PT87593B

PT87593B - Processo para a preparacao de nucleosidos e de composicoes farmaceuticas que os contem

Info

Publication number: PT87593B
Application number: PT87593A
Authority: PT
Inventors: Thomas Anthony Krenitsky; George Walter Koszalka
Original assignee: Wellcome Found
Priority date: 1987-05-29
Filing date: 1988-05-27
Publication date: 1992-09-30
Also published as: ZA883830B; NZ224812A; WO1988009332A1; PT87593A; AU1796288A; IL86533A0; AU2200092A; KR890701582A; JPH02503557A; GB8712691D0

Description

Memória descritiva

A presente invenção refere-se a determinados derivados de 2’,3’-didesoxicitidina e à sua utilização na te rapeutica, particularmente para o tratamento ou profilaxia de al. gumas infecçães víricas.

No campo da quimioterapêutica antivírica, existem poucas drogas que combatem eficazmente os vírus per se. devido à dificuldade de se atacar os vírus enquanto vivem sem in fectar as células do hospedeiro. Verificou-se agora, que determi nados estádios do ciclo de vida do vírus os quais variam de espé cie para espécie. São específicos desses mesmos vírus. Esses estádios podem ser susceptiveis de se atacar quando diferirem sufi cientemente de qualquer função correspondente da célula do hosp_e deiro. Contudo, devido à grande semelhança entre as funçães do vírus e as das células do hospedeiro, verifica-se que os tratamentos eficazes são muito difíceis de descobrir.

Um grupo de viroses que recentemente tem as

II ί

sumido uma particular importância representa o grupo das retroviroses. As retroviroses formam um sub-grupo das viroses RNA cujos vírus para se replicarem precisam de primeiro, transcrever · inversamente o RNA do seu genoma para o DNA (a designação de transcrição refere-se habitualmente à síntese do RNA a partir do DNA), Uma vez na forma de DNA, o genoma virai é incorporado no genoma da célula do hospedeiro, permitindo ao vírus aproveitar-se de todas as vantagens da maquinaria de transcrição/tradu-ί ção das células do hospedeiro, para se reproduzir. Uma vez incorí porado, o DNA virai é virtualmente indistinguível do DNA do hos-; pedeiro e o vírus pode persistir nesse estádio enquanto a célula viver. Como nessa forma o vírus é virtualmente invulnerável de ser atacado, qualquer tratamento deve ser dirigido a outra fase do ciclo de vida do vírus e necessita ser continuado até todas as células infectadas pelo vírus estarem mortas.

Uma espécie de retrovírus foi reproduzívelmente isolada dos doentes com SIDA e designa-se por vírus da imu nodeficiencia humana (HIV). Esse vírus era conhecido anteriormen te sob a designação de vírus linfotrópico das células T humanas III (HTLV III), de retrovírus associado à SIDA (ARV) e de vírus associado a linfadenopatia (LAV). 0 referido vírus tem mostrado preferência para infectar e destruir as células T que transportam os marcadores de superfície OKT e está reconhecido ser o agente etiolégico da SIDA. 0 doente pede progressivamente essa série de células T, o balanço global do sistema imune fica perturbado, reduz-se a sua capacidade para combater outras infecções e predispõe o doente a infecções oportunistas que frequentemente revelam-se fatais. Assim, a causa geral de morte das vítimas da SIDA não é uma consequência directa da infecçâo pelo HIV mas uma infecçâo oportunista tal como a pneumonia, ou os câncer induzidos por vírus.

Recentemente, também foi recuperado o HIV de outros tipos de tecidos, compreendendo as células B que revelam os marcadores T, macréfagos e tecidos associados não sanguíneos do sistema nervoso central verificou-se nos doentes que revelam os sintomas clássicos de SIDA e está associada com a desmielini— zação progressiva conduzindo ao enfraquecimento e aos sintomas

de encefalopatia, de disartria progressiva, de ataxia e de dis-¹orientação. Ás situações associadas ainda com a infecção por l

HIV são o estado de portador assintomático, a linfadenopatia ge neralizada progressiva (PGL), a neuropatia periférica e a situa ção complexa relacionada com a SIDA. ί composto 2’,3’-didesoxicitidina (DDC) é conhecido pela sua actividade potente anti-HIV. O composto e o j seu processo de preparação são divulgados na Patente Europeia ί

e Reivindicações anexas N2 0216511. I

Os ésteres do composto de partida DDC foj ram divulgados anteriormente na Patente Europeia e Reivindica- j ções anexas N# 206497 ® a síntese do composto 2’,3*-didesoxi- j -N-pivaloilcitidina foi divulgada na Synth. Commun. (1985), (5), 401-9.

Os requerentes verificaram agora que deter minados derivados de DDC como atrás descrito, são úteis para o tratamento ou para a profilaxia de infecções víricas, particularmente as infecções retrovíricas e especificamente a SIDA e revelam tuna biodisponibilidade melhorada sobre o composto de par tida i.e., o composto DDC.

Os derivados atrás mencionados de DDC de acordo com a presente invenção, são compostos derivados nos quais a posição N4 da DDC é substituída por um grupo acilo (por ex. um grupo alcanoilo ^3.5) ®/^{ou a} posição 5‘-0 é substituída por um grupo alcanoilo C^ Os grupos acilo particularmente preferidos são os grupos propionilo e pivaloilo. Esses compostos derivados são referidos a seguir como compostos de acordo com a invenção.

Os compostos de acordo com a invenção particularmente preferidos compreendem:

1, 2',3’-didesoxi-N4,5*-0“dipropionilcitidina}

2. 2’,3 *-didesoxi-N4-propionilcitidina;

3. 2»,3‘-didesoxi-5’-0-propionilcitidina;

4, 2’,3»-didesoxl-N4,5*-0-dipivaloilcitidinaí

5· 2·,3’-d±desoxi-N4-pivaloilcitidina; ί

6. -didesoxi-5 ‘ -O-pivaloilci tidina.

A vantagem dos compostos derivados atrás referidos sobre o composto de partida DDC é a sua biodisponibilidade bastante melhorada, demonstrada pela persistência de DDC na corrente sanguínea e os níveis elevados de DDC no cérebro apés a administração de um dos ésteres atrás referidos quando comparada com a administração do próprio composto DDC. Os compostos de acordo com a invenção são por consequência, úteis na I terapêutica médica particularmente no tratamento de infecções pelo HIV, especificamente as do sistema nervoso central.

I

Em mais um aspecto da presente invenção proporcionam-se como compostos novos, os compostos derivados de DDC atrás referidos de acordo com a presente invenção com a excepção do composto 2·,-3*-didesoxi-N4pivaloilcitidina.

Os compostos de acordo com a invenção também são úteis para o tratamento ou para a profilaxia de outras situações clínicas associadas com as infecções retrovíricas, por exemplo, o sarcoma de Kaposi, a trombocitopénia púrpura, a situação complexa relacionada com a SIDA e para os doentes portadores de anticorpos da SIDA ou que são seropositivos para o vírus da SIDA, assim como nas situações neurológicas crónicas tais como a esclerose múltipla ou a paraparésia espasmódica trópica. Os compostos de acordo com a invenção também são úteis para o tratamento ou profilaxia das infecções por HTLV-II e por HTLV-IV (HIV-2) assim como outras infecções retrovíricas humanas associadas com a SIDA ou com a imunodeficiência. A presente invenção por consequência, proporciona os compostos de acordo com a invenção para a utilização no tratamento ou profilaxia de qualquer das situações ou infecções atrás referidas.

Observou-se uma actividade particularmente boa contra as viroses que sejam retroviroses e também para as DNA viroses com actividade da transcriptase inversa. Assim, pro, porcionam-se ainda, os compostos de acordo com a invenção para a utilização no tratamento ou profilaxia de infecções retrovíri-

cas ou de infecções por vírus análogos.

Considera-se que os compostos de acordo com a invençSo também podem ser utilizados na preparação de um medicamento para o tratamento ou profilaxia de qualquer das situações ou infecções atrás referidas.

Pela designação um derivado farmaceuticamente aceitável” refere-se qualquer sal farmaceuticamente aceitável, ou qualquer outro composto que pela administração ao beneficiário, é capaz de proporcionar (directa ou indirectamente) o composto 2’,3’-didesoxinucleósido como atrás descrito, ou um metabolito activo antivírico ou um seu resíduo.

Qualquer referência a algum dos compostos atrás referidos também compreende a referência a um seu sal far maceuticamente aceitável.

Exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos de acordo com a invenção e dos seus derivados farmaceuticamente aceitáveis compreendem sais de bases, por exemplo, de uma base adequada, tal como os sais de metais alcalinos (por ex. de sódio), de metais alcalino-terrosos (por ex. de magnésio, de amónio e de NX⁺(em que X representa um grupo alquilo · θ® ^s&i® fisiologicamente aceitáveis de um átomo de hidrogénio ou de um grupo amina compreendem os sais de ácidos carboxílicos orgânicos tais como os ácidos acético, láctico tartárico, málico, isetiónico, lactobiónico e succínico; de ácidos sulfónicos orgânicos tais como os ácidos metanosulfónico, etanosulfónico, benzenosulfónico e p-toluenosulfónico e de ácidos inorgânicos tais como os ácidos clorídrico, sulfúrico, fosfórico e sulfâmico. Os sais fisiologicamente aceitáveis de um composto com um grupo hidroxi compreende o anião do referido composto em combinação com um catião adequado tais como Na , NH*^ e NX⁺^ (em que X representa um grupo alquilo ·

Os compostos de acordo com a invenção também referidos como a substância activa, podem ser administrados para a terapêutica por qualquer via adequada compreendendo a via oral, rectal, nasal, tópica (compreendendo as vias bucal e

sublingual), vaginal e parentérica (compreendendo a subcutânea, a intramuscular, a intravenosa e a intradérmica). Considera-se que a via de administraçao preferida varia com a situação e a idade do beneficiário, a natureza da infecçâo e a escolha da substância activa.

Em geral a dose adequada situa-se no inter valo de 3,0 a 120 mg por kilograma de peso do beneficiário e por dia, preferivelmente no intervalo entre 6 e 90 mg por kilograma de peso por dia e mais preferivelmente no intervalo de 15 a 60 mg por kilograma de peso por dia, A dose desejada apresenta-se preferivelmente como duas, três, quatro, cinco, seis ou mais sub-doses administradas em intervalos de tempo adequados através do dia. Essas sub-doses podem ser administradas em formas de unidades de dosagem, por exemplo, contendo de 10 a 1500 mg, preferivelmente de 20 a 1000 mg e mais preferivelmente de 50 a 700 mg da substância activa por forma de unidade de dosagem.

A substância activa da maneira ideal, deve ser administrada para atingir o pico das concentrações plasmáti cas do composto activo, de entre 1 a 75 μΜ, preferivelmente de 2 a 50 jjM, mais preferivelmente de 3 a 30 juM. Esse pico de concentrações pode ser atingido, por exemplo, pela injecção intravenosa de uma solução de 0,1 a 5% de substância activa, opcionalmente em soro fisiológico, ou por via oral sendo administrada como um bolo contendo de 1 a 100 mg/kg da substância activa. Os níveis sanguíneos desejados podem ser mantidos por uma infusão contínua para proporcionar cerca de 0,01 a 5,0 mg/kg/hora ou por infusões intermitentes contendo de 0,4 a 15 mg/kg da substância activa.

Embora seja possível administrar a substan cia activa por si so é preferível apresentá-la numa composição farmacêutica. As composições da presente invenção compreendem pelo menos uma substância activa, como atrás definida, conjuntamente com um ou mais dos seus veículos aceitáveis e opcionalmente com outros agentes terapêuticos. Cada veículo deve ser aceitável no sentido de ser compatível com as outras substân-

cias da composição e não prejudicar o doente. Nas formulações compreendem-se as adequadas para a administração oral, rectal, nasal, tópica (incluindo bucal e sublingual), vaginal ou parentérica (incluindo subcutânea, intramuscular, intravenosa e intradérmica). As formulações podem ser adequadaoente apresentadas na forma de unidades de dosagem e podem ser preparadas por qualquer dos métodos conhecidos da química farmacêutica. Esses métodos compreendem o passo da misturar-se a substância activa com o veículo que é constituído por uma ou por mais substâncias adjuvantes. Em geral, as composições são preparadas misturando-se uniformemente e intimamente a substância activa com os veículos líquidos ou os veículos sólidos finamente divididos ou com ambos e depois disso, se necessário segue-se a moldagem do produto.

As composições da presente invenção, adequadas para a administração oral podem ser apresentadas na forma de unidades de dosagem tais como cápsulas, pílulas ou compri midos contendo cada uma, uma quantidade pré-determinada da subsi tância activa; na forma de um pó ou de grânulos; na forma de uma solução ou uma suspensão num líquido aquoso ou não aquoso; ou na forma de uma emulsão líquida de óleo em água ou de tuna emulsão líquida de água em óleo. A substância activa pode também ser apresentada na forma de um bolo, de uma poção ou de uma pasta.

Um comprimido pode ser preparado por compressão ou por moldagem, opcionalmente com uma ou com mais subjs tâncias adjuvantes. Os comprimidos por compressão podem ser prje parados comprimindo numa máquina adequada a substância activa na forma levemente livre tal como na forma de um pó ou de grânu los, opcionalmente misturado com um aglutinante (por ex. povidn na, gelatina, hidroxipropilmetilcelulose), com um lubrificante, um diluente inerte, um conservante, um desegregante (por ex. amido glicolato de sódio, povidona reticulada, carboximetilcelu lose de sódio reticulada) agentes tensioactivos ou agentes dispersantes. Os comprimidos por moldagem podem ser preparados mol. dando-se numa máquina adequada uma mistura húmida do composto em pó com um diluente líquido Inerte. Os comprimidos podem op—

cionalmente ser revestidos ou marcados e podem ser formulados para proporcionar a libertação lenta ou controlada da substân- í cia activa utilizando-se para esse fim por exemplo, a hidroxi- ι propilmetilcelulose em várias proporções para proporcionar o j perfil de libertação desejado. Os comprimidos podem opcionalmen te possuir um revestimento entérico, para proporcionar a libertação nas outras partes do intestino e não no estomago. Essa li bertaçâo é particularmente vantajosa para os compostos derivados de nucleésidos de purina pois tais compostos são susceptíveis à hidrólise ácida.

As composições adequadas para a administra ção tópica na boca compreendem as pastilhas com a substância a_c tiva numa base aromatizada, geralmente a sacarose e acácia ou goma adraganta; as pastilhas com a substância activa numa base inerte tal como a gelatina ou a glicerina, ou a sacarose e acácia e os elixires para a boca com a substância activa num adequado veículo líquido.

As composições para a administração rectal podem ser apresentadas como supositórios com uma base adequada compreendendo por exemplo manteiga de cacau ou um salicilato.

As composições adequadas para a administra·· ção vaginal podem ser apresentadas na forma de óvulos, tampões, cremes, geles, pastas, espumas ou na forma de aerossoles conten do em adição à substância activa os veículos adequados conhecidos da química farmacêutica.

As composições adequadas para administração parentérica compreendem as soluções aquosas e nâo aquosas injectáveis estéreis e isotónicas que podem conter antioxidantes, soluções de tampão, bacteriostáticos e solutos que proporcionam uma composição isotónica no sangue do beneficiário; e suspensões aquosas e não aquosas estéreis que podem conter agen tes de suspensão e agentes espessantes, Às composições podem ser apresentadas nos frascos de dose unitária ou de dose múltipla, por exemplo, em ampolas e frascos-ampola e podem ser fornecidos no estado seco por congelação (liofilizado) requerendo apenas imediatamente antes de utilizar-se, que seja adicionado

o veículo líquido estéril, por exemplo água para injectáveis. As soluções e suspensões injectáveis extemporâneas podem ser preparadas a partir dos pós, grânulos e comprimidos estéreis do tipo atrás descrito.

As composições preferidas de unidades de dosagem são as que contêm uma dose diária ou uma dose unitária, uma sub-dose diária da substância activa, conforme atrás referido, ou uma sua fracção adequada.

Os compostos atras referidos de acordo coir a invenção e os seus derivados farmaceuticamente aceitáveis, podem ser utilizados em combinação com outros agentes terapeuti cos para o tratamento ou profilaxia das infecções ou situações clínicas atrás referidas. Exemplos desses agentes terapêuticos que se podem combinar, compreendem os que são eficazes para o tratamento ou profilaxia das infecções por HIV ou situações clínicas associadas, tais como os compostos 3’-azido-3’-desoxitimidina (zidonudina) que aumentam ou potenciam a actividade dos compostos de acordo com a invenção, tais como os nucleósidos acíclicos (por ex. aciclovir), interferões, tais como c( -interferão, inibidores da excreção renal, tal como o probenecide ou inibidores do transporte de nucleósidos, tal como o dipiridamol, assim como imunomoduladores tal como interleucina II e factores estimulantes de colónias de granulócitos macrófagos.

Considera-se que em adição âs substâncias particulares atrás referidas, as composições de acordo com a presente invenção podem compreender outros agentes habituais da química farmacêutica com respeito ao tipo de composição em causa, por exemplo, os agentes adequados para administração oral podem compreender ainda, edulcorantes, espessantes e aromatizantes.

De acordo ainda, com uma caracteristica { importante da presente invenção proporciona-se um processo para a preparação de um composto de acordo com a invenção o qual compreendei

A) fazer-se a acilaçâo do composto 2·,3’-didesoxicitidina (DDC) para efectuar-se a introdução dos grupos acilo adequados

nas posições N4-e/ou 5*0- do composto DDC;

B) tratar-se um derivado diacilo N4, 5’-0 de acordo com a presente invençSo para efectuar-se a remoção do grupo acilo de uma das posições N4- e/ou 5’0.

No processo A) atrás referido, a acilação pode ser realizada pela utilização por exemplo, de um anidrido de ácido adequado ou por um agente de acilação análogo, preferivelmente sob condições básicas por ex. na presença de uma ami na terciária tal como a piridina, num meio de solvente adequado tal como o acetonitrilo.

No processo B) atrás referido, o grupo N4-aoilo pode ser selectivamente removido, por exemplo pelo trata mento com um halogeneto de metal tal como o brometo de zinco num meio de solvente adequado tal como o metanol. A remoção selectiva do grupo 5‘0-acilo pode ser realizada por exemplo pelo tratamento com uma enzima estearase, por exemplo a estearase de fígado porcino de tipo 1.

à

Exemplo 1> 2’ ,3’-Didesoxi-N—,5¹-O-dipropionilcitidina

Foram dispersos em 50 ml de acetonitrilo,

2*,3*-didesoxicitidina (2,4 mmoles; 0,5 St Pharmacia”, Piscataway, NJ), dimetilaminopiridina (0,178 mmoles; 21,7 mg), trietllamina (6,34 mmoles) e anidrido propiónico (5,67 mmoles; Aldrich Chemicals Milvrankee, Wl). A reacção foi deixada a prosseguir ã temperatura ambiente durante vinte e quatro horas e passado esse tempo foram adicionados 10 ml de metanol. Foi removido o solvente da mistura reaccional sob vácuo e o resíduo foi cromatografado numa coluna de sílicagel de 5 x ^0 cm. Foi utili zada a fase móvel de clorofórmio/metanol (9:1; v/v), 0 produto contido no pico foi recuperado e o solvente foi removido sob vá cuo. 0 resíduo foi dissolvido em etanol/água 95% (v/v) e seco sob vácuo. Esta operação foi repetida uma segunda vez. Um terceiro ciclo também foi iniciado com a solução a ser filtrada através de um filtro de 0,45 η»μ antes da secagem. 0 resíduo foi dissolvido com água e liofilizado para se obter 0,747 g do com= 10 =

,5 *-O-dipropionilcitidina ^C15^H21^N3°5 *

6,55; N, 13,00 6,56} N, 12,93.

posto 2*,3’-didesoxi-N Analise calculada para Calculado: C,55,72; H, Encontrado:0,55,695 H,

Os valores de RMN e de espectrometria de massa estavam de acordo com a formula de estrutura.

à

Exemplo 2: 2',3*-Didesoxi-N -propionilcitidina

Foram dispersos em 50 ml de acetonitrilo, o composto 2·,3’-didesoxicitidina (2,4-mmoles; 0,5 g, Pharmacia”, Piscataway, NJ), dimetilaminopiridina (0,178 mmoles;

21,7 mg), trietilamina (6,34 mmoles; 0,886 ml) e anidrido propiónico (l ml; Aldrich Chemicals, Milwankee, Wl). A reacção foi deixada a prosseguir á temperatura ambiente durante vinte e qua tro horas e passado esse tempo foram adicionados 10 ml de metanol. Foi removido sob vácuo o solvente da reacção e o resíduo foi cromatografado numa coluna de sílica gel de 5 x 4o cm. A fase móvel utilizada foi de clorofórmio/metanol (9*1; v/v).

As fracções contendo o produto foram reunidas e o solvente foi removido sob vácuo. 0 resíduo foi dissolvido com água e adicionou-se 3^0 unidades de estearase de fígado porcino de tipo 1 (EC 3.1.1.1, Sigma Chemicals, St. Louis, MO). Após vinte e quatro horas a temperatura ambiente o pH foi ajustado para 7,0 & partir de 5,5 ^e adicionou-se mais 320 unidades de estearase. Um dia depois, a reacção estava completa e removeu-se o solvente sob vácuo. 0 resíduo foi cromatografado numa coluna de sílica-gel (5 X 40 cm) e foi eluída com clorofórmio/metanol (9*1, v/v). Foram reunidas as fracções contendo o produto e removeu-se o solvente no vácuo obtendo-se 0,408 g de 2*,3*-didesoxi4 -N -pivaloilcitidina contendo 0,5 equivalentes de agua.

Análise calculada para 0,5 H^O:

Calculado : C, 52,17$ H, 6,57? M, 15,21.

Encontrado : C, 52,25; H, 6,4l; N, 15,11

Os valores de RMN e de espectrometria de = 11 =

massa estavam de acordo com a fórmula de estrutura.

Exemplo 3: 2»,3‘-Didesoxi-5’-0-propionilcitidina

Foram combinados com 9 ml de clorofórmio/ /metanol (8:2; v/v), quatrocentos e três miligrama do composto obtido no Exemplo 1 e 1 mmole de brometo de zinco em 1 ml de metanol e agitou-se a mistura reaccional durante uma noite à temperatura ambiente. Foi removido o solvente sob pressão redu zida e o resíduo foi cromatografado numa coluna contendo sílicagel (5 x 35 cm) com clorofórmio/metanol (8:2; v/v). As fracÇ8es contendo o produto foram reunidas e depois do solvente ter sido removido no vácuo, o resíduo foi dissolvido em n-propanol/água 30% (v/v), Foi cromatografado numa coluna contendo resina BioRad P.2 (5 x 90 cm). As fracções contendo o produto foram reunidas e o solvente foi removido sob pressão reduzida obtendo-se 0,051 g de 2’,3'-didesoxi-S^O-propionilcitidina contendo 0,25 equivalentes de n-propanol.

Análise calculada para 0,25 C^HgOí

Calculado : C, 54,25; H, 6,78} N, 14,88

Encontrado : C, 54,41; H, 6,59$ N, 14,83

Os valores de RMN e de espectrometria de massa estão de acordo com a fórmula de estrutura.

A

Exemplos 4 e 5: 2'.3^t-Didesoxl-N\5^>-0-dipivaloilcitidina e 2¹.3'-didesoxi-N -pivaloilcitidina

Em 50 ml de acetonitrilo foram dispersos 2»,3'-didesoxicitidina (2,4 mmoles; 0,5 g$ Pharmacia, Piscataway, NJ), dimetilaminopiridina (θ,17θ mmoles; 21,7 mg), trietilamina (6,34 mmoles) e anidrido trimetilacético (5»67 mmoles). Foi deixada prosseguir a reacção à temperatura ambiente durante quarenta e oito horas e passado esse tempo foram adicionados 10 ml de metanol. 0 solvente da mistura reaccional foi removido sob vácuo e o resíduo foi cromatografado numa coluna de sílicagel de 5 x 400cm. A fase móvel utilizada foi clorofórmio/ /metanol (9:1 v/v). Foram recolhidos separadamente os primei12 a

roe dois picos de absorção no UV e foi removido o solvente sob vácuo (Picos 1 e 2). 0 resíduo do pico 1 foi dissolvido em eta nol/água 95$ e seco sob vácuo. Essa operação foi repetida uma segunda vez. Foi também iniciado um terceiro ciclo sendo a solução filtrada através de um filtro de 0,4-5 pm antes da secagem. 0 resíduo foi dissolvido com água e da liofilização obteve-se 0,36 g do composto 2»,3'-didesoxi-N^,5’-0-dipivaloilciti dina (Exemplo 4) contendo depois de analisado, 0,2 equivalentes de água e 0,45 equivalentes de etanol.

Análise calculada para O^H^N^O^ 0,5 H^O 0,45 CgH^Oí

Calculado : C, 59,19} H, 8,01} N, 10,4l

Encontrado : C, 59,34} H, 7,86} N, 10,24

Os valores de RMN e de espectrometria de massa estão de acordo com a fórmula de estrutura pico 2 foi dissolvido em n-propanol/água 30% (v/v) e cromatografado numa coluna contendo resina BioRad P-2 (2,5 x 90 cm). Foram reunidas as fracções contendo o produto e o solvente foi removido no vácuo para se obter 0,077 S do composto 2¹,3’-didesoxi-N^-pivaloilcitidina (Exemplo 5) conten do 0,7 equivalentes de água.

Análise calculada para ^4^21^3^4 ⁸

Calculado : C, 54,60} H, 7,33} N, 13,65.

Encontrado : C, 55,36} H, 7,24} N, 13,34.

Os valores de RMN e de espectrometria de massa estão de acordo com a estrutura.

Exemplo 6: 2’,3’-Didesoxi-5’-0-pivaloilcitidina

Foram combinados com 12 ml de metanol, duzentos e dez miligramas do Exemplo 4 e cento e vinte e quatro miligramas de brometo de zinco e a mistura reaccional foi agitada durante uma noite à temperatura ambiente, 0 solvente foi de^ pois removido sob pressão reduzida e o resíduo dissolveu-se em n-propanol/água 30% (v/v). Foi cromatografado numa coluna con= 13 «

tendo resina BioRad P-2 (2,5 x 90 cm). As fraeções contendo o produto foram reunidas e removeu-se o solvente no vácuo obtendo-se O,l43 g do composto 2’,3*-didesoxi-5’-0~pivaloilcitidina contendo 0,5 equivalentes de água e 0,1 equivalentes de n-propa nol.

Análise calculada para θι^^^Ν^Ο^ 0,5 H^O 0,1 C^HgO:

Calculado í C, 55,34} H, 7,40·, N, 13,54.

Encontrado : C, 55,36} H, 7,24; N, 13,34.

Exemplo 7» Composições de comprimidos

As seguintes composições A e B são preparadas pela granulaç&o a húmido dos ingredientes com uma solução de po vidona seguida pela adição de estearato de magnésio e pela compressão.

Composição A

	mg/comprimido	mg/comprimido
(a) Substância activa	250	250
(b) Lactose B.P.	210	26
(c) Povidona B.P,	15	9
(d) Amido glicolato de sódio	20	12
(e) Estearato de magnésio	5 500	3 300

= 14 =

Composição B

	mg/comprimido	mg/comprimido
(a) Substancia activa	250	250
(b) Lactose	150	-
(e) Avicel PH 101	60	26
(d) Povidona B.P.	15	9
(e) Amido glicolato de sódio	20	12
(f) Estearato de magnésio	5	3
	500	300
Composição C	mg/comprimido
Substância activa	100
Lactose	200
Amido	50
Povidona	5
Estearato de magnésio	4
	359
As seguintes	composiçães D e E	são preparadas
por compressão directa da mistura dos ingredientes, A lactose
na composição E é do tipo de -^MZeporox”).	compressão directa	(Dairy Crest-
Composição D	mg/comprimido
Substância activa	250

Amido prégelatinado NF%5 150

400

Composição E

Substância activa

Lactose

Avicel mg/comprimido

250

150

100

500

Composição F (Composição de libertação controlada !

A composição é preparada pela granulação a hú-i mi cl o dos ingredientes (abaixo indicados) com uma solução de po-i vidona seguida pela adição de estearato de magnésio e pela com-R

pressão.	mg/comprimido
(a) Substância activa	500
(b) Hidroxipropilmetilcelulose	112
(Methocel K4M Premium)
(c) Lactose B.P.	53
(d) Povidona B.P.	28
(e) Estearato de magnésio	7
	700

A libertação da droga é realizada durante um período de cerca de seis a oito horas e esta completa depois de doze horas»

Exemplo 8t Composições de capsulas

Composição A

A composição A de cápsulas é preparada por mis» tura dos ingredientes da composição D no Exemplo 7 atrás referi do e pelo preenchimento com a mistura das cápsulas de gelatina dura constituídas por duas partes. A composição B (abaixo referida) é preparada de uma maneira análoga.

Composição B mg/cápsula

(a) Substancia activa	250
(b) Lactose B.P.	143
(c) Amido glicolato de sédio	25
(d) Estearato de magnésio	2 420

Composição C mg/cápsula

250

350

600 (a) Substancia activa (b) Macrogol 4000 B.P.

As cápsulas são preparadas pela fusão do Macro gol 4000 B.P., pela dispersa© da substância activa na quantidade fundida e pelo preenchimento das cápsulas de gelatina dura ; constituídas de

Composição D uas partes.

mg/cápsula

250

100

450

Substância activa Lecitina óleo de Arachis

As cápsulas são preparadas pela dispersão da substância activa na lecitina e no óleo de “Arachis e preenchi mento da mistura em cápsulas de gelatina elástica mole.

ComposiçSo E (cápsulas de libertação controlada

A seguinte composição de cápsula de libertação controlada ó preparada pela extrusão dos ingredientes a, b e £ utilizando um aparelho de extrusão, seguida pela formação de es; feras da massa extrusada e pela secagem. As pílulas secas são depois revestidas com uma membrana que controla a libertação (d) e incorporados em cápsulas de gelatina dura de duas partes.

mg/cápsula

(a)	Substância activa	250
(b)	Celulose microcristalina	125
(c)	Lactose B.P,	125
(d)	Etilcelulose	13
		513

Exemplo 9: Composição de injectável }

Composição A j í

Substância activa 0,200 g '

Solução de ácido clorídrico, O,1M q.b.p, pH 4,0 a 7,0 Solução de hidróxido de sódio, O,1M q.b.p. pH 4,0 a 7,0 Água esterilizada q.b.p. 10 ml

A substância activa é dissolvida na maior parte de água (35° a 40° C) e o pH é ajustado entre 4,0 e 7,0 com | í

ácido clorídrico ou com hidróxido de sódio conforme adequado. ; A solução é depois completada atá ao volume com a água e á filtrada através de um filtro micropore esterilizado para um fras-| eo-ampola de vidro (tipo l) âmbar esterilizado e de 10 ml de caí pacidade e selada com coberturas esterilizadas e sobreselada.

Composição B

Substância activa 0,125 g

Solução tampão de fosfatos de pH 7 apirogenica e esterilizada q.b.p. 25 ml

Exemplo 10» Injectável intramuscular

Substância activa

Álcool benzílico

Glicofurol 75

Água para injectáveis q.b.p.

0,20 g 0,10 g

1,45 g 3,00 ml

A substância activa é dissolvida em glicofurol. É depois adicionado o álcool benzílico e é dissolvido e é adicionada a água até 3 ml. A mistura é em seguida filtrada através de um filtro micropore esterilizado e selada num frasco -ampola de vidro (tipo l) de cor ambar de 3 ml de capacidade.

= 18 =

Exemplo 11t Xarope

Substância activa Solução de sorbitol Glicerol

Benzoato de sódio Aromatizante de pêssego Água purificada

2,0000 g 0,0050 g i7.42.3i69 0,0125 ml

q.b.p. 5,0000 ml

A substância activa e dissolvida numa mistura ‘ de glicerol e da maior parte de água purificada, tí adicionada '

I depois uma solução aquosa de benzoato de sódio, â solução ante-í rior, seguida pela adição da solução de sorbitol e finalmente ; pela adição do aromatizante. 0 volume e completado com a agua purificada e bem misturado.

Exemplo 121 Supositórios mg/supositório

Substância activa (63 pm)* 250

Excipiente Witepsol gordo e duro (witepsol

H15 - Dynamit Nobel) 1770

2020

A substância activa ó utilizada na forma de um pó em que pelo menos 90% das partículas têm o diâmetro de 63 um ou menos.

Um quinto da quantidade de Witepsol H15 é fundida numa panela de vapor a 45° C no máximo. A substância activa á passada através de um tamis de 200 pm e adicionada com agi tação â base fundida, utilizando um dispositivo de silverson” adaptado com uma cabeça cortante até que seja alcançada uma dispersão regular. Mantendo a mistura a 45° C é adicionado à suspensão o restante Witepsol H15 e agitou-se para assegurar uma mistura homogénea. A suspensão inteira é passada através de um tamis de aço inoxidável de 250 pm e com agitação contínua é deixada a arrefecer até 40° C. λ temperatura entre 38° C a 4o° C, ó incorporada 2,02 g da mistura em moldes de plástico adequados de 2 ml. Os supositórios são deixados a arrefecer a temperatura ambiente.

Exemplo 13» óvulos mg/óvulo

Substância activa (63 pm) 250 Dextrose desidratada 380 Amido de batata 363 Estearato de magnésio 7

1000

Os ingredientes acima referidos sâo misturaI dos directamente e os óvulos sâo preparados por compressão di- ! recta da mistura resultante, í

Actividade antivírica

Os compostos dos Exemplos de 1 a 6 foram ensaiados para a actividade contra o HIV geralmente de acordo com o método descrito por Mitsuya et al , Proc, Nat, Acad, Sei,

USA Vol. 82, pp 7096-7100, Out. 19®5 β verificou-se possuirem actividade contra o HIV nas concentrações seguintes:

Exemplo Protecção (%) Concentrações ÇuM)

Exl	-	25
Ex4		25
Ex5	42%	100
Ex6	88%	6,4
DDC	99%	16

Exemplo

Ex2 36

Ex3 1,6

Biodisponibilidade do composto 2»,3*-didesoxicitidina e dos seus análogos após a administração oral nos ratos

Utilizando uma agulha intragástrica, foram administradas doses únicas de 25 mg/kg do composto DDC ou doses

I

equimolares dos compostos análogos de DDC em ratos machos sexu-j almente desenvolvidos Sprague Dawley.

Para os estudos de excreção unitária e fecal,' cada composto foi administrado a dois animais alojados separa- í damente em gaiolas metabólicas e a urina e as fezes foram separadas e recolhidas durante os intervalos de 0 a 24 horas, de ; 24 a 48 horas e de 48 a 7² horas após a dose. Foi colocada azi-; da de sódio no recipiente de recolha de urina para evitar-se o ! desenvolvimento das bactérias e deste modo a concentraçSo final após 24 horas de recolha da urina foi cerca de 0,02$. As fezes foram pesadas, homogeneizadas em 9 volumes (9 ml/g) de água desionizada e centrifugadas (12000 x G, 4 C, 30 minutos). As amostras dos sobrenadantes de homogeneizado fecal e das urinas foram filtradas (filtros de 0,22 pm) antes da análise por croma tografia líquida de elevada resolução (HPLC) do conteúdo em dr<> ga e metabolitos.

Para os estudos concomitantes dos níveis plasmáticos e no cérebro, cada composto foi administrado a dois animais. Os animais foram sacrificados por decapitação, um de cada par após 3θ minutos e o outro duas horas após a administra ção da droga. 0 sangue foi recolhido em copos heparinizados e foi preparado o plasma. As amostras de cada plasma foram ultrafiltradas (Amicon Centrifree Micropartition Systems”) antes da análise por HPLC. Os cérebros foram retirados, pesados, homogeneizados em dois volumes de água desionizada (2 ml/g) e centrifugados (l2 000 x 6 4° C, 30 minutos). Antes da análise por HPLC, foram filtrados (filtros 0,22 pm) os produtos sobrenadantes.

Foi utilizado um sistema HPLC de bomba dupla para analisar as amostras de urina, de fezes, de plasma e de cé rebro contendo o composto DDC e seus análogos e os seus metabolitos. 0 solvente para a bomba A foi ácido fosfórico 25 mM, tam ponado a pH de 7»² com hidróxido de amónio. 0 solvente para a bomba B foi acetonitrilo 60$ no solvente A. As amostras foram injectadas numa coluna Adsorbospher-fenilo” (4,6 x 250 mm, de enchimento de 5 micro-esferas) e eluídas a uma taxa de fluxo de = 21 =

ml/minuto utilizando no solvente B incrementos lineares de 0 ? a 15% durante 15 minutos e de 15 a 100% durante 21 minutos, com' 5 minutos de purga (l00% B) e 15 minutos de período de restauração entre as injecções, A absorvância do efluente da coluna foi monitorado a 273 nm e 254 nm. As concentrações dos compostos foram determinadas por comparação das áreas dos picos ade- ‘ quados com as curvas padrão obtidas a partir da análise de soluções aquosas de padrões verdadeiros. Os compostos foram identificados por comparação dos tempos de retenção e das razões das áreas dos picos a 273 nm e 254 nm com padrões verdadeiros. !

i

Resultados

Após ter sido administrado por via oral o com posto DDC (25 mg/kg) a dois ratos, foi observada uma limitada absorção gastrointestinal. Em setenta e duas horas foi excretada na urina uma média de 43,0% da dose não biotransformada. A excreção fecal do composto de partida e de 2*,3’-didesoxi-uridl na é responsável por uma média de 28,1% e de 1,9% da dose, respectivamente, Não foi identificado nenhum outro metabolito.

Depois da administração oral do composto do Exemplo 6, a dose foi completamente recolhida na urina na forma de DDC (a recuperação média foi de 105,1% da dose), que indica uma completa absorção e hidrólise do composto administrado. Nenhum composto do Exemplo 6 foi excretado na urina. Mais ainda, nenhum composto do Exemplo 6 compos tt>de DDC ou 2’,3’-didesoxi-uridina foi detectado nas fezes.

Os ratos administrados com o composto do Exem pio 4 excretaram na urina uma média de 23,0% da dose na forma de composto DDC e de 58,3% na forma de composto do Exemplo 5. Assim, se justificaram 81,3% da dose. Nenhum composto do Exemplo 4 não biotransformado foi excretado na urina e nas fezes não foi detectado nenhum composto do Exemplo 4, composto do Exemplo 5, composto de DDC ou de 2’,3’-didesoxi-uridina.

Foram obtidos resultados comparáveis depois de ser administrado aos ratos uma dose oral do composto do Exem pio 1. A excreção unitária média de DDC e do composto do Exem-

pio 2 foram responsáveis por 40,3% e 45,4% da dose, respectiva-i mente, para um total de 85,7% da dose. Nenhum composto de parti! da foi encontrado na urina e nenhum composto do Exemplo 1, com-: posto do Exemplo 2, DDC e 2*,3’-didesoxi-uridina foi detectado ί nas fezes.

Os resultados do estudo da biodisponibilidade metabólica sugerem que, nos ratos, a ligação 5'-ester é facil4 z mente hidrolisada enquanto a ligação N -amida e cindida mais lentamente. Os resultados sugerem ainda, que a biodisponibilidaj de oral do composto DDC á aumentada 2,5 vezes quando o compostoj é administrado na forma de um composto análogo de 5'-plvalato (o composto do exemplo 6). .

Foram determinados nos ratos os níveis do com posto de DDC e dos compostos análogos concomitantemente no pias ma e no cérebro, meia hora e duas horas após a intubação intragástrica de doses equivalentes a 25 mg do composto DDC, Após uma dose do composto do Exemplo 4, do composto do Exemplo 1 ou do composto do Exemplo 5, os níveis plasraáticos e no cérebro do composto DDC foram inferiores aos observados após a administração do composto DDC. Foram verificadas quantidades mais elevadas dos compostos análogos ainda contendo a substituição N^-ami da, tanto no plasma como no cérebro. As doses dos compostos do Exemplo 3 ou do Exemplo 6 (compostos análogos apenas com substi. tuiçSes 5’-éster) produziram níveis mais elevados de DDC no plasma e no cérebro meia hora após a administração da dose quan do comparados com os níveis verificados após uma dose do compos^ to de DDC. Contudo, duas horas após a administração da dose, as concentraçães de DDC no plasma e no cérebro foram inferiores às observadas após uma dose do composto DDC. Tanto no plasma cç> mo no cérebro em nenhum caso foi detectado qualquer composto análogo contendo a substituição 5'-éster.

Pelos resultados verificou-se novamente que a ligação 5’-éster é facilmente hidrolisada enquanto a substituição N^-amida é metabolicamente muito mais estável. Os compostos à

análogos com a ligação N -amida podem penetrar na barreira hema toencefálica mas após a penetração ocorrida são manifestamente

estáveis no cérebro e não produzem níveis significativos de DDC. Os dados dos níveis plasmáticos sugerem ser os compostos análogos com a substituição 5‘-éster simples mais rapidamente absorvidos e facilmente hidrolisados obtendo-se mais cedo apés a administração, as concentrações mais elevadas de DDC enquanto a absorção do composto DDC embora incompleta, pode ser mais prolon gada.

Tabela 1: Recuperação urinária e fecal das doses orais de DDC e

dos seus compostos análogos	5·-o-éster	e N4-amida
Composto				Composto	Percentagem da
Administrado	Rato	Amostra	detectado	dose excretada
DDC	1	Urina	0-2 4h	DDC	46,6
		Urina	24-72h	DDC	6,23
		Fezes	0-2 4h	DDC	12
				ddU*	1,1
		Fezes	24-72 h	nenhum
DDC	2	Urina	0-24 h	DDC	31,6
		Urina	24-72 h	DDC	1,5
		Fezes	0-24 h	DDC	32,2
				ddU*	2,6
		Fezes	24-72 h	nenhul
Ex. 4		Urina	0-24	DDC	20,4
				Ex5	57,3
		Urina	24-72 h	DDC	1
		Fezes	0-72 h	nenhum
Ex.4	6	Urina	0-24 h	DDC	22,7
				Ex.5	59,3
		Urina	24-72 h	DDC	1,8
		Fezes	0-72 h	nenhum
Ex.l	7	Urina	0-24 h	DDC	33,4
				Ex.2	52,5

= 24

Tabela 1 (Cont.)
Composto Adminis trado	Rato	Amostra	Composto detectado	Percentagem da dose excretada
		Urina 24-72 h	DDC	1,1
			Ex.2	4,2
		Fezes 0-72 h	nenhum
Ex.l	8	Urina 0-24 h	DDC	44,4
			Ex.2	30,6
		Urina 24-72 h	DDC	1,7
			Ex.2	3,5
		Fezes 0-72 h	nenhum
Ex.6	3	Urina 0-24 h	DDC	92,3
		Urina 24-72 h	DDC	8,5
		Fezes 0-72 h	nenhum
Ex. 6	4	Urina 0-24 h	DDC	102,3
		Urina 24-72 h	DDC	7,2
		Fezôs 0-72 h	nenhum

*ddU = 2’ ,3‘-didesoxi-uridina

F^l! (Φ (β s

η (β

Η d

Ο β

d

Ό •Η

Pt

k
Φ +> (0 'Φ 1 o 1 A
n o δ£
postos análo
DC e dos seus com	0
	h
φ	Φ
Ό	h
n	ce
tI Φ	0
►	β
M 'Z,	Φ

σι (β

Η

Φ φ σι φ ·

Η Κ ο Μ ε c

ο u


Φ
h
'Φ
O
	A	00
0	•	00	(A
β	X	*	et
	w	o	τ-l

ο «ti ο» (ti h

σι οο σ\

W * σι ο

A tΜ Λ pt σι

-μ φ

υ β

ο ο

«

(0

»

0

•ri

ri

to

6D

to

Sd

M

σι

H

A

+»

00

+»

cn

m

b-

A

•μ

σι

□I

SO

cn

rd

«

H

»

b-

Τ-Ϊ

r-!

σι

n

A

Ql

*

4t

*

Φ

et

Φ

·*

et

·*

φ

31

O

S>

O

>

H

O

04

O

V

φ ε

η (0

Η α

ο β

ο «0 θ’ (β β

φ ο

β ο

ο ο

a ε

φ

Η φ

(0 ο

Ό φ

η

Ό ft (β

Α * Η Η * α ό \Ο 00 ·> *

Α Α rd η κο νο

Μ · α \ο Η Η

et	t—	t-	-4·	σι	A	00	A	Pt	b-	\0
O\	tH	et	et	et	•s	et	*	*	k	et	·»
rH	rd	A	A	\o	Pt	σ\	-3	o	A	cn	A
				H		A		A

	A	Λ
A	o	A
et	et	et
o	σι	o

Λ	Λ	Λ
O	A	O
et	et	et
OÍ	o	OÍ

Λ	Λ	Λ
A	O	A
et	et	et
o	OÍ	o

Λ	Λ	Λ
O	A	o
et	et	et
OÍ	o	σι

χ ο

O	•o (ti -P		pf
-μ	(0	O	•
<0	•ri		X
o a E 0 o	Admin	β	M

rd α

•

Η

ΙΑ »

ses equivalentes a 25 mg DDC/kg stígios = entre 0,04 e 0.15

Claims

REIVINDICAÇÕES

- 1* Processo para a preparação de um composto com a fórmula (i) j

(I)

1 2 na qual R representa um grupo NH^ ou um grupo -NH-acilo e R representa um átomo de hidrogénio ou um grupo acilo com a condição de
2 9 9 1

a) quando R representar um átomo de hidrogénio, R não representa um grupo NH^ nem representa um grupo pivaloil-NH- e \ 1 2

b) quando R representar um grupo NH₂, R representa um grupo alcanoilo caracterizado por compreender

A) fazer-se a acilaçâo de 2',3’-didesoxicitidina (DDC) para a introdução dos grupos acilo adequados nas posições N4- e/ou 5»0- de DDC; ou

B) tratar-se um derivado N4,5’-0-diacilo de acordo com a presen te invenção para se efectuar a eliminação do grupo acilo de uma das posições N4- e/ou 5’-°- 2« Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por os grupos acilo representarem grupos alcanoilo • ^C3-5· = 27 =

- 3® - | i

Processo de acordo com a reivindicação 1, ca!

racterizado por os grupos acilo representarem grupos propionilo ou pivaloilo.

- 4* Processo de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado por se obterem os seguintes compostos:

ί

1. 2’,3’-didesoxi-N4,5’-0-dipropionilcitidinaj i

2. 2’,3*-didesoxi-N4-propionilcitidinaj
3. 2’,3’-didesoxi-5'-O-propionilcitidina;
4. 2’,3*-didesoxi-N4,5‘-0-dipivaloilcitidina;
5. 2»,3»-didesoxi-N4-pivaloilcitidinaj e
6. 2’,3*-didesoxi-5’-O-pivaloilcitidina.

- 55 Processo para a preparação de composições farmacêuticas caracterizado por se incorporar como substância activa um composto quando preparado de acordo com quaisquer das reivindicações anteriores, em combinação com pelo menos um excipiente farmacêutico para formar a composição farmacêutica referida.

A requerente declara que o primeiro pedido desta patente foi apresentado no Reino Unido em 29 de Maio de 1987, sob ο ns 8712691.

Lisboa, 27 de Maio de 1988 = 28 =