) tem dois protões não equivalentes a 4,22 (dd) e 4,14 (dd) ppm no espectro ^H-RMN, o que indica que o composto acti vo tem o grupo parcial de ΗΟΕ^-ΕΗ-Ο^ΟΡ na molécula. Dos re sultados das análises elementares R é -SO^NH^.

Destes espectros RMN e análises elementares, o pó é ca racterizado como sendo éster sulfato de 3 °(, 7^, 12 oÇ, 24, 26-penta-hidroxicoprostano-27-amónio. 0 ião amónio na estrutura resulta provavelmente do tampão de fosfato de amónio usa do como fase móvel em HPLC, por substituição do ião sódio. P.a

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Order n2. 3290-3MS

-8ra verificar isto, submeteu-se um pó activo purificado por XAD-2 e em seguida por cromatografia em coluna em Sephadex

L.H-20 a espectrofotometria de absorção para o sódio e a análise elementar para o azoto. Os resultados foram, calc. para C2yH^^0gSNa, Na 4,03, N 0,00, encontrado Na 3,57, N 0,02. A estereoquímica da posição 24-C na estrutura foi determinada como 24R por análise cristalográfica de raios X de cimenol e a rotação específica do sulfato cimenol de sódio é positiva. Assim, concluíu-se que o princípio activo isolado de tubarão ê éster sulfato de 24R-( + )-3 <X ,7 o( ,12 , 24,26-penta-hidroxi.

coprostano-27-sódio.

ião sódio ou amónio no éster sulfato é facilmente substituído por outros iões metálicos, tais como potássio, cálcio, etc. ou por catiães de amina orgânicos tais como ami noácidos, etc., por intermédio de procedimentos bem conhecidos.

Os quadros que se seguem ilustram a actividade dos extractos aquosos do invento:

QUADRO I

	Dosagem	Bioensaio(A) (unidades)	Bioensaio(B) (segundos)
Parte do fígado de tubarão
solúvel em óleo	500 mg	13.800	21
Parte do fígado de tubarão
solúvel em água	50 mg	9.500	15
Controlo		13.000	22

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Order π-. 3290-JMS

-9QUADRO II

Extracto aquoso da vesícula biliar de tubarão, purifica do por:	Dosagem	Bioensaio(A) (unidades)	Bioensaio(B) (segundos)
Adsorção com carvão	5mg		15
Adsorção com XAD-2	lmg		16
Adsorção com resina de pejr
muta aniónica	0,5mg	8.200	14
Princípio activo purificado	0,15mg	9.600	15
Controlo		14.000	22
0s bioensaios padrão	referidos	na descrição	anterior

foram realizados da seguinte forma:

Bioensaio A

Teste biológico relativo à actividade protectora contra lesães do fígado induzidas por tetracloreto de carbono (CCl^) em ratos.

Usaram-se ratos macho Std:ddy (pesando 30-35 g) em grupos de 5 animais. Durante 7 dias administraram-se oralmente, a uma dose diária adequada, amostras de materiais teste e apôs administração da última amostra, administrou-se oralmente 0,1 ml de CCl^ a 5% em azeite. 24 horas após a administração de CCl^ obteve-se sangue da cavidade orbital. Obteve-se soro por centrifugação (3000 rpm, 10 mn) e mediu-se a actividade da glut&mico-pirúvico-transaminase pelo método de Reitman-Frankel-Momose. A actividade foi expressa como comparação dos valores GPT entre os grupos aos quais foram administradas amostras e os controlos.

Bioensaio (B)

Efeito na respiração na administração de nicotina a ratos.

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-10Usaram-se ratos macho Stdsddy (pesando 20-22 g) em gru pos de 5 animais. Injectou-se subcutaneamente tartarato de nicotina (3 mg). 3 horas antes da administração de nicotina administraram-se oralmente amostras de materiais teste. Após a administração de nicotina o tempo tomado para 30 respirações foi de 5 minutos. A actividade foi expressa como compa ração do tempo observado, entre os grupos aos quais foram administradas amostras e os controlos.

presente invento proporciona também uma composição farmacêutica contendo uma substância activa, como a descrita / anteriormente, em conjunto com um portador ou diluente farma ceuticamente aceitável. Como exemplo, a substância activa pode ser formulada em comprimidos estáveis, depois de ser mis, turada, em pó, com um portador ou agente encorpante conhecido. Alternativamente, a substância activa pode ser incorporada nu ma loção ou base para creme, para aplicação tópica. Ainda nu ma outra alternativa, a substância activa pode ser, por exem pio, introduzida numa cápsula de gelatina mole, se desejado depois de ter sido misturada com óleo de fígado de tubarão. Estas composiçães farmacêuticas podem ser usadas por exemplo para a protecção do fígado ou para activação da função do gado no tratamento de doenças ou situaçães que afectem o fíqa do, tais como hepatite, nefrite, diabetes, etc.. Estas com posições podem também ser usadas na activação da regeneração do tecido da pele, por exemplo, no tratamento de dermatite, traumas ou acne.

Testes clínicos realizados usando composições contendo a substância activa demonstraram especificamente a sua aç tividade no restabelecimento da função do fígado e no tratamento de seborreia.

Num outro aspecto deste invento, proporciona-se uma composição alimentar dietética ou de fortalecimento que compreende o princípio activo descrito aqui, em conjunto com um ou mais materiais base ou portador adequados. Esta composição pode ser útil, por exemplo, no tratamento de uma ressaca.

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-11Num outro aspecto, o presente invento proporciona uma composição cosmética compreendendo o princípio activo descri to anteriormente, em conjunto com um material base cosmético.

As composiçães do presente invento podem ainda incorporar produtos farmacêuticos conhecidos ou outros ingredientes activos, por exemplo, antibióticos ou outras substâncias antibacterianas.

Mais detalhes serão evidentes dos Exemplos que se seguem que ilustram o invento sem de qualquer maneira o limita rem.

EXEMPLO 1 - Preparação do Princípio Activo Bruto

Homogeneizaram-se em 300 ml de água, 280 g de uma mis. tura de fígado e de vesícula biliar isolados de 4 kg de tuba rão e centrifugou-se a mistura a 12000 rpm durante 30 minutos para obter uma camada aquosa límpida. Adicionaram-se à cama da aquosa 50 g de resina de permuta iónica do tipo de permuta aniónica básica e deixou-se a mistura repousar durante a noite. A resina foi removida por filtração e lavada com água. Extractou-se então a resina com 200 ml de uma solução de cio. reto de sódio a 0,5%. Adicionaram-se 100 g de XAO 2 à solução extractada. Removeu-se a XAD 2 por filtração e lavou-se com água. A XAD 2 foi extractada com 200 ml de etanol. Do extracto, removeu-se o etanol por destilação, obtendo-se 45 mg de pó activo bruto.

EXEMPLO 2 - Cromatografia em coluna de Silica-gel

Submeteram-se a cromatografia numa coluna de silica-gel, usando como solvente Me0H-CHCl^-H20 (30:70:6), 100 g do composto activo bruto obtido por adsorção numa coluna de XAD 2, obtendo-se pó branco (40 g).

EXEMPLO 3 - Cromatografia em Camada Fina (TLC) composto activo bruto foi submetido a TLC numa placa de camada fina de silica-gel 60 pré-revestida (Merck), usaji

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Order n2. 3290-0MS

-12do o sistema (partes em volume): n-Bu0H(85)-Ac0H(10)-H₂0(5) e Me0H(40)-CHCl₃(60)-H₂0(10). 0 princípio activo apresentou-se como uma única mancha em TLC e foi visualizado pulverizando com reagente ácido sulfúrico-vanilina.

EXEMPLO 4 - Cromatografia Líquida de elevada eficiência (HPLC)

A purificação final do pá activo bruto foi conseguida por aplicação sucessiva de HPLC preparativa com uma coluna de fase inversa. Obtiveram-se 31 g do composto activo na forma de pó branco, p.f. 1409, a partir duma amostra de 100 g puri ficada por XAD-2. 0 tempo de retenção representativo aprox^ mado do composto activo foi de 16 minutos. As condições para a HPLC foram as seguintes: coluna: YMC-Pack A-324 (ODS); caudal: 20 ml)mn; fase móvel: CH^CN-tampão dosfato de amó nio 0,02N (pH 7,45) (8:2); detector: índice de refracção.

EXEMPLO 5 - Cromatografia em Coluna em Sephadex LH-20 composto activo bruto (100 g) obtido por adsorção nu ma coluna de XAD-2 foi submetido a filtração em gel numa coluna Sephadex LH-20, usando como eluentes MeOH-CHCl^ (1:1) e em seguida MeOH, obtendo-se, da fracção de MeOH, pó branco (45 g). A recromatografia na mesma coluna deu 30 g de pó branco quase puro.

EXEMPLO 6

Vesículas biliares (65 g) obtidas de 5 tubarões da es. pécie Rhizoprionodon acutus (aprox. com um peso de 8 kg), fo ram homogeneizadas e em seguida congeladas-secas. Este mate rial (10,25 g) foi usado como fonte de princípio activo, sul fato cimenol de sódio. Depois de desengordurar o material com n-hexano refluxante (3 x 100 ml) foi extractado com meta nol (3 x 100 ml) sob refluxo durante 1 hora. 0 concentrado (3,67 g) foi dissolvido em H₂0 (80 ml) e aplicado a uma colu na de Amberlite XAD-2 (3,0 x 16,0 cm). A coluna foi eluida

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-13com H₂0 (400 ml) e em seguida com etanol (400 ml). Em segui, da, o eluído de etanol (1,95 g) foi aplicado a uma coluna Sephadex LH-20 (3,0 x 32,0 cm), clorofórmio e metanol (1:1). Após eluição com clorofórmio e metanol (200 ml) a coluna foi desenvolvida com metanol em lotes de 50 ml. A concentração do eluído de metanol contendo o sal de sódio produziu uma g_o ma branca (1,06 g). A purificação deste material (120 mg) por HPLC deu 85,6 mg de sulfato cimenol de sódio, na forma de pó branco. As condições para a HPLC foram as seguintes: co luna, YMC-Pack A-324 (ODS) 10 x 300 mm; caudal, 2 ml/mn; fa | se móvel CH^CN a 35$ - tampão fosfato de sódio 0,lN (pH 6,43);

detector, índice de refracção. 0 sulfato cimenol de sódio tem os seguintes dados físicos: pó branco; - 21,75 (0,5 c, em MeOH); Anal.: Cale, para C^yH^^O^SNa: C 56,82, H 8,30, S 5,62, Na 4,03. Encontrado: C 56,99, H 8,79, S 5,62, Na 4,23. SIMS de massa (m/e): 654 /“c^H^SOg. HN(C₂H₆0)₂_7,

574 /~C„„H,-0,.HN(C_H,0)_o. IV ^K®^rcm“¹: 3420, 2950, 1470, 1380, 1230, 1070, 980, 910, 810. ^ΧΗ-ΗΜΝ (em CD₃0D); S(ppm): 4,22 (1H, dd, 0=4,5, 10,0Hz), 4,11 (1H, dd, 3=6,6, 10,0Hz), 4,00 (1H, alargado), 3,80 (1H, m), 3,80-3,62 (3H, m), 3,45-3,30 (1H, m), 2,35-2,15 (2H, m), 2,05-1,02 (23H, m), 1,02 (3H, d, 3=6,2Hz), 0,92 (3H, s), 0,72 (3H, s). ¹³C-RMN (em CD^OD); & (ppm): 74,1 (d), 72,9(d), 71,4(d), 69,l(d), 66,7 ) (t), 61,2(t), 48,3(d), 47,8(d), 47,5(s), 43,l(d), 43,0(d),

41,0(d), 40,3(t), 37,0(d), 36,5<t), 35,9(s), 35,8(t), 33,3(t), 32,l(t), 31,2(t), 29,5(t), 28,8(t), 27,9(d), 24,3(t), 23,2(q), 18,l(q), 13,l(q).

EXEMPLO 7

Conduziram-se experiências usando o princípio activo deste invento numa loção anti-seborreica aplicada topicamente em 40 pacientes masculinos e femininos afectados por hiper. -seborreia facial desde há muitos anos (72). As experiências foram conduzidas como experiências em duplo , em branco com 20 pacientes aplicando um placebo e em 20 pacientes aplicando a loção contendo o princípio activo.

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Order nS. 3290-3MS

Nestas experiências, o tratamento foi aplicado três ve. zes ao dia (de manhã, ao meio-dia e à noite) durante um perlo do de 20 dias e efectuou-se uma verificação da seborreia (I_n dice de Seborreia) nos dias 0 (antes do tratamento), 10 e 21 (no final do tratamento).

Os resultados mostraram uma melhoria significativameji te maior na seborreia para os pacientes usando a loção conteri do o princípio activo relativamente aos usando o placebo. Observou-se também que esta melhoria se verificava tanto nos pacientes masculinos como nos femininos.

EXEMPLO 8 - Composições

Claims

1 - Processo de preparação de um composto de fórmula geral I, sob forma substancialmente pura, onde A é um catião, caracterizado por compreender os passas de preparação de um extracto aquoso do fígado e/ou da vesícu la biliar de um tubarão e o isolamento do referido composto a partir do referido extracto aquoso.

2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado por o catião ser um ião de sódio, de potássio, de cál. cio ou de amónio ou uma amina orgânica.

3 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caractjs rizado por o referido passo de isolamento a partir do extraç. to aquoso compreender pelo menos um passo seleccionado de ejn tre extracção com solvente, adsorção e cromatografia.

4 - Processo de preparação de uma composição farmacêjj tica, caracterizado por se associar um composto de fórmula geral I preparado de acordo com a reivindicação 1, com um portador ou diluente farmaceuticamente aceitável.

5 - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracte rizado por se obter a composição farmacêutica na forma de um comprimido, cápsula, loção ou creme.

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Order n^. 3290-JMS

6 - Processo de preparação de uma composição para o tratamento da pele, caracterizado por compreender associar um composto de fórmula geral I, preparado de acordo com a reivin dicação 1, com um portador ou diluente topicamente aceitável.

7 - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracte rizado por à composição se associar ainda um antibiótico ou outra substância antibacteriana.

8 - Processo de preparação de uma composição cosmética, caracterizado por se associar um composto de fórmula geral I, preparado de acordo com a reivindicação 1, com um material base cosmético.