HUT53152A - Process for producing monoclonal antibody available for recognizing reg-proteins - Google Patents

Description

KÖZZÉTÉTELI PÉLDÁNY

z z

Skionogi Co.

SlCtt ^ttGYVÉD’ ln«> -“VADAIM; IRODA 1061 BUDAPEST, DALSZÍNHÁZ U. 10 TELEFON: 183-3733

D&jOgELŐÁLLÍTÁSÁRA

Ltd..,

(AQSM !_o$ ‘53152

Feltalálók :	CKAkOT 0 Ai r o shi ,	’IIYAGI
	IDE lliseo,	HY0G0
	YOSHILA l'obuo,	HYOGO
	T ÉRA OKA Kiró shi,	OSAKA,	J apán
A bej elε-ut όε	napja : 1989. 11.	15.
kisebbsége :	1988. 11. IS. / 63	- 2S9591 / J:

• · · cl bán reg fehérjének nevezünk/ felismerő monoklonc'lis antitestekkel ο

antitesteket termelő szolgáló élj árasokkal

Z .

AL· ·

v.

J- J_ J_

Lr 0 L· U álmiri y kenés fiyyelkc

-f- <-.TÍ - p — J -.-u.

figyelhető meg gr ez / a.70

T”

X*.· ss munkatársai /19SS/,. Ennek a .mek /reg gén/ kifejező hans hasnyálmirigy kezelés epen. Ennél ogva a reg az ezen gén .1 eg fehérje ről / felt;

' j. _o

V Vlezzük, ho, tJU szerepet játszik a sejtek szaporodásában cl hasnyál ziik, hogy a nel: és reg fehérjéknek azonos funkciókat kell ellátnio az emberi

Ον*·,ν

-jjCa. k- xA ·.· .Inirigy sziget-sejtekben, mint a patkány hasnyál·

SZÍ — nális antitestek, vagy fehérjék kimutatásához, azonosításéihoz,

J.

.£* • ·· · mennyiségi meghatározásához és valamint fehérjék biológiai tevékenységének a magyarázatához.

eijrivül az ilyen antitestek va;

sál >- ’nn aia.

nózisához és óhoz, amelyekben :ifej ezodé ε énei:

AZ

Π Ί n η «— 1J-T-, ci X . i n iJ<

szefoglalj u·· 'η · %- 4o uh . _U- - m _ U ·

A jeler.

sserinti ono’il onáli ε ess

e.

re j ét

s.icr fel.

egyik • reg

j.

Jci L· .i._v ereset λ2 egvi.;

S_1 v

c.

X ΙΟ C,

REG 17 ti monoklonális antitest, a —·. —Ί <*í

tt*? ·η * ·'. ·,ν	HREG 9 mo
A	jelen tál
lálnány	s z éri nt i
Az	egyik cl
dóma, a	REG 17 h
ma vagy	a HREG 9

hibriaoixs monokionáliε sutitest eket.

előállítása, £Z j eien

REG bl-i C.Ó· az alábbi lenes

eljárás reg	fehér j e menny	• z iseg:
eket foglalja	magába : egy	els
lagosan felis:	mer valamely	reg
ét tartalmazó	vizsgálandó

említett reg r·*

O rr fe olyan módon, hogy az fehérje ko ΐ o íj é l·: a r említett első antitesthez; egy második antit mely jlagosan felismeri a reg fehérjét, említett z

na.

említett konjugált második .második antitest kötő <* .

OCg z -i o ^!r O ra - c— aj amely e mennyi ^cm re ?

menny egyim λ r e, anyag ük antitest zerinti élj ár ás az “1 * Π “1 · J * előállítása • ·· · ··· • · · · · · ··· ·· ···· ·· /1.

fehérj éhez az említett említett antite sógének meghat ározása r r f -.

ír isivel az ^z ε o di 1: ant i t e s meghat ár οz ásóhoz

ÍZ Z «} j speseket egy

C? Ί említett

Ve cí . IS amely leu

Λ · ^z J erjSG ; az említett reg fehérj hOZZ dúsa olyan módon, ho Χίε, z reg fehérje j elzett iiácodi k antitest, el;· eg f.··’ , Z . z merj οτ, hozzáadása z

C- Q ésével itt leirt vagy e: ilit ett vésődik antitest ex C 44 J L· V. Oj ók az emlimonoklonális

O n/ • Λ C p «7 , - Ct-J enlitett reg mennyitalálmány emberi z

ét felismerni kénes tipusu monoklonális antitest szol ehérj e kimutatásában, azonosításában, mennyiségi meghatározásába más betegségek diagnóés /3/ eljárás szol amely a fentebb említett monoklonális antitestet meghat ár oz ás ár a,

AZ alábbiakban viden i smertetj valókká válnak azok utalunk a megfelelő

5-öt li br

Az

l.ábra

A 2.ábra a re o ex , REG 17-et z

es sz ámára, fehérj e z

^C<_>V ációs görbét mutatj

Z-U ábra p patkány •u a be.

mutatja be.

Az 5«ábra az emberi reá említett bázi ss mutatj a be.

.ábra az emberi reg mely gélé • · · · ·· · ♦·· • · · · • · ···· ·· ábrákat.

A jelen tatárgya és előnyei nyilvánszendvics-vizsgálatához_t amely REG testet alkalmaz, *» τ z · « z . z reg zemerre zuzios cDHS gén bázisszekvenciáját ását bemutató vázlatos munkamenet emberi

HREG ITl-et és

HREG

9-peroxiő.áz utatja be.

és a sz endvic s- viz s.;ólat óhoz konjugátumot alkalmaz, szolAz alábbiakban leírjuk a találmány előnyös kiviteli mó íjait.

A jelen találmány monoklonális antitesteit ionungénként re• · 9 · ·· · ···

- 6 azonImnungénként megfelelően kivont ée tisztított természetes re

Amint

CΠΙΊ31 fog ve abaűalmi 1 semmikénné '-^g en fi fi η *o ο* n y ] r sem kori fi ή ¹ - »·> «?

• l_w -V. 4J , s. speciális élj é

53-195727 fi fi fi

Z£± ésben leirt élj írásokra

Z · fi η herjen, pl _·>

z .

0 j.

eok neonba ét szabadalmi bejelenr* - z . fi i

------._:er ve.gy

Az ilyen reg fehérje’ ziós fehérjéiket alkalmazva olyan hibridámákat terhellek.

féle komplett adjuvánsban vagy nás egerek isn ételt ik entebb említett emulzióval, áli s,an, szubkután vagy intravénáson.

1guanin-foszforibozil-iranszferáz hiány /HGPRT / elő szülósejlekként való alkalmazáshoz, hogy fuzionálhassuk ezekét a fenti antitest-termelő sejtekkel abból a célból, hogy • · · · · ·· ·· · · · · · • ·· · ··· • · · · · · ··· ·« ···« ·· ··· így tehát a hibri dómákat az említett mielóma-sejtek és antitestréernelő lépsejtek fúziójával alkotják meg. A hibridómák /?CS/ adui sej ttényészté c'

DulbecCO c· Γ zz , vagyis a miéi • J · S ι Z · * sejtr.vzioi- natekonysa.

zic s szer, pl :-l alkalmazásával % kon31

A fűziónéit törzseket

c.

os eljárások bármelyikével, ae: ábrán imnunfluoresze éneióval, enzimmel bens vizsgálattal /ELISA/, immunhisztológiai dioimmunassayval /RIA/, ezáltal kiválasztva azokat a hibridóma amelyek kiválasztják a kívánt immunglobulint.»

Abból a célból, hogy megvizsgáljuk ezen hibridómák monoklonális tápláló rétegként

Szélesztjük, mog·· sejt jelentkezzék az egyes üregekben és az ilyen módon növekedett kiónokat ismét átvizsgáljuk. A monoklonális antitesteket vérül ennek az al-klónoismétlésével

Ezután abból a célból, hogy negálkössük

ε. jelen szerinti monoklonális antitesteket, a fentebb leirt módon kapott t

• · • · • · • · • · ·· • · ···· ·· ·· • · • ·· · · ·* ♦ · · ·· ·· ro /, vagy valamely állat testén belül / vagyis in vivő /. Az in vitro növesztésnél tenyésztő tápközeget készítünk olyan módon, hogy FCS-t adunk a fentebb említett szokásos :éliez, és az ebbei

XX J.

után monoklonális anti testeket kanunk a táokö

e._; fel ulússój óból men

Z ( · Π Π J · ísü illeti, a eltesz folyadékból monoklonális antitesteket kapun!

s.· lyea módon k:

sok, lelő kombinálásával tisztíthatjuk.

A jelen találmány szerinti RnG

REG 17 és REG monokioirmunk énként humán ψ—int er1 9 « λenerj e fúziós fehérjéjét alkalmazva. Amint ezek az antitestek reaktivitást mutatnak rett humán re.” fel írjével, mind az érett patkány reg fehérjével. A jelen találmány szerinti HREG El és HRnG 9 nonoklonáJ_ X tel· reaktivitást mutatnak az érett tel a nagyfokú homológiára a z

A P, s a patkány reg-fehérje között minden emlősben jelénvan, követkeszerinti monoklonális antitestek ké• ·· ·· ·· ·* ·····» ·· • ·· · ··· ··· • · · · · · ·

A REG 5, REG 17 és REG 30 liibri dómákat, amelyek a jelen ta.tit esteket t emeli k, ” REG 17 HybriTorna ^í:-nal nyeri Col

02.ck ilyen né· ven lettek ál va a Bement ation Research Inst tutc Agoncy Por

Indusírial

Iligas’ii 1 cnomc, psukuba-shi , Ibara.ln.-ken, Janón / ?ER1 p-21 letéti szóin on 198C. november S-án ’v dóm. ”-nak nevezzük, és ezek ilyen néven lettek deponálva a ko· ábban említett Bementation Research Institute Agency fór Indust rtál Science bíBP-2591 illetve 2592 letéti szánon

J.

A reg fehérje immunológiai meghatározásához alkalmas jelen találmány szerinti

Alis anaz mázzák, és azokat a RIA technikákat, amelyek azokat kétféle antitestet

Azok között az anyagok kozott, amelyeket az antitest imobitaláljak az antigén antitest reakcióhoz az imunassaynál általánosan alkalmazott , ·>

-f-X reg fehérjét felismerő monoklonális antitesteket ezekre a támasztóanyagokra abszorbeáljuk. Általában az antitestet ezeknek a tá kére olyan

Ο.1-ti karbonát oldatban tt egy z · Ο Ί '-'cl só Heten

Az adozorbeált antitestet hordozó lacsong hőmórs üzleten tároljuk, ha szerinti antitesteket alan’n» fragmentumokat is. A bisztitást olyan módon végezhetjük el, hogy az antitesteket tártál aentúrnőt kapjunk, etil-aminnal redukáljuk, részletesen leirja a Journal of meny, és azonos eljárást alkalmazhatunk a jelen találmánnyal kapcsolatban is.

Az antitestet jelezhetjük enzimekkel, pl. alkálikus foszfatázzál, stb.

• · · •·* ♦ ·· ί

• ·· • · • · · • ·

Az antitestet az enzimmel az alábbi módon konjugálhatjuk.

áz esetében pl., amint ezt a későbbi példákban jelezzük, az enzimek cukorláncaiban levő hidroxilesöpörtokát oxidáljuk, ct ,z antitest a:íino-csöpörtjaihoz.

bonsav-ií-szukcinini d-észt er, 5-maisírni do-hexr~>sav-IT-szukcinimi d4,4 vén.

Ga>

enzimmel z

ne Γ'

u.· C-.

ismert eljárd sok lyeket az slkalmazo'tt kereszt-kötő ágens tulajdonságai alapj

C-.J- C-Jválasztan': ki agyóbb z z ··» ·ν»π O

X /_! ii ha a fentebb említett enzimmel jelzett antitesteket affinitás kr ómat ogr áfi ával vág:·

Ov sötét kö· zégben tároljuk felhasználásig ismerő

Cv.

fajlagosan felismeri, reakciót végezve hajthatjuk végre.

osztályozható / i mobilizáljuk, és ehhez adjuk a meghatározandó, re.

— '-'vu jét tét fel.

a reg-fehérje mennyiségét

A fentebb említett

a kötött harmadik antitest meny utólag vég ett jelzéssel.

eljáráson ki vili alhalnas a me.vhatárosáéi techni 1C3, 1S mobilizálunk egy, a reg fehérjére fajlagos monoklonális antitesét tartalmazó, meghatárózandó oldali £

a.

reg fehérjét az antitesthez kötjük.

jelzővel jelzett násodil nonokloná reg fehérjéhez kö· tődni. így a reg fehérjét a fentebb említett lásodik monoklonális leírjuk a jelen találmányt_t ezek a példák azonban csak illuszt rációként szolgálna talmi korét.

1. példa

Az immunogén előállítása

Humán ^—interferonnal fuzionált érett patkány reg-fehérje kifej ezodése.

, Ltd.tői /?, tlii-1, tlir-1, leuBő, lacYl, tonA21, supB44·,' z z ar οεο szerint végezzük /Cold Sprin

A DNS fragzaentunokat

t or z s	a CŐOO
λ/.	A reko:
szakkc	inyvben
Harbor	: La bori

c.

nal izolálja' ciós

BAP-vel /0,1 egység/pnól/ sékleten 2 z Z or an át. A nagyobbik fragnentuziot izoláljuk, όε ezt azután lióljuk az alább jelzett oligonukleotid adapterrel é

Trp pAT

Sáli

Az il;

ez a vekt

’ Asp	11 e	Glu	Gly
! GAC'	ATC	GAA	GGT
l· 1 u*	TAG	OTT	GCA
.yen ;	lódon ka	pott
>r az	uA ’--C~	pter	bel;

Ara végzett előε z e kv énei ával.

• ·· ·· ♦ · · 9 · * · · • ·· 4 ··« ··· ··* ·· * *

- 14 ♦ ·· fentebb említett kifejező vektort Pstl restrikciós enzim1121 , majd Kleno'v fragnentunnál ke· zelj k /0,5 ász tízhez/ °C li

Z Λ · , « Zz mérsékletén 1 ornn át

Xa tor feli

s.ier ő

Xbal-el

Az ilvci z

eme

4- p 4- 4u t- u L· vekt orba epy, a primer·

Z ff | η erei-τ oló D17S

-4C. r v

X :entumOü i az

Z I · erc-ιτ z

'*·>?

j át kódoló e?oli z · '21 ít indukálunk olyan no aon, '1

Z , z ot e s dőlő c-jy szálú uLS

D1TS fragmentumot, •j · z z elj ítraesa sál fnucl.

kus oli^oniklc-oti '1 /lásd a 3.

szálú

P7,állítunk elő téses áoic.s Aes.

alkalmazva

Q >

•· • · •·· ·· ···

- - 15 or Industrial Science and

T e chno1oyy-nál november

9-én BERI.I BP-2142 letéti

Λ· f~\ rr >

te «· ··· • · •· ken, Japán / 1988.

ómon a Buclanesti izei * _n z

ZOG.HS .yésztj ’ scherichia coli al t °C h :i választ juk.

űröket lé ó amelye

η. ι ez nn /c/ Kifej

C“! ú ét te· ^*7

J> I leien

LB tévköze,gén, amely

A ill -d tét ezzül

W'-i /1,#·!

is no r

'.r

Z _cteir.·

V kezelésűé megkapj ul:

jul és hús tartalmaz, hl a

37°C m:

.ZZ / J oran at .ősitott K? t 'pközc.-’ben ele •v

4°C hőmé ékleten 1 z z éren elüli vet j álz P. o ^Z u

Gv csapa:.ot SDS-gél

A fehérj e ét /zárványtestek/

Blue R festést és anti-humány' interferon-antitestet alkalmazva.

ezáltal tiszfásva cél-fehérje mibenlétét reg-fehérje /c/ Izolálás tisztító.

ént ebb eulitett es tételt z I z

ο.τ o £·

L-.

Lássál ζ

Of endáljuk / 0,1 •ól/l zni az

Cl, metsor, 10 mól b ζ

θ'. C' ráncia szét z

h’7.

uf utó vetj‘^; alá, ·- 1 , ezáltal

Ί <00 -o.

loklorid, 0,1 nól/1 trioz.	’-ΎΌ .xZ X
?0 mól/1 altiotróitól, pH	r-τ í— 1 , 7
icgy a végső koncentráció 2	;ac
lérj e-koncentráció 1,5 rag/1	le

/.

z »θη o c?

tartalmast ⁿ2io· oki őri cl, fórban/ ho

Γ» hagyjuk, ζ

Zi c* zuk /ezt z

^r-: ff P.

,2 maól/1 z

OC κ_· c· telj es fehérjét

4··? */

Saulin

7Γ -r ’F o r? xJ s L· z-, ZJ

Ό θ ~ΰ rii nonogem c ént rí fu ál .nádi ‘DIA, 10 imól/1 IA

1/1 guani din-Ili dr okloi ’ósóre hígítjuk a keletkezett

1?? fv?

hígított teζ

Τ. <τ<

t ováb azonosak, oldat ot 1 cső: na dohot centri tö-neg/ lliilt ιι;

xeőszek (*» ·>

ϊ θ:

OUfZz Z J oron ot állni tugálással ö ár. ”C'^; • · • · · · • · · · · · olyan oldatot, amely llapotban.

.2 ..Λ '41-L _1 ..· .1 υ

L· feaírj teljessé válása .U m , g* o U < AJ neve:

'.ózzuk c

.... · aj «-· U.

r< π rz ’JT— ι rés t ét tartalmasé frakciót ossse

V ‘-'d ·> · f irarcic

Jtiiv.lt tZf'

Ό.

centrifavízzel.

minVt iak

^.következtet vet4- ,Ώ — — L· v L· v z

-2 O trisz. 1-101-1 el / gH 7 li /4.óot centrifugáljuk ás. a

->

.1:, A kiter-j V fogjuk vczm.

.. Jil b cú!

•r /0,0$ mól/1 trisz ττΛΙ ''^f

1 , d _zv % glicerin /,

CÍ keveréket

100°C hőmérsékleten 5 percig kezelJ J-lí· ék telj es /13,8 x 15,0 cm,

Elektroforézis után a 17 kilodaltonos fehérje helyét a vezető esik festéséből meghatározzuk, és a 17 kilodaltonos fehérjét megmaradó gélből kinyerjük Max-Yield fehérje-kinyerő egységgel • · le:· lezz ük SDS-PAGE-val ée az yület ainosavös szót ét el étΟ Τ’ Cv Zj

X'

-Ele-Él

Él ccní

Hlodaltoaos fehérje tártál • · 9 · · · * • · · ··· ··« • · · · · ·

9 9 99 9 tt ·9 ét ki eredné

nyék	azt i	gazolják, ho+y a ve-
rj e.	,« Ί Λ 1 !	id. 1 odalt onos felérj e
.tbr.n	: nt:. j	jak he. Ezen kívül
vize;	jélata	feltárja, hogy az

áléi.

7-1

LiCJl

Γ f Z Ο?-7Θ7_Ο1 a-llü-A ιερ.

ezu·

--Ogy^a t c ; feli' je teljee aninosavgyökös ne.rvem ·

TÁBLÁZAT AmlITOSAV-ÖSSZETÉTEL

íinosav	Az aminosavak Számított	száma Talált
Asp	2 0	19,3
Gin	13	14,5
	5	'5,1
Ser	21	19,0
Pro	4	> > í
Gly	10	14,9
Alá	11	11,0
Cys/2	6	4,6
Val	7	6,9
1'ίίΘ ν'	2	2,1
11 e	4	4,0
Leu	12	11,8
Tyr	9	8,6
Phe	6	6 ,1
Lvs	7	8,0
V
Eis	3	4,-1
Trp	6	5,2
Ar-	6	5,9

összesen

152 /1/ Immunizálás

8-10 hetes BALB/c

Λ» nostény egerek.

fentebb említett A valamint a D” minta, vagyis a λ z els o immunizálást a patkány re fehérj e ta/ és emuiziáj ' két csoportba vógrc, fehérjében /1.csoport/ vagy 50Λ reg.

gokkal /34Xg az 1.csoportnál, 14 KC a 2.csoportnál/ PCA-val számított 41.

nait az immunizált állatokban ELISA-val határozzuk meg.

Sloször pat reg-fehérje • · · · · · • · · · • · · · • ···

Ezut • ·· • · · • · ·· · · alil :votegy órán énként 0,05 ml-t adunk a és 37°C hő· mérsékleten végzett 1 ó z z

T-G'-p

Vectostain ABC

T’--*/’’ ú-.'m x-·-· l-'-j zután kromo'.’ó ént 2 z a· 1 “

A fitért azonos énnel rí e:

G- X - i.C dclkezne ·»_ Z li.. .

tatnak /3/ Hibridónál: előállítása je in te 0,2 ni PBS-ben oldott liz át urnánál •ϊ ej er

X k- j i_' ,ioz ; ezek olyan szérummal nanpal a ren

Ju

34Ag-os dózisának intraperitone?.lis ^zn ' ^z zalas után sej tfűziót sejtfúzióhoz allényegében Gál és Llilstein [liethods Enzymol. 73.

/19C1/J azonos. Először egér _ú el óma séj1640 tápközegszérűn, 0 ,15 mg/ml nát rium-piruvát,

0,15 mg/ml oxálecetsav és

osszekeveríink 2

QO ,'-'·' immunizált egerekből való lépsej ttel, máj d os polietilén-glikol oldatot adunk cseppénként az üledéket tarpercen évértetj ül:

t~T tót adun'

Ί R Γ ·

- c.' — további 2 ul t''. c· e e^et adunk hozzá 1 nercen belül ά<

OS

Z ₅ nn.

ege csenne ént 2 percen belül kev “S

Ízben, z z ve ml me , r τ óva t ípkozeget a au l-X uVCa éden a nevei ^z t et centrifu :ál.j u ül c dó :et el üledéke

-ben /70 í' 'h ιο / szuszpendálj π λ :

X

10^-7

10“^?mól/l timidin, ál ecet ?·- f ]

r.-oz·. egye • 10 ^mol/1 xiLí ES , ml inaπaminosavak kevert ol _ a.¹ jeivel voltak fedve rí C hőmérsékletén

1.

.'.v# Λ z

es fentebb emlitett ε ej tszu e z penzi ót szét

0,9?

kevert

95>* vágj- több légnedvességnél 95u

Ov levegőfelót miniegy minden harmadik napon friss HAT tápközeggel kicserélve.

·· • · ·

2. fejezetben leírtul:· Az • · ·· • · • · • · · · • · ··V · ··

Hintegy ' x -.. ' x ~ L· ri3 b hérje antitest termelését, átvizsgálva erre a célra _wZ hajtjuk végre, amint est ebben a meghatározásban

G.

li satummal, é ’Ί választj al faj 1agosan raagáló et termelnek.

t ár olása·

Ίο· in o említett három vonal

Z J ·, I Z at a mar a . r?

Λ—ι eloszl tjük 55 reges

1eme z eken

3t ml t általi nos íz antióban ie,·.

aatározzuk ugyanolyan nódon, unt

Gfenti reg-fehérje

Túl testet .iákat 50% borjú lis

0,5 tel . z

V C.t t G·.

z .'Z c·

-l· u

ése ut?

szérumot és /6/ Aszcitesz

Először REG 5, ί rv* X V/uszpenziót fagyasztjuk

REG 17 és

RuG 30 hibridómasejtek PBS-ben levő f-, » — dí 4 * * · · · · · · ·*· ·« 44«· «· aszu.

cent:iíalikvotokra oszti -.n <J λ -ΊΤ'η r- -·Τ?π T7 Xfi. -UJ _), J. í 3b

-A Jj JT és aló n J- Ó7 <* .. ..X

1-i.Lj d. kS-A. “ \^ral t Z » f ^J' - '-· <> r~ ry ! r ·-η z^—· n ry w — t-1 ^L__ J.x_ . · Λ ZJ ε/Zyned Laborét őri es, mc./ ί n _Cix .kid'.* J_ | ™ t- ι*

2a/t/-ne

03Z/3/ Az antitestek tisztító

A REG 5-öt é észlettel /BioRad Laboratories, Inc./ éi tartoző előirt nunkarrenet szerint. Z

REG 17-et f’élszTréssel tisztit9,4 /5/ Peroxidáz

Z'G 17 t eme,-zer oxi ónzett konjug ót un át

Nakané és nun

c.

cd

T xx · és Kavaoi A.:

Elő s· szőr 0,2 ni 0,1 nól/literes peroxidáz szobaliő át dializáljuk 1 nmől/1 nátrium- ecet át

4,4/ sz ezután a dializátunot pH 9,5-re állítjuk be 0,2 nől/1 nátriun-karbonáttal.

• ·

il 0,01 mól/literes

L·· • ·· • · · · · · · ♦ * · · * · · · · ·· · ·

Ύ-» X ^JHZ υ adun?

hoz

i.-V z .

Γ.τ ke

Ezobahfné = éljük ellen, .10• _1 y · '·- j konjugátumot megkapjuk.

/10/ A reg

4- X z

zsa

Ál « / oó alhalmaz\ *, m. -Ί kxj’JT oldat alikvotjait 'ró··:?

e —es

0,1 sókleten, és 0,3 zil 0 a lemezt 1

Z . - Z Z J

s.n sasban ot ,l>á-os órán át 37°C hóm

J-X és a keveréket állni

T'· z « tel Cl ósa után é: 20113’ ep-fehérje 0,05 ml-es,1 •J z

ζϊΐ

Aj.

reagálni }.

lér só Életen azután a len /·* zz peron!d / végső 'X

4j autó őrt o· cÍiamn

0,03 zza, <r.

nerc en /4érsekiét en.

reakciót ?'· hozzáadásával leállitj nm-nél

A re--fehérje

Ό.

,0/ z

c. c >1 / alikvotjait adjuk

0,1 ml-es alikvotjainak kimutatási érzékenysége a jelen eljárásban ábrát/

3./ Anti-Iglí antitestet alkalmazva

A burkolást REG 5-tel, a kazeinnel végzett blokkolást és a j _ z J.

el, mint a fenti A. fejezetben, ezután REG 17 oldat re, Z * Z J zeheraec t ugyanνΧη ugX végezz aduul őzzé, és reagáltatunk 37°C

T?rm ) ) 4- O •J új ti L· ·. áj. _ d mnt ozzá előirt munkamenet szerint, i ezt követő mu j elem /11/ A reg-fehérje

WesternU' z z * C’O kamenetet eg· :· co

2,5 ng/üreg kimutatása re^- < r--*· /1··

7/ec brit/ fehérj e végre

X' ása.

Eschericliia coli

-L '>

alhalmazva s z ini:énz ődést kd-s elvnél. Ezek a helyek megegyeznek azokkal énei illetve o— lyan csikót is figyelünk meg a ki s molekulátcmegü oldalon, a· ié ly reagálni kénes és a fehérje szelevenciaelemzése azt igazolja, terméke humán hasnyálmirigy reg-felmérj ék kimutatása.

SDS-EAGE-nek vetünk alá, és Western foltképzést hajtunk végre az

- 27 ··«·,·· · , • ·· · ··* ··« » ♦ « · « ♦ · ··· ·· ···· «* ·« feliérj éknek megfelelő nyilvánvaló csíkok válnak láthatóvá rEG 5 és REG 30 monoklonális ant i t e st ekkel.

A fentebb említett antitesttel ki mutatott feh érje jelenlétét megfigyelj li. ez

Z J Z η r- -> 77/12/ Reg' 'v egyéb szövetekben.

Romái

-L pC* b nyok /Lenis snyeiy k_‘‘ más szöveteit 1 mmól/1 x egyes

4,

4/ fólion tekaoott lizátumokat 100 él 15 a felülúszót elkül szob

PBS-ben levő 2>a SJS-t adun (Λώ mérsékleten tartjuk. Ezután ez ifugáijuk 1?

percen át 10000 ól ái e a ο 1 tz r· t a keveréket z fi er

OC órán

Λ-l· szolubilizált felülúszó Ima és szolubilizált rnenb:

e tartalmát

Cl oncentrációj át határózzuk meg a hasny álmi ri gybői

J.

SDS-szolubili zált

J?ckeiában.

standard rekombináns reg-feO' <4tartalmaz gramm nedves szövetenként. Reg-fehérjét mutatunk ki higgyél összehasonlítva • <· ·· ···· ·· · · · · ·· s » ·· · ······ • ♦ · · · · · ··· ·· ···· ····

Plazmidok

A pAL.3 2 /shuttle/ vektort [Proc.

Háti

61-55951

Z Z .

oznn 3 a· z

ΡΞΙ

Research ól 313.

letéti számon v sze—

Ζ» rvektorként.

voktor S

61, ely ÁR01 , 2 xm őri-1 és Leu2-t 'i) fi 9 í ’-V L- »r‘ nmly ^ΛΡ

T> ι

COl u 0 σ· áll, le le

-C*.

,7 kb-s z - j zr oleezιj

o.’.ot őrt

2* df ej ez

Z* ·> 1 o ve.nor

Piotec (J

Λ» va:

r> a/-.

J · ‘J-L - a/ , cDES —1 Z «η Z franszi ormalas

A tz vége

Himura társai leiz tartalmazó Surkholder-féle nini iái

O ό» .-! t-Ι elekt óljuk.

A savas foszfátáz t /21105/ cl tz FF en·· észt o

Pi/ ebályózhatjuk [The h_30 « z

C Γ’ Ο >_. cJou nal

1, 675-600 /1582/J

Előszói do” tényé

30^vC hőmérsékleten 2 napon át Pi/+/ hisztiül .Ima z c /20jtg/ml/ táp no Zj e^b θζι ·

Ezután ebből a tenyészetből 20 nl-t átPi/-/ tápkezegviszünk 10

CÜ

X4humán reg-fenorjst mutatunk ki.

n*v» -f~ _ u ha~yom'fkolecular fold S pring

a. e'.v /“X *F

-/_/ · iXLU.ic.

1-T - f 1 5 ¹ -- Ki-; b_d LU mentire, ΐΉτ/.Ίοτιταη : uA-il .e*.

Z · Z, f ·, ,

-jaban / ezemeü vei _uort /

J.

első fél , IQcnow-fragmentumon!

kezelj

EcoRI-gyed.

J -íi fragment >_J_ nlazni dót

Sacl-gyel emésztjük, csóiéval ligáljuk, majd Xbal-gyel emésztjük, ilyen módo·· •M i enj.

humán rcr-nek nevezünk, Xhol-gyel és HincII-vel emésztjük, és az igy kapott ki-· ·.

A fenti munkamenetben mindegyik restrikciós enzimet 3 egy sóg/M g DnS koncentrációban alkalmazzuk, és 1 órán át 37°C hó• · ·

A fentebb leírtak szerint humán reg cDNS-hez alkotott 1 fejező vektort E.coli K-12 CőOO-ba transzformáljuk, az ampicillii^rezisztens telepeket kiválasztjuk,és nagy mennyiségű plazmid DZ’S-t preparálunk ezeket a rekombináns törzseket alkalmazva.

Azokat a rekombináns plazmidókat, amelyek E.coliban sok ezorozódtak,

A rekombinánsokat Pi/+/ tápközegben növesztjük 2 napon ét, :ia. j d Pi/-/ tápmözegbe vissük át, hogy a reg-fehérje termelését indukáljak. A fenti munkamenetben a fentebb említett élesztőt 30°C hőmérsékleten tenyésztjük élénk kevertetés mellett mind a

Pi/+/, mind a Pi/-/ tápközegben.

és 5. napon a tenyészfolyadékból mintát veszünk és a sejteke centrifugálissal ebből eltávolítjuk.

Az igy kapott tenyészfolyadékot mintegy századára koncent ráljuk Centricon-10-zel /Amicon/ és nitrogén gáz átvezetésével.

tenyészfolyadéknak felelnek meg/ 16%-os SDS-PAGE-nek vetjük alá fPEBS Lett. 58, 254-258 /1375/ ; Natúré /London/ 227, 680 /1970/? és az igy létrejövő mintákat Coonassie Brilliant Blue R -rel festve elemezzük.

Ez az elemzés igazolja a humán reg-fehérje kiválasztott ter melését a gazdasejtek révén. A kimutatott fehérje elsősorban regfehérje, kimutatható azonban kis mennyiségű szennyező fehérje is

- 32 Humán reg-fehérje immunológiai kimutatása

A fentebb enlitett tenyészfolyadékot mintegy századára konA koncentrált tenyészfolyadékot 16%-os SDS-PAGB-nek vetjük fj és az igy létrejövő mintákat Western-foltképzéssel elemezVirol, 10, 211 /1972/J ,a fentebb említett REG 5 vagy ális antitesteket alkalmazva ; ilyen módon egy lí kilodaltonos mázzuk monoklonális antitestek előállításában..

ezáltal a végső elektromos vezetőképességet 0,3 nmho-ra állítjuk be. Ehhez az oldathoz 100 ml S-Sepharose-t £gyors áramlású /fást flow”/ tipusj adunk, amelyet előzőleg 5 mmól/1 nátriun-acetát pufferral /pH 3,4; est a továbbiakban ”A” pufférnék nevezzük/ .

egyensúlyoztunk ki, és a keveréket gyengéden kevertetjük 16 órán át 4°C hőmérsékleten. Ezt az S-Sepharose-t az abszorbeált ”A^K pufferral mossuk, amely 0,3 mól/1 nátrium-kloridót is tartalEzután azt a reg-fehérje funkciót amely SDS-PAGE-n /15;5-os gél/ mintegy 16 000 mól e leül a töm eget mutat, összegyűjtjük és ”A” át 4°C hőmérsékleten. Ezt pufferral szemben dializáljuk 15 órán leiegyensúlyozott S-Sepharose oszlopra /0,7 x 25 cm/ tápláljuk, najd az oszlopot 0,3 mól/1 nátrium-lel őri dót is tartalmazó ”A” puf ferral mossuk.

- 33 • ·« · ♦· · ··« • · · · · ···· ·· ·· a 0,44 mól/1 nátrium-klorid koncentrációnál kapjuk meg, ez az

SDS-PAGE-n /15%-os gél/ egységes összetételt mutat. Anicon YLI-10 tisztított

A fentebb leírt eljárással kapott, tisztított reg-fehérje molekulatömege SDS-PAGE-vel meghatározva mintegy 16000. Ez az ér tél: jól egyezik a 16275 elméleti értékkel, amelyet a cDITS szek véneiéből kikövetkeztetett aminosavszekvenciából számolunk ki. A reg- fehérje amino-terminálisa következésképpen az 5. ábrában levő cDITS szekvenciaszerinti 22. glutamingyöknek felel meg.

/b/ Aminosav-összetétel

A reg-fehérjét HPLC-vel sómentesitjük /Aquapore RP-300 oszlop, Brownlee/, majd 24 órán át hidrölizáljuk 110°C hőmérsékleten 4 mól/1 metánszulfonsawal, amely 0,2% 3-/2-amino-etil/-inr· dőlt is tartalmaz. Az aminosavelemzést Hitachi L’odel 835 aminosav elemzővel végezzük.

Amint a 2. táblázatban bemutatjuk, a reg-fehérje aminosavösszetétele jól egyezik az elméleti értékkel, /c/ Amino-terminális szekvencia

Amikor a reg-fehérje amino-terminális szekvenciáját elemzésnek vetjük alá Applied Biosystens 477A Protein Sequencer be*

rendezést ezt követő amiát - arai no pe pt i dáz z al kezelj ük, módon elemezzük. Az enzimmel kezelt reg-fehérje amino-terniná lisnál levő, ilyen módon meghatározott 29 aminosavat a t átír rr <·- *!

kővetkező :;e hon amely az 5.

ábrában bemutatott szekvencia 22. helyzeténél levő vág;

r eg- fehérj ében az ami no-terminálisnál a gyök glutaminsav, amely a humán szekvencia 23

2. TÁBLÁZAT t

Aminosav

Az aminoorvak száma

Számolt

Talált

Asp	17,1	17
Tlrr	6,9	7
Ser	15,7	X7
Glu	14,ε	14
Pro	< * o , V	6
Gly	10,2	10
Alá	8,0	8
l/2Cys	5,5	6
Val	9,9	10
I.Iet	1,0	1
Ile	3,9	4
Leu	θ,Ι	8
Tyr	7,1	7
Phe	7,0	7
Lys	9,1	9
His	2,2	2
Arg	4,8	5
Trp	5,8	6

összesen

144 • · *·· ·· ···* ·· ·· ~ 36 -

TÁBLÁZAT
Elbontási	A reg-fehérje	Kinyerés
lépés	aminosav gyöke	/%/
1	/Gin/*1
2	Glu	17,3
3	Alá	18,1
4	Qln	20,6
5	Thr	11,9
6	Glu	14,9
7	Leu	16,8
8	Pro	15,2
9	Gin	14,7
10	Alá	14,2
11	Arg	7,9
12	Ile	' 9,8
13 14	S ©I* f) /Cys/*2	A J í -
15	Pro	7,5
16	Glu	5,7
17	Gly	8,6
18	Thr	12,2
19	Asn	5,9
20	Alá	6,8
21	T j r	5,6
22	Arg	3,5
23	Ser	22,0
24	/ih/*s	4,5
25
26	Tyr	4,8
27	Tyr	6,4
28	Phe	4,4
29	Asn	4,1
30	Glu	2,7

: Nem azonosított gyök. A gyököt a piroglutanát-aminopeptidázzal végzett kezelés eredményeiből glutaminnak következtetjük.

•X 2 : Nem azonosított gyök. A gyököt a cDITS szekvencia alapján Cys -nek következtetjük.

i oállité· ·· · · * ·♦ • · · • · · · « • · · e · · · • · ·

9··· ·« ·· t • · /1/ Irrzunizálás

AZ és met es z*

1Ί •'Ü Q

3l ározásáho z alkalmazott

-->1 **

Első η Z .1 t kenzett

M g fel

T í

szol· fentebb leirt munkanemetekkel εί 1:1 az én?

emulzióként, érje/egér ν^Λ

0^3- os /2

Rreund-féle nannal a második •a <n4· ti u íiS jait

0,1 fj.

•·;λ b ók el

-I ** elő.

z

AA

C Zj b szubkutá adagokkal l-ó e~L emulzió

-1· negyedik immunizálás : Ezeket

J.

55, immunizált állαüregenként 30 ng fehérje menjen a beburkolás, ezután az

0,3 rü-es alilevőtjai zdjuk hogy a blokkolás hatékonyan f r f 'a c a lemezt egy skonyan végbe egyes üregekhez l>5-os BSA/PBS és a lemezt 1 órán át inkubáljuk, menj en végbe «

« · ·

Ezután az elemzésre váró oldat 0,05 ml-ez ali e-res Krémekhez, z

o. e· • · · • · · • · • · · · · · votjai • · · ·· t adjuk az végzett reakció határozást Vectastain ABC

Kit készlettel /egér

Ij^ észlet, Vector Laboratories, Inc./ a 1

I -* -i ** · ^z tozo előírás oldd ét alkalmazzuk kromo..-;

z -1 c

Ϊ1 ál LiPP-22 Coro:

c -ereket fehérje antitest titert nutatr /3/ A hibridámák

1.

után iJC élik immunizálás

6ε intraneritoneálisan injektáljuk. Az nappal sejtés Hilstein eljárása szerint végezzük £11 tenyésztünk módosított RPLÍI 1540 tápközegben / 90% RP1.II 1β40,

10% borjúembrió szérum, 0,15 ng/ml nátrium-piruvát, 0,15 mg/ml cl

3,93

Ezután 1 adunk hozzá cseppenként 1 percen belül, ezután l_y5 percen át ketápközeget adunk hozzá 2 perc alatt, majd további 2 ml azonos tápközeget • · · · · A · • · · · A · · ·*· ·· ···· ·· f

··*

- 39 gyengéden 12 ml azonos tápközeget adunk hozzá, majd üledéket kép1,9.10-^61/1 tini din, 0,15 mg/ml nátrium-piruvát,

0,15 mg/ml ónálecetsav, aminosavak kevert oldata inzulin, 2,5.10' m ⁴ Ί/1

-mer ka p t o- e t a/, í;

a lépsejt-koncEntrációt 1,5.10° c* ebbel a sejtszuszpenzióból 0,1 ml-es alikvotokat szétosztunk egy •lőmér s éki et en 9 5/í

Ον ezt követően a tá szerint fries HAT tápközeggel helyettesitjük.

2. Iá sáriét nappal a negyedik inmunizálás után ugyanúgy, mint az 1. Iá sáriétben, és az ötödik immunizálás után 3 nappal sejtfúziót végzünk. Az alkalmazott egér mielóma sejtvonal a P3X63-Ag 8.653 /6,27 . 10? sejt/, ós ezep két a mielóma sejteket fuzionáljuk 2,65 · 10 egér lépsejttel ugyanazzal az élj árassal,mint az 1. kísérletben A fúziós sejt/ml koncentrációban, és ezt a szuszpenziót 96 üreges kezelő⁶ lemezeken osztjuk szét, üregenként 0,1 ral-es ali levőt okát.

·· « • · • * · ♦ ··» »· ··

A HAT tápközeg hozzáadására és helyettesítésére szolgáló munkámenetek, valamint a további tenyésztési körülmények azonosak az

1. kísérletben leírtakkal.

A növekedésnek mintegy 2. hete után a humán reg-fehérje terti 2. fejezetben leírtuk. Kiválasztja!

areagáló· antitestek stabil termelését mutatják.

/5/ A liibridónak klónozása és fagyasztva tárolása

4-4 lemzéssel klónozzuk. A sejteket RPLZI 1640 tápközegben szuszpendúljuk és 9G üreges lemezen osztjuk szét olyan módon, hogy 0,3 mán reg-fehérje antitestének literét a tápközeg a fenti 4. fejezetben, ez a HREG 111, illetve ISEG 3 hibridóma kiónok szelek.11 térjú szérumot és 10% /6/ Aszcitesz

Először hibridóma sejtek PBS-szuszpenziójából / 2.10^-5.10^ sejt/ml /0,5 nl-es adagokat vezetünk be intraperitoneálisan oit lyan egerekbe, amelyeket előzőleg 7-10 nappal indukálunk 0,5 ml

Pristan intraperitoneális injekciójával, majd mintegy 1 hét múlva «

♦ 4 · · · • · · · 4 · · • 4 · · •··· ·· *·

I clyadékot alikvotokra osztjuk és .fagyasztó-tárolótérbe helyezzük. A kapott antitest mennyisége 1 ml aszcitesz folyadékra száA hibridóma sejtek által termelt monoklonális antitestek immunglobulin osztályait és alosztályait ELISA-val határozzuk ztál’· meg, LionoAb ID EIA Kit készletet /Zymed Conpany/ alkalmazva. Az

HREG /0/ Az antitestek tisztítása (et

A HREG IT1 monoklonális antitest Affigel Protein A LIAPS II juk, a készlethez tartozó előirt munkamenet szerint

A HREG 9 monoklonális antitestet ammóniun-szülfátos frakcionálással / 50 %-οε telítés/ tisztítjuk.

HRhG KI oldatot alikvotokra osztunk / üregenként 0,5/^g/O,! ml 0,1 mól/literes nátrium-karbonátbán/,

Z · λ Z Z 1 a , Λ* z Z .

ej szakai? at 4 C homersekés miután a lemezt állni hagyjuk egy po s létén, 1%' BSA / foszfáttal pufférőit

Ον fiziológiás konyhasóoldatbán/

0,3 ml-es alikvotjait adjuk hozzá és a lemezt 1 órán át inkubáljuk 37°C hőmérsékleten, hogy hatékony blokkolást végezzünk, Ezután humán reg- fehérje oldat / 1% BSA/PBS-ben/ 0,05 ml-es alikvotjait adjuk hozzá és e keveréket reagáltatjuk 37°C hőmérsékle9 '*···«· ·· • ·· · ··» ··· • * · · · « · 9·· «« ··«« ·· 4« )já”

Ezután a HREG 3 monoklonális antitest peroxidáz konjugtunának / amelyet azonos módon állítunk elő, mint az 1. példában/

4000-szeres hígításából 0,05 ml-es alikvotot adunk az egyes üregekhez., és 2 órán át 37°C hőmérsékleten végzett reakció után yen o— feni 1-diamin oldat / 0,01 ng /0,1 ml 0,1 mól/ literes citrát

0,1 ml-es alikvotjainak ciót re a en kell érteni, hogy különböze más módosítások nyilvánvalóak azok számára és könnyen elvégezhetők azok által, akik a nány oltalmi körétől és szellemétől

Következésképpen nem célunk korlátozódjanak, ezért az igénypontokat úgy fogalmaztuk öleljék körül a szabadalmazható újdonság, amely a je amelyel: ezekkel egyénértéküekként kezelhetők azon terület szak- 43 • ·· ·· ···· ······· · · • ·· « ····«· * 9 · · · ··

Claims (5)

1. ··· ·· ···· ·· ··

   SZABADALMI IGÉNYPONTOK ismer fel.
2. 2./ Az első igénypont szerinti monoklonális antitest azzal jel mezve, hogy ez REG 5 monoklonális antitest, REG 17 monoklonális antitest. REG 30 monoklonális antitest, HREG '31 monoklonális antitest, vagy HREG 9 monoklonális antitest.
3. 4./ Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti monoklonális anti test azzal jellenelve, hogy az említett monoklonális antitest szilárd támasztóanyagon van rögzítve igénypontok bármelyike szerinti monoklonális antitest ázzál jellemezve, hogy az említett monoklonális antitest enzim nel jelzett.

   őz/ Hibridóma azzal jellemezve, hogy az 1-3. igénypontok bármelyikefszerinti monoklonális antitestet termel.
4. 7./ A c. igénypont szerinti hibridóma azzal jellemezve, hogy az említett hibridóma REG 5 hibridcma, REG 17 hibridóma, REG 30 hib ridoma, HREG NI hibridoma vagy HREG 9 hibridóma

   -egy első antitestet állítunk elő, amely fajlagosan felismer egy re-fehérj ét,

   -egy, az említett reg-fehérjét tartalmazó meghatározandó oldatot adunk hozzá úgy, hogy az említett reg-fehérje kötődjék az említett első antitesthez,

   - egy tett reg-fehérjét, adunk hoz

   -egy harmadik antitestet, amelv

   V tett rc-g-fehér j ét, adunk hozzá úgy

   Ci. cJ eghatározzul

   Γ' O · i sínynont említő

   J. J. j 0

   SOul titest anti-I
5. 10./' • ·· ·· ·· ·· ······« « • ·· · ··· ··· • · · · · · · ··· ·· ···· ·· ·· jlagosan feli az emliaz említett másodi , hogy a ntite ás az említett z z <

   dl'nr, .-.sí anaz emli <J, Zi emliπ y~ ~ ^K' ÍJV hogy datot adunk hozzá úgy, hogy z ·>

   az említett első antitesthez,