PT96796B

PT96796B - Processo para a preparacao de diterpenos com actividade imunomodulatoria

Info

Publication number: PT96796B
Application number: PT96796A
Authority: PT
Inventors: Manfred Baumgarth; Hans-Eckart Radunz; Michael Wolf; Willy Kinzy; Luckenbach
Original assignee: Merck Patent Gmbh
Priority date: 1990-02-17
Filing date: 1991-02-15
Publication date: 1998-07-31
Also published as: KR910015305A; AU7111691A; GR3018737T3; IE910535A1; ES2081337T3; EP0443198A2; EP0443198B1; AU637192B2; ATE132499T1; HU910515D0; PT96796A; IE74878B1; HU207223B; DE4005159A1; EP0443198A3; US5508390A; CA2036480A1; HUT59933A; ZA911158B; DK0443198T3

Description

INVENTORES: HANS-ECKART RADUNZ, MICHAEL WOLF, MANFRED BAUMGARTH, WILLY KINZY e LUCKENBACH

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.

Prioridade na República Federal da Alemanha em 17.02.90 sob o N²P 40 05 159.5 mPI MOO 3 RF 1Ç73J?

ao processo para a imunomodulatória de

RESUMO:

A presente invenção refere-se preparação de diterpenos com actividade

(II)

2 na qual A, R e R possuem vindicações que compreende ma das fórmulas Ia, III ou as significações referidas nas isolar e purificar um composto IV rei du

a partir de plantas dos géneros Acanthospermum, Brickellia, Halimium ou Ayapana e se submeter o composto assim obtido pe lo menos a uma das seguintes operações de síntese:

- 2Α -

/

- hidrogenaçao da dupla ligação trissWstituida;

- oxidação do grupo CHgOH para obtenção do aldeído ou do áci do carboxílico ou do éster de ácido carboxílico;

- desidrogenação da ligação simples ^c0niP^0s^⁰ fór mula III;

- esterificação do ácido carboxílico do composto da fórmula IV;

- redução do ácido carboxílico do composto da fórmula IV;

- substituição do éster de galactose por outro açúcar;

- glicosidação do grupo hidroxilo no átomo de 0^; e

- redução do ácido carboxílico.

Os compostos de acordo com a invenção têm activida de imunomodulatória e, por isso, são empregados na preparaçã de composições farmacêuticas imunomodulatórias que são administráveis a seres humanos para melhorar o sistema de defesa imune dos seus organismos.

A invenção refere-se a derivados de diterpeno, que possuem uma actividade imunomodulatória, em especial, uma ac vidade estimulante das células T e são, portanto, apropriadojs como substâncias activas farmacêuticas.

A ocorrência de doenças significa, em última análi se, que o sistema imunológico do indivíduo atacado pela doen ça foi, de certo modo, pelo menos transitoriamente atacado e enfraquecido. Além do tratamento medicamentoso totalmente es pecífico da maior parte das doenças provocadas por agentes específicos, tem um papel importante o fortalecimento geral da resistência imunológica, em especial, desde que se verifi cou que também o aparecimento de tumores e de doenças da auto imunidade pode ser impedido, em parte, mediante substâncias imunomodulatórias de efeito geral, ou ser influenciado de for ma positiva. Na busca de substâncias correspondentemente apro priadas, a indústria farmacêutica tem utilizado em quantidade crescente, entre outras, substâncias naturais de tipos di versos, na maior parte sob a forma de extractos ou essências indefinidos. Exemplos conhecidos destes produtos são os extractos de equinácea (Echinacea) ou Thuja (árvore da vida). Todos os extractos deste tipo têm a desvantagem de as própri as substâncias activas não serem geralmente conhecidas; além disso, existem somente em concentrações muito pequenas, o seu isolamento e a identificação das estruturas químicas em geral complicadas originam dificuldades consideráveis; o efeito em parte não é específico e, não raramente, apresentam um efeito de combinação, ou o extracto em si mesmo é, em numerosos casos, tóxico.

Existe, portanto, a necessidade de se colocar à di posição novas substâncias activas fa.rmacêuticas que possam ser utilizadas para o reforço da resistência imunológica e que possam ser isoladas, de forma nítida, de preparados de substâncias naturais de plantas adequadas, e possam ser ca- 4 -

racterizadas e quimicamente modificadas a fim de que se possa produzir um medicamento bem definido nas suas propriedade^ na sua estrutura e na sua maneira de actuar farmacológica.

A Requerente descobriu agora que determinados deri vados de diterpenos, por exemplo, de plantas dos géneros Acah thospermum (acantospermo), Brickellia (brichélia), Halimium (halímio) ou Ayapana (aiapana), assim como as suas variantes quimicamente modificadas depois do seu isolamento têm uma act vidade imunomodulatória que e, de modo surpreendente, fortemente acentuada. Observa-se, em especial, uma estimulação si gnificativa das células T, que desempenham um papel fundamen tal na defesa imunolõgica. As substâncias activas de acordo com a invenção, dentro do intervalo de dosagens empregado, não são tóxicas, não têm acção mitogénica sobre os linfócitOi3 e também não têm nenhuma influência negativa sobre o sistema nervoso central. Portanto, elas são adequadas, preferencialmente, para aplicação na imunoterapia.

São, por conseguinte, obáecto da invenção substâncias activas farmacêuticas de fórmula I

na qual

R¹ significa -01^-0(011^) =0H-R⁵ ou -OHp-OHCCK^-CHg-R⁵;

R^ significa -CH^OH, -GHO, -COOH ou -000R% ._f

R significa alquilo com 1 a 5 átomos de carbono;

A significa ^GH-GH- ou ^OaOHg ©

R significa hidrogénio ou. radicais de pentoses, hexoses, dis sacáridos/oligossacáridos ou amino^açúcares.

objecto da invenção é constituído especialmente pela substância activa farmacêutica da formula Ia

(Ia)

É ainda objecto da invenção uma composição farmacêu tica caracterizada pelo facto de conter pelo menos um compos to de fórmula I e/ou de um dos seus sais de adição de ácido fisiologicamente aceitáveis.

Além disso, á objecto da invenção um processo para a preparação de composições farmacêuticas, caracterizado pelo facto de se misturar, um composto de fórmula I e/ou de um dos seus sais de adição de ácido fisiologicamente aceitáveis, pelo menos com uma substância veicular ou auxiliar sólida, líquida ou semilíquida e se conferir à mistura uma forma de dosagem apropriada.

São ainda objecto da invenção os novos compostos de fórmula geral II

E² (II) na qual β ^δ

1/

R¹ significa -OH2-O(CH5)=OH-R⁵ ou -0H2-0H(0H₅)-0H₂-R⁵;

R⁵ significa -CH₂0H, -CHO, -COOH ou -C00R⁴;

»

R significa alquilo com 1 a 5 átomos de carbono;

A significa^CH-CHj ou ^C-CH₂; e

P

R^ significa radicais de pentoses, hexoses, dissacáridos /olí gossacáridos ou amino-açúcares, com a condição de que, simultaneamente, R^ não pode significar

-ch₂-c(ch₅)=ch-cee₂oh ou ch₂-c(ch₅)=ch-cho, \ 2

A significar _XC=CH₂ e R significar galactose.

Além disso, constitui objecto da invenção um procejs so para a preparação dos compostos da fórmula XI, caracterizado pelo facto de, à escolha, (a) se isolar e purificar o composto da fórmula Ia a partir de plantas do género Acanthospermum (acantospermo) e se realizar pelo menos uma das seguintes operações de sínte se

- hidrogenação da ligação dupla trissubstituída;

- hidrogenação da ligação dupla exocíclica;

- oxidação do grupo -CHgOH da parte de diterpeno para a obte ção de aldeído ou de ácido carboxílico ou de éster de ácido carboxílico;

- substituição do radical galactose por um outro açúcar;

(b) se isolar e purificar o composto da fórmula III

0H₂0H

OH

HO (III) a partir de plantas dos géneros Brickellia (brichélia) ou. Ha limium (halímio) e se realizar pelo menos uma das seguintes operações de síntese

- desidrogenação da ligação 0^-0₂ da fórmula III;

- hidrogenação da ligação dupla exocíclica;

- oxidação do grupo -CHgOH para se obter aldeído ou ácido ca: boxílico ou o éster de ácido carboxílico;

- glicosidação do grupo hidroxilo no átomo 0^;

(c) se isolar e purificar o composto- da fórmula IV

a partir de plantas da espécie Ayapana (aiapana) e se realizar pelo menos uma das seguintes operações de síntese

- hidrogenação da ligação supla trissubstituída;

- hidrogenação da ligação dupla exocíclica;

- esterificação do ácido carboxílico;

- redução do ácido carboxílico ou do éster de ácido carboxílico para originar aldeído ou álcool;

- glicosidação do grupo hidroxilo no átomo de 0^.

Finalmente, é objecto da invenção também a aplicação dos compostos de fórmula I na preparação de medicamentos com actividade imunomodulatória, em especial com actividade éstimuí aríte das células T.

Os compostos de fórmula I já são em si mesmos em

parte conhecidos.

Especialmente, são já conhecidos os compostos de fórmulas Ia, III e IV. Pelo contrário, o seu efeito terapêu-i tico é novo. Podem-se obter os compostos de fórmulas Ia, III; e IV de maneira conhecida, por exemplo, a partir de plantas ! ou de partes de plantas dos geâeros Acanthospermum, Brickel-j lia, Halimium ou Ayapana. Eles já foram suficientemente carac terizados quanto à sua estrutura (Nair et al. (1976), Phytoohemiatry 15, 1776; Bohlmann et al. (1979)» Phytochemistry 18, 1997; de Pasmai Teresa et al (1985) Phytochemistry 24, |

791; Achmed et al., (1986), Phyt o chemistry 25, 1385). As plajn tas mencionadas são plantas silvestres de zonas tropicais e subtropicais, mas também de zona temperadas, como, por exemplo, Américas Central e do Sul, índia ou. regiões mediterrâni cas. As operações de isolamento e purificação dos compostos de fórmulas Ia, III e IV, a partir de fragmentos de folhas ou de raízes, encontram-se suficientemente descritas nas referidas obras de literatura técnica.

As espécies preferidas são Acanthospermumyhlspidum Ayapana amygdalina, Halimium iscosum e Briokellia vernicosa.

Os novos compostos de fórmula II, que possuem igual mente actividade imunomodulatória, respectivamente um efeito imunoestimulante, podem ser preparados, por exemplo, a parti das substâncias naturais purificadas de fórmulas Ia, III e IV, de maneira em si conhecida, consoante procedimentos padrão da Química Orgânica.

Assim, por exemplo, pode-se hidrogenar cataliticamente, de maneira convencional, a ligação dupla trissubstituída dos compostos de fórmulas Ia, II e IV, de preferência com platina em ácido acético.

A hidrogenação da ligação dupla exocíclica ( A : ^C-CH₂ com obtenção âe /GH-CH^) realiza-se de prefe- 9 -

7/

também cataliticamente. Neste caso, é especialmente adequada a utilização de paládio sobre carvão activo em metanol, mas podem empregar-se também outros catalisadores.

A oxidação dos grupos -OH^OH alílicos, por exemplo, nos compostos de fórmulas Ia, II e III, para se obterem os correspondentes alilaldeídos, realiza-se preferivelmente com bióxido de manganês activo de acordo com uma maneira de proceder em si conhecida. Se a ligação dupla alílica já estiver hidrogenada, pode-se realizar a oxidação do álcool primário do radical de diterpeno para originar aldeído também com outros agentes oxidantes usuais para estes casos; no entanto, preferem-se cobre, cromito cúprico ou prata, visto que, com estes agentes oxidantes, se inibe a posterior oxidação que origina ácido carboxílico.

A oxidação do respectivo álcool primário ou do aldeído para se obter ácido carboxílico .faz-se de maneira simples e conhecida, por exemplo, com K Wi 0^, OrO^, K₂^^r2^7 ^empiridina.

A esterificação do radical -GOOH com os álcoois do η , tipo R OH realiza-se por exemplo cataliticamente em meio acido ou básico, de acordo com processos convencionais. Também se pode introduzir o desejado radical R por meio de trans-esterificação.

A glicosidação do grupo hidroxilo no átomo de 0^ dos compostos de fórmulas III e IV ou do grupo hidroxilo no p

átomo de G? dos compostos de fórmula I (R =H) realiza-se de acordo com processos habituais da Química dos hidratos de car bono. Prefereneialmente insere-se o radical de açúcar por meio de síntese de Pischer, síntese de fíelferich ou da sínte se de Koenigs-Knorr na estrutura principal de diterpeno. Durante as reacções, obtêm-se glicósidos alfa e beta. Por meio de determinadas variantes processuais, podem preparar-se, poi?

7

exemplo, glicósidos beta, que são obtidos preferivelmente por síntese de Koenigs-Iínorr, que são anomerizados por tratamento com, por exemplo, tetracloreto de titâneo no seio de dissolventes apoiares e, assim, rsão . transformados, duma forma quã se quantitativa, nos correspondentes alfa-glicósitos. De acor do com a invenção, são apropriados tanto os glicósidos alfa como os glicósidos beta. Pode-se realizar a ligação do açúcar também duma forma particularmente vantajosa pelo processo de imidato (R. Schmidt (1986), Angewandte Ghemie 98, 213).

Para a obtenção das substâncias activas isentas de açúcar de acordo com a invenção, a partir dos respectivos cog. postos glicosados de fórmulas I, Ia e II, o glicósido é tratado de forma em si conhecida com ácidos minerais, de preferência, no entanto, com uma resina permutadora de iões ácida

Também se pode realizar uma separação enzimática com glicosidases, como, por exemplo, alfa, beta-glicosidases ou alfa, beta-galactosidases.

o

De acordo com a invenção, R significa, nos compos tos de fórmulas I e II, hidrogénio, pentoses, hexoses, dissacáridos/oligossacáridos ou açúcar aminado. Preferem-se, no entanto, os respectivos glicósidos, visto que, em regra, elels possuem as melhores caracteristicas de substâncias activas no sentido duma actividade estimulante das células T e, especial mente, no caso dos monossacáridos/dissacáridos, possuem uma melhor solubilidade. Entre os açúcares preferem-se os monossacáridos. Nestes incluem-se, por exemplo, radicais de pento ses como ribose, treose ou xilose; hexoses, como gliicose, ma nose, frutose ou galactose, ou então também açúcares aminado tal como glucosamino ou galactosamino. De acordo com a inven ção prefere-se especialmente a galactose. Gomo dissacáridos devem citar-se, principalmente, lactose, maltose ou celobiose. Os exemplos de oligossacáridos ou polissacáridos são pre ferivelmente rafinose ou também outros trissacáridos ou tetras

I

- 11 -Λ Ui sacáridos. 0 amido e a amilose sao apenas pouco adequados de vido à sua reduzida solubilidade.

De acordo com a invenção, E^ significa -CHg-C(GH^)= =CH-R³ ou -CH₂-CH(CHp-CH₂-R\ em que E^ significa -CHgOH, -CHO COOH ou -C00I?\Preferem-se particularmente os radicais E^ que significam -CH₂-C(CHp=CH-CH₂0H,CH₂-C(CH₃)-CH-CH0, -CH₂-C(CH₃)?= ΌΗ-COOH, -CH₂-CH(CH₃)-CH₂-CH₂OH e -CH₂-CH(CH₃)-CH₂-COOH.

No éster -COOR^, R^ significa de preferência metilo, etilo, n-propilo, n-butilo, isopropilo, terc-butilo ou 2j-metilpropilo.

significado preferido de A é >C=CH₂·

Nos compostos de fórmulasI ou II especialmente pre feridos,

R¹ significa -CH₂-C(CH₃)=CH-CHOH ou -CH₂-C(CH₃)-CH-CHO}

A representa ^C=CH₂ e o

R significa galactose, glucose, frutose ou ribose, em especial todavia, galactose.

Os compostos de acordo oom a invenção possuem, na estrutura diterpér£ca, vários átomos de carbono assimétricos que condicionam uma correspondente estereoespecificidade. Ne te caso sao particularmente importantes as posições 3, 7, 9 e 10 dos compostos de fórmulas I e II, visto que estas posições são, por vezes, distintas nas diferentes composições dej substâncias naturais. Assim, por exemplo, na espécie Acanthois permum hispidum existeaconfiguração 3R» 7R» 9S, 1QR; na espé cie Ayapana amygdalina existe a configuração 3R, 7R> 9R, 10S e na espécie Brickellia vernicosa existe a configuração 3S, 7R, 9S, 10R. Dado que a configuração relativa nos respectivos centros de assimetria não tem importância essencial para a citada actividade farmacêutica ou terapêutica dos medica* mentos de acordo com a presente invenção, preferem-se, por razões de disponibilidade mais fácil, as configurações que as substâncias naturais possuem. E evidente que, de acordo com a invenção, podem preparar-se, por isomerização química consoan te processos convencionais, os correspondentes compostos com outras configurações.

Pode-se transformar uma base de fórmulas I e II com um ácido, para se obter o correspondente sal de adição de ác:L do. Para esta reacção interessam em especial os ácidos que originam sais fisiològicamente aceitáveis. Assim, podem emprjs gar-se ácidos inorgânicos, como por exemplo áeido sulfúrico, ácido nítrico; hidrácidos halogenados, tais como, por exemplo, ácido clorídrico ou ácido bromídrico; ácidos fosfóricos, como ácido ortofosfórico, ácido sulfâmico; e ainda ácidos orgâ nicos, em especial, ácidos carboxílicos, ácidos sulfónicos ou ácidos sulfúricos alifáticos, alicíclicos, aralifáticos, aromáticos ou heterocíclicos, monopróticos e polipróticos, por exemplo ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico, ácido piválico, ácido dietilacético, ácido malónico, ácido succinico, ácido pimélico, ácido fumárico, ácido maleico, ác do láctico, ácido tartárico, ácido málico, ácido benzóico, ácido salicílico, ácido 2-fenil-propiónico, ácido 3-íenil--propiónico, ácido cítrico, ácido glucónico, ácido ascórbico, ácido nicotínico, ácido isonicotínico, ácido metanossulfónico ou ácido etanossulfónico; ácido 2-h.idroxi-etanossulfó nico, ácido benzossulfónico, ácido p-toluenossulfónico, ácidos naftalenomonossulfónicos e ácidos naftalenodissulfónicos ácido laurilsulfúrico.

Inversamente, podem transformar-se os compostos de fórmula I, por tratamento com uma base, num dos seus sais me tálicos (por exemplo sais de sódio, sais de potássio, sais de cálcio) ou sais de amónio.

Podem obter-se os sais de amónio quaternários dos

compostos de fórmulas 1 e II, por exemplo, no caso de aminoaçúcares, por tratamento dos referidos compostos com agentes de quaternização, por exemplo, halogenetos de alquilo ou halogenetos de· aralquilo, alquilsulfonatos ou aralquilsulfonatos, alquilsulfatos ou araiquilsulfatos, tais como cloreto de metilo, brometo de metilo, iodeto de metilo, p-toluenossu.L fonato de metilo, sulfato de dimetilo, brometo de etilo, cio reto de benzilo, convenientemente em presença de um dissolven te inerte, por exemplo de um álcool, tal como metanol ou eta nol, a temperaturas compreendidas no intervalo entre -10° e +30°.

Os compostos de fórmulas I, Ia e II de acordo com a invenção e os seus sais fisiologicamente aceitáveis podem ser utilizados na preparação de composições farmacêuticas, quando se transforma numa forma de doseamento adequada, em conjunto com pelo menos um agente veicular ou uma substância auxiliar, e, se assim se desejar, em conjunto com uma ou várias outras substâncias activas. Podem aplicar-se as composi ções assim obtidas, como medicamentos, na medicina humana e veterinária. Gomo substâncias veiculares interessam substâncias orgânicas ou inorgânicas, que sejam adequadas para administra ção por via entérica (por exemplo, oral ou rectal) ou parentérica, ou para uma aplicação sob a forma de pulverização para inalação e nao reajam com os novos compostos, como por exemplo, água, óleos vegetais, álcoois benzílicos, polietilenoglicóis triacetato de glicerina e outros glicéridos de ácidos gordos^ gelatina, lecitina de soja, hidratos de carbono, tais como lactose ouanido, estearato de magnésio, talco, celulose. Para a administração por via oral servem, em especial, xaropes soluções ou gotas; têm um especial interesse os comprimidos laçados e cápsulas com revestimentos ou coberturas resistentes ao suco gástrico. Para a administração por via rectal uti lizam-se os supositórios; para a aplicação por via parentéri14 sr

ca empregam-se soluções, de preferência, soluções oleosas ou aquosas, e ainda suspensões, emulsões, ou implantes. Para a aplicação como pulverização para inalação, podem utilizar-se sprays” que contêm a substância activa, quer dissolvida, qm suspensa, numa mistura de gases propelantes (por exemplo, hi· drocarbonetos clorofluorados). Convenientemente emprega-se, neste caso, a substância activa sob a forma micronizada, a que podem adicionar-se um ou vários dissolventes adicionais, fisiologicamente aceitáveis, por exemplo, etanol. As soluçõe para inalação podem ser administradas por intermédio de inal dores convencionais. Também se podem liofilizar os novos com postos e podem empregar-se os produtos liofilizados assim ob dos, por exemplo, para a preparação de composições para injecções.

s a

ti

As composições mencionadas podem ser esterilizadas e/ou conter substâncias auxiliares, tais como agentes conser vantes, agentes de estabilização e/ou agentes molhantes, emul sionantes, sais para modificar a pressão osmética, substâncias -tampão, agentes corantes e/ou aromatizantes ou conter várias outras substâncias activas, por exemplo, uma ou várias vitaminas.

Prefere-se a aplicação por via parentérica.

Pode-se medir e determinar in vitro a actividade imunomodulatória de linfócitos T de seres humanos e animais, por exemplo, procedendo da seguinte maneira. 0 processo baseia-se no facto de as células T serem estimuladas selectivamente para a mitose pela lectina-fito-hemaglutinina (PHA), sem ser necessária uma separação prévia de outros linfócitos, como por exemplo macrófagos ou células Β. A intensidade da activação das células T depende, neste caso, da quantidade de PHA empregada. Se se escolher uma activação das células Ί igual a cerca de metade do valor máximo, pode-se avaliar especialmente bem a imunomodulação. Substâncias com actividade

- 15 imunomodulatôria, que não adicionadas à mistura a ensaiar, au mentam (imunoestimulação) ou diminuem (imunossupressão) a divisão celular já existente. Substâncias terapeuticamente inadequadas, pelo contrário causam, sem activaçao prévia, uma divisão celular não orientada dos linfócitos T. Esse facto pode originar reacções patológicas do sistema imunológico. Gomo medida indirecta da divisão celular utiliza-se a formação ou a avaliação da timidina radioactiva no ADN novamente sintetizado nas células.

As substâncias activas de acordo com a invenção cau sam uma estimulação significativa dos linfócitos T dos seres humanos. Assim, em relação ao valor do controlo (sem substân cia activa), pode-se observar um aumento da actividade das células T compreendido entre 30 e 8CÇé, de preferência, entre 40 e 6%. Os compostos não actuam mitogenicamente sobre os linfócitos.

Os compostos glicosídicos possuem, em geral, uma maior actividade do que os compostos não glicosados. As subs tâncias sao geralmente bem toleradas. Não se puderam constatar efeitos negativos sobre o sistema nervoso central. Admin traram-se as substâncias activas de acordo com a invenção, prefereneialmente, em dosagens compreendidas entre cerca de 0,1 mg e 10 mg, especialmente, entre 0,5 mg ® 2,5 mg por uni dade de dosagem. A dosagem diária está, de preferência, compreendida no intervalo entre 0,1 e 1 mg/Kg de peso corporal. No entanto, a dose para cada determinado paciente depende do mais diversos factores, por exemplo, da actividade do compos especial aplicado, da idade, do peso corporal, do estado geral de saúde, do sexo, da alimentação, da velocidade de elimi nação, duma possível combinação de medicamentos, assim como da gravidade da respectiva enfermidade, à qual se aplica a terapia. Os compostos de acordo com a invenção são também ex ceientemente apropriados para a profilaxia.

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Exemplo 1

Isolamento de linfócitos humanos de sangue periférico

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Dilui-se sangue heparinizado (10 unidades de heparinato de lítio/ml de sangue) de doadores saudáveis, normais com o mesmo volume dum meio de cultura adequado para esta fi nalidade (RPMI 1640, GIBGO, KA). Recobrem-se lentamente 10 ml de um meio de gradiente apropriado, usual no comércio (pop exemplo, da marca registada Lymphoprep, da firma Dr. Molter GmbH, Alemanha) dentro dum tubo de ensaio de 5θ ml com tampa roscada, com 20 ml de sangue diluído. Oentrifuga-se o gradiente em 700 x g durante 20 minutos. Neste caso, resultam 3 fases; a fase superior é separada por sucção e rejeitada. De pois, retira-se a nítida fase intermédia com os linfócitos e monócitos/macrófagos, colocai—se num tubo de ensaio de 15 ml com a tampa roscada e enche-se até perfazer 14 ml com meio de cultura. Gentrifuga-se a 400 x g durante 15 minutos e decanta-se a substancia sobrenadante. Introduzem-se no tubo de ensaio ainda 15 ml de meio de cultura, suspendem-se as células e centrifuga-se a 275 x g durante 10 minutos. 0 sobrenadante é decantado, 0 pelete é solto e retomado em 2 ml de me de cultura e nele suspendem-se as células. Da suspensão reti ra-se uma amostra de 100 ^1 e dilui-se com uma amostra de 10' pil e dilui-se com uma solução (a 0,5%) de azul de tripano na proporção de 1 ; 10. Determina-se 0 número de células vivas numa câmara de contagem de Neubauer. Em pelo menos dois quadrantes (opostos) contam-se pelo menos 100 células.

Exemplo 2

Estimulação mitogénica

Colocam-se linfócitos isolados de acordo com 0 Exe pio 1 num meio de cultura contendo 1 x 10° células/ml de mei

de cultura. Em cada reentrância duma placa de microtitulação de fundo plano introduz-se 0,2 ml da suspensão de células. Adiciona-se fito-hemaglutinina mitogénica (PHA) a cada uma das referidas microculturas, de modo que exista cerca de 0,04 /ig PHA/cultura. Escolhe-se esta quantidade para que se deva esperar uma activação de células T que é cerca de metade da activação máxima. A estas composições iniciais juntaram-se diversas concentrações (50“500 ng/cultura) das substâncias activas de acordo com a invenção. Uma composição inicial serve para determinar o valor de controlo.

Exemplo 5

Proliferação dos linfócitos

Deixam-se em cultivo as placas de microtitulação com as culturas de acordo com o Exemplo 2, durante 4 dias, numa incubadora na qual se introduz gás com 10% de QC^, e se encontra a uma temperatura de 37°O e com 95% de humidade relativa do ar. 18 horas antes da conclusão do ensaio misturaram-se as culturas com 0,5 pOi de li-timidina por cada cultu ra. Em seguida prossegue-se a incubação das culturas, No 42. dia recolhem-se as células por sucção com um aparelho de captação de células através de um filtro de fibras de vidro. A almofada de filtração é colocada sobre uma folha, embebida com 10 ml dum líquido de cintilação usual no comércio e, em seguida, soldam-se as margens. Efectuou-se a medição da radioactividade da 3H-timidina inserida no ADN com um dispositivo de cintilação.

Exemplo 4

...... iWhniiiu........ II

Actividade do composto de fórmula Ia

Isolou-se o composto de acordo com o processo indi cado por Nair et al. e purificou-se (Phytochemistry (197θ) 1£

177θ)· Kb ensaio segundo os Exemplos 1 a 3, o referido compos to, com uma concentração compreendida no intervalo entre 100 e 200 mg/cultura, tinha uma actividade estimulante das células T igual a 51% e tamhém não revelava ter nenhuma acção mi togénica sobre os linfócitos. No ensaio sobre o sistema nervoso central ”in vivo (de acordo com Irwin (1963), Psychopharmacologica 15, 222) de ratos, não se pôde constatar, no caso de se administrar 0,5 mg/Kg (i.v.) após 1/4 e 24 horas, nenhuma actividade substancial causada pela substância.

Exemplo

Actividade do composto da fórmula Ia, em que o álcool alílico foi substituído por -CEO.

Preparou-se o composto de forma análoga à do Exemplo 4 e procedeu-se ao ensaio da sua actividade estimuladora da imunidade.

Em relação ao valor do controlo, determinou-se um aumento de actividade (células T) igual a 40%.

REIVINDIGAÇÕES:

Claims

REIVINDIGAÇÕES:

ia. - Processo para a preparação de diterpenos com actividade imunomodulatória de fórmula geral II na qual o símbolo r! significa -GH₂-G(GH₃)=GH-R^ ou -GHg-GHCGH^)-CH₂-R⁵, o símbolo R^ significa -OILjOH, -GHO, -GOO2 ou -COOR^ o símbolo R significa alquilo com 1 a 5 átomos de G, o símbolo A significa ^GH-GH^ ou ^G=GH₂ ^e p

o símbolo Ε^ώ significa 3, pentoses, hexoses, dissacáridos, oligossacáridos ou amino-açúcares, com a condição de que simultaneamente

R.1 não pode significar

-C2₂-G(G2₃)=CH-CH₂GB ou -0H₂-G ( 0H₅ ) =GH-GHO,

A não pode significar >0=GH₂ e

R nao pode significar galactose, caracterizado pelo facto de

a) se isolar e purificar o composto da fórmula Ia a partir de plantas do género Acanthospermum (acantospermo) e se realizar pelo menos uma das seguintes operações de síntese:

- hidrogenação da dupla ligação trissuhstituída,

- hidrogenação da dupla ligação exocíclica,

- oxidação do grupo -CHgOH da parte de diterpeno para obtenção de aldeído ou de ácido carboxílico ou de éster de ácido carboxílico,

- substituição do éster de galactose por outro açúcar; ou b) se isolar e purificar o composto da fórmula III a partir de plantas dos géneros Brickellia (brichélia) ou Halimium (halímio) e se realizar pelo menos uma das seguintes operações de síntese:

- desidrogenação da ligação entre os átomos de Cj-Cg da fórmula III,

- hidrogenação da dupla ligação exocíclica,

- oxidação do grupo -OHgGH com obtenção de aldeído ou de áci do carboxílico ou de éster de atido carboxílico,

- glicosidação do grupo hidroxilo no átomo de 0^; ou c) se isolar e purificar o composto da fórmula IV

COOH (IV) a partir de plantas do gênero Ayapana (aiapana) e se realizac pelo menos uma das seguintes operações:

- hidrogenação da dupla ligação trissubstituída,

- hidrogenação da dupla ligação exocíclica,

- redução do ácido carboxílico ou do éster de ácido carboxílico para obtenção de aldeído ou de álcool,

- glicosidação do grupo carboxílico no átomo de 0^.
2&. - processo de acordo com a reivindicação 1, ca racterizado pelo facto de se glicosidar o composto de fórmula lia assim obtido.
3â. - processo para a preparação de composições fa. macêuticas com acção imunomodulatória, com acção de estímulo de células T ou de estímulo das defesas do organismo, earact rizado pelo facto de se misturar pelo menos um composto de fórmula I

I Ir » na qual dos ou aminoaçúcares, ou um dos seus sais de adição de áci do fisiologicamente aceitáveis com as substâncias veicula res e/ou diluentes e/ou auxiliares sólidas, líquidas ou semilíquidas farmacologicamente aceitáveis.

- Processo para estimular o sistema imune em seres humanos e animais, especialmente estimulando os respec tivos linfócitos T, caracterizado pelo facto de se administrar aos pacientes que precisam esse tratamento uma dose diá ria de, pelo menos, um composto de fórmula I de acordo com as reivindicações anteriores ou de um dos seus sais fisiologicamente aceitáveis de preferência compreendida entre cerca de 0,1 e 1 mg/Kg de peso corporal.

Lisboa,

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