JPH09216900A - 抗体を用いるｍａｐキナーゼまたは活性型ｍａｐキナーゼの定量法 - Google Patents
抗体を用いるｍａｐキナーゼまたは活性型ｍａｐキナーゼの定量法Info
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- JPH09216900A JPH09216900A JP8071659A JP7165996A JPH09216900A JP H09216900 A JPH09216900 A JP H09216900A JP 8071659 A JP8071659 A JP 8071659A JP 7165996 A JP7165996 A JP 7165996A JP H09216900 A JPH09216900 A JP H09216900A
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
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Abstract
(57)【要約】
【課題】種々の動物種由来あるいは種々の分子種のＭＡ
Ｐキナーゼ、活性型あるいは不活性型ＭＡＰキナーゼに
高度に結合する抗体を作成して、ＭＡＰキナーゼの検
出、定量を行ない、各ＭＡＰキナーゼの細胞、組織での
発現の分布およびその発現量やリン酸化活性の変化、生
体内等におけるＭＡＰキナーゼの役割をさらに解明す
る。 【解決手段】ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）で免疫す
ることにより得られるモノクローナル抗体、ＭＡＰキナ
ーゼのリン酸化された活性型部分あるいはヒトＭＡＰキ
ナーゼのフラグメントで免疫することにより得られるポ
リクローナル抗体を、各々、あるいは組合せて用いるこ
とにより、各種ＭＡＰキナーゼの検出、定量を可能とし
た。
Ｐキナーゼ、活性型あるいは不活性型ＭＡＰキナーゼに
高度に結合する抗体を作成して、ＭＡＰキナーゼの検
出、定量を行ない、各ＭＡＰキナーゼの細胞、組織での
発現の分布およびその発現量やリン酸化活性の変化、生
体内等におけるＭＡＰキナーゼの役割をさらに解明す
る。 【解決手段】ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）で免疫す
ることにより得られるモノクローナル抗体、ＭＡＰキナ
ーゼのリン酸化された活性型部分あるいはヒトＭＡＰキ
ナーゼのフラグメントで免疫することにより得られるポ
リクローナル抗体を、各々、あるいは組合せて用いるこ
とにより、各種ＭＡＰキナーゼの検出、定量を可能とし
た。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は抗体を用いるＭＡＰ
キナーゼまたは活性型ＭＡＰキナーゼの定量法に関し、
特にヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）に結合性を有する
モノクローナル抗体、その製造法、活性型ＭＡＰキナー
ゼに結合性を有する抗体、その製造法、各種ＭＡＰキナ
ーゼ〔ＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）、ＭＡＰキナーゼ
（ＥＲＫ２）、および、活性型ＭＡＰキナーゼ〕に特異
的に結合するポリクローナル抗体、および上記各種抗体
の用途、即ちこれら抗体を用いるＭＡＰキナーゼまたは
活性型ＭＡＰキナーゼの検出、定量法に関する。
キナーゼまたは活性型ＭＡＰキナーゼの定量法に関し、
特にヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）に結合性を有する
モノクローナル抗体、その製造法、活性型ＭＡＰキナー
ゼに結合性を有する抗体、その製造法、各種ＭＡＰキナ
ーゼ〔ＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）、ＭＡＰキナーゼ
（ＥＲＫ２）、および、活性型ＭＡＰキナーゼ〕に特異
的に結合するポリクローナル抗体、および上記各種抗体
の用途、即ちこれら抗体を用いるＭＡＰキナーゼまたは
活性型ＭＡＰキナーゼの検出、定量法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＭＡＰキナーゼ（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃ
ｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）は、
最初は増殖因子を培養細胞に添加すると活性化する蛋白
質リン酸化酵素として同定された〔プロシージングス・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ），第８４巻、第１５０２−１５０６頁（１
９８７）〕。しかし、その後の研究から、神経細胞の分
化〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），第２６５巻、第４７３
０−４７３５頁（１９９０）〕、免疫細胞の活性化〔ジ
ャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．），第１４４巻、第２６８３−２６８９頁（１９９
０）〕、分泌〔ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー
（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．），第１１０巻、第７３１
−７４２頁（１９９０）〕等の生命現象に関与している
ことが明らかになってきた。ヒトＭＡＰキナーゼについ
ては、遺伝子のクローニングから、非常に相同性の高
い、いくつかの分子種の存在が知られているが、主なも
のはＥＲＫ１とＥＲＫ２の２種類であり、この２種の蛋
白は非常に高い相同性を有する（８４．７％）〔フェブ
スレターズ（ＦＥＢＳ ＬＥＴＴ．），第３０４巻、第
１７０−１７８頁（１９９２）〕。ＥＲＫ１とＥＲＫ２
について、その機能の違いが推測されているものの、こ
れまで、試験管内で、その機能や活性の違いは見出され
ていない。このＭＡＰキナーゼに対しては、これまで数
種の抗体が得られているが、その大半がポリクローナル
抗体である。また、たとえば次のような数種のモノクロ
ーナル抗体が知られている。即ち、クローンＭＫ１２
〔Ｊｕｌｉａｎ Ｇｏｍｅｚ−Ｃａｍｂｒｏｎｅｒｏ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．
第８９巻、第７５５１−７５５５頁（１９９２）又は生
化学工業カタログ（１９９３／９４）第１８４頁〕やク
ローンＢ９〔ＵＢＩカタログ（１９９３）第３３頁〕等
である。しかし、ＥＲＫ１とＥＲＫ２を識別し得るモノ
クローナル抗体についての報告はない。また、ヒトのＭ
ＡＰキナーゼを用いて、ヒト以外の動物（マウスなど）
を免疫し、モノクローナル抗体を取得した事例も、これ
まで知られていない。これまで、ＥＲＫ１とＥＲＫ２を
識別し得る抗体としては、Ｓｉｍｏｎ Ｊ．Ｃｏｏｋら
が報告している、それぞれに特異的に結合するポリクロ
ーナル抗体〔エンボ・ジャーナル（ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒ
ｎａｌ）、第１２巻、第３４７５−３４８５頁（１９９
３）〕等が知られているが、いずれもウエスタンブロッ
ティングや免疫沈降に用いているのみで、ＭＡＰキナー
ゼの蛋白量の正確な定量は行なわれていない。また、Ｍ
ＡＰキナーゼは、Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ配列のＴｈｒ
とＴｙｒ残基が両方共、リン酸化されて活性化するセリ
ン／スレオニンキナーゼであり、この両方の残基のリン
酸化が、活性化に必要かつ十分な条件であると考えられ
ている〔Ｎｅｉｌ Ｇ．Ａｎｄｅｒｓｏｎら、ネイチャ
ー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３４３巻、第６５１−６５３頁
（１９９０）〕。このリン酸化されたＭＡＰキナーゼと
特異的に結合する抗体としては、伊藤ら〔１９９４年日
本生化学会大会 要旨集、講演番号４８８７〕、もしく
は、ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳの抗体が知
られているが、活性型ＭＡＰキナーゼのウエスタンブロ
ッティング、免疫沈降、および細胞の免疫染色に用いら
れているのみで、活性型ＭＡＰキナーゼの定量化はされ
ていない。
ｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）は、
最初は増殖因子を培養細胞に添加すると活性化する蛋白
質リン酸化酵素として同定された〔プロシージングス・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ），第８４巻、第１５０２−１５０６頁（１
９８７）〕。しかし、その後の研究から、神経細胞の分
化〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），第２６５巻、第４７３
０−４７３５頁（１９９０）〕、免疫細胞の活性化〔ジ
ャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．），第１４４巻、第２６８３−２６８９頁（１９９
０）〕、分泌〔ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー
（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．），第１１０巻、第７３１
−７４２頁（１９９０）〕等の生命現象に関与している
ことが明らかになってきた。ヒトＭＡＰキナーゼについ
ては、遺伝子のクローニングから、非常に相同性の高
い、いくつかの分子種の存在が知られているが、主なも
のはＥＲＫ１とＥＲＫ２の２種類であり、この２種の蛋
白は非常に高い相同性を有する（８４．７％）〔フェブ
スレターズ（ＦＥＢＳ ＬＥＴＴ．），第３０４巻、第
１７０−１７８頁（１９９２）〕。ＥＲＫ１とＥＲＫ２
について、その機能の違いが推測されているものの、こ
れまで、試験管内で、その機能や活性の違いは見出され
ていない。このＭＡＰキナーゼに対しては、これまで数
種の抗体が得られているが、その大半がポリクローナル
抗体である。また、たとえば次のような数種のモノクロ
ーナル抗体が知られている。即ち、クローンＭＫ１２
〔Ｊｕｌｉａｎ Ｇｏｍｅｚ−Ｃａｍｂｒｏｎｅｒｏ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．
第８９巻、第７５５１−７５５５頁（１９９２）又は生
化学工業カタログ（１９９３／９４）第１８４頁〕やク
ローンＢ９〔ＵＢＩカタログ（１９９３）第３３頁〕等
である。しかし、ＥＲＫ１とＥＲＫ２を識別し得るモノ
クローナル抗体についての報告はない。また、ヒトのＭ
ＡＰキナーゼを用いて、ヒト以外の動物（マウスなど）
を免疫し、モノクローナル抗体を取得した事例も、これ
まで知られていない。これまで、ＥＲＫ１とＥＲＫ２を
識別し得る抗体としては、Ｓｉｍｏｎ Ｊ．Ｃｏｏｋら
が報告している、それぞれに特異的に結合するポリクロ
ーナル抗体〔エンボ・ジャーナル（ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒ
ｎａｌ）、第１２巻、第３４７５−３４８５頁（１９９
３）〕等が知られているが、いずれもウエスタンブロッ
ティングや免疫沈降に用いているのみで、ＭＡＰキナー
ゼの蛋白量の正確な定量は行なわれていない。また、Ｍ
ＡＰキナーゼは、Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ配列のＴｈｒ
とＴｙｒ残基が両方共、リン酸化されて活性化するセリ
ン／スレオニンキナーゼであり、この両方の残基のリン
酸化が、活性化に必要かつ十分な条件であると考えられ
ている〔Ｎｅｉｌ Ｇ．Ａｎｄｅｒｓｏｎら、ネイチャ
ー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３４３巻、第６５１−６５３頁
（１９９０）〕。このリン酸化されたＭＡＰキナーゼと
特異的に結合する抗体としては、伊藤ら〔１９９４年日
本生化学会大会 要旨集、講演番号４８８７〕、もしく
は、ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳの抗体が知
られているが、活性型ＭＡＰキナーゼのウエスタンブロ
ッティング、免疫沈降、および細胞の免疫染色に用いら
れているのみで、活性型ＭＡＰキナーゼの定量化はされ
ていない。
【０００３】これまで、ＭＡＰキナーゼの活性を測定す
る方法としては、γ−32Ｐ−ＡＴＰを用いてＭＢＰ（Ｍ
ｙｅｌｉｎ ｂａｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）をリン酸化
し、ＭＢＰに取り込まれた放射活性を測定する方法〔Ａ
ｈｎ，Ｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２６６巻、
第４２２０−４２２７頁（１９９１）〕や、細胞抽出液
をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、そのゲルの中でＭＢＰのリ
ン酸化を行う方法〔Ｌｅｅｖｅｒｓ Ｓ．Ｊ．ら、ＥＭ
ＢＯ Ｊ．、第１１巻、第５６９−５７４頁（１９９
２）〕が主に行なわれるが、これらの方法は放射性同位
体を用いるという欠点がある。より簡便な方法として、
活性型と不活性型の電気泳動度の違いを利用する方法
〔例えばＪｏｈａｎ Ｖａｎ Ｌｉｎｔら、モレキュラー
・アンド・セルラー・バイオケミストリー（Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ）、第１２７／１２８巻、第１７１−１７８頁
（１９９３）〕が知られているが、定量は困難である。
る方法としては、γ−32Ｐ−ＡＴＰを用いてＭＢＰ（Ｍ
ｙｅｌｉｎ ｂａｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）をリン酸化
し、ＭＢＰに取り込まれた放射活性を測定する方法〔Ａ
ｈｎ，Ｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２６６巻、
第４２２０−４２２７頁（１９９１）〕や、細胞抽出液
をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、そのゲルの中でＭＢＰのリ
ン酸化を行う方法〔Ｌｅｅｖｅｒｓ Ｓ．Ｊ．ら、ＥＭ
ＢＯ Ｊ．、第１１巻、第５６９−５７４頁（１９９
２）〕が主に行なわれるが、これらの方法は放射性同位
体を用いるという欠点がある。より簡便な方法として、
活性型と不活性型の電気泳動度の違いを利用する方法
〔例えばＪｏｈａｎ Ｖａｎ Ｌｉｎｔら、モレキュラー
・アンド・セルラー・バイオケミストリー（Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ）、第１２７／１２８巻、第１７１−１７８頁
（１９９３）〕が知られているが、定量は困難である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】したがって、種々の動
物種由来あるいは種々の分子種のＭＡＰキナーゼに、ま
たは活性型あるいは不活性型のＭＡＰキナーゼに対して
高感度に結合性を示すモノクローナル抗体またはポリク
ローナル抗体をそれぞれ作製することができれば、各Ｍ
ＡＰキナーゼの細胞、組織での発現の分布およびその発
現量やリン酸化活性の変化などを知ることができると同
時に、生体内等におけるＭＡＰキナーゼの役割をさらに
解明することが可能となる。また、リン酸化されたＭＡ
Ｐキナーゼに対して高感度に結合性を示す抗体を作製す
ることができれば、ＭＡＰキナーゼの活性を酵素免疫測
定法やウエスタンブロッティング法で検出または測定す
ることが可能になる。さらに、これらの抗体を組み合わ
せることにより、ＥＲＫ１とＥＲＫ２の活性を分けて定
量できると同時にサンドイッチ法での酵素免疫測定法が
可能になり、生体内等におけるＭＡＰキナーゼの役割、
さらにはＥＲＫ１とＥＲＫ２の役割の違いを、これまで
以上に解明することが可能になる。また、ＭＡＰキナー
ゼの量や活性を簡便に測定することができれば、種々の
ＭＡＰキナーゼ関連疾患の診断や、薬物の作用機作を解
析することが可能になる。
物種由来あるいは種々の分子種のＭＡＰキナーゼに、ま
たは活性型あるいは不活性型のＭＡＰキナーゼに対して
高感度に結合性を示すモノクローナル抗体またはポリク
ローナル抗体をそれぞれ作製することができれば、各Ｍ
ＡＰキナーゼの細胞、組織での発現の分布およびその発
現量やリン酸化活性の変化などを知ることができると同
時に、生体内等におけるＭＡＰキナーゼの役割をさらに
解明することが可能となる。また、リン酸化されたＭＡ
Ｐキナーゼに対して高感度に結合性を示す抗体を作製す
ることができれば、ＭＡＰキナーゼの活性を酵素免疫測
定法やウエスタンブロッティング法で検出または測定す
ることが可能になる。さらに、これらの抗体を組み合わ
せることにより、ＥＲＫ１とＥＲＫ２の活性を分けて定
量できると同時にサンドイッチ法での酵素免疫測定法が
可能になり、生体内等におけるＭＡＰキナーゼの役割、
さらにはＥＲＫ１とＥＲＫ２の役割の違いを、これまで
以上に解明することが可能になる。また、ＭＡＰキナー
ゼの量や活性を簡便に測定することができれば、種々の
ＭＡＰキナーゼ関連疾患の診断や、薬物の作用機作を解
析することが可能になる。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記事情
に鑑み、鋭意研究した結果、ＭＡＰキナーゼの一種であ
るヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）を免疫原として、該
蛋白質に対して特異的な結合能を有するモノクローナル
抗体を作製することに成功した。該モノクローナル抗体
は、ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ２）やラットＭＡＰキ
ナーゼ（ＥＲＫ１）には結合しないため、免疫化学測定
法に付すと、ヒト細胞由来ＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）
を特異的に感度よく検出または定量できる。また該モノ
クローナル抗体を用いることにより、ヒト由来細胞等か
らヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）を効率よく精製する
ことができる。また、ＭＡＰキナーゼの被リン酸化部位
のアミノ酸配列をリン酸化したペプチド（合成ペプチ
ド）を免疫原として、活性型ＭＡＰキナーゼに対して特
異的な結合能を有する抗体を作製することに成功した。
該抗体は、不活性型のＭＡＰキナーゼには結合しないの
で、免疫化学測定法に付すと、ヒト、ラット、マウス等
の活性型ＭＡＰキナーゼを、ＥＲＫ１とＥＲＫ２の区別
なく、特異的に感度良く検出または定量できる。また、
該抗体を用いることにより、活性型のＭＡＰキナーゼを
効率よく精製することができる。これらの知見に基づい
てさらに研究した結果、本発明を完成した。すなわち、
本発明は、（１）ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）を免
疫原とし、ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）に結合性を
示す、ＩｇＧ型モノクローナル抗体、（２）ヒトＭＡＰ
キナーゼ（ＥＲＫ１）に結合性を示し、かつヒトＭＡＰ
キナーゼ（ＥＲＫ２）、ラットＭＰＡキナーゼ（ＥＲＫ
１）、およびラットＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ２）に結合
性を示さないモノクローナル抗体、（３）ヒトＭＡＰキ
ナーゼ（ＥＲＫ１）で免疫した哺乳動物の脾臓細胞と、
同種または異種のリンパ球様細胞からなるクローン化さ
れたハイブリドーマ、（４）ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲ
Ｋ１）で免疫した哺乳動物の脾臓細胞と、異種または同
種のリンパ球様細胞とを細胞融合し、クローニングする
ことを特徴とする上記（３）記載のハイブリドーマの製
造法、（５）上記（３）記載のハイブリドーマを液体培
地中または哺乳動物の腹腔内で増殖させることを特徴と
する上記（１）または（２）記載のモノクローナル抗体
の製造法、（６）上記（１）または（２）記載のモノク
ローナル抗体を用いることを特徴とするヒトＭＡＰキナ
ーゼ（ＥＲＫ１）の検出または定量法、（７）酵素免疫
測定法である（６）記載の検出または定量法、（８）上
記（１）または（２）記載のモノクローナル抗体を用い
ることを特徴とするヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）の
活性測定法、（９）上記（１）または（２）記載のモノ
クローナル抗体を用いることを特徴とするヒトＭＡＰキ
ナーゼ（ＥＲＫ１）の精製法、（１０）配列がＨｉｓ−
Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ（Ｔｈｒ−ＰＯ3Ｈ2）
−Ｇｌｕ−（Ｔｙｒ−ＰＯ3Ｈ2）−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｔ
ｈｒ−Ａｒｇ（配列番号：１）であるペプチドに特異的
に結合する抗ＭＡＰキナーゼ抗体、（１１）上記（１
０）記載の抗体を用いることを特徴とする、活性型ＭＡ
Ｐキナーゼの検出または定量法、（１２）酵素免疫測定
法である（１１）記載の検出または定量法、（１３）上
記（１０）記載の抗体を用いることを特徴とする、活性
型ＭＡＰキナーゼの精製法、（１４）上記（１）または
（２）記載のモノクローナル抗体と、上記（１０）記載
の抗体とを用いることを特徴とする、活性型ヒトＭＡＰ
キナーゼ（ＥＲＫ１）の検出または定量法、および（１
５）酵素免疫測定法である上記（１４）記載の検出また
は定量法、に関するものである。
に鑑み、鋭意研究した結果、ＭＡＰキナーゼの一種であ
るヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）を免疫原として、該
蛋白質に対して特異的な結合能を有するモノクローナル
抗体を作製することに成功した。該モノクローナル抗体
は、ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ２）やラットＭＡＰキ
ナーゼ（ＥＲＫ１）には結合しないため、免疫化学測定
法に付すと、ヒト細胞由来ＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）
を特異的に感度よく検出または定量できる。また該モノ
クローナル抗体を用いることにより、ヒト由来細胞等か
らヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）を効率よく精製する
ことができる。また、ＭＡＰキナーゼの被リン酸化部位
のアミノ酸配列をリン酸化したペプチド（合成ペプチ
ド）を免疫原として、活性型ＭＡＰキナーゼに対して特
異的な結合能を有する抗体を作製することに成功した。
該抗体は、不活性型のＭＡＰキナーゼには結合しないの
で、免疫化学測定法に付すと、ヒト、ラット、マウス等
の活性型ＭＡＰキナーゼを、ＥＲＫ１とＥＲＫ２の区別
なく、特異的に感度良く検出または定量できる。また、
該抗体を用いることにより、活性型のＭＡＰキナーゼを
効率よく精製することができる。これらの知見に基づい
てさらに研究した結果、本発明を完成した。すなわち、
本発明は、（１）ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）を免
疫原とし、ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）に結合性を
示す、ＩｇＧ型モノクローナル抗体、（２）ヒトＭＡＰ
キナーゼ（ＥＲＫ１）に結合性を示し、かつヒトＭＡＰ
キナーゼ（ＥＲＫ２）、ラットＭＰＡキナーゼ（ＥＲＫ
１）、およびラットＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ２）に結合
性を示さないモノクローナル抗体、（３）ヒトＭＡＰキ
ナーゼ（ＥＲＫ１）で免疫した哺乳動物の脾臓細胞と、
同種または異種のリンパ球様細胞からなるクローン化さ
れたハイブリドーマ、（４）ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲ
Ｋ１）で免疫した哺乳動物の脾臓細胞と、異種または同
種のリンパ球様細胞とを細胞融合し、クローニングする
ことを特徴とする上記（３）記載のハイブリドーマの製
造法、（５）上記（３）記載のハイブリドーマを液体培
地中または哺乳動物の腹腔内で増殖させることを特徴と
する上記（１）または（２）記載のモノクローナル抗体
の製造法、（６）上記（１）または（２）記載のモノク
ローナル抗体を用いることを特徴とするヒトＭＡＰキナ
ーゼ（ＥＲＫ１）の検出または定量法、（７）酵素免疫
測定法である（６）記載の検出または定量法、（８）上
記（１）または（２）記載のモノクローナル抗体を用い
ることを特徴とするヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）の
活性測定法、（９）上記（１）または（２）記載のモノ
クローナル抗体を用いることを特徴とするヒトＭＡＰキ
ナーゼ（ＥＲＫ１）の精製法、（１０）配列がＨｉｓ−
Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ（Ｔｈｒ−ＰＯ3Ｈ2）
−Ｇｌｕ−（Ｔｙｒ−ＰＯ3Ｈ2）−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｔ
ｈｒ−Ａｒｇ（配列番号：１）であるペプチドに特異的
に結合する抗ＭＡＰキナーゼ抗体、（１１）上記（１
０）記載の抗体を用いることを特徴とする、活性型ＭＡ
Ｐキナーゼの検出または定量法、（１２）酵素免疫測定
法である（１１）記載の検出または定量法、（１３）上
記（１０）記載の抗体を用いることを特徴とする、活性
型ＭＡＰキナーゼの精製法、（１４）上記（１）または
（２）記載のモノクローナル抗体と、上記（１０）記載
の抗体とを用いることを特徴とする、活性型ヒトＭＡＰ
キナーゼ（ＥＲＫ１）の検出または定量法、および（１
５）酵素免疫測定法である上記（１４）記載の検出また
は定量法、に関するものである。
【０００６】一方、本発明者らは、ＭＡＰキナーゼの一
種であるＥＲＫ１およびＥＲＫ２のアミノ酸配列をもつ
ペプチドを免疫原として、それぞれのＭＡＰキナーゼに
特異的な結合能を有する抗体を作製することにも成功し
た。得られた抗ＥＲＫ１抗体は、ヒトおよびラットのＥ
ＲＫ１に結合能を有するが、ヒトおよびラットのＥＲＫ
２には結合しない。一方、抗ＥＲＫ２抗体は、ヒトおよ
びラットのＥＲＫ２のみに結合能を有し、ヒトおよびラ
ットのＥＲＫ１には結合しない。このことから、これら
の抗体を用いることにより、免疫化学測定法で、ＥＲＫ
１とＥＲＫ２を区別して、ＭＡＰキナーゼの検出または
定量ができる。また、先にＭＡＰキナーゼの被リン酸化
部位付近のアミノ酸配列をもつ合成ペプチド（リン酸化
ペプチド）を免疫原として、活性型ＭＡＰキナーゼに特
異的な結合能を有する抗体を作製することに成功した。
この抗体は、活性化されたヒトおよびラットのＭＡＰキ
ナーゼ（ＥＲＫ１、ＥＲＫ２どちらにも）に特異的な結
合能を有し、不活性型のＭＡＰキナーゼや他のリン酸基
をもつ蛋白には結合しないので、この抗体を用いて免疫
化学測定法を行うと、活性型ＭＡＰキナーゼを特異的に
感度よく検出または定量できることは前述の通りである
が、上記のＥＲＫ１またはＥＲＫ２に特異的に結合する
抗体と組み合わせて用いれば、活性型ＥＲＫ１と活性型
ＥＲＫ２を区別して検出または定量できる。
種であるＥＲＫ１およびＥＲＫ２のアミノ酸配列をもつ
ペプチドを免疫原として、それぞれのＭＡＰキナーゼに
特異的な結合能を有する抗体を作製することにも成功し
た。得られた抗ＥＲＫ１抗体は、ヒトおよびラットのＥ
ＲＫ１に結合能を有するが、ヒトおよびラットのＥＲＫ
２には結合しない。一方、抗ＥＲＫ２抗体は、ヒトおよ
びラットのＥＲＫ２のみに結合能を有し、ヒトおよびラ
ットのＥＲＫ１には結合しない。このことから、これら
の抗体を用いることにより、免疫化学測定法で、ＥＲＫ
１とＥＲＫ２を区別して、ＭＡＰキナーゼの検出または
定量ができる。また、先にＭＡＰキナーゼの被リン酸化
部位付近のアミノ酸配列をもつ合成ペプチド（リン酸化
ペプチド）を免疫原として、活性型ＭＡＰキナーゼに特
異的な結合能を有する抗体を作製することに成功した。
この抗体は、活性化されたヒトおよびラットのＭＡＰキ
ナーゼ（ＥＲＫ１、ＥＲＫ２どちらにも）に特異的な結
合能を有し、不活性型のＭＡＰキナーゼや他のリン酸基
をもつ蛋白には結合しないので、この抗体を用いて免疫
化学測定法を行うと、活性型ＭＡＰキナーゼを特異的に
感度よく検出または定量できることは前述の通りである
が、上記のＥＲＫ１またはＥＲＫ２に特異的に結合する
抗体と組み合わせて用いれば、活性型ＥＲＫ１と活性型
ＥＲＫ２を区別して検出または定量できる。
【０００７】これらの知見に基いてさらに研究した結
果、本発明を完成した。即ち、本発明は、（１６）Ｓｅ
ｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ
−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−
Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ（配列番号：
１１，ｐｅｐｔｉｄｅ（図６））を含有するアミノ酸
配列を有するペプチドに特異的に結合する抗ＭＡＰキナ
ーゼ抗体、（１７）Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−
Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（配列
番号：１２，ｐｅｐｔｉｄｅ（図６））を含有するア
ミノ酸配列を有するペプチドに特異的に結合する抗ＭＡ
Ｐキナーゼ抗体、（１８）Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｈ
ｉｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｒ
ｐ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ
−Ａｌａ−Ａｓｐ（配列番号：１５，ｐｅｐｔｉｄｅ
（図１１））を含有するアミノ酸配列を有するペプチド
に特異的に結合する抗ＭＡＰキナーゼ抗体、（１９）Ｉ
ｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｒ
ｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ
−Ｓｅｒ（配列番号：１６，ｐｅｐｔｉｄｅ（図１
１））を含有するアミノ酸配列を有するペプチドに特異
的に結合する抗ＭＡＰキナーゼ抗体、（２０）Ｇｌｕ−
Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌ
ｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｔｈ
ｒ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ（配列番号：１０，ｐｅｐｔｉｄｅ
（図６））を含有するアミノ酸配列を有するペプチド
に特異的に結合する抗ＭＡＰキナーゼ抗体、（２１）Ｍ
ＡＰキナーゼ、ＭＡＰキナーゼのムテインもしくはＭＡ
Ｐキナーゼのフラグメントに特異的に結合する抗体を用
いることを特徴とするＭＡＰキナーゼの定量法、（２
２）抗体が（１６）、（１７）、（１８）、（１９）ま
たは（２０）記載のものである（２１）記載のＭＡＰキ
ナーゼの定量法、（２３）酵素免疫測定法である（２
１）または（２２）記載の定量法、（２４）サンドイッ
チ法による（２３）記載の定量法、（２５）ＭＡＰキナ
ーゼがＥＲＫ１である（２１）、（２２）、（２３）ま
たは（２４）記載の定量法、（２６）（１６）、（１
７）もしくは（２０）記載の抗体を用いる（２５）記載
の定量法、（２７）ＭＡＰキナーゼがＥＲＫ２である
（２１）、（２２）、（２３）または（２４）記載の定
量法、（２８）（１８）もしくは（１９）記載の抗体を
用いる（２７）記載の定量法、（２９）ＭＡＰキナーゼ
が活性型ＥＲＫ１である（２１）、（２２）、（２３）
または（２４）記載の定量法、（３０）（１０）記載の
抗体と（１６）、（１７）もしくは（２０）記載の抗体
とを用いる（２９）記載の定量法、（３１）ＭＡＰキナ
ーゼが活性型ＥＲＫ２である（２１）、（２２）、（２
３）または（２４）記載の定量法、および（３２）（１
０）記載の抗体と（１８）もしくは（１９）記載の抗体
とを用いる（３１）記載の定量法、（３３）被検体と
（１），（２），（１０），（１６）、（１７）、（１
８）、（１９）または（２０）記載の抗体とを接触さ
せ、被検体中のＭＡＰキナーゼを定量することを特徴と
するＭＡＰキナーゼ関連疾患の診断法、（３４）
（１），（２），（１０），（１６）、（１７）、（１
８）、（１９）または（２０）記載の抗体を含有するこ
とを特徴とするＭＡＰキナーゼ関連疾患の診断剤、にも
関するものである。
果、本発明を完成した。即ち、本発明は、（１６）Ｓｅ
ｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ
−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−
Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ（配列番号：
１１，ｐｅｐｔｉｄｅ（図６））を含有するアミノ酸
配列を有するペプチドに特異的に結合する抗ＭＡＰキナ
ーゼ抗体、（１７）Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−
Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（配列
番号：１２，ｐｅｐｔｉｄｅ（図６））を含有するア
ミノ酸配列を有するペプチドに特異的に結合する抗ＭＡ
Ｐキナーゼ抗体、（１８）Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｈ
ｉｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｒ
ｐ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ
−Ａｌａ−Ａｓｐ（配列番号：１５，ｐｅｐｔｉｄｅ
（図１１））を含有するアミノ酸配列を有するペプチド
に特異的に結合する抗ＭＡＰキナーゼ抗体、（１９）Ｉ
ｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｒ
ｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ
−Ｓｅｒ（配列番号：１６，ｐｅｐｔｉｄｅ（図１
１））を含有するアミノ酸配列を有するペプチドに特異
的に結合する抗ＭＡＰキナーゼ抗体、（２０）Ｇｌｕ−
Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌ
ｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｔｈ
ｒ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ（配列番号：１０，ｐｅｐｔｉｄｅ
（図６））を含有するアミノ酸配列を有するペプチド
に特異的に結合する抗ＭＡＰキナーゼ抗体、（２１）Ｍ
ＡＰキナーゼ、ＭＡＰキナーゼのムテインもしくはＭＡ
Ｐキナーゼのフラグメントに特異的に結合する抗体を用
いることを特徴とするＭＡＰキナーゼの定量法、（２
２）抗体が（１６）、（１７）、（１８）、（１９）ま
たは（２０）記載のものである（２１）記載のＭＡＰキ
ナーゼの定量法、（２３）酵素免疫測定法である（２
１）または（２２）記載の定量法、（２４）サンドイッ
チ法による（２３）記載の定量法、（２５）ＭＡＰキナ
ーゼがＥＲＫ１である（２１）、（２２）、（２３）ま
たは（２４）記載の定量法、（２６）（１６）、（１
７）もしくは（２０）記載の抗体を用いる（２５）記載
の定量法、（２７）ＭＡＰキナーゼがＥＲＫ２である
（２１）、（２２）、（２３）または（２４）記載の定
量法、（２８）（１８）もしくは（１９）記載の抗体を
用いる（２７）記載の定量法、（２９）ＭＡＰキナーゼ
が活性型ＥＲＫ１である（２１）、（２２）、（２３）
または（２４）記載の定量法、（３０）（１０）記載の
抗体と（１６）、（１７）もしくは（２０）記載の抗体
とを用いる（２９）記載の定量法、（３１）ＭＡＰキナ
ーゼが活性型ＥＲＫ２である（２１）、（２２）、（２
３）または（２４）記載の定量法、および（３２）（１
０）記載の抗体と（１８）もしくは（１９）記載の抗体
とを用いる（３１）記載の定量法、（３３）被検体と
（１），（２），（１０），（１６）、（１７）、（１
８）、（１９）または（２０）記載の抗体とを接触さ
せ、被検体中のＭＡＰキナーゼを定量することを特徴と
するＭＡＰキナーゼ関連疾患の診断法、（３４）
（１），（２），（１０），（１６）、（１７）、（１
８）、（１９）または（２０）記載の抗体を含有するこ
とを特徴とするＭＡＰキナーゼ関連疾患の診断剤、にも
関するものである。
【０００８】本発明において哺乳動物の免疫に用いるヒ
トＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）などのＭＡＰキナーゼ
（ＥＲＫ１あるいはＥＲＫ２）としては、哺乳動物細胞
由来のＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１あるいはＥＲＫ２）で
あればいずれでもよく、分子としては天然型のみならず
部分ペプチドおよびムテイン（ｍｕｔｅｉｎ）であって
もよい。例えば、ヒト細胞由来のＭＡＰキナーゼ（ＥＲ
Ｋ１あるいはＥＲＫ２）は、例えば、ＥＧＦで刺激した
Ａ４３１細胞からＬ．Ｂｒｙａｎ Ｒａｙらの示した方
法〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，第２６３巻、第１２７２
１−１２７２７頁〕により精製することができる。免疫
原としては上述のＭＡＰキナーゼを組織や細胞から分離
してもよく、またＭＡＰキナーゼをコードする塩基配列
を有するＤＮＡを含有する発現ベクターを作製し、適当
な宿主細胞に導入してＭＡＰキナーゼを大量に産生させ
たものでもよい。発現ベクターは例えば、（イ）ＭＡＰ
キナーゼをコードするＲＮＡを分離し、（ロ）該ＲＮＡ
から単鎖の相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、次いで二重鎖Ｄ
ＮＡを合成し、（ハ）該相補ＤＮＡをプラスミドに組み
込み、（ニ）得られた組み換えプラスミドで宿主を形質
転換し、（ホ）得られた形質転換体を培養後、形質転換
体から適当な方法、例えばＤＮＡプローブを用いたコロ
ニーハイブリダイゼーション法により目的とするＤＮＡ
を含有するプラスミドを単離し、（ヘ）該プラスミドか
ら目的とするクローン化ＤＮＡを切り出し、（ト）該ク
ローン化ＤＮＡをベクターのプロモーターの下流に連結
する、ことにより、それぞれ製造することができる。
トＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）などのＭＡＰキナーゼ
（ＥＲＫ１あるいはＥＲＫ２）としては、哺乳動物細胞
由来のＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１あるいはＥＲＫ２）で
あればいずれでもよく、分子としては天然型のみならず
部分ペプチドおよびムテイン（ｍｕｔｅｉｎ）であって
もよい。例えば、ヒト細胞由来のＭＡＰキナーゼ（ＥＲ
Ｋ１あるいはＥＲＫ２）は、例えば、ＥＧＦで刺激した
Ａ４３１細胞からＬ．Ｂｒｙａｎ Ｒａｙらの示した方
法〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，第２６３巻、第１２７２
１−１２７２７頁〕により精製することができる。免疫
原としては上述のＭＡＰキナーゼを組織や細胞から分離
してもよく、またＭＡＰキナーゼをコードする塩基配列
を有するＤＮＡを含有する発現ベクターを作製し、適当
な宿主細胞に導入してＭＡＰキナーゼを大量に産生させ
たものでもよい。発現ベクターは例えば、（イ）ＭＡＰ
キナーゼをコードするＲＮＡを分離し、（ロ）該ＲＮＡ
から単鎖の相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、次いで二重鎖Ｄ
ＮＡを合成し、（ハ）該相補ＤＮＡをプラスミドに組み
込み、（ニ）得られた組み換えプラスミドで宿主を形質
転換し、（ホ）得られた形質転換体を培養後、形質転換
体から適当な方法、例えばＤＮＡプローブを用いたコロ
ニーハイブリダイゼーション法により目的とするＤＮＡ
を含有するプラスミドを単離し、（ヘ）該プラスミドか
ら目的とするクローン化ＤＮＡを切り出し、（ト）該ク
ローン化ＤＮＡをベクターのプロモーターの下流に連結
する、ことにより、それぞれ製造することができる。
【０００９】このようにして得られた発現ベクターを、
適当な宿主（例、大腸菌、枯草菌、酵母、動物細胞な
ど）に組み込み、得られた形質転換体を培地に培養する
ことにより、ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）などのＭ
ＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１あるいはＥＲＫ２）を製造する
ことができる。上記ＭＡＰキナーゼ蛋白質としては、Ｍ
ＡＰキナーゼのムテインも含まれる。ＭＡＰキナーゼム
テインとしては、本来、元のペプチドあるいは蛋白質の
アミノ酸配列が変異したものであり、アミノ酸の付加、
構成アミノ酸の欠損、他のアミノ酸への置換が挙げられ
る。該アミノ酸の付加としては、少なくとも１個のアミ
ノ酸が付加しているものが挙げられる。該構成アミノ酸
の欠損としては、少なくとも１個のＭＡＰキナーゼ構成
アミノ酸が欠損しているものが挙げられる。該他のアミ
ノ酸への置換としては、少なくとも１個のＭＡＰキナー
ゼ構成アミノ酸が別のアミノ酸で置換されているものが
挙げられる。ＭＡＰキナーゼにアミノ酸が付加している
ムテインにおけるアミノ酸の付加としては、ペプチドを
発現する際に用いられる開始コドンに基因するメチオニ
ンや、シグナルペプチドの付加はこれに含まれないもの
である。付加されるアミノ酸の数としては、少なくとも
１個であるが、ＭＡＰキナーゼの特徴を失わない限り何
個でもよい。さらに好ましくは、ＭＡＰキナーゼ間で高
い相同性（ホモロジー）が認められているアミノ酸配列
の一部あるいはすべてが挙げられる。構成アミノ酸が欠
損しているＭＡＰキナーゼのムテインにおける欠損して
いる構成アミノ酸の数としては、少なくとも１個である
がＭＡＰキナーゼの有する特徴を失わない限り何個でも
よい。構成アミノ酸が別のアミノ酸で置換されているＭ
ＡＰキナーゼのムテインにおける置換される前のＭＡＰ
キナーゼの構成アミノ酸（被置換アミノ酸）の数として
は、少なくとも１個であるがＭＡＰキナーゼの特徴を失
わない限り何個でもよい。置換される構成アミノ酸（被
置換アミノ酸）の例としては、システインあるいはシス
テイン以外のいずれのアミノ酸も対象となり得るが、シ
ステインが特に好ましく置換される。システイン以外の
被置換アミノ酸としては、アスパラギン酸、アルギニ
ン、グリシン、バリンなどが挙げられる。被置換アミノ
酸がシステインである場合には、置換するアミノ酸（置
換アミノ酸）としては、たとえば中性アミノ酸が好まし
い。該中性アミノ酸の具体例としては、たとえば、グリ
シン、バリン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、チ
ロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、トリプトファ
ン、セリン、スレオニン、メチオニンなどが挙げられ
る。特に、セリン、スレオニンが好ましい。被置換アミ
ノ酸がシステイン以外のものである場合には、置換アミ
ノ酸としては、たとえば、アミノ酸の親水性、疎水性あ
るいは電荷の点で、被置換アミノ酸とは異なる性質をも
つものを選ぶ。具体的には被置換アミノ酸がアスパラギ
ン酸の場合には、置換アミノ酸としてアスパラギン、ス
レオニン、バリン、フェニルアラニン、アルギニンなど
が挙げられるが、特にアスパラギン、アルギニンが好ま
しい。被置換アミノ酸がアルギニンの場合には置換アミ
ノ酸としてグルタミン、スレオニン、ロイシン、フェニ
ルアラニン、アスパラギン酸が挙げられるが、特にグル
タミンが好ましい。被置換アミノ酸がグリシンである場
合には、置換アミノ酸としては、スレオニン、ロイシ
ン、フェニルアラニン、セリン、グルタミン酸、アルギ
ニンなどが挙げられ、特にスレオニンが好ましい。被置
換アミノ酸がセリンである場合には、置換アミノ酸とし
ては、メチオニン、アラニン、ロイシン、システイン、
グルタミン、アルギニン、アスパラギン酸などが挙げら
れ、特にメチオニンが好ましい。被置換アミノ酸がバリ
ンである場合には、置換アミノ酸としては、セリン、ロ
イシン、プロリン、グリシン、リジン、アスパラギン酸
などが挙げられ、特にセリンが好ましい。被置換アミノ
酸としては、アスパラギン酸、アルギニン、グリシン、
セリン、バリンが好ましく、置換アミノ酸としては、ア
スパラギン、グルタミン、アルギニン、スレオニン、メ
チオニン、セリン、ロイシンが好ましい。上記の置換に
おいては、２以上の置換を同時に行なってもよい。特
に、２または３個の構成アミノ酸が置換されるのが好ま
しい。上記のムテインは、上記した付加、欠損、置換の
２つまたは３つが組み合わさったものでもよい。該ムテ
インを製造するためには、特定部位指向性変異誘発技術
（Ｓｉｔｅｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔｅｇｅｎｅｓｉ
ｓ）が採用される。該技術は周知であり、アール・エフ
・レイサー（Ｌａｔｈｅｒ，Ｒ．Ｆ．）及びジェイ・ピ
ー・レコック（Ｌｅｃｏｑ，Ｊ．Ｐ．）、ジェネティッ
ク・エンジニアリング（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅ
ｅｒｉｎｇ）、アカデミックプレス社（１９８３年）第
３１−５０頁、に示されている。オリゴヌクレオチドに
指示された変異誘発はエム・スミス（Ｓｍｉｔｈ，
Ｍ．）及びエス・ギラム（Ｇｉｌｌａｍ，Ｓ．）、ジェ
ネティック・エンジニアリング：原理と方法、プレナム
プレス社（１９８１年）第３巻 第１−３２頁に示され
ている。
適当な宿主（例、大腸菌、枯草菌、酵母、動物細胞な
ど）に組み込み、得られた形質転換体を培地に培養する
ことにより、ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）などのＭ
ＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１あるいはＥＲＫ２）を製造する
ことができる。上記ＭＡＰキナーゼ蛋白質としては、Ｍ
ＡＰキナーゼのムテインも含まれる。ＭＡＰキナーゼム
テインとしては、本来、元のペプチドあるいは蛋白質の
アミノ酸配列が変異したものであり、アミノ酸の付加、
構成アミノ酸の欠損、他のアミノ酸への置換が挙げられ
る。該アミノ酸の付加としては、少なくとも１個のアミ
ノ酸が付加しているものが挙げられる。該構成アミノ酸
の欠損としては、少なくとも１個のＭＡＰキナーゼ構成
アミノ酸が欠損しているものが挙げられる。該他のアミ
ノ酸への置換としては、少なくとも１個のＭＡＰキナー
ゼ構成アミノ酸が別のアミノ酸で置換されているものが
挙げられる。ＭＡＰキナーゼにアミノ酸が付加している
ムテインにおけるアミノ酸の付加としては、ペプチドを
発現する際に用いられる開始コドンに基因するメチオニ
ンや、シグナルペプチドの付加はこれに含まれないもの
である。付加されるアミノ酸の数としては、少なくとも
１個であるが、ＭＡＰキナーゼの特徴を失わない限り何
個でもよい。さらに好ましくは、ＭＡＰキナーゼ間で高
い相同性（ホモロジー）が認められているアミノ酸配列
の一部あるいはすべてが挙げられる。構成アミノ酸が欠
損しているＭＡＰキナーゼのムテインにおける欠損して
いる構成アミノ酸の数としては、少なくとも１個である
がＭＡＰキナーゼの有する特徴を失わない限り何個でも
よい。構成アミノ酸が別のアミノ酸で置換されているＭ
ＡＰキナーゼのムテインにおける置換される前のＭＡＰ
キナーゼの構成アミノ酸（被置換アミノ酸）の数として
は、少なくとも１個であるがＭＡＰキナーゼの特徴を失
わない限り何個でもよい。置換される構成アミノ酸（被
置換アミノ酸）の例としては、システインあるいはシス
テイン以外のいずれのアミノ酸も対象となり得るが、シ
ステインが特に好ましく置換される。システイン以外の
被置換アミノ酸としては、アスパラギン酸、アルギニ
ン、グリシン、バリンなどが挙げられる。被置換アミノ
酸がシステインである場合には、置換するアミノ酸（置
換アミノ酸）としては、たとえば中性アミノ酸が好まし
い。該中性アミノ酸の具体例としては、たとえば、グリ
シン、バリン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、チ
ロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、トリプトファ
ン、セリン、スレオニン、メチオニンなどが挙げられ
る。特に、セリン、スレオニンが好ましい。被置換アミ
ノ酸がシステイン以外のものである場合には、置換アミ
ノ酸としては、たとえば、アミノ酸の親水性、疎水性あ
るいは電荷の点で、被置換アミノ酸とは異なる性質をも
つものを選ぶ。具体的には被置換アミノ酸がアスパラギ
ン酸の場合には、置換アミノ酸としてアスパラギン、ス
レオニン、バリン、フェニルアラニン、アルギニンなど
が挙げられるが、特にアスパラギン、アルギニンが好ま
しい。被置換アミノ酸がアルギニンの場合には置換アミ
ノ酸としてグルタミン、スレオニン、ロイシン、フェニ
ルアラニン、アスパラギン酸が挙げられるが、特にグル
タミンが好ましい。被置換アミノ酸がグリシンである場
合には、置換アミノ酸としては、スレオニン、ロイシ
ン、フェニルアラニン、セリン、グルタミン酸、アルギ
ニンなどが挙げられ、特にスレオニンが好ましい。被置
換アミノ酸がセリンである場合には、置換アミノ酸とし
ては、メチオニン、アラニン、ロイシン、システイン、
グルタミン、アルギニン、アスパラギン酸などが挙げら
れ、特にメチオニンが好ましい。被置換アミノ酸がバリ
ンである場合には、置換アミノ酸としては、セリン、ロ
イシン、プロリン、グリシン、リジン、アスパラギン酸
などが挙げられ、特にセリンが好ましい。被置換アミノ
酸としては、アスパラギン酸、アルギニン、グリシン、
セリン、バリンが好ましく、置換アミノ酸としては、ア
スパラギン、グルタミン、アルギニン、スレオニン、メ
チオニン、セリン、ロイシンが好ましい。上記の置換に
おいては、２以上の置換を同時に行なってもよい。特
に、２または３個の構成アミノ酸が置換されるのが好ま
しい。上記のムテインは、上記した付加、欠損、置換の
２つまたは３つが組み合わさったものでもよい。該ムテ
インを製造するためには、特定部位指向性変異誘発技術
（Ｓｉｔｅｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔｅｇｅｎｅｓｉ
ｓ）が採用される。該技術は周知であり、アール・エフ
・レイサー（Ｌａｔｈｅｒ，Ｒ．Ｆ．）及びジェイ・ピ
ー・レコック（Ｌｅｃｏｑ，Ｊ．Ｐ．）、ジェネティッ
ク・エンジニアリング（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅ
ｅｒｉｎｇ）、アカデミックプレス社（１９８３年）第
３１−５０頁、に示されている。オリゴヌクレオチドに
指示された変異誘発はエム・スミス（Ｓｍｉｔｈ，
Ｍ．）及びエス・ギラム（Ｇｉｌｌａｍ，Ｓ．）、ジェ
ネティック・エンジニアリング：原理と方法、プレナム
プレス社（１９８１年）第３巻 第１−３２頁に示され
ている。
【００１０】該ムテインをコードする構造遺伝子を製造
するためには、たとえば、（ａ）ＭＡＰキナーゼの構造
遺伝子の１本鎖からなる１本鎖ＤＮＡを突然変異株オリ
ゴヌクレオチドプライマーと雑種形成させる（この１本
鎖で代替すべきシステイン用コドン、又は場合によりこ
のコドンと対合をつくるアンチセンス・トリプレットを
包含する領域に対して上記プライマーは相補的なもので
ある。但し、当該コドンの他のアミノ酸暗号化用コド
ン、又は場合によりアンチセンス・トリプレットとの不
一致はこの限りでない）、（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼに
よりプライマーを伸長させ、突然変異性ヘテロニ量体
（ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ）を形成させる、及び、
（ｃ）この突然変異性ヘテロニ量体を複製する。次に突
然変異化された遺伝子を運搬するファージＤＮＡを単離
し、プラスミドへ組み込む。このようにして得られたプ
ラスミドで適当な宿主を形成転換し、得られた形質転換
体を培地に培養することにより、ムテインを製造するこ
とができる。本発明における抗原としてのＭＡＰキナー
ゼの構成アミノ酸が欠損したムテインとしては、ＭＡＰ
キナーゼのアミノ酸配列のうちのアミノ酸の個数が１０
０個以上のものからなるムテインが好ましく、さらに好
ましくは１１０個以上のムテインがあげられる。
するためには、たとえば、（ａ）ＭＡＰキナーゼの構造
遺伝子の１本鎖からなる１本鎖ＤＮＡを突然変異株オリ
ゴヌクレオチドプライマーと雑種形成させる（この１本
鎖で代替すべきシステイン用コドン、又は場合によりこ
のコドンと対合をつくるアンチセンス・トリプレットを
包含する領域に対して上記プライマーは相補的なもので
ある。但し、当該コドンの他のアミノ酸暗号化用コド
ン、又は場合によりアンチセンス・トリプレットとの不
一致はこの限りでない）、（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼに
よりプライマーを伸長させ、突然変異性ヘテロニ量体
（ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ）を形成させる、及び、
（ｃ）この突然変異性ヘテロニ量体を複製する。次に突
然変異化された遺伝子を運搬するファージＤＮＡを単離
し、プラスミドへ組み込む。このようにして得られたプ
ラスミドで適当な宿主を形成転換し、得られた形質転換
体を培地に培養することにより、ムテインを製造するこ
とができる。本発明における抗原としてのＭＡＰキナー
ゼの構成アミノ酸が欠損したムテインとしては、ＭＡＰ
キナーゼのアミノ酸配列のうちのアミノ酸の個数が１０
０個以上のものからなるムテインが好ましく、さらに好
ましくは１１０個以上のムテインがあげられる。
【００１１】
【発明の実施の形態】本発明のヒトＭＡＰキナーゼ（Ｅ
ＲＫ１）、ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ２）などのＭＡ
Ｐキナーゼに対するモノクローナル抗体を製造するに
は、ＭＡＰキナーゼ、そのムテインまたはその部分ペプ
チドを哺乳動物に免疫し、得られた脾臓細胞と哺乳動物
のリンパ球様細胞とを細胞融合させ、次いでクローン化
することにより製造される。該ＭＡＰキナーゼ、そのム
テインまたはその部分ペプチドを免疫するに際しては、
ＭＡＰキナーゼをキャリヤー蛋白との複合体としてか
ら、これを免疫に用いてもよい。該キャリヤー蛋白とし
ては、たとえばウシ血清アルブミン、ウシサイログロブ
リン、ヘモシアニンなどが挙げられる。キャリヤー蛋白
複合体を用いる場合に、キャリヤー蛋白とＭＡＰキナー
ゼとのカップリング比率は、約０．１〜３０倍（キャリ
ヤー／ＭＡＰキナーゼ：重量比）で用いられる。望まし
くは約０．５〜５倍が用いられる。また、ハプテンとキ
ャリヤーとのカップリングには、種々の縮合剤を用いる
ことが出来るが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド
等が好都合に用いられる。
ＲＫ１）、ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ２）などのＭＡ
Ｐキナーゼに対するモノクローナル抗体を製造するに
は、ＭＡＰキナーゼ、そのムテインまたはその部分ペプ
チドを哺乳動物に免疫し、得られた脾臓細胞と哺乳動物
のリンパ球様細胞とを細胞融合させ、次いでクローン化
することにより製造される。該ＭＡＰキナーゼ、そのム
テインまたはその部分ペプチドを免疫するに際しては、
ＭＡＰキナーゼをキャリヤー蛋白との複合体としてか
ら、これを免疫に用いてもよい。該キャリヤー蛋白とし
ては、たとえばウシ血清アルブミン、ウシサイログロブ
リン、ヘモシアニンなどが挙げられる。キャリヤー蛋白
複合体を用いる場合に、キャリヤー蛋白とＭＡＰキナー
ゼとのカップリング比率は、約０．１〜３０倍（キャリ
ヤー／ＭＡＰキナーゼ：重量比）で用いられる。望まし
くは約０．５〜５倍が用いられる。また、ハプテンとキ
ャリヤーとのカップリングには、種々の縮合剤を用いる
ことが出来るが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド
等が好都合に用いられる。
【００１２】ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）などのＭ
ＡＰキナーゼまたは複合体を用いて免疫するに際し、免
疫する哺乳動物は、羊、山羊、兎、モルモット、ラッ
ト、マウス等の実験動物が使われるが、モノクローナル
抗体を得るためには、ラット、マウスが好ましい。免疫
方法は、例えばマウスを免疫する場合、腹腔内、静脈
内、筋肉内、皮内、皮下等のいずれのルートからでも可
能であるが、主として皮下、腹腔内、静脈内に（とりわ
け皮下）注入するのが好ましい。また、免疫間隔、免疫
量等も可変度は高く、種々の方法が可能であるが、たと
えば２週間隔で約２〜６回免疫し、最終免疫後、約１〜
５日、好ましくは約２〜４日後に摘出した脾臓細胞を用
いる方法がよく用いられる。免疫量は１回にペプチド量
として、マウス当り約０．１μｇ以上、好ましくは約１
０μｇ〜３００μｇ用いることが望ましい。又、脾臓を
摘出する前には、部分採血を行い、血中の抗体価の上昇
を確認した上で、脾臓細胞を用いる融合を行うことが望
ましい。上記の細胞融合は例えば摘出したマウスの脾臓
細胞を、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルト
ランスフェラーゼ欠損（ＨＧＰＲＴ~）や、チミジンキ
ナーゼ欠損（ＴＫ~）の様なマーカーを持った適切な同
種または異種（好ましくは同種）のミエローマ〔例、Ｐ
３−Ｘ６３−Ａｇ・８Ｕ１（市森他 ジャーナル・オブ
・イムノロジカル・メソッド、第８０巻、第５５頁（１
９８５）〕等の、リンパ球様細胞株との間で融合させ
る。例えばケーラーおよびミルスタインらの方法〔ネイ
チャー（Ｎａｔｕｒｅ）第２５６巻、第４９５頁（１９
７５）〕に準じ融合させることにより製造される。たと
えばミエローマ細胞と脾細胞とを約１：５の割合で、た
とえばイスコフ培地とハムＦ−１２培地を１：１に混合
した培地（以下ＩＨ培地と称する。）に懸濁させ、セン
ダイウイルス、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の
融合剤が用いて融合することができる。もちろんジメチ
ルスルホキシド（ＤＭＳＯ）その他の融合促進剤をこれ
らに替えて加えることも可能である。ＰＥＧの平均分子
量は、ふつう約１０００〜９０００、反応時間は約０．
５〜３０分、濃度は約１０％〜８０％等が用いられる
が、好ましい条件の一例として、ＰＥＧ６０００を約３
５〜５５％で約４〜１０分処理することにより、効率よ
く融合させることが出来る。融合細胞は、ヒポキサンチ
ン−アミノプテリン−チミジン培地〔ＨＡＴ培地：ネイ
チャー、第２５６巻、第４９５頁（１９７５）〕等を用
いて、選択的に増殖させることが出来る。
ＡＰキナーゼまたは複合体を用いて免疫するに際し、免
疫する哺乳動物は、羊、山羊、兎、モルモット、ラッ
ト、マウス等の実験動物が使われるが、モノクローナル
抗体を得るためには、ラット、マウスが好ましい。免疫
方法は、例えばマウスを免疫する場合、腹腔内、静脈
内、筋肉内、皮内、皮下等のいずれのルートからでも可
能であるが、主として皮下、腹腔内、静脈内に（とりわ
け皮下）注入するのが好ましい。また、免疫間隔、免疫
量等も可変度は高く、種々の方法が可能であるが、たと
えば２週間隔で約２〜６回免疫し、最終免疫後、約１〜
５日、好ましくは約２〜４日後に摘出した脾臓細胞を用
いる方法がよく用いられる。免疫量は１回にペプチド量
として、マウス当り約０．１μｇ以上、好ましくは約１
０μｇ〜３００μｇ用いることが望ましい。又、脾臓を
摘出する前には、部分採血を行い、血中の抗体価の上昇
を確認した上で、脾臓細胞を用いる融合を行うことが望
ましい。上記の細胞融合は例えば摘出したマウスの脾臓
細胞を、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルト
ランスフェラーゼ欠損（ＨＧＰＲＴ~）や、チミジンキ
ナーゼ欠損（ＴＫ~）の様なマーカーを持った適切な同
種または異種（好ましくは同種）のミエローマ〔例、Ｐ
３−Ｘ６３−Ａｇ・８Ｕ１（市森他 ジャーナル・オブ
・イムノロジカル・メソッド、第８０巻、第５５頁（１
９８５）〕等の、リンパ球様細胞株との間で融合させ
る。例えばケーラーおよびミルスタインらの方法〔ネイ
チャー（Ｎａｔｕｒｅ）第２５６巻、第４９５頁（１９
７５）〕に準じ融合させることにより製造される。たと
えばミエローマ細胞と脾細胞とを約１：５の割合で、た
とえばイスコフ培地とハムＦ−１２培地を１：１に混合
した培地（以下ＩＨ培地と称する。）に懸濁させ、セン
ダイウイルス、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の
融合剤が用いて融合することができる。もちろんジメチ
ルスルホキシド（ＤＭＳＯ）その他の融合促進剤をこれ
らに替えて加えることも可能である。ＰＥＧの平均分子
量は、ふつう約１０００〜９０００、反応時間は約０．
５〜３０分、濃度は約１０％〜８０％等が用いられる
が、好ましい条件の一例として、ＰＥＧ６０００を約３
５〜５５％で約４〜１０分処理することにより、効率よ
く融合させることが出来る。融合細胞は、ヒポキサンチ
ン−アミノプテリン−チミジン培地〔ＨＡＴ培地：ネイ
チャー、第２５６巻、第４９５頁（１９７５）〕等を用
いて、選択的に増殖させることが出来る。
【００１３】増殖してきた細胞の培養上清は、目的とす
る抗体の産生の有無についてスクリーニングを行うが、
抗体価のスクリーニングは次の様に行うことが出来る。
即ち、まず第１段階として免疫に用いた抗原ペプチドに
対する抗体産生の有無を、ラジオイムノアッセイ（ＲＩ
Ａ）法またはエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）法等
の方法で調べることが出来るが、これらの方法について
も種々の変法が可能である。好ましい測定法の一例とし
て、ＥＩＡを用いる一つの方法について述べる。セルロ
ースビーズ等の担体に、例えばウサギ抗マウスイムノグ
ロブリン抗体を常法に従ってカップリングさせておき、
これに測定したい培養上清や、マウスの血清を加え、一
定時間、定温（約４〜４０℃を示す。以下においても同
様。）で反応させる。この後、反応物をよく洗った後、
酵素で標識した抗原ペプチド（酵素と抗原ペプチドを常
法に従いカップリングさせた後精製）を加え、一定時
間、定温で反応させる。反応物をよく洗った後、酵素基
質を加え、一定時間、定温で反応させ、その後、生成発
色物を吸光度または蛍光強度等で測定することが出来
る。選択培地で増殖を示し、かつ免疫に用いた抗原ペプ
チドに対する抗体活性のみられたウエルの細胞は、限界
希釈法等によりクローニングを行うことが望ましい。ク
ローン化された細胞の上清について同様にスクリーニン
グを行い抗体価の高いウエルの細胞を増やすことによ
り、免疫に用いた抗原ペブチドと反応性を示すモノクロ
ーナル抗体産生ハイブリドーマクローンが得られる。こ
のようにしてクローン化されたハイブリドーマを、液体
培地中で増殖させる。具体的には例えば、液体培地たと
えばＲＰＭＩ−１６４０〔Ｍｏｏｒｅ，Ｇ．Ｅ．，ら、
ジャーナル・オブ・アメリカン・メディカル・アソシエ
ーション（Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．）１９９，
５４９（１９６７）〕に約０．１〜４０％の牛血清を加
えた培地等で約２〜１０日間、好ましくは約３〜５日間
培養することにより、培養液から該モノクローナル抗体
を得ることができる。また、哺乳動物の腹腔内に接種
し、細胞を増殖させ、腹水を採取することにより抗体を
取得することが出来る。このためには、例えばマウスを
用いる場合、ミネラルオイル等を前もって接種したＢＡ
ＬＢ／ｃ等のマウスに約１×１０4〜１×１０7個、好ま
しくは約５×１０5〜２×１０6個のハイブリドーマを腹
腔内に接種し、約７〜２０日後、好ましくは約１０〜１
４日後に腹水液を採取する。腹水に生成蓄積した抗体
は、例えば硫安分画、ＤＥＡＥ−セルロースカラムクロ
マトグラフィー等の分離、精製法により、容易にモノク
ローナル抗体を純粋な免疫グロブリンとして単離するこ
とが出来る。このようにして、ヒトＭＡＰキナーゼ（Ｅ
ＲＫ１）などのＭＡＰキナーゼに対するモノクローナル
抗体が得られる。かかるモノクローナル抗体としては、
ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）とヒトＭＡＰキナーゼ
（ＥＲＫ２）又はヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）とラ
ットなどのヒト以外のＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）にお
いて、アミノ酸配列が異なる領域を認識するモノクロー
ナル抗体が好ましく、なかでも、ヒトＭＡＰキナーゼ
（ＥＲＫ１）の３７５〜３７６番目のＶａｌ−Ｌｅｕを
含むカルボキシル末端付近のアミノ酸配列（例えば、Ｉ
ｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｒ
ｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ
−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ、（配列番号：１２）など）
を認識するモノクローナル抗体（例えばＨＥ１１３）が
好ましい。
る抗体の産生の有無についてスクリーニングを行うが、
抗体価のスクリーニングは次の様に行うことが出来る。
即ち、まず第１段階として免疫に用いた抗原ペプチドに
対する抗体産生の有無を、ラジオイムノアッセイ（ＲＩ
Ａ）法またはエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）法等
の方法で調べることが出来るが、これらの方法について
も種々の変法が可能である。好ましい測定法の一例とし
て、ＥＩＡを用いる一つの方法について述べる。セルロ
ースビーズ等の担体に、例えばウサギ抗マウスイムノグ
ロブリン抗体を常法に従ってカップリングさせておき、
これに測定したい培養上清や、マウスの血清を加え、一
定時間、定温（約４〜４０℃を示す。以下においても同
様。）で反応させる。この後、反応物をよく洗った後、
酵素で標識した抗原ペプチド（酵素と抗原ペプチドを常
法に従いカップリングさせた後精製）を加え、一定時
間、定温で反応させる。反応物をよく洗った後、酵素基
質を加え、一定時間、定温で反応させ、その後、生成発
色物を吸光度または蛍光強度等で測定することが出来
る。選択培地で増殖を示し、かつ免疫に用いた抗原ペプ
チドに対する抗体活性のみられたウエルの細胞は、限界
希釈法等によりクローニングを行うことが望ましい。ク
ローン化された細胞の上清について同様にスクリーニン
グを行い抗体価の高いウエルの細胞を増やすことによ
り、免疫に用いた抗原ペブチドと反応性を示すモノクロ
ーナル抗体産生ハイブリドーマクローンが得られる。こ
のようにしてクローン化されたハイブリドーマを、液体
培地中で増殖させる。具体的には例えば、液体培地たと
えばＲＰＭＩ−１６４０〔Ｍｏｏｒｅ，Ｇ．Ｅ．，ら、
ジャーナル・オブ・アメリカン・メディカル・アソシエ
ーション（Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．）１９９，
５４９（１９６７）〕に約０．１〜４０％の牛血清を加
えた培地等で約２〜１０日間、好ましくは約３〜５日間
培養することにより、培養液から該モノクローナル抗体
を得ることができる。また、哺乳動物の腹腔内に接種
し、細胞を増殖させ、腹水を採取することにより抗体を
取得することが出来る。このためには、例えばマウスを
用いる場合、ミネラルオイル等を前もって接種したＢＡ
ＬＢ／ｃ等のマウスに約１×１０4〜１×１０7個、好ま
しくは約５×１０5〜２×１０6個のハイブリドーマを腹
腔内に接種し、約７〜２０日後、好ましくは約１０〜１
４日後に腹水液を採取する。腹水に生成蓄積した抗体
は、例えば硫安分画、ＤＥＡＥ−セルロースカラムクロ
マトグラフィー等の分離、精製法により、容易にモノク
ローナル抗体を純粋な免疫グロブリンとして単離するこ
とが出来る。このようにして、ヒトＭＡＰキナーゼ（Ｅ
ＲＫ１）などのＭＡＰキナーゼに対するモノクローナル
抗体が得られる。かかるモノクローナル抗体としては、
ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）とヒトＭＡＰキナーゼ
（ＥＲＫ２）又はヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）とラ
ットなどのヒト以外のＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）にお
いて、アミノ酸配列が異なる領域を認識するモノクロー
ナル抗体が好ましく、なかでも、ヒトＭＡＰキナーゼ
（ＥＲＫ１）の３７５〜３７６番目のＶａｌ−Ｌｅｕを
含むカルボキシル末端付近のアミノ酸配列（例えば、Ｉ
ｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｒ
ｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ
−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ、（配列番号：１２）など）
を認識するモノクローナル抗体（例えばＨＥ１１３）が
好ましい。
【００１４】本発明のヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）
に対するモノクローナル抗体は、ヒトＭＡＰキナーゼ
（ＥＲＫ１）と高感度に結合することから、ヒトＭＡＰ
キナーゼ（ＥＲＫ１）測定用試薬として極めて有用であ
る。さらに生体臓器、組織中のヒトＭＡＰキナーゼ（Ｅ
ＲＫ１）の測定を容易にすることは、ヒトＭＡＰキナー
ゼ（ＥＲＫ１）に関する基礎知見（例えば生体内分布）
を得る上からも極めて有用である。生体臓器、組織中の
ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）の検出には通常酵素免
疫測定法（ＥＩＡ法）などによる定量、あるいは蛍光抗
体法やＲＩＡ法が用いられるが、なかでもＥＩＡ法が好
ましい。また本発明抗体を用いこれらの臓器、組織中に
存在するヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）の大きさを知
るにはタンパクのウエスタンブロッティング法が有効で
ある。この方法は臓器、組織由来の粗抽出液あるいはそ
の部分精製試料をアクリルアミド電気泳動した後、メン
ブランフィルターにトランスファーし、ＨＲＰ標識抗ヒ
トＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）抗体で検出する。さらに
本発明抗体とヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）との結合
能を利用し、抗体アフィニティーカラムを作製してヒト
ＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）の精製に利用することもで
きる。ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）を検出、定量す
るために用いられる抗体分子は、そのフラクション
｛例、Ｆ（ａｂ′）2，Ｆａｂ′もしくはＦａｂ｝であ
っても良い。なかでも、標識剤を直接結合させる抗体分
子はＦａｂ′であることが好ましい。本発明のモノクロ
ーナル抗体は、このようにヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ
１）の免疫化学的測定法における試薬として用いること
ができる。ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）の免疫化学
的測定法によって、生体組織や細胞のヒトＭＡＰキナー
ゼ（ＥＲＫ１）の量及び活性を測定することができ、こ
れにより、たとえば種々の組織や細胞のヒトＭＡＰキナ
ーゼ（ＥＲＫ１）を測定することにより、種々の疾患に
おけるＭＡＰキナーゼの関与を調べるために役立つと考
えられる。上記免疫学的測定法において、二種の抗体を
用いる測定法を行なうに際しては、一方の抗体として本
発明のモノクローナル抗体を用い、他方の抗体として、
本発明のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体
を用いることができる。このときヒトＭＡＰキナーゼ
（ＥＲＫ１）に対するモノクローナル抗体とポリクロー
ナル抗体との組合せや、ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ
１）に対するモノクローナル抗体と活性型ＭＡＰキナー
ゼに対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗
体との組合せ等を用いることができる。また、測定感度
を上げる目的で３種以上の抗体を適宜組み合わせて用い
ることもできる。
に対するモノクローナル抗体は、ヒトＭＡＰキナーゼ
（ＥＲＫ１）と高感度に結合することから、ヒトＭＡＰ
キナーゼ（ＥＲＫ１）測定用試薬として極めて有用であ
る。さらに生体臓器、組織中のヒトＭＡＰキナーゼ（Ｅ
ＲＫ１）の測定を容易にすることは、ヒトＭＡＰキナー
ゼ（ＥＲＫ１）に関する基礎知見（例えば生体内分布）
を得る上からも極めて有用である。生体臓器、組織中の
ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）の検出には通常酵素免
疫測定法（ＥＩＡ法）などによる定量、あるいは蛍光抗
体法やＲＩＡ法が用いられるが、なかでもＥＩＡ法が好
ましい。また本発明抗体を用いこれらの臓器、組織中に
存在するヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）の大きさを知
るにはタンパクのウエスタンブロッティング法が有効で
ある。この方法は臓器、組織由来の粗抽出液あるいはそ
の部分精製試料をアクリルアミド電気泳動した後、メン
ブランフィルターにトランスファーし、ＨＲＰ標識抗ヒ
トＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）抗体で検出する。さらに
本発明抗体とヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）との結合
能を利用し、抗体アフィニティーカラムを作製してヒト
ＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）の精製に利用することもで
きる。ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）を検出、定量す
るために用いられる抗体分子は、そのフラクション
｛例、Ｆ（ａｂ′）2，Ｆａｂ′もしくはＦａｂ｝であ
っても良い。なかでも、標識剤を直接結合させる抗体分
子はＦａｂ′であることが好ましい。本発明のモノクロ
ーナル抗体は、このようにヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ
１）の免疫化学的測定法における試薬として用いること
ができる。ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）の免疫化学
的測定法によって、生体組織や細胞のヒトＭＡＰキナー
ゼ（ＥＲＫ１）の量及び活性を測定することができ、こ
れにより、たとえば種々の組織や細胞のヒトＭＡＰキナ
ーゼ（ＥＲＫ１）を測定することにより、種々の疾患に
おけるＭＡＰキナーゼの関与を調べるために役立つと考
えられる。上記免疫学的測定法において、二種の抗体を
用いる測定法を行なうに際しては、一方の抗体として本
発明のモノクローナル抗体を用い、他方の抗体として、
本発明のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体
を用いることができる。このときヒトＭＡＰキナーゼ
（ＥＲＫ１）に対するモノクローナル抗体とポリクロー
ナル抗体との組合せや、ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ
１）に対するモノクローナル抗体と活性型ＭＡＰキナー
ゼに対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗
体との組合せ等を用いることができる。また、測定感度
を上げる目的で３種以上の抗体を適宜組み合わせて用い
ることもできる。
【００１５】上記のヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）に
対する抗体の他に、ＭＡＰキナーゼの被リン酸化部位の
アミノ酸配列をリン酸化したペプチド（合成ペプチド）
を免疫原として、活性型ＭＡＰキナーゼに対して特異的
な結合能を有する抗体を作製することに成功した。この
合成ペプチドの一例としては、 Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌ
ｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−（Ｔｈｒ−ＰＯ3Ｈ2）−Ｇｌｕ−
（Ｔｙｒ−ＰＯ3Ｈ2）−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｒ
ｇ （配列番号：１）が挙げられ、これは、ＭＡＰキナ
ーゼが、蛋白質リン酸化酵素として働くためには、ＭＡ
Ｐキナーゼ内の特定の２ヶ所の被リン酸化部位（ヒトＥ
ＲＫ１については２０２残基目のスレオニンと２０４残
基目のチロシン、ヒトＥＲＫ２については１８５残基目
のスレオニンと１８７残基目のチロシン）が、共にリン
酸化されることが必要かつ十分な条件であると考えられ
ているため、その近辺のアミノ酸配列を持ってきたもの
である。
対する抗体の他に、ＭＡＰキナーゼの被リン酸化部位の
アミノ酸配列をリン酸化したペプチド（合成ペプチド）
を免疫原として、活性型ＭＡＰキナーゼに対して特異的
な結合能を有する抗体を作製することに成功した。この
合成ペプチドの一例としては、 Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌ
ｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−（Ｔｈｒ−ＰＯ3Ｈ2）−Ｇｌｕ−
（Ｔｙｒ−ＰＯ3Ｈ2）−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｒ
ｇ （配列番号：１）が挙げられ、これは、ＭＡＰキナ
ーゼが、蛋白質リン酸化酵素として働くためには、ＭＡ
Ｐキナーゼ内の特定の２ヶ所の被リン酸化部位（ヒトＥ
ＲＫ１については２０２残基目のスレオニンと２０４残
基目のチロシン、ヒトＥＲＫ２については１８５残基目
のスレオニンと１８７残基目のチロシン）が、共にリン
酸化されることが必要かつ十分な条件であると考えられ
ているため、その近辺のアミノ酸配列を持ってきたもの
である。
【００１６】活性型ＭＡＰキナーゼに対するポリクロー
ナル抗体を製造するためには、上記合成ペプチドなど免
疫原の部分ペプチドにより直接、またはこれを前記キャ
リヤー蛋白との複合体としてから、温血動物に接種され
る。上記抗体の製造に用いられる温血動物としては、例
えば哺乳温血動物（例、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ラッ
ト、マウス、モルモット、ウマ、ブタ）、鳥類（例、ニ
ワトリ、ハト、アヒル、ガチョウ、ウズラ）などが挙げ
られる。免疫原を、温血動物に接種する方法としては、
動物に接種する免疫原は、抗体産生に有効な量で良く、
例えば、ウサギに１回１ｍｇを１ｍｌの生理食塩水およ
びフロイントの完全アジュバントで乳化して、背部なら
びに後肢掌皮下に４週間おきに５回接種すると抗体を産
生させる場合が多い。このようにして、温血動物中に形
成された抗体を採取する方法としては、例えばウサギで
は、通常最終接種後７日から１２日の間に耳静脈から血
液を採取し、遠心分離して血清として得られる。得られ
た抗血清は、通常、各抗原ペプチドを保持させた担体を
用いるアフィニティクロマトグラフィーで吸着した画分
を回収することによりポリクローナル抗体を精製するこ
とが出来る。活性型ＭＡＰキナーゼに対するモノクロー
ナル抗体の製造に当っては、ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲ
Ｋ１）に対するモノクローナル抗体の製造と同様の方法
が用いられる。
ナル抗体を製造するためには、上記合成ペプチドなど免
疫原の部分ペプチドにより直接、またはこれを前記キャ
リヤー蛋白との複合体としてから、温血動物に接種され
る。上記抗体の製造に用いられる温血動物としては、例
えば哺乳温血動物（例、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ラッ
ト、マウス、モルモット、ウマ、ブタ）、鳥類（例、ニ
ワトリ、ハト、アヒル、ガチョウ、ウズラ）などが挙げ
られる。免疫原を、温血動物に接種する方法としては、
動物に接種する免疫原は、抗体産生に有効な量で良く、
例えば、ウサギに１回１ｍｇを１ｍｌの生理食塩水およ
びフロイントの完全アジュバントで乳化して、背部なら
びに後肢掌皮下に４週間おきに５回接種すると抗体を産
生させる場合が多い。このようにして、温血動物中に形
成された抗体を採取する方法としては、例えばウサギで
は、通常最終接種後７日から１２日の間に耳静脈から血
液を採取し、遠心分離して血清として得られる。得られ
た抗血清は、通常、各抗原ペプチドを保持させた担体を
用いるアフィニティクロマトグラフィーで吸着した画分
を回収することによりポリクローナル抗体を精製するこ
とが出来る。活性型ＭＡＰキナーゼに対するモノクロー
ナル抗体の製造に当っては、ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲ
Ｋ１）に対するモノクローナル抗体の製造と同様の方法
が用いられる。
【００１７】本発明の抗リン酸化ペプチド抗体（活性型
ＭＡＰキナーゼに対する抗体）は、活性型ＭＡＰキナー
ゼと特異的に高感度に結合することから、活性型ＭＡＰ
キナーゼの測定用試薬、言い換えればＭＡＰキナーゼの
活性測定用試薬として極めて有用である。この抗体を用
いることにより、放射性の化合物を用いずに、ＭＡＰキ
ナーゼの活性を検出または定量化することができる。さ
らに、生体臓器、組織中のＭＡＰキナーゼの活性の測定
を容易にすることは、ＭＡＰキナーゼに関する基礎知見
を得る上からも極めて有用である。生体臓器、組織中の
活性型ＭＡＰキナーゼの検出には、通常酵素免疫測定法
（ＥＩＡ）などによる定量、あるいは蛍光抗体法やＲＩ
Ａ法が用いられるが、なかでもＥＩＡ法が好ましい。ま
た、これらの臓器、組織中に存在する活性型ＭＡＰキナ
ーゼの大きさを知るには、ウエスタンブロッティング法
が有効である。この方法は臓器、組織由来の粗抽出液あ
るいはその部分精製試料をアクリルアミド電気泳動した
後、メンブランフィルターにトランスファーし、ＨＲＰ
などで標識した抗活性型ＭＡＰキナーゼ抗体で検出す
る。さらに、本発明の抗活性型ＭＡＰキナーゼ抗体と活
性型ＭＡＰキナーゼとの結合能を利用し、抗体アフィニ
ティカラムを作製して活性型ＭＡＰキナーゼの精製に利
用することもできる。活性型ＭＡＰキナーゼを検出、定
量するために用いられる抗体分子は、そのフラクション
〔例えばＦ（ａｂ’）2、Ｆａｂ’もしくはＦａｂ〕で
あってもよい。なかでも、標識剤を直接結合させる抗体
分子は、Ｆａｂ’であることが好ましい。本発明の抗活
性型ＭＡＰキナーゼ抗体（抗リン酸化ペプチド抗体）
は、このように活性型ＭＡＰキナーゼの免疫化学的測定
法における試薬として用いることができる。活性型ＭＡ
Ｐキナーゼの免疫化学的測定法によって、生体組織や細
胞の活性型ＭＡＰキナーゼの量、言い換えればＭＡＰキ
ナーゼの活性を測定することができ、これにより、種々
の疾患におけるＭＡＰキナーゼの活性化の関与を調べる
ために役立つと考えられる。さらに、本発明の抗ヒトＭ
ＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）抗体（好ましくはモノクロー
ナル抗体）と抗活性型ＭＡＰキナーゼ抗体（抗リン酸化
ペプチド抗体）を組み合わせて用いることにより、例え
ばサンドイッチ酵素免疫測定法で、活性化されたヒトＭ
ＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）のみを、ヒトＭＡＰキナーゼ
（ＥＲＫ２）や他の生物種のＭＡＰキナーゼおよび不活
性型の各酵素と区別して定量することができる。同様
に、種々のＭＡＰキナーゼに特異的な抗体を抗活性型Ｍ
ＡＰキナーゼ抗体と組み合わせれば、それぞれの種の活
性型ＭＡＰキナーゼを定量することができる。例えば、
本発明のＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ２）に特異的に結合す
る抗体と抗活性型ＭＡＰキナーゼ抗体とを組み合わせる
ことにより、活性型のＥＲＫ２のみを定量することがで
きる。言い換えれば、ＥＲＫ１とＥＲＫ２の活性を区別
して測定することが可能となる。
ＭＡＰキナーゼに対する抗体）は、活性型ＭＡＰキナー
ゼと特異的に高感度に結合することから、活性型ＭＡＰ
キナーゼの測定用試薬、言い換えればＭＡＰキナーゼの
活性測定用試薬として極めて有用である。この抗体を用
いることにより、放射性の化合物を用いずに、ＭＡＰキ
ナーゼの活性を検出または定量化することができる。さ
らに、生体臓器、組織中のＭＡＰキナーゼの活性の測定
を容易にすることは、ＭＡＰキナーゼに関する基礎知見
を得る上からも極めて有用である。生体臓器、組織中の
活性型ＭＡＰキナーゼの検出には、通常酵素免疫測定法
（ＥＩＡ）などによる定量、あるいは蛍光抗体法やＲＩ
Ａ法が用いられるが、なかでもＥＩＡ法が好ましい。ま
た、これらの臓器、組織中に存在する活性型ＭＡＰキナ
ーゼの大きさを知るには、ウエスタンブロッティング法
が有効である。この方法は臓器、組織由来の粗抽出液あ
るいはその部分精製試料をアクリルアミド電気泳動した
後、メンブランフィルターにトランスファーし、ＨＲＰ
などで標識した抗活性型ＭＡＰキナーゼ抗体で検出す
る。さらに、本発明の抗活性型ＭＡＰキナーゼ抗体と活
性型ＭＡＰキナーゼとの結合能を利用し、抗体アフィニ
ティカラムを作製して活性型ＭＡＰキナーゼの精製に利
用することもできる。活性型ＭＡＰキナーゼを検出、定
量するために用いられる抗体分子は、そのフラクション
〔例えばＦ（ａｂ’）2、Ｆａｂ’もしくはＦａｂ〕で
あってもよい。なかでも、標識剤を直接結合させる抗体
分子は、Ｆａｂ’であることが好ましい。本発明の抗活
性型ＭＡＰキナーゼ抗体（抗リン酸化ペプチド抗体）
は、このように活性型ＭＡＰキナーゼの免疫化学的測定
法における試薬として用いることができる。活性型ＭＡ
Ｐキナーゼの免疫化学的測定法によって、生体組織や細
胞の活性型ＭＡＰキナーゼの量、言い換えればＭＡＰキ
ナーゼの活性を測定することができ、これにより、種々
の疾患におけるＭＡＰキナーゼの活性化の関与を調べる
ために役立つと考えられる。さらに、本発明の抗ヒトＭ
ＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）抗体（好ましくはモノクロー
ナル抗体）と抗活性型ＭＡＰキナーゼ抗体（抗リン酸化
ペプチド抗体）を組み合わせて用いることにより、例え
ばサンドイッチ酵素免疫測定法で、活性化されたヒトＭ
ＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）のみを、ヒトＭＡＰキナーゼ
（ＥＲＫ２）や他の生物種のＭＡＰキナーゼおよび不活
性型の各酵素と区別して定量することができる。同様
に、種々のＭＡＰキナーゼに特異的な抗体を抗活性型Ｍ
ＡＰキナーゼ抗体と組み合わせれば、それぞれの種の活
性型ＭＡＰキナーゼを定量することができる。例えば、
本発明のＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ２）に特異的に結合す
る抗体と抗活性型ＭＡＰキナーゼ抗体とを組み合わせる
ことにより、活性型のＥＲＫ２のみを定量することがで
きる。言い換えれば、ＥＲＫ１とＥＲＫ２の活性を区別
して測定することが可能となる。
【００１８】種々のＭＡＰキナーゼに特異的な抗体を製
造するには、ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）またはヒ
トＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ２）、あるいはそのムテイン
または部分ペプチドなどを哺乳動物に免疫し、ポリクロ
ナール抗体の場合には、その血清を精製することによ
り、得ることができる。また、モノクローナル抗体の場
合には、免疫した動物の脾臓細胞と哺乳動物のリンパ球
様細胞とを細胞融合させ、次いでクローン化することに
より製造される。ＭＡＰキナーゼ、そのムテインまたは
その部分ペプチドを免疫するに際しては、ＭＡＰキナー
ゼをキャリヤー蛋白との複合体としてから、これを免疫
に用いてもよい。該キャリヤー蛋白としては、たとえば
ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン、ヘモシア
ニンなどが挙げられる。キャリヤー蛋白複合体を用いる
場合に、キャリヤー蛋白とＭＡＰキナーゼとのカップリ
ング比率は、約０．１〜３０倍（キャリヤー／ＭＡＰキ
ナーゼ：重量比）で用いられる。望ましくは約０．５〜
５倍が用いられる。また、ハプテンとキャリヤーとのカ
ップリングには、種々の縮合剤を用いることが出来る
が、グルタルアルデヒドやカルボジイミド等が好都合に
用いられる。ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）の部分ペ
プチドとしては、図６のヒトＥＲＫ１（配列番号：８）
の内の５４〜７１番目の配列に相当するｐｅｐｔｉｄｅ
（配列番号：９）、１９４〜２０９番目の配列に相当
するｐｅｐｔｉｄｅ（配列番号：１０）、２８３〜３
００番目の配列に相当するｐｅｐｔｉｄｅ（配列番
号：１１）、３６４〜３７９番目の配列に相当するｐｅ
ｐｔｉｄｅ（配列番号：１２）およびこれらのアミノ
酸末端にＣｙｓを付加したペプチド（配列番号：１３，
６，２，３）等が挙げられる。ヒトＭＡＰキナーゼ（Ｅ
ＲＫ２）の部分ペプチドとしては、図１１のヒトＥＲＫ
２（配列番号：１４）の内の２６６〜２８３番目の配列
に相当するｐｅｐｔｉｄｅ（配列番号：１５）、３４
７〜３６０番目の配列に相当するｐｅｐｔｉｄｅ（配
列番号：１６）およびこれらのアミノ酸末端にＣｙｓを
付加したペプチド（配列番号：４，５）等が挙げられ
る。
造するには、ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）またはヒ
トＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ２）、あるいはそのムテイン
または部分ペプチドなどを哺乳動物に免疫し、ポリクロ
ナール抗体の場合には、その血清を精製することによ
り、得ることができる。また、モノクローナル抗体の場
合には、免疫した動物の脾臓細胞と哺乳動物のリンパ球
様細胞とを細胞融合させ、次いでクローン化することに
より製造される。ＭＡＰキナーゼ、そのムテインまたは
その部分ペプチドを免疫するに際しては、ＭＡＰキナー
ゼをキャリヤー蛋白との複合体としてから、これを免疫
に用いてもよい。該キャリヤー蛋白としては、たとえば
ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン、ヘモシア
ニンなどが挙げられる。キャリヤー蛋白複合体を用いる
場合に、キャリヤー蛋白とＭＡＰキナーゼとのカップリ
ング比率は、約０．１〜３０倍（キャリヤー／ＭＡＰキ
ナーゼ：重量比）で用いられる。望ましくは約０．５〜
５倍が用いられる。また、ハプテンとキャリヤーとのカ
ップリングには、種々の縮合剤を用いることが出来る
が、グルタルアルデヒドやカルボジイミド等が好都合に
用いられる。ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）の部分ペ
プチドとしては、図６のヒトＥＲＫ１（配列番号：８）
の内の５４〜７１番目の配列に相当するｐｅｐｔｉｄｅ
（配列番号：９）、１９４〜２０９番目の配列に相当
するｐｅｐｔｉｄｅ（配列番号：１０）、２８３〜３
００番目の配列に相当するｐｅｐｔｉｄｅ（配列番
号：１１）、３６４〜３７９番目の配列に相当するｐｅ
ｐｔｉｄｅ（配列番号：１２）およびこれらのアミノ
酸末端にＣｙｓを付加したペプチド（配列番号：１３，
６，２，３）等が挙げられる。ヒトＭＡＰキナーゼ（Ｅ
ＲＫ２）の部分ペプチドとしては、図１１のヒトＥＲＫ
２（配列番号：１４）の内の２６６〜２８３番目の配列
に相当するｐｅｐｔｉｄｅ（配列番号：１５）、３４
７〜３６０番目の配列に相当するｐｅｐｔｉｄｅ（配
列番号：１６）およびこれらのアミノ酸末端にＣｙｓを
付加したペプチド（配列番号：４，５）等が挙げられ
る。
【００１９】ＭＡＰキナーゼまたは複合体を用いて免疫
するに際し、ポリクローナル抗体を製造するためには、
上記合成ペプチドなど免疫原の部分ペプチドにより直
接、またはこれを前記キャリヤー蛋白との複合体として
から、温血動物に接種される。上記抗体の製造に用いら
れる温血動物としては、例えば哺乳温血動物（例、ウサ
ギ、ヒツジ、ウシ、ラット、マウス、モルモット、ウ
マ、ブタ）、鳥類（例、ニワトリ、ハト、アヒル、ガチ
ョウ、ウズラ）などが挙げられる。免疫原を、温血動物
に接種する方法としては、動物に接種する免疫原は、抗
体産生に有効な量で良く、例えば、ウサギに１回１ｍｇ
を１ｍｌの生理食塩水およびフロイントの完全アジュバ
ントで乳化して、背部ならびに後肢掌皮下に４週間おき
に５回接種すると抗体を産生させる場合が多い。このよ
うにして、温血動物中に形成された抗体を採取する方法
としては、例えばウサギでは、通常最終接種後７日から
１２日の間に耳静脈から血液を採取し、遠心分離して血
清として得られる。得られた抗血清は、通常、各抗原ペ
プチドを保持させた担体を用いるアフィニティクロマト
グラフィーで吸着した画分を回収することによりポリク
ローナル抗体を精製することが出来る。
するに際し、ポリクローナル抗体を製造するためには、
上記合成ペプチドなど免疫原の部分ペプチドにより直
接、またはこれを前記キャリヤー蛋白との複合体として
から、温血動物に接種される。上記抗体の製造に用いら
れる温血動物としては、例えば哺乳温血動物（例、ウサ
ギ、ヒツジ、ウシ、ラット、マウス、モルモット、ウ
マ、ブタ）、鳥類（例、ニワトリ、ハト、アヒル、ガチ
ョウ、ウズラ）などが挙げられる。免疫原を、温血動物
に接種する方法としては、動物に接種する免疫原は、抗
体産生に有効な量で良く、例えば、ウサギに１回１ｍｇ
を１ｍｌの生理食塩水およびフロイントの完全アジュバ
ントで乳化して、背部ならびに後肢掌皮下に４週間おき
に５回接種すると抗体を産生させる場合が多い。このよ
うにして、温血動物中に形成された抗体を採取する方法
としては、例えばウサギでは、通常最終接種後７日から
１２日の間に耳静脈から血液を採取し、遠心分離して血
清として得られる。得られた抗血清は、通常、各抗原ペ
プチドを保持させた担体を用いるアフィニティクロマト
グラフィーで吸着した画分を回収することによりポリク
ローナル抗体を精製することが出来る。
【００２０】モノクロナール抗体を得るためには、免疫
する動物は、ラット、マウスが好ましい。免疫方法は、
例えばマウスを免疫する場合、腹腔内、静脈内、筋肉
内、皮内、皮下等のいずれのルートからでも可能である
が、主として皮下、腹腔内、静脈内に（とりわけ皮下）
注入するのが好ましい。また、免疫間隔、免疫量等も可
変度は高く、種々の方法が可能であるが、たとえば２週
間隔で約２〜６回免疫し、最終免疫後、約１〜５日、好
ましくは約２〜４日後に摘出した脾臓細胞を用いる方法
がよく用いられる。免疫量は１回にペプチド量として、
マウス当り約０．１μｇ以上、好ましくは約１０μｇ〜
３００μｇ用いることが望ましい。又、脾臓を摘出する
前には、部分採血を行い、血中の抗体価の上昇を確認し
た上で、脾臓細胞を用いる融合を行うことが望ましい。
上記の細胞融合は例えば摘出したマウスの脾臓細胞を、
ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフ
ェラーゼ欠損（ＨＧＰＲＴ~）や、チミジンキナーゼ欠
損（ＴＫ~）の様なマーカーを持った適切な同種または
異種（好ましくは同種）のミエローマ〔例、Ｐ３−Ｘ６
３−Ａｇ・８Ｕ１（市森他 ジャーナル・オブ・イムノ
ロジカル・メソッド、第８０巻、第５５頁（１９８
５）〕等の、リンパ球様細胞株との間で融合させる。例
えばケーラーおよびミルスタインらの方法〔ネイチャー
（Ｎａｔｕｒｅ）第２５６巻、第４９５頁（１９７
５）〕に準じ融合させることにより製造される。たとえ
ばミエローマ細胞と脾細胞とを約１：５の割合で、たと
えばイスコフ培地とハムＦ−１２培地を１：１に混合し
た培地（以下ＩＨ培地と称する。）に懸濁させ、センダ
イウイルス、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の融
合剤が用いて融合することができる。もちろんジメチル
スルホキシド（ＤＭＳＯ）その他の融合促進剤をこれら
に替えて加えることも可能である。ＰＥＧの平均分子量
は、ふつう約１０００〜９０００、反応時間は約０．５
〜３０分、濃度は約１０％〜８０％等が用いられるが、
好ましい条件の一例として、ＰＥＧ６０００を約３５〜
５５％で約４〜１０分処理することにより、効率よく融
合させることが出来る。融合細胞は、ヒポキサンチン−
アミノプテリン−チミジン培地〔ＨＡＴ培地：ネイチャ
ー、第２５６巻、第４９５頁（１９７５）〕等を用い
て、選択的に増殖させることが出来る。
する動物は、ラット、マウスが好ましい。免疫方法は、
例えばマウスを免疫する場合、腹腔内、静脈内、筋肉
内、皮内、皮下等のいずれのルートからでも可能である
が、主として皮下、腹腔内、静脈内に（とりわけ皮下）
注入するのが好ましい。また、免疫間隔、免疫量等も可
変度は高く、種々の方法が可能であるが、たとえば２週
間隔で約２〜６回免疫し、最終免疫後、約１〜５日、好
ましくは約２〜４日後に摘出した脾臓細胞を用いる方法
がよく用いられる。免疫量は１回にペプチド量として、
マウス当り約０．１μｇ以上、好ましくは約１０μｇ〜
３００μｇ用いることが望ましい。又、脾臓を摘出する
前には、部分採血を行い、血中の抗体価の上昇を確認し
た上で、脾臓細胞を用いる融合を行うことが望ましい。
上記の細胞融合は例えば摘出したマウスの脾臓細胞を、
ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフ
ェラーゼ欠損（ＨＧＰＲＴ~）や、チミジンキナーゼ欠
損（ＴＫ~）の様なマーカーを持った適切な同種または
異種（好ましくは同種）のミエローマ〔例、Ｐ３−Ｘ６
３−Ａｇ・８Ｕ１（市森他 ジャーナル・オブ・イムノ
ロジカル・メソッド、第８０巻、第５５頁（１９８
５）〕等の、リンパ球様細胞株との間で融合させる。例
えばケーラーおよびミルスタインらの方法〔ネイチャー
（Ｎａｔｕｒｅ）第２５６巻、第４９５頁（１９７
５）〕に準じ融合させることにより製造される。たとえ
ばミエローマ細胞と脾細胞とを約１：５の割合で、たと
えばイスコフ培地とハムＦ−１２培地を１：１に混合し
た培地（以下ＩＨ培地と称する。）に懸濁させ、センダ
イウイルス、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の融
合剤が用いて融合することができる。もちろんジメチル
スルホキシド（ＤＭＳＯ）その他の融合促進剤をこれら
に替えて加えることも可能である。ＰＥＧの平均分子量
は、ふつう約１０００〜９０００、反応時間は約０．５
〜３０分、濃度は約１０％〜８０％等が用いられるが、
好ましい条件の一例として、ＰＥＧ６０００を約３５〜
５５％で約４〜１０分処理することにより、効率よく融
合させることが出来る。融合細胞は、ヒポキサンチン−
アミノプテリン−チミジン培地〔ＨＡＴ培地：ネイチャ
ー、第２５６巻、第４９５頁（１９７５）〕等を用い
て、選択的に増殖させることが出来る。
【００２１】増殖してきた細胞の培養上清は、目的とす
る抗体の産生の有無についてスクリーニングを行うが、
抗体価のスクリーニングは次の様に行うことが出来る。
即ち、まず第１段階として免疫に用いた抗原ペプチドに
対する抗体産生の有無を、ラジオイムノアッセイ（ＲＩ
Ａ）法またはエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）法等
の方法で調べることが出来るが、これらの方法について
も種々の変法が可能である。好ましい測定法の一例とし
て、ＥＩＡを用いる一つの方法について述べる。セルロ
ースビーズ等の担体に、例えばウサギ抗マウスイムノグ
ロブリン抗体を常法に従ってカップリングさせておき、
これに測定したい培養上清や、マウスの血清を加え、一
定時間、定温（約４〜４０℃を示す。以下においても同
様。）で反応させる。この後、反応物をよく洗った後、
酵素で標識した抗原ペプチド（酵素と抗原ペプチドを常
法に従いカップリングさせた後精製）を加え、一定時
間、定温で反応させる。反応物をよく洗った後、酵素基
質を加え、一定時間、定温で反応させ、その後、生成発
色物を吸光度または蛍光強度等で測定することが出来
る。選択培地で増殖を示し、かつ免疫に用いた抗原ペプ
チドに対する抗体活性のみられたウエルの細胞は、限界
希釈法等によりクローニングを行うことが望ましい。ク
ローン化された細胞の上清について同様にスクリーニン
グを行い抗体価の高いウエルの細胞を増やすことによ
り、免疫に用いた抗原ペブチドと反応性を示すモノクロ
ーナル抗体産生ハイブリドーマクローンが得られる。こ
のようにしてクローン化されたハイブリドーマを、液体
培地中で増殖させる。具体的には例えば、液体培地たと
えばＲＰＭＩ−１６４０〔Ｍｏｏｒｅ，Ｇ．Ｅ．，ら、
ジャーナル・オブ・アメリカン・メディカル・アソシエ
ーション（Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．）１９９，
５４９（１９６７）〕に約０．１〜４０％の牛血清を加
えた培地等で約２〜１０日間、好ましくは約３〜５日間
培養することにより、培養液から該モノクローナル抗体
を得ることができる。また、哺乳動物の腹腔内に接種
し、細胞を増殖させ、腹水を採取することにより抗体を
取得することが出来る。このためには、例えばマウスを
用いる場合、ミネラルオイル等を前もって接種したＢＡ
ＬＢ／ｃ等のマウスに約１×１０4〜１×１０7個、好ま
しくは約５×１０5〜２×１０6個のハイブリドーマを腹
腔内に接種し、約７〜２０日後、好ましくは約１０〜１
４日後に腹水液を採取する。腹水に生成蓄積した抗体
は、例えば硫安分画、ＤＥＡＥ−セルロースカラムクロ
マトグラフィー等の分離、精製法により、容易にモノク
ローナル抗体を純粋な免疫グロブリンとして単離するこ
とが出来る。このようにして、ＭＡＰキナーゼに対する
モノクローナル抗体が得られる。
る抗体の産生の有無についてスクリーニングを行うが、
抗体価のスクリーニングは次の様に行うことが出来る。
即ち、まず第１段階として免疫に用いた抗原ペプチドに
対する抗体産生の有無を、ラジオイムノアッセイ（ＲＩ
Ａ）法またはエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）法等
の方法で調べることが出来るが、これらの方法について
も種々の変法が可能である。好ましい測定法の一例とし
て、ＥＩＡを用いる一つの方法について述べる。セルロ
ースビーズ等の担体に、例えばウサギ抗マウスイムノグ
ロブリン抗体を常法に従ってカップリングさせておき、
これに測定したい培養上清や、マウスの血清を加え、一
定時間、定温（約４〜４０℃を示す。以下においても同
様。）で反応させる。この後、反応物をよく洗った後、
酵素で標識した抗原ペプチド（酵素と抗原ペプチドを常
法に従いカップリングさせた後精製）を加え、一定時
間、定温で反応させる。反応物をよく洗った後、酵素基
質を加え、一定時間、定温で反応させ、その後、生成発
色物を吸光度または蛍光強度等で測定することが出来
る。選択培地で増殖を示し、かつ免疫に用いた抗原ペプ
チドに対する抗体活性のみられたウエルの細胞は、限界
希釈法等によりクローニングを行うことが望ましい。ク
ローン化された細胞の上清について同様にスクリーニン
グを行い抗体価の高いウエルの細胞を増やすことによ
り、免疫に用いた抗原ペブチドと反応性を示すモノクロ
ーナル抗体産生ハイブリドーマクローンが得られる。こ
のようにしてクローン化されたハイブリドーマを、液体
培地中で増殖させる。具体的には例えば、液体培地たと
えばＲＰＭＩ−１６４０〔Ｍｏｏｒｅ，Ｇ．Ｅ．，ら、
ジャーナル・オブ・アメリカン・メディカル・アソシエ
ーション（Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．）１９９，
５４９（１９６７）〕に約０．１〜４０％の牛血清を加
えた培地等で約２〜１０日間、好ましくは約３〜５日間
培養することにより、培養液から該モノクローナル抗体
を得ることができる。また、哺乳動物の腹腔内に接種
し、細胞を増殖させ、腹水を採取することにより抗体を
取得することが出来る。このためには、例えばマウスを
用いる場合、ミネラルオイル等を前もって接種したＢＡ
ＬＢ／ｃ等のマウスに約１×１０4〜１×１０7個、好ま
しくは約５×１０5〜２×１０6個のハイブリドーマを腹
腔内に接種し、約７〜２０日後、好ましくは約１０〜１
４日後に腹水液を採取する。腹水に生成蓄積した抗体
は、例えば硫安分画、ＤＥＡＥ−セルロースカラムクロ
マトグラフィー等の分離、精製法により、容易にモノク
ローナル抗体を純粋な免疫グロブリンとして単離するこ
とが出来る。このようにして、ＭＡＰキナーゼに対する
モノクローナル抗体が得られる。
【００２２】本発明の抗ＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）抗
体は、ヒトおよびラットのＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）
に結合能を有するが、ヒトおよびラットのＭＡＰキナー
ゼ（ＥＲＫ２）には結合しない。一方、本発明の抗ＭＡ
Ｐキナーゼ（ＥＲＫ２）抗体は、ヒトおよびラットのＭ
ＡＰキナーゼ（ＥＲＫ２）に結合能を有するが、ヒトお
よびラットのＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）には結合しな
い。このことから、これらの抗体は、各ＭＡＰキナーゼ
の検出、測定、精製などの免疫化学的な研究における試
薬として用いることができる。
体は、ヒトおよびラットのＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）
に結合能を有するが、ヒトおよびラットのＭＡＰキナー
ゼ（ＥＲＫ２）には結合しない。一方、本発明の抗ＭＡ
Ｐキナーゼ（ＥＲＫ２）抗体は、ヒトおよびラットのＭ
ＡＰキナーゼ（ＥＲＫ２）に結合能を有するが、ヒトお
よびラットのＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）には結合しな
い。このことから、これらの抗体は、各ＭＡＰキナーゼ
の検出、測定、精製などの免疫化学的な研究における試
薬として用いることができる。
【００２３】さらに生体臓器、組織中のＭＡＰキナーゼ
の測定を容易にすることは、ＭＡＰキナーゼに関する基
礎知見（例えば生体内分布）を得る上からも極めて有用
である。生体臓器、組織中のＭＡＰキナーゼの検出には
通常酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）などによる定量、ある
いは蛍光抗体法やＲＩＡ法が用いられるが、なかでもＥ
ＩＡ法が好ましい。また本発明抗体を用いこれらの臓
器、組織中に存在するＭＡＰキナーゼの大きさを知るに
はタンパクのウエスタンブロッティング法が有効であ
る。この方法は臓器、組織由来の粗抽出液あるいはその
部分精製試料をアクリルアミド電気泳動した後、メンブ
ランフィルターにトランスファーし、ＨＲＰ標識抗ＭＡ
Ｐキナーゼ抗体で検出する。さらに本発明抗体とＭＡＰ
キナーゼとの結合能を利用し、抗体アフィニティーカラ
ムを作製してＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１もしくはＥＲＫ
２）の精製に利用することもできる。ＭＡＰキナーゼを
検出、定量するために用いられる抗体分子は、そのフラ
クション｛例、Ｆ（ａｂ′）2，Ｆａｂ′もしくはＦａ
ｂ｝であっても良い。なかでも、標識剤を直接結合させ
る抗体分子はＦａｂ′であることが好ましい。本発明の
抗体は、このようにＭＡＰキナーゼの免疫化学的測定法
における試薬として用いることができる。ＭＡＰキナー
ゼの免疫化学的測定法によって、生体組織や細胞のＭＡ
Ｐキナーゼの量及び活性を測定することができ、これに
より、たとえば種々の組織や細胞のＭＡＰキナーゼの量
や活性を測定することにより、種々の疾患におけるＭＡ
Ｐキナーゼの関与を調べるために役立つと考えられ、種
々のＭＡＰキナーゼ関連疾患の診断や原因の究明にも、
本発明の測定法を適用することができる。例えば、患部
の組織や細胞におけるＭＡＰキナーゼの量や活性の程度
を正常な組織や細胞での値と比較し、診断の確定、疾患
の分類、適切な治療法・薬物の選択、疾患の原因の究明
等を行うことが可能になる。該疾患としてはＭＡＰキナ
ーゼの量や活性の変化に起因する疾患であればいずれで
もよく、例えばガン関連疾患（脳腫瘍、胃癌、肺癌、甲
状腺癌、膵臓癌、白血病など）、代謝異常（糖尿病な
ど）、循環器系疾患（動脈硬化など）、アレルギー性疾
患（喘息、花粉症、アトピー性皮膚炎など）、中枢神経
疾患（アルツハイマー病、パーキンソン病、老人性痴呆
など）、骨および関節疾患（リューマチなど）などが挙
げられる。また本測定法を使うことにより、種々の薬物
の作用機作を解明することができる。すなわち、様々な
組織や細胞内のＭＡＰキナーゼの量や活性の変化を薬物
の存在下と非存在下で比較することにより、その薬物の
作用点を解明することが可能である。上記免疫学的測定
法において、二種の抗体を用いる測定法を行なうに際し
ては、本発明の抗体を組み合わせて用いることができ
る。また、測定感度を上げる目的で３種以上の抗体を適
宜組み合わせて用いることもできる。
の測定を容易にすることは、ＭＡＰキナーゼに関する基
礎知見（例えば生体内分布）を得る上からも極めて有用
である。生体臓器、組織中のＭＡＰキナーゼの検出には
通常酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）などによる定量、ある
いは蛍光抗体法やＲＩＡ法が用いられるが、なかでもＥ
ＩＡ法が好ましい。また本発明抗体を用いこれらの臓
器、組織中に存在するＭＡＰキナーゼの大きさを知るに
はタンパクのウエスタンブロッティング法が有効であ
る。この方法は臓器、組織由来の粗抽出液あるいはその
部分精製試料をアクリルアミド電気泳動した後、メンブ
ランフィルターにトランスファーし、ＨＲＰ標識抗ＭＡ
Ｐキナーゼ抗体で検出する。さらに本発明抗体とＭＡＰ
キナーゼとの結合能を利用し、抗体アフィニティーカラ
ムを作製してＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１もしくはＥＲＫ
２）の精製に利用することもできる。ＭＡＰキナーゼを
検出、定量するために用いられる抗体分子は、そのフラ
クション｛例、Ｆ（ａｂ′）2，Ｆａｂ′もしくはＦａ
ｂ｝であっても良い。なかでも、標識剤を直接結合させ
る抗体分子はＦａｂ′であることが好ましい。本発明の
抗体は、このようにＭＡＰキナーゼの免疫化学的測定法
における試薬として用いることができる。ＭＡＰキナー
ゼの免疫化学的測定法によって、生体組織や細胞のＭＡ
Ｐキナーゼの量及び活性を測定することができ、これに
より、たとえば種々の組織や細胞のＭＡＰキナーゼの量
や活性を測定することにより、種々の疾患におけるＭＡ
Ｐキナーゼの関与を調べるために役立つと考えられ、種
々のＭＡＰキナーゼ関連疾患の診断や原因の究明にも、
本発明の測定法を適用することができる。例えば、患部
の組織や細胞におけるＭＡＰキナーゼの量や活性の程度
を正常な組織や細胞での値と比較し、診断の確定、疾患
の分類、適切な治療法・薬物の選択、疾患の原因の究明
等を行うことが可能になる。該疾患としてはＭＡＰキナ
ーゼの量や活性の変化に起因する疾患であればいずれで
もよく、例えばガン関連疾患（脳腫瘍、胃癌、肺癌、甲
状腺癌、膵臓癌、白血病など）、代謝異常（糖尿病な
ど）、循環器系疾患（動脈硬化など）、アレルギー性疾
患（喘息、花粉症、アトピー性皮膚炎など）、中枢神経
疾患（アルツハイマー病、パーキンソン病、老人性痴呆
など）、骨および関節疾患（リューマチなど）などが挙
げられる。また本測定法を使うことにより、種々の薬物
の作用機作を解明することができる。すなわち、様々な
組織や細胞内のＭＡＰキナーゼの量や活性の変化を薬物
の存在下と非存在下で比較することにより、その薬物の
作用点を解明することが可能である。上記免疫学的測定
法において、二種の抗体を用いる測定法を行なうに際し
ては、本発明の抗体を組み合わせて用いることができ
る。また、測定感度を上げる目的で３種以上の抗体を適
宜組み合わせて用いることもできる。
【００２４】ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）などＭＡ
Ｐキナーゼのまたは活性型ＭＡＰキナーゼの測定方法に
おいて用いられる担体上に保持された抗体（固相抗体）
における担体としては、例えば、ゲル粒子（例、アガロ
ースゲル〔例、セファロース４Ｂ、セファロース６Ｂ
（商品名、ファルマシア・ファインケミカル社（スエー
デン）製）〕、デキストランゲル〔例、セファデックス
Ｇ−７５、セファデックスＧ−１００、セファデックス
Ｇ−２００（登録商標、ファルマシア・ファインケミカ
ル社（スエーデン）製）〕、ポリアクリルアミドゲル
〔例、バイオゲルＰ−３０、バイオゲルＰ−６０、バイ
オゲルＰ−１００（登録商標、バイオラッド・ラボラト
リーズ社（米国）製）〕、セルロース粒子〔例、アビセ
ル（登録商標、旭化成製）、イオン交換セルロース
（例、ジエチルアミノエチルセルロース、カルボキシメ
チルセルロース）〕、物理的吸着剤〔例、ガラス（例、
ガラス球、ガラスロッド、アミノアルキルガラス球、ア
ミノアルキルガラスロッド）、シリコン片、スチレン系
樹脂（例、ポリスチレン球、ポリスチレン粒子）、イム
ノアッセイ用プレート（例、ヌンク社（デンマーク）
製〕、イオン交換樹脂｛例、弱酸性陽イオン交換樹脂
〔例、アンバーライトＩＲＣ−５（登録商標、ローム・
アンド・ハース社（米国）製）、ゼオカーブ２２６（商
品名、パームチット社（西ドイツ）製）〕、弱塩基性陰
イオン交換樹脂〔例、アンバーライトＩＲ−４Ｂ、ダウ
エックス３（登録商標、ダウケミカル社（米国）製〕｝
などが挙げられる。担体に抗体を保持させるためには、
公知の常套手段を応用し得るが、例えば、“代謝”、第
８巻、第６９６頁（１９７１年）に記載されているプロ
ムシアン法、グルタールアルデヒド法などが挙げられ
る。また、より簡便な方法として物理的に担体表面に吸
着させてもよい。標識剤を結合させた抗体（標識抗体）
における標識剤としては、放射性同位元素、酵素、蛍光
物質、発光物質などが挙げられるが、酵素を用いるのが
好ましい。酵素としては、安定で非活性の大きなものが
好ましく、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファター
ゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダー
ゼ等を用いることができるが、ペルオキシダーゼが好ま
しい。ペルオキシダーゼとしては、種々の起源のものを
用いることができるが、その例としてはたとえば西洋わ
さび、パイナップル、イチジク、甘藷、ソラマメ、トウ
モロコシなどから得られるペルオキシダーゼが挙げら
れ、特に西洋わさびから抽出されたホースラディッシュ
ペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒ
ｏｘｉｄａｓｅ）（ＨＲＰ）が好ましい。
Ｐキナーゼのまたは活性型ＭＡＰキナーゼの測定方法に
おいて用いられる担体上に保持された抗体（固相抗体）
における担体としては、例えば、ゲル粒子（例、アガロ
ースゲル〔例、セファロース４Ｂ、セファロース６Ｂ
（商品名、ファルマシア・ファインケミカル社（スエー
デン）製）〕、デキストランゲル〔例、セファデックス
Ｇ−７５、セファデックスＧ−１００、セファデックス
Ｇ−２００（登録商標、ファルマシア・ファインケミカ
ル社（スエーデン）製）〕、ポリアクリルアミドゲル
〔例、バイオゲルＰ−３０、バイオゲルＰ−６０、バイ
オゲルＰ−１００（登録商標、バイオラッド・ラボラト
リーズ社（米国）製）〕、セルロース粒子〔例、アビセ
ル（登録商標、旭化成製）、イオン交換セルロース
（例、ジエチルアミノエチルセルロース、カルボキシメ
チルセルロース）〕、物理的吸着剤〔例、ガラス（例、
ガラス球、ガラスロッド、アミノアルキルガラス球、ア
ミノアルキルガラスロッド）、シリコン片、スチレン系
樹脂（例、ポリスチレン球、ポリスチレン粒子）、イム
ノアッセイ用プレート（例、ヌンク社（デンマーク）
製〕、イオン交換樹脂｛例、弱酸性陽イオン交換樹脂
〔例、アンバーライトＩＲＣ−５（登録商標、ローム・
アンド・ハース社（米国）製）、ゼオカーブ２２６（商
品名、パームチット社（西ドイツ）製）〕、弱塩基性陰
イオン交換樹脂〔例、アンバーライトＩＲ−４Ｂ、ダウ
エックス３（登録商標、ダウケミカル社（米国）製〕｝
などが挙げられる。担体に抗体を保持させるためには、
公知の常套手段を応用し得るが、例えば、“代謝”、第
８巻、第６９６頁（１９７１年）に記載されているプロ
ムシアン法、グルタールアルデヒド法などが挙げられ
る。また、より簡便な方法として物理的に担体表面に吸
着させてもよい。標識剤を結合させた抗体（標識抗体）
における標識剤としては、放射性同位元素、酵素、蛍光
物質、発光物質などが挙げられるが、酵素を用いるのが
好ましい。酵素としては、安定で非活性の大きなものが
好ましく、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファター
ゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダー
ゼ等を用いることができるが、ペルオキシダーゼが好ま
しい。ペルオキシダーゼとしては、種々の起源のものを
用いることができるが、その例としてはたとえば西洋わ
さび、パイナップル、イチジク、甘藷、ソラマメ、トウ
モロコシなどから得られるペルオキシダーゼが挙げら
れ、特に西洋わさびから抽出されたホースラディッシュ
ペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒ
ｏｘｉｄａｓｅ）（ＨＲＰ）が好ましい。
【００２５】ペルオキシダーゼと抗体を結合するにあた
り、抗体分子としてのＦａｂ′のチオール基を利用する
ために、あらかじめペルオキシダーゼにマレイミド基を
導入したものを用いると好都合である。マレイミド基を
ペルオキシダーゼに導入する方法としては、ペルオキシ
ダーゼのアミノ基を介してマレイミド基を導入すること
ができる。そのためには、Ｎ−サクシニミジル−マレイ
ミド−カルボキシレート誘導体を用いることができ、好
ましくは、Ｎ−（γ−マレイミドブチルオキシ）サクシ
イミド（ＧＭＢＳと略称することもある）などが良い。
従って、マレイミド基とペルオキシダーゼとの間に一定
の基が入っていることとなってもよい。ＧＭＢＳをペル
オキシダーゼに反応させるには、両者を、ｐＨ約６ない
し８の緩衝液中で約１０ないし５０℃の温度で約１０分
ないし２４時間反応させることによって行われる。該緩
衝液としては、たとえば、ｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸
緩衝液などが挙げられる。このようにして得られたマレ
イミド化ペルオキシダーゼは、たとえばゲルクロマトグ
ラフィーなどにより精製することができる。該ゲルクロ
マトグラフィーを行う際に用いられる担体としては、例
えば、セファデックスＧ−２５〔登録商標、ファルマシ
ア・ファインケミカル社（スエーデン）製〕、バイオゲ
ルＰ−２〔登録商標、バイオラッド・ラボラトリーズ社
（米国）製〕などが挙げられる。マレイミド化ペルオキ
シダーゼと抗体分子との反応は、両者を緩衝液中で約０
℃ないし４０℃の温度で、約１ないし４８時間反応させ
ることにより行うことができる。該緩衝液としては、た
とえば、ｐＨ６．０の５ｍＭエチレンジアミン四酢酸ナ
トリウム塩を含む０．１Ｍリン酸緩衝液などが挙げられ
る。このようにして得られたペルオキシダーゼ標識抗体
は、たとえばゲルクロマトグラフィーなどにより精製す
ることができる。該ゲルクロマトグラフィーを行う際に
用いられる担体としては、例えば、セファデックスＧ−
２５〔ファルマシア・ファインケミカル社（スエーデ
ン）製〕、バイオゲルＰ−２〔バイオラッド・ラボラト
リーズ社（米国）製〕などが挙げられる。さらに、ペル
オキシダーゼにチオール基を導入し、マレイミド化され
た抗体分子と反応させても良い。ペルオキシダーゼ以外
の酵素を抗体に直接結合させるには、ペルオキシダーゼ
の場合に準じて行なうことができ、また、自体公知のグ
ルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸法、水溶性カルボジイ
ミド法などが用いられる。
り、抗体分子としてのＦａｂ′のチオール基を利用する
ために、あらかじめペルオキシダーゼにマレイミド基を
導入したものを用いると好都合である。マレイミド基を
ペルオキシダーゼに導入する方法としては、ペルオキシ
ダーゼのアミノ基を介してマレイミド基を導入すること
ができる。そのためには、Ｎ−サクシニミジル−マレイ
ミド−カルボキシレート誘導体を用いることができ、好
ましくは、Ｎ−（γ−マレイミドブチルオキシ）サクシ
イミド（ＧＭＢＳと略称することもある）などが良い。
従って、マレイミド基とペルオキシダーゼとの間に一定
の基が入っていることとなってもよい。ＧＭＢＳをペル
オキシダーゼに反応させるには、両者を、ｐＨ約６ない
し８の緩衝液中で約１０ないし５０℃の温度で約１０分
ないし２４時間反応させることによって行われる。該緩
衝液としては、たとえば、ｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸
緩衝液などが挙げられる。このようにして得られたマレ
イミド化ペルオキシダーゼは、たとえばゲルクロマトグ
ラフィーなどにより精製することができる。該ゲルクロ
マトグラフィーを行う際に用いられる担体としては、例
えば、セファデックスＧ−２５〔登録商標、ファルマシ
ア・ファインケミカル社（スエーデン）製〕、バイオゲ
ルＰ−２〔登録商標、バイオラッド・ラボラトリーズ社
（米国）製〕などが挙げられる。マレイミド化ペルオキ
シダーゼと抗体分子との反応は、両者を緩衝液中で約０
℃ないし４０℃の温度で、約１ないし４８時間反応させ
ることにより行うことができる。該緩衝液としては、た
とえば、ｐＨ６．０の５ｍＭエチレンジアミン四酢酸ナ
トリウム塩を含む０．１Ｍリン酸緩衝液などが挙げられ
る。このようにして得られたペルオキシダーゼ標識抗体
は、たとえばゲルクロマトグラフィーなどにより精製す
ることができる。該ゲルクロマトグラフィーを行う際に
用いられる担体としては、例えば、セファデックスＧ−
２５〔ファルマシア・ファインケミカル社（スエーデ
ン）製〕、バイオゲルＰ−２〔バイオラッド・ラボラト
リーズ社（米国）製〕などが挙げられる。さらに、ペル
オキシダーゼにチオール基を導入し、マレイミド化され
た抗体分子と反応させても良い。ペルオキシダーゼ以外
の酵素を抗体に直接結合させるには、ペルオキシダーゼ
の場合に準じて行なうことができ、また、自体公知のグ
ルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸法、水溶性カルボジイ
ミド法などが用いられる。
【００２６】本発明の測定系における被検試料として
は、組織、細胞、細胞株や菌体の抽出液またはそれらの
培養上清が挙げられる。本発明の測定方法の例として、
標識剤がペルオキシダーゼの場合について以下に具体的
に説明するが、ペルオキシダーゼに限定されるものでは
ない。まず、：担体に保持された抗体に、測定すべき
ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）あるいは活性型ＭＡＰ
キナーゼなどの各種ＭＡＰキナーゼ含有の分析対象物を
加えて、被検体を抗体に接触させ抗原抗体反応を行った
後、これに、前記で得られたペルオキシダーゼと抗ＭＡ
Ｐキナーゼ抗体との結合物（酵素標識抗体）を加えて反
応させる。 ：で得られた反応生成物にペルオキシダーゼの基質
を加え、生じた物質の吸光度もしくは蛍光強度を測定す
ることにより上記の反応生成物の酵素活性を知る。 ：上記〜の操作を既知量のヒトＭＡＰキナーゼ
（ＥＲＫ１）あるいは活性型ＭＡＰキナーゼなどの各種
ＭＡＰキナーゼの標準溶液に対してあらかじめ行い、標
準蛋白量と吸光度もしくは蛍光強度との関係を標準曲線
として作成しておく。 ：未知量のＭＡＰキナーゼを含む分析対象物（被検試
料）について得られた吸光度もしくは蛍光強度を標準曲
線にあてはめ、分析対象物の各種ＭＡＰキナーゼの量を
測定する。本発明で得られた抗体を用いてヒトＭＡＰキ
ナーゼ（ＥＲＫ１）あるいは活性型ＭＡＰキナーゼなど
の各種ＭＡＰキナーゼを精製することができる。これに
は、該抗体を用いてアフィニティーカラムクロマトグラ
フィーを行なうことにより行なうことができる。該アフ
ィニティーカラムクロマトグラフィーは、たとえば、該
抗体を適切な担体にカップリングさせ、これをカラムに
充填し、ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）あるいは活性
型ＭＡＰキナーゼを含む溶液をカラムに通し吸着させ、
次いで溶出させることにより行なうことができる。該担
体としては、たとえば、先に記載された担体と同様のも
のが挙げられる。とりわけゲル粒子や各種合成樹脂が好
都合に用いられる。たとえばＣＮＢｒ−活性化セファロ
ース４Ｂ（ファルマシア・ファインケミカル社製）、ア
フィゲル−１０、アフィゲル１５（商品名、バイオラッ
ド・ラボラトリー社製）などが挙げられる。抗体を担体
にカップリングさせるには、公知の常套手段を応用し得
るが、たとえば“代謝”、第８巻、第６９６頁（１９７
１年）に記載されているブロムシアン法、グルタールア
ルデヒド法が挙げられる。また、水溶性カルボジイミド
を用いる方法、活性エステル法なども用いることができ
るが、より簡単な方法として物理的に担体表面に吸着さ
せてもよい。
は、組織、細胞、細胞株や菌体の抽出液またはそれらの
培養上清が挙げられる。本発明の測定方法の例として、
標識剤がペルオキシダーゼの場合について以下に具体的
に説明するが、ペルオキシダーゼに限定されるものでは
ない。まず、：担体に保持された抗体に、測定すべき
ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）あるいは活性型ＭＡＰ
キナーゼなどの各種ＭＡＰキナーゼ含有の分析対象物を
加えて、被検体を抗体に接触させ抗原抗体反応を行った
後、これに、前記で得られたペルオキシダーゼと抗ＭＡ
Ｐキナーゼ抗体との結合物（酵素標識抗体）を加えて反
応させる。 ：で得られた反応生成物にペルオキシダーゼの基質
を加え、生じた物質の吸光度もしくは蛍光強度を測定す
ることにより上記の反応生成物の酵素活性を知る。 ：上記〜の操作を既知量のヒトＭＡＰキナーゼ
（ＥＲＫ１）あるいは活性型ＭＡＰキナーゼなどの各種
ＭＡＰキナーゼの標準溶液に対してあらかじめ行い、標
準蛋白量と吸光度もしくは蛍光強度との関係を標準曲線
として作成しておく。 ：未知量のＭＡＰキナーゼを含む分析対象物（被検試
料）について得られた吸光度もしくは蛍光強度を標準曲
線にあてはめ、分析対象物の各種ＭＡＰキナーゼの量を
測定する。本発明で得られた抗体を用いてヒトＭＡＰキ
ナーゼ（ＥＲＫ１）あるいは活性型ＭＡＰキナーゼなど
の各種ＭＡＰキナーゼを精製することができる。これに
は、該抗体を用いてアフィニティーカラムクロマトグラ
フィーを行なうことにより行なうことができる。該アフ
ィニティーカラムクロマトグラフィーは、たとえば、該
抗体を適切な担体にカップリングさせ、これをカラムに
充填し、ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）あるいは活性
型ＭＡＰキナーゼを含む溶液をカラムに通し吸着させ、
次いで溶出させることにより行なうことができる。該担
体としては、たとえば、先に記載された担体と同様のも
のが挙げられる。とりわけゲル粒子や各種合成樹脂が好
都合に用いられる。たとえばＣＮＢｒ−活性化セファロ
ース４Ｂ（ファルマシア・ファインケミカル社製）、ア
フィゲル−１０、アフィゲル１５（商品名、バイオラッ
ド・ラボラトリー社製）などが挙げられる。抗体を担体
にカップリングさせるには、公知の常套手段を応用し得
るが、たとえば“代謝”、第８巻、第６９６頁（１９７
１年）に記載されているブロムシアン法、グルタールア
ルデヒド法が挙げられる。また、水溶性カルボジイミド
を用いる方法、活性エステル法なども用いることができ
るが、より簡単な方法として物理的に担体表面に吸着さ
せてもよい。
【００２７】このようにして得られた抗体結合担体を用
いて精製を行なうには、抗体を結合させた担体を充填し
た抗体カラムに中性付近の緩衝液中に調製したＭＡＰキ
ナーゼ溶液を供し、各種ＭＡＰキナーゼを吸着させる。
次にカラムを同じ緩衝液で洗浄したのち、特異的に吸着
されたＭＡＰキナーゼを溶出させる。特異的に吸着され
たＭＡＰキナーゼを溶出するには、たとえば、低ｐＨも
しくは高ｐＨの緩衝液、高濃度の塩を含有する緩衝液を
用いて行なわれる。該低ｐＨの緩衝液としては、たとえ
ばｐＨ２．３の０．１７Ｍグリシン−塩酸緩衝液、ｐＨ
１．８の０．１Ｍ第二クエン酸ナトリウム−塩酸緩衝液
などが挙げられる。該高ｐＨの緩衝液としては、たとえ
ばｐＨ１１のアンモニア水、ｐＨ１１．７の０．２Ｍホ
ウ酸ナトリウム緩衝液などが挙げられる。該高濃度の塩
を含有する緩衝液としては、たとえば６Ｍグアニジン塩
酸溶液、７Ｍ尿素溶液などが挙げられる。上記の溶出
は、バッチ法でもよく、またカラムを用いる方法でもよ
い。抗原の溶出液はたとえば透析して精製する。たとえ
ば低ｐＨの緩衝液で溶出した時は、たとえば０．１Ｍ炭
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．５）などの高ｐＨ緩衝
液、高ｐＨの緩衝液で溶出した時は、たとえば０．１Ｍ
グリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）などの低ｐＨ緩衝
液で中性化したのち、たとえば０．１％ＮａＮ3 を含む
０．０２Ｍリン酸食塩緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透
析する。また高濃度の塩を含有する緩衝液で溶出した抗
原液は直接上記のリン酸食塩緩衝液に透析して保存する
こともできる。また、上記溶出液または透析液を凍結乾
燥して得られた凍結乾燥標品として保存することもでき
る。このようにして本発明の抗体を用いて精製される各
種ＭＡＰキナーゼは、極めて高純度、高単位のものであ
り、種々の細胞内情報伝達系の研究において試薬として
用いるのに有用であると考えられる。
いて精製を行なうには、抗体を結合させた担体を充填し
た抗体カラムに中性付近の緩衝液中に調製したＭＡＰキ
ナーゼ溶液を供し、各種ＭＡＰキナーゼを吸着させる。
次にカラムを同じ緩衝液で洗浄したのち、特異的に吸着
されたＭＡＰキナーゼを溶出させる。特異的に吸着され
たＭＡＰキナーゼを溶出するには、たとえば、低ｐＨも
しくは高ｐＨの緩衝液、高濃度の塩を含有する緩衝液を
用いて行なわれる。該低ｐＨの緩衝液としては、たとえ
ばｐＨ２．３の０．１７Ｍグリシン−塩酸緩衝液、ｐＨ
１．８の０．１Ｍ第二クエン酸ナトリウム−塩酸緩衝液
などが挙げられる。該高ｐＨの緩衝液としては、たとえ
ばｐＨ１１のアンモニア水、ｐＨ１１．７の０．２Ｍホ
ウ酸ナトリウム緩衝液などが挙げられる。該高濃度の塩
を含有する緩衝液としては、たとえば６Ｍグアニジン塩
酸溶液、７Ｍ尿素溶液などが挙げられる。上記の溶出
は、バッチ法でもよく、またカラムを用いる方法でもよ
い。抗原の溶出液はたとえば透析して精製する。たとえ
ば低ｐＨの緩衝液で溶出した時は、たとえば０．１Ｍ炭
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．５）などの高ｐＨ緩衝
液、高ｐＨの緩衝液で溶出した時は、たとえば０．１Ｍ
グリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）などの低ｐＨ緩衝
液で中性化したのち、たとえば０．１％ＮａＮ3 を含む
０．０２Ｍリン酸食塩緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透
析する。また高濃度の塩を含有する緩衝液で溶出した抗
原液は直接上記のリン酸食塩緩衝液に透析して保存する
こともできる。また、上記溶出液または透析液を凍結乾
燥して得られた凍結乾燥標品として保存することもでき
る。このようにして本発明の抗体を用いて精製される各
種ＭＡＰキナーゼは、極めて高純度、高単位のものであ
り、種々の細胞内情報伝達系の研究において試薬として
用いるのに有用であると考えられる。
【００２８】本発明明細書および図面において、塩基や
アミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵ
Ｂ Ｃｏｍｍｉｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分
野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記
する。また、アミノ酸に関し光学異性体がありうる場合
は、特に明示しなければＬ−体を示すものとする。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸 ｄＴＴＰ：デオキシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸 ｄＣＴＰ：デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸 Ｔｄｒ ：チミジン ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム Ｇｌｙ ：グリシン Ａｌａ ：アラニン Ｖａｌ ：バリン Ｌｅｕ ：ロイシン Ｉｌｅ ：イソロイシン Ｓｅｒ ：セリン Ｔｈｒ ：スレオニン Ｃｙｓ ：システイン Ｍｅｔ ：メチオニン Ｇｌｕ ：グルタミン酸 Ａｓｐ ：アスパラギン酸 Ｌｙｓ ：リジン Ａｒｇ ：アルギニン Ｈｉｓ ：ヒスチジン Ｐｈｅ ：フェニールアラニン Ｔｙｒ ：チロシン Ｔｒｐ ：トリプトファン Ｐｒｏ ：プロリン Ａｓｎ ：アスパラギン Ｇｌｎ ：グルタミン Ｃｌｚ ：２−クロロベンジルオキシカルボニル ＢｒＺ ：２−プロモベンジルオキシカルボニル Ｂｚｌ ：ベンジル Ｂｏｃ ：ｔ−ブトキシカルボニル
アミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵ
Ｂ Ｃｏｍｍｉｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分
野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記
する。また、アミノ酸に関し光学異性体がありうる場合
は、特に明示しなければＬ−体を示すものとする。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸 ｄＴＴＰ：デオキシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸 ｄＣＴＰ：デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸 Ｔｄｒ ：チミジン ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム Ｇｌｙ ：グリシン Ａｌａ ：アラニン Ｖａｌ ：バリン Ｌｅｕ ：ロイシン Ｉｌｅ ：イソロイシン Ｓｅｒ ：セリン Ｔｈｒ ：スレオニン Ｃｙｓ ：システイン Ｍｅｔ ：メチオニン Ｇｌｕ ：グルタミン酸 Ａｓｐ ：アスパラギン酸 Ｌｙｓ ：リジン Ａｒｇ ：アルギニン Ｈｉｓ ：ヒスチジン Ｐｈｅ ：フェニールアラニン Ｔｙｒ ：チロシン Ｔｒｐ ：トリプトファン Ｐｒｏ ：プロリン Ａｓｎ ：アスパラギン Ｇｌｎ ：グルタミン Ｃｌｚ ：２−クロロベンジルオキシカルボニル ＢｒＺ ：２−プロモベンジルオキシカルボニル Ｂｚｌ ：ベンジル Ｂｏｃ ：ｔ−ブトキシカルボニル
【００２９】
【実施例】以下に実施例をもって、本発明をさらに詳し
く説明するが、本発明はこれらによってなんら限定され
るものではない。なお、後述の実施例で得られた本発明
の抗体産生ハイブリドーマは、次に示すように寄託され
ている。 （ＩＦＯ） （ＮＩＢＨ） 動物細胞 ＩＦＯ Ｎｏ． ＦＥＲＭ Ｎｏ． マウスハイブリドーマＨＥ１１３ ５０４５３ ＢＰ−５４５６ （1995.3.28） (1995.4.4) ＩＦＯ：財団法人発酵研究所（大阪） ＮＩＢＨ：通商産業省工業技術院生命工学技術研究所 表中（ ）内は受託日を示す。マウスハイブリドーマＨ
Ｅ１１３は、１９９５年４月４日にＮＩＢＨに受託番号
ＦＥＲＭ Ｐ−１４８７６として寄託され、該寄託は１
９９６年３月１１日にブダペスト条約に基づく寄託に切
り換られて、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５４５６として
ＮＩＢＨに保管されている。
く説明するが、本発明はこれらによってなんら限定され
るものではない。なお、後述の実施例で得られた本発明
の抗体産生ハイブリドーマは、次に示すように寄託され
ている。 （ＩＦＯ） （ＮＩＢＨ） 動物細胞 ＩＦＯ Ｎｏ． ＦＥＲＭ Ｎｏ． マウスハイブリドーマＨＥ１１３ ５０４５３ ＢＰ−５４５６ （1995.3.28） (1995.4.4) ＩＦＯ：財団法人発酵研究所（大阪） ＮＩＢＨ：通商産業省工業技術院生命工学技術研究所 表中（ ）内は受託日を示す。マウスハイブリドーマＨ
Ｅ１１３は、１９９５年４月４日にＮＩＢＨに受託番号
ＦＥＲＭ Ｐ−１４８７６として寄託され、該寄託は１
９９６年３月１１日にブダペスト条約に基づく寄託に切
り換られて、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５４５６として
ＮＩＢＨに保管されている。
【００３０】実施例１ ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ
１）蛋白質の調製 標記の蛋白質をコードするｃＤＮＡの配列は公知である
〔Ｄａｖｉｄ Ｌ．Ｃｈａｒｅｓｔら、モレキュラー・
セルラー・アンド・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．
Ｂｉｏｌ．），第１３巻、第４６７９−４６９０頁（１
９９３）〕。このｃＤＮＡを得るために、図１に示した
２種類のＤＮＡ鎖を合成した（配列番号：１７、配列番
号：１８）。ヒト由来の培養細胞ＷＩ−３８〔エクスペ
リメンタル・セルラー・リサーチ（Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．
Ｒｅｓ．），第２５巻、第５８５頁、ＡＴＣＣ ＣＣＬ
−７５〕から得た総ＲＮＡを鋳型として、ランダムヘキ
サプライマーと逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社、Ｓ
ｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ）を用いてｃＤＮＡを合成し
た。このｃＤＮＡに、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（シ
ータス社）と、上記の２種の合成ＤＮＡを加えて、９４
℃で１分、５５℃で１分、７２℃で３分を１サイクルと
して、３５サイクルのＰｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎ
ｒｅａｃｔｉｏｎを行った。反応後、５％のアクリル
アミドゲルで電気泳動を行い、ヒトＥＲＫ１ ｃＤＮＡ
の鎖長から予想される移動度を示すＤＮＡ鎖の部分を切
りとり、１ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス塩酸バ
ッファー中に懸濁させて一晩静置し、ｃＤＮＡを溶出さ
せた。これを用いて、図２に示した方法で該蛋白質の大
腸菌内での発現系を構築した。誘導的に発現させるため
に、Ｔ７ファージのプロモーターの系を用いた。〔Ｓｔ
ｕｄｉｅｒ，Ｆ．Ｗ．等、メソッズ・イン・エンザイモ
ロジー（ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧ
Ｙ）、第１８５巻、第６０−８９頁〕。クローニングさ
れたｃＤＮＡの塩基配列は、ジデオキシヌクレオチドを
用いた合成鎖停止法〔Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．らＰｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ、第７４巻、
第５４６３−５４６７頁（１９７７）〕で確認した。Ｂ
ｏｕｌｔｏｎ，Ｔ．Ｇ．等の方法〔セル（Ｃｅｌｌ）、
第６５巻、第６６３−６７５頁〕に従って該蛋白質の発
現と精製を行い、最終的にＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）〔ラエムリら、ネイ
チャー、第２２７巻、第６８０−６８５頁（１９７
０）〕後のクマジ−ブリリアントブルー（Ｒ−２５０）
による染色で、ほぼ単一のバンドとして検出されるまで
精製された該蛋白質を得た（図３）。
１）蛋白質の調製 標記の蛋白質をコードするｃＤＮＡの配列は公知である
〔Ｄａｖｉｄ Ｌ．Ｃｈａｒｅｓｔら、モレキュラー・
セルラー・アンド・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．
Ｂｉｏｌ．），第１３巻、第４６７９−４６９０頁（１
９９３）〕。このｃＤＮＡを得るために、図１に示した
２種類のＤＮＡ鎖を合成した（配列番号：１７、配列番
号：１８）。ヒト由来の培養細胞ＷＩ−３８〔エクスペ
リメンタル・セルラー・リサーチ（Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．
Ｒｅｓ．），第２５巻、第５８５頁、ＡＴＣＣ ＣＣＬ
−７５〕から得た総ＲＮＡを鋳型として、ランダムヘキ
サプライマーと逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社、Ｓ
ｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ）を用いてｃＤＮＡを合成し
た。このｃＤＮＡに、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（シ
ータス社）と、上記の２種の合成ＤＮＡを加えて、９４
℃で１分、５５℃で１分、７２℃で３分を１サイクルと
して、３５サイクルのＰｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎ
ｒｅａｃｔｉｏｎを行った。反応後、５％のアクリル
アミドゲルで電気泳動を行い、ヒトＥＲＫ１ ｃＤＮＡ
の鎖長から予想される移動度を示すＤＮＡ鎖の部分を切
りとり、１ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス塩酸バ
ッファー中に懸濁させて一晩静置し、ｃＤＮＡを溶出さ
せた。これを用いて、図２に示した方法で該蛋白質の大
腸菌内での発現系を構築した。誘導的に発現させるため
に、Ｔ７ファージのプロモーターの系を用いた。〔Ｓｔ
ｕｄｉｅｒ，Ｆ．Ｗ．等、メソッズ・イン・エンザイモ
ロジー（ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧ
Ｙ）、第１８５巻、第６０−８９頁〕。クローニングさ
れたｃＤＮＡの塩基配列は、ジデオキシヌクレオチドを
用いた合成鎖停止法〔Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．らＰｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ、第７４巻、
第５４６３−５４６７頁（１９７７）〕で確認した。Ｂ
ｏｕｌｔｏｎ，Ｔ．Ｇ．等の方法〔セル（Ｃｅｌｌ）、
第６５巻、第６６３−６７５頁〕に従って該蛋白質の発
現と精製を行い、最終的にＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）〔ラエムリら、ネイ
チャー、第２２７巻、第６８０−６８５頁（１９７
０）〕後のクマジ−ブリリアントブルー（Ｒ−２５０）
による染色で、ほぼ単一のバンドとして検出されるまで
精製された該蛋白質を得た（図３）。
【００３１】実施例２ 抗ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ
１）モノクローナル抗体の取得 （１）免疫 ＢＡＬＢ／ｃマウス（♀８週令）に対し、実施例１で得
られたヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）１０μｇとフロ
インド完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ、米国）の混合物を皮下に接種した。２週間
後にヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）１０μｇとフロイ
ンド不完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ）の混合物を同マ
ウス皮下に接種し、同様の免疫を約２週間の間隔で、さ
らに５回行い、最終免疫から１７日後に、５０ｍＭトリ
ス−塩酸（ｐＨ７．４）に溶かした１００μｇのヒトＭ
ＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）を同マウスの静脈内に接種し
た。 （２）細胞融合 上記（１）で得られた免疫マウスより、抗原最終免疫の
３日後脾臓を摘出し、細胞融合に用いる細胞を取得し、
ＭＥＭ培地に懸濁した。マウスミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ
６３−Ａｇ・８Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）は５％ウシ胎仔血清を
含有するＧＩＴ培地（日本製薬）で５％炭酸ガス、９５
％空気の条件で継代培養した。細胞融合はケーラーとミ
ルスタインが確立した分法〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒ
ｅ）第２５６巻、第４９５頁（１９７５）〕に準じ行っ
た。Ｐ３Ｕ１細胞６．９×１０7個と上述の方法で得ら
れた免疫された脾臓細胞３．２×１０8 個を混合し、遠
心後、細胞にあらかじめ３７℃に加温した０．５ｍｌの
ＭＥＭ培地に溶解した４５％ＰＥＧ６０００を、ゆっく
り滴下した。７分後３７℃に加温したＭＥＭ培地を１分
間に０．５ｍｌずつ加え１５ｍｌとした後、室温で６０
０回転１５分間遠心し上清を除去した。この細胞沈澱物
を５％ウシ胎仔血清を含有するＧＩＴ培地２１０ｍｌに
懸濁し、９６穴マイクロプレート（ヌンク社、Ｎａｐｅ
ｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）に１００μｌずつ２０６４ウエル
に播種した。１日後、ＨＡＴ（ヒポキサンチン１×１０
~4Ｍ、アミノプテリン４×１０~7Ｍ、チミジン１．６×
１０~5Ｍ）を含んだＧＩＴ培地（５％牛胎仔血清含有）
（以下ＨＡＴ培地と称する）を各ウエルに１５０μｌず
つ添加し、さらに３日おきに、培地の１／２量を新しい
ＨＡＴ培地と交換した。このようにして生育した細胞は
雑種細胞である。
１）モノクローナル抗体の取得 （１）免疫 ＢＡＬＢ／ｃマウス（♀８週令）に対し、実施例１で得
られたヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）１０μｇとフロ
インド完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ、米国）の混合物を皮下に接種した。２週間
後にヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）１０μｇとフロイ
ンド不完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ）の混合物を同マ
ウス皮下に接種し、同様の免疫を約２週間の間隔で、さ
らに５回行い、最終免疫から１７日後に、５０ｍＭトリ
ス−塩酸（ｐＨ７．４）に溶かした１００μｇのヒトＭ
ＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）を同マウスの静脈内に接種し
た。 （２）細胞融合 上記（１）で得られた免疫マウスより、抗原最終免疫の
３日後脾臓を摘出し、細胞融合に用いる細胞を取得し、
ＭＥＭ培地に懸濁した。マウスミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ
６３−Ａｇ・８Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）は５％ウシ胎仔血清を
含有するＧＩＴ培地（日本製薬）で５％炭酸ガス、９５
％空気の条件で継代培養した。細胞融合はケーラーとミ
ルスタインが確立した分法〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒ
ｅ）第２５６巻、第４９５頁（１９７５）〕に準じ行っ
た。Ｐ３Ｕ１細胞６．９×１０7個と上述の方法で得ら
れた免疫された脾臓細胞３．２×１０8 個を混合し、遠
心後、細胞にあらかじめ３７℃に加温した０．５ｍｌの
ＭＥＭ培地に溶解した４５％ＰＥＧ６０００を、ゆっく
り滴下した。７分後３７℃に加温したＭＥＭ培地を１分
間に０．５ｍｌずつ加え１５ｍｌとした後、室温で６０
０回転１５分間遠心し上清を除去した。この細胞沈澱物
を５％ウシ胎仔血清を含有するＧＩＴ培地２１０ｍｌに
懸濁し、９６穴マイクロプレート（ヌンク社、Ｎａｐｅ
ｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）に１００μｌずつ２０６４ウエル
に播種した。１日後、ＨＡＴ（ヒポキサンチン１×１０
~4Ｍ、アミノプテリン４×１０~7Ｍ、チミジン１．６×
１０~5Ｍ）を含んだＧＩＴ培地（５％牛胎仔血清含有）
（以下ＨＡＴ培地と称する）を各ウエルに１５０μｌず
つ添加し、さらに３日おきに、培地の１／２量を新しい
ＨＡＴ培地と交換した。このようにして生育した細胞は
雑種細胞である。
【００３２】（３）抗体産生細胞の検索 実施例（１）記載の方法で精製されたヒトＭＡＰキナー
ゼ（ＥＲＫ１）を０．５μｇ／ｍｌになるように１０ｍ
Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈し、その１００μｌ
を９６穴イムノプレート（ヌンク社）の各ウエルに入れ
４℃一夜放置し、固相にヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ
１）を結合させた。ＰＢＳで洗浄した後、余剰の結合部
位を塞ぐため、ブロックエース（雪印乳業）を２０％含
有するＰＢＳを２５０μｌずつウエルに注入して、使用
時まで冷所に保存した。以上のようにして得られたヒト
ＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）を結合した９６穴イムノプ
レートに、雑種細胞上清を１００μｌずつ加え室温で２
時間インキュベートした。培養上清を除去、洗浄後、２
次抗体としてＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（カペ
ル社、米国）を加え室温で２時間インキュベートした。
２次抗体を除去し、よくウエルを洗浄した後、ＨＲＰ用
基質溶液（０．０２％ Ｈ2Ｏ2と０．１５％ｏ−フェニ
レンジアミンを含むｐＨ５．５のクエン酸ナトリウム緩
衝液）を１００μｌ加え、２５℃で１０分反応させ、２
Ｎ硫酸１００μｌを加えることにより酵素反応を停止さ
せた後、マイクロプレート用自動比色計（ＭＴＰ−３
２、コロナ社）を用い、４９２ｎｍにおける吸光度を測
定した。その結果１ウエルにヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲ
Ｋ１）に結合性を示す抗体の存在を認めた。 （４）雑種細胞のクローニング 抗体の存在を認めたウエルの細胞を、１ウエルあたり
０．５個となるように、予め５×１０4 個／ウエルのマ
ウス胸腺細胞を栄養細胞として播いておいた９６穴マイ
クロプレートに播き、クローニングを行った。その結
果、代表的なクローン細胞１種(マウスハイブリドーマ
ＨＥ１１３）を得た。
ゼ（ＥＲＫ１）を０．５μｇ／ｍｌになるように１０ｍ
Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈し、その１００μｌ
を９６穴イムノプレート（ヌンク社）の各ウエルに入れ
４℃一夜放置し、固相にヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ
１）を結合させた。ＰＢＳで洗浄した後、余剰の結合部
位を塞ぐため、ブロックエース（雪印乳業）を２０％含
有するＰＢＳを２５０μｌずつウエルに注入して、使用
時まで冷所に保存した。以上のようにして得られたヒト
ＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）を結合した９６穴イムノプ
レートに、雑種細胞上清を１００μｌずつ加え室温で２
時間インキュベートした。培養上清を除去、洗浄後、２
次抗体としてＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（カペ
ル社、米国）を加え室温で２時間インキュベートした。
２次抗体を除去し、よくウエルを洗浄した後、ＨＲＰ用
基質溶液（０．０２％ Ｈ2Ｏ2と０．１５％ｏ−フェニ
レンジアミンを含むｐＨ５．５のクエン酸ナトリウム緩
衝液）を１００μｌ加え、２５℃で１０分反応させ、２
Ｎ硫酸１００μｌを加えることにより酵素反応を停止さ
せた後、マイクロプレート用自動比色計（ＭＴＰ−３
２、コロナ社）を用い、４９２ｎｍにおける吸光度を測
定した。その結果１ウエルにヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲ
Ｋ１）に結合性を示す抗体の存在を認めた。 （４）雑種細胞のクローニング 抗体の存在を認めたウエルの細胞を、１ウエルあたり
０．５個となるように、予め５×１０4 個／ウエルのマ
ウス胸腺細胞を栄養細胞として播いておいた９６穴マイ
クロプレートに播き、クローニングを行った。その結
果、代表的なクローン細胞１種(マウスハイブリドーマ
ＨＥ１１３）を得た。
【００３３】（５）抗体の製造 上記（４）においてクローニングによって得られたハイ
ブリドーマクローンをそれぞれあらかじめ０．５ｍｌの
ミネラルオイルを腹腔内に投与しておいたＢＡＬＢ／ｃ
マウスの腹腔内に１匹あたり１×１０6個接種すること
により腹水化を行った。ハイブリドーマを腹腔に投与し
て１０日後、腹水を採取した。得られたそれぞれの腹水
約１０ｍｌから、ステーリンら〔ジャーナル オブ バ
イオロジカルケミストリー、第２５６巻、第９７５０−
９７５４頁（１９８１）〕の方法に準じてモノクローナ
ル抗体を精製した。まず腹水からフィブリン様物質を除
去するため１０，０００回転１５分間遠心した後、ＰＢ
Ｓ（８．１ｍＭ−リン酸二ナトリウム、１．５ｍＭリン
酸カリウム、２７ｍＭ ＫＣ１、１３７ｍＭ ＮａＣ
ｌ、ｐＨ７．２）で２８０ｎｍの紫外部吸収（Ａ280）
が１２〜１４の値を示す濃度に希釈した。希釈後サンプ
ルに飽和硫酸アンモニウム溶液を４７％の濃度になるよ
うに加え、４℃で攪拌しながら６０分間塩析を行い、そ
の後遠心（１０，０００回転、１５分間）を行なって沈
澱物を得た。沈澱物を５０ｍＭ ＮａＣｌ含有２０ｍＭ
トリス緩衝溶液（ｐＨ７．９）に溶融し、同溶液２リッ
トルに対して透析を行った。２時間後、２リットルの新
しい同じ透析液に換え、さらに１５分間透析を行った。
透析後、沈澱を除去するため１０，０００回転１５分間
遠心を行い、上清をＡ280の値が２０〜３０の濃度にな
るように調製した。このサンプルを充分量の５０ｍＭ−
ＮａＣｌ含有トリス緩衝溶液で平衡化した２０ｍｌのＤ
ＥＡＥセルロースカラム（ワットマンＤＥ52）にかけ、
５０ｍＭ ＮａＣｌ含有トリス緩衝溶液でよく洗った
後、５０ｍＭ−５００ｍＭ ＮａＣｌを含む同緩衝液の
濃度勾配塩溶液を用いて１．５ｍｌ／分の流出速度で分
画を行って素通り画分を濃縮し、精製モノクローナル抗
体ＨＥ１１３を得た。抗体の純度の確認にはＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を
用いた。すなわち、硫安塩析し、ＤＥＡＥセルロースカ
ラムで素通りした画分を、２−メルカプトエタノールで
還元し、アクリルアミド濃度１０％のゲルを用いて１８
０ボルトで２．５時間泳動を行った。その結果、分子量
５２ＫＤａ前後にＨ鎖、２８ＫＤａ前後にＬ鎖の２つの
バンドが認められた。
ブリドーマクローンをそれぞれあらかじめ０．５ｍｌの
ミネラルオイルを腹腔内に投与しておいたＢＡＬＢ／ｃ
マウスの腹腔内に１匹あたり１×１０6個接種すること
により腹水化を行った。ハイブリドーマを腹腔に投与し
て１０日後、腹水を採取した。得られたそれぞれの腹水
約１０ｍｌから、ステーリンら〔ジャーナル オブ バ
イオロジカルケミストリー、第２５６巻、第９７５０−
９７５４頁（１９８１）〕の方法に準じてモノクローナ
ル抗体を精製した。まず腹水からフィブリン様物質を除
去するため１０，０００回転１５分間遠心した後、ＰＢ
Ｓ（８．１ｍＭ−リン酸二ナトリウム、１．５ｍＭリン
酸カリウム、２７ｍＭ ＫＣ１、１３７ｍＭ ＮａＣ
ｌ、ｐＨ７．２）で２８０ｎｍの紫外部吸収（Ａ280）
が１２〜１４の値を示す濃度に希釈した。希釈後サンプ
ルに飽和硫酸アンモニウム溶液を４７％の濃度になるよ
うに加え、４℃で攪拌しながら６０分間塩析を行い、そ
の後遠心（１０，０００回転、１５分間）を行なって沈
澱物を得た。沈澱物を５０ｍＭ ＮａＣｌ含有２０ｍＭ
トリス緩衝溶液（ｐＨ７．９）に溶融し、同溶液２リッ
トルに対して透析を行った。２時間後、２リットルの新
しい同じ透析液に換え、さらに１５分間透析を行った。
透析後、沈澱を除去するため１０，０００回転１５分間
遠心を行い、上清をＡ280の値が２０〜３０の濃度にな
るように調製した。このサンプルを充分量の５０ｍＭ−
ＮａＣｌ含有トリス緩衝溶液で平衡化した２０ｍｌのＤ
ＥＡＥセルロースカラム（ワットマンＤＥ52）にかけ、
５０ｍＭ ＮａＣｌ含有トリス緩衝溶液でよく洗った
後、５０ｍＭ−５００ｍＭ ＮａＣｌを含む同緩衝液の
濃度勾配塩溶液を用いて１．５ｍｌ／分の流出速度で分
画を行って素通り画分を濃縮し、精製モノクローナル抗
体ＨＥ１１３を得た。抗体の純度の確認にはＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を
用いた。すなわち、硫安塩析し、ＤＥＡＥセルロースカ
ラムで素通りした画分を、２−メルカプトエタノールで
還元し、アクリルアミド濃度１０％のゲルを用いて１８
０ボルトで２．５時間泳動を行った。その結果、分子量
５２ＫＤａ前後にＨ鎖、２８ＫＤａ前後にＬ鎖の２つの
バンドが認められた。
【００３４】実施例３ 抗体の特徴 （１）ウエスタンブロット法 ヒト由来の細胞であるＰＣ−３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１
４３５）、ＤＵ１４５（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−８１）、Ｍ
ＤＡ−ＭＢ−４５３（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１３１）、Ｊ
ｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１５２）、ＣＣＲＦ−
ＣＥＭ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１１９）、およびラット由
来の細胞であるＰＣ−１２（ＡＴＣＣＣＲＬ−１７２
１）を、それぞれＡＴＣＣのカタログに示された培養液
で組織培養用シャーレ（ファルコン３００３）で一面に
生育するまで培養し、ＳＤＳとメルカプトエタノールを
含む溶液で溶解し、９５℃で５分間加温した。これを、
１０％ゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた後、蛋白をメ
ンブランフィルターにトランスファーし、実施例２で得
られたモノクローナル抗体と反応させた。さらに、アル
カリフォスファターゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を反
応させ、フォスファターゼ活性を利用して発色させた
（図４）。その結果、ヒト由来の全ての細胞で、ＥＲＫ
１が検出されたが、ＥＲＫ２は検出されなかった。ま
た、ラットのＥＲＫ１，ＥＲＫ２のどちらも検出されな
かった。対照として用いた市販のモノクローナル抗体
（クローンＭＫ１：ＢＩＯ ＤＥＳＩＧＮ社；クローン
Ｂ９：ＢＵＩカタログ（１９９３）第３３頁）では、ヒ
トＥＲＫ１の外、ヒトＥＲＫ２、ラットＥＲＫ１、及び
ラットＥＲＫ２が明確に検出されていることから、本発
明で得られたモノクローナル抗体ＨＥ１１３は、ヒトＥ
ＲＫ１のみと結合するものと考えられる。 （２）ＥＩＡ法 実施例１で報告したものと同じ方法でヒトＥＲＫ２ ｃ
ＤＮＡをクローニングした。さらに、ヒトＥＲＫ１ ｃ
ＤＮＡとヒトＥＲＫ２ ｃＤＮＡをそれぞれプラスミド
ｐＧＥＸ−４Ｔ−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にクローニ
ングし、ヒトＥＲＫ１およびヒトＥＲＫ２蛋白をＧＳＴ
（グルタチオンＳトランスフェラーゼ）蛋白との融合蛋
白として発現させ、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．らの方法〔Ｇ
ｅｎｅ第６７巻、第３１−４０頁〕に従ってグルタチオ
ンセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムで精製し
た。これらの蛋白をコートしたイムノプレート（ヌン
ク）を用い、実施例２−（３）で述べたのと同じＥＩＡ
法でモノクローナル抗体の結合性を調べたところ、ＧＳ
Ｔ−ヒトＥＲＫ１蛋白をコートした場合には、得られた
モノクローナル抗体は強い結合を示したが、一方、ＧＳ
Ｔ−ヒトＥＲＫ２蛋白をコートした場合には、結合を示
さなかった（図５）。この結果からもヒトＥＲＫ１に対
する高い特異性が分かる。 （３）抗体の認識部位 得られたモノクローナル抗体がヒトＥＲＫ１蛋白のどの
領域を認識しているのかを調べるために、ヒトＥＲＫ１
（配列番号：８）の様々な領域のアミノ酸配列をもつ合
成ペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅ−１〜Ｐｅｐｔｉｄｅ−
４）（図６）（配列番号：９，配列番号：１０，配列番
号：１１，配列番号：１２）を上記のＥＩＡの系に加え
て、その影響を調べた。この結果（図７）から、抗体が
蛋白のカルボキシル末端付近の配列（Ｐｅｐｔｉｄｅ−
４）（配列番号：１２）を認識していることが分かっ
た。また、この抗体は、ラットＥＲＫ１とは結合しない
ので、ヒトとラットで異なる３７５番目のバリンと３７
６番目のロイシンを含む領域を認識していると考えられ
る。
４３５）、ＤＵ１４５（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−８１）、Ｍ
ＤＡ−ＭＢ−４５３（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１３１）、Ｊ
ｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１５２）、ＣＣＲＦ−
ＣＥＭ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１１９）、およびラット由
来の細胞であるＰＣ−１２（ＡＴＣＣＣＲＬ−１７２
１）を、それぞれＡＴＣＣのカタログに示された培養液
で組織培養用シャーレ（ファルコン３００３）で一面に
生育するまで培養し、ＳＤＳとメルカプトエタノールを
含む溶液で溶解し、９５℃で５分間加温した。これを、
１０％ゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた後、蛋白をメ
ンブランフィルターにトランスファーし、実施例２で得
られたモノクローナル抗体と反応させた。さらに、アル
カリフォスファターゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を反
応させ、フォスファターゼ活性を利用して発色させた
（図４）。その結果、ヒト由来の全ての細胞で、ＥＲＫ
１が検出されたが、ＥＲＫ２は検出されなかった。ま
た、ラットのＥＲＫ１，ＥＲＫ２のどちらも検出されな
かった。対照として用いた市販のモノクローナル抗体
（クローンＭＫ１：ＢＩＯ ＤＥＳＩＧＮ社；クローン
Ｂ９：ＢＵＩカタログ（１９９３）第３３頁）では、ヒ
トＥＲＫ１の外、ヒトＥＲＫ２、ラットＥＲＫ１、及び
ラットＥＲＫ２が明確に検出されていることから、本発
明で得られたモノクローナル抗体ＨＥ１１３は、ヒトＥ
ＲＫ１のみと結合するものと考えられる。 （２）ＥＩＡ法 実施例１で報告したものと同じ方法でヒトＥＲＫ２ ｃ
ＤＮＡをクローニングした。さらに、ヒトＥＲＫ１ ｃ
ＤＮＡとヒトＥＲＫ２ ｃＤＮＡをそれぞれプラスミド
ｐＧＥＸ−４Ｔ−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にクローニ
ングし、ヒトＥＲＫ１およびヒトＥＲＫ２蛋白をＧＳＴ
（グルタチオンＳトランスフェラーゼ）蛋白との融合蛋
白として発現させ、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．らの方法〔Ｇ
ｅｎｅ第６７巻、第３１−４０頁〕に従ってグルタチオ
ンセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムで精製し
た。これらの蛋白をコートしたイムノプレート（ヌン
ク）を用い、実施例２−（３）で述べたのと同じＥＩＡ
法でモノクローナル抗体の結合性を調べたところ、ＧＳ
Ｔ−ヒトＥＲＫ１蛋白をコートした場合には、得られた
モノクローナル抗体は強い結合を示したが、一方、ＧＳ
Ｔ−ヒトＥＲＫ２蛋白をコートした場合には、結合を示
さなかった（図５）。この結果からもヒトＥＲＫ１に対
する高い特異性が分かる。 （３）抗体の認識部位 得られたモノクローナル抗体がヒトＥＲＫ１蛋白のどの
領域を認識しているのかを調べるために、ヒトＥＲＫ１
（配列番号：８）の様々な領域のアミノ酸配列をもつ合
成ペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅ−１〜Ｐｅｐｔｉｄｅ−
４）（図６）（配列番号：９，配列番号：１０，配列番
号：１１，配列番号：１２）を上記のＥＩＡの系に加え
て、その影響を調べた。この結果（図７）から、抗体が
蛋白のカルボキシル末端付近の配列（Ｐｅｐｔｉｄｅ−
４）（配列番号：１２）を認識していることが分かっ
た。また、この抗体は、ラットＥＲＫ１とは結合しない
ので、ヒトとラットで異なる３７５番目のバリンと３７
６番目のロイシンを含む領域を認識していると考えられ
る。
【００３５】実施例４ 抗体のサブクラスの測定 実施例２で得られたモノクローナル抗体（ＨＥ１１３）
のサブクラスを次の方法で調べた。モノクローナル抗体
を９６穴イムノプレートにコートし、洗浄後ウサギ抗マ
ウスγ1，γ2a，γ2b，γ3，κ鎖，λ鎖に対する抗体
（カペル社）をそれぞれ１００μｌ入れ室温で２時間イ
ンキュベートした。それぞれの抗体を除去，洗浄後ＨＲ
Ｐ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（カペル社）を加え室温
で２時間インキュベートした。標識抗体を除去し、よく
洗浄した後、実施例２−（３）に記載した方法で酵素反
応を行い、吸光度を測定した。その結果、ＨＥ１１３
は、γ2a、κのサブクラスに属する抗体であることが判
明した。
のサブクラスを次の方法で調べた。モノクローナル抗体
を９６穴イムノプレートにコートし、洗浄後ウサギ抗マ
ウスγ1，γ2a，γ2b，γ3，κ鎖，λ鎖に対する抗体
（カペル社）をそれぞれ１００μｌ入れ室温で２時間イ
ンキュベートした。それぞれの抗体を除去，洗浄後ＨＲ
Ｐ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（カペル社）を加え室温
で２時間インキュベートした。標識抗体を除去し、よく
洗浄した後、実施例２−（３）に記載した方法で酵素反
応を行い、吸光度を測定した。その結果、ＨＥ１１３
は、γ2a、κのサブクラスに属する抗体であることが判
明した。
【００３６】実施例５ 抗体を用いたヒトＭＡＰキナー
ゼ（ＥＲＫ１）の定量法 実施例２で得られたモノクローナル抗体と、ヒトＭＡＰ
キナーゼのカルボキシル末端付近のアミノ酸配列をもつ
合成ペプチドをウサギに免疫して得られたポリクローナ
ル抗体を組み合わせて、サンドイッチＥＩＡ法によるヒ
トＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）の定量法を開発した。 （１）ポリクローナル抗体の作成 図６に示したｐｅｐｔｉｄｅ−４のアミノ末端にシステ
インを付加したペプチドを合成し、ＧＭＢＳ〔N-(Malei
midobutyryloxy)Succinimide、同仁化学研究所〕を用い
て、システインのＳＨ基を介して Bovine Thyroglobuli
n(BTG,シグマ)に結合させた。ウサギ(ニュージーランド
ホワイト、オス、２．５ｋｇ）に対し、上記のペプチド
の結合したＢＴＧ（０．２ｍｇのペプチドを含む）とフ
ロインド完全アジュバント(Difco Laboratories,米国)
の混合物を皮下に接種した。その後は、不完全アジュバ
ントとの混合物を２週間おきに接種し、４回目の接種か
ら一週間後に採血を行い、血清を得た。得られた血清を
同じ体積の飽和硫安と混合し、沈殿した蛋白質を遠心に
より回収した。この沈殿をＰＢＳ（８．１ｍＭリン酸二
ナトリウム、１．５ｍＭリン酸カリウム、２７ｍＭ塩化
カリウム、１３７ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）に
溶解し、血清の時と同じ体積の溶液にした。これを、ポ
アサイズ０．２２μｍのフィルター（ミリポア社）でろ
過した後、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で２倍
に希釈し、ＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ カラム(Ph
armacia Biotech社)にかけた。１０ｍｌの２０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ７．０）でカラムを洗浄した後、３ｍｌ
の０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．７）でＩｇ
Ｇを溶出し、１５０μｌの１．０Ｍトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ９．０）を加えて中和した。得られたＩｇＧ画分
を、５００ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ７．０）で２倍に希釈し、抗体を、免疫に
用いたペプチドを結合させたＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ−ａ
ｃｔｉｖａｔｅｄ カラム(Pharmacia Biotech)に結合さ
せ、５００ｍＭの塩化ナトリウムを含む１００ｍＭグリ
シン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．０）で溶出し、上記と同様
に中和した。 （２）抗体のビオチン標識 精製した抗体を０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ８．２）に対して透析し、最終的に１ｍｇ／ｍｌの濃
度に合わせた。１ｍｌ当り６０μｇのＮＨＳ−ＬＣ−Ｂ
ｉｏｔｉｎ(PIERCE 社)を加えて、室温で４時間混合し
続けた後、０．０１％チメロサールを含むＰＢＳに対し
て、４℃で透析した。 （３）ＥＩＡ系の設定 実施例２で得られたモノクローナル抗体を、１０ｍＭの
炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で２０μｇ／
ｍｌに希釈し、ＥＩＡ用の９６穴プレート（コーニング
社、No.430480)の各穴に１００μｌずつ加え、４℃で一
晩放置し、固相に抗体を結合させた。ＰＢＳ（８．１ｍ
Ｍリン酸二ナトリウム、１．５ｍＭリン酸カリウム、２
７ｍＭ塩化カリウム、１３７ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ
７．２）で２回洗浄した後、２５％ブロックエース（雪
印乳業）を含むＰＢＳを３００μｌずつ各穴に加え、使
用時まで冷所に保存した。このプレートを、０．０５％
のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで２回洗浄し、上記のブ
ロックエースを含むＰＢＳで種々の濃度に希釈したＧＳ
ＴとＥＲＫ１の融合蛋白の溶液を、１００μｌずつ各穴
に加え、４℃で一晩静置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２
０を含むＰＢＳで３回洗浄した後、０．１％ＢＳＡを含
むＰＢＳで１０００倍に希釈した、ビオチン標識したポ
リクローナル抗体を１００μｌずつ各穴に加え、室温で
２時間静置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢ
Ｓで４回洗浄した後、あらかじめ３０分間混合しておい
たビオチン標識された西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｈ
ＲＰ）とアビジン（共にベクター ラボラトリー社製、
ベクタステイン エリート ＡＢＣキットを１０００倍希
釈）を１００μｌずつ各穴に加えて、室温で１時間静置
した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで６回洗
浄した後、ＨＲＰ基質溶液を加え、実施例２−（３）記
載と同様の方法で酵素反応を行い、４９２ｎｍにおける
吸光度を測定した。その結果、本測定系でのＥＲＫ１の
検出限界は約７０ｐｇ／assay であった（図８）。
ゼ（ＥＲＫ１）の定量法 実施例２で得られたモノクローナル抗体と、ヒトＭＡＰ
キナーゼのカルボキシル末端付近のアミノ酸配列をもつ
合成ペプチドをウサギに免疫して得られたポリクローナ
ル抗体を組み合わせて、サンドイッチＥＩＡ法によるヒ
トＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）の定量法を開発した。 （１）ポリクローナル抗体の作成 図６に示したｐｅｐｔｉｄｅ−４のアミノ末端にシステ
インを付加したペプチドを合成し、ＧＭＢＳ〔N-(Malei
midobutyryloxy)Succinimide、同仁化学研究所〕を用い
て、システインのＳＨ基を介して Bovine Thyroglobuli
n(BTG,シグマ)に結合させた。ウサギ(ニュージーランド
ホワイト、オス、２．５ｋｇ）に対し、上記のペプチド
の結合したＢＴＧ（０．２ｍｇのペプチドを含む）とフ
ロインド完全アジュバント(Difco Laboratories,米国)
の混合物を皮下に接種した。その後は、不完全アジュバ
ントとの混合物を２週間おきに接種し、４回目の接種か
ら一週間後に採血を行い、血清を得た。得られた血清を
同じ体積の飽和硫安と混合し、沈殿した蛋白質を遠心に
より回収した。この沈殿をＰＢＳ（８．１ｍＭリン酸二
ナトリウム、１．５ｍＭリン酸カリウム、２７ｍＭ塩化
カリウム、１３７ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）に
溶解し、血清の時と同じ体積の溶液にした。これを、ポ
アサイズ０．２２μｍのフィルター（ミリポア社）でろ
過した後、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で２倍
に希釈し、ＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ カラム(Ph
armacia Biotech社)にかけた。１０ｍｌの２０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ７．０）でカラムを洗浄した後、３ｍｌ
の０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．７）でＩｇ
Ｇを溶出し、１５０μｌの１．０Ｍトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ９．０）を加えて中和した。得られたＩｇＧ画分
を、５００ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ７．０）で２倍に希釈し、抗体を、免疫に
用いたペプチドを結合させたＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ−ａ
ｃｔｉｖａｔｅｄ カラム(Pharmacia Biotech)に結合さ
せ、５００ｍＭの塩化ナトリウムを含む１００ｍＭグリ
シン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．０）で溶出し、上記と同様
に中和した。 （２）抗体のビオチン標識 精製した抗体を０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ８．２）に対して透析し、最終的に１ｍｇ／ｍｌの濃
度に合わせた。１ｍｌ当り６０μｇのＮＨＳ−ＬＣ−Ｂ
ｉｏｔｉｎ(PIERCE 社)を加えて、室温で４時間混合し
続けた後、０．０１％チメロサールを含むＰＢＳに対し
て、４℃で透析した。 （３）ＥＩＡ系の設定 実施例２で得られたモノクローナル抗体を、１０ｍＭの
炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で２０μｇ／
ｍｌに希釈し、ＥＩＡ用の９６穴プレート（コーニング
社、No.430480)の各穴に１００μｌずつ加え、４℃で一
晩放置し、固相に抗体を結合させた。ＰＢＳ（８．１ｍ
Ｍリン酸二ナトリウム、１．５ｍＭリン酸カリウム、２
７ｍＭ塩化カリウム、１３７ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ
７．２）で２回洗浄した後、２５％ブロックエース（雪
印乳業）を含むＰＢＳを３００μｌずつ各穴に加え、使
用時まで冷所に保存した。このプレートを、０．０５％
のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで２回洗浄し、上記のブ
ロックエースを含むＰＢＳで種々の濃度に希釈したＧＳ
ＴとＥＲＫ１の融合蛋白の溶液を、１００μｌずつ各穴
に加え、４℃で一晩静置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２
０を含むＰＢＳで３回洗浄した後、０．１％ＢＳＡを含
むＰＢＳで１０００倍に希釈した、ビオチン標識したポ
リクローナル抗体を１００μｌずつ各穴に加え、室温で
２時間静置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢ
Ｓで４回洗浄した後、あらかじめ３０分間混合しておい
たビオチン標識された西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｈ
ＲＰ）とアビジン（共にベクター ラボラトリー社製、
ベクタステイン エリート ＡＢＣキットを１０００倍希
釈）を１００μｌずつ各穴に加えて、室温で１時間静置
した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで６回洗
浄した後、ＨＲＰ基質溶液を加え、実施例２−（３）記
載と同様の方法で酵素反応を行い、４９２ｎｍにおける
吸光度を測定した。その結果、本測定系でのＥＲＫ１の
検出限界は約７０ｐｇ／assay であった（図８）。
【００３７】〔参考例１〕合成ペプチド Ｈｉｓ−Ｔｈ
ｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−（Ｔｈｒ−ＰＯ3Ｈ2）−
Ｇｌｕ−（Ｔｙｒ−ＰＯ3Ｈ2）−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｔｈ
ｒ−Ａｒｇ （配列番号：１）の合成 上記ペプチドの合成は、アプライドバイオシステム社の
自動ペプチド合成機を用いた固相合成法にて行った。基
本的に、Ｂｏｃ法〔Merrifield,R.B.ら、アドバンス・
オブ・エンザイモロジー（Adv.Enzymol.）,第32巻,第22
1-296頁(1969)〕に順じて合成を行った。脱保護の後、
逆相のＨＰＬＣで精製し、アミノ酸組成の分析と質量分
析を行い、予想値と一致することを確認した。
ｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−（Ｔｈｒ−ＰＯ3Ｈ2）−
Ｇｌｕ−（Ｔｙｒ−ＰＯ3Ｈ2）−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｔｈ
ｒ−Ａｒｇ （配列番号：１）の合成 上記ペプチドの合成は、アプライドバイオシステム社の
自動ペプチド合成機を用いた固相合成法にて行った。基
本的に、Ｂｏｃ法〔Merrifield,R.B.ら、アドバンス・
オブ・エンザイモロジー（Adv.Enzymol.）,第32巻,第22
1-296頁(1969)〕に順じて合成を行った。脱保護の後、
逆相のＨＰＬＣで精製し、アミノ酸組成の分析と質量分
析を行い、予想値と一致することを確認した。
【００３８】動物の免疫等に用いた、その他のペプチド
も、上記と同様にして、化学的に合成した。
も、上記と同様にして、化学的に合成した。
【００３９】実施例６ 活性型ＭＡＰキナーゼと特異的
に結合する抗体の作成 ＭＡＰキナーゼが、蛋白質リン酸化酵素として働くため
には、ＭＡＰキナーゼ内の特定の２ヶ所の被リン酸化部
位（ヒトＥＲＫ１については２０２残基目のスレオニン
と２０４残基目のチロシン、ヒトＥＲＫ２については１
８５残基目のスレオニンと１８７残基目のチロシン）
が、共にリン酸化されることが必要かつ十分な条件であ
ると考えられている〔Neil G. Anderson ら、Nature、
第343巻、第651-653頁(1990)〕。活性化されたＭＡＰキ
ナーゼと特異的に結合する抗体を得るために、参考例１
で合成した、配列が Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ
−Ｌｅｕ−（Ｔｈｒ−ＰＯ3Ｈ2）−Ｇｌｕ−（Ｔｙｒ−
ＰＯ3Ｈ2）−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ である
合成ペプチドを、グルタルアルデヒド(和光純薬)を用い
てＢＴＧに結合させた（この配列は、ヒトＥＲＫ１、ヒ
トＥＲＫ２、ラットＥＲＫ１およびＥＲＫ２において、
同一である。）。実施例５で述べたのと同じ方法でウサ
ギを免疫し、血清を得て、ＩｇＧ画分にまで精製した。
実施例５−（１）と同じ方法で、免疫に用いたのと同じ
合成ペプチドを結合させたカラムに、上記のＩｇＧを通
し、結合した画分を回収した。さらに、アミノ酸配列に
関係なく、リン酸化チロシンさえあれば結合する抗体を
除くため、リン酸化チロシンを結合させたカラムを作製
し、先の回収画分をこのカラムに通し、素通りした画分
を集めた。さらに、リン酸化スレオニンを結合させたカ
ラムを通し、素通り画分を得た。最後に、免疫したペプ
チドと同じアミノ酸配列を含む非リン酸化ペプチド（図
６のｐｅｐｔｉｄｅ−２）を結合させたカラムを通し、
素通り画分を回収して、以後の実験に用いた。
に結合する抗体の作成 ＭＡＰキナーゼが、蛋白質リン酸化酵素として働くため
には、ＭＡＰキナーゼ内の特定の２ヶ所の被リン酸化部
位（ヒトＥＲＫ１については２０２残基目のスレオニン
と２０４残基目のチロシン、ヒトＥＲＫ２については１
８５残基目のスレオニンと１８７残基目のチロシン）
が、共にリン酸化されることが必要かつ十分な条件であ
ると考えられている〔Neil G. Anderson ら、Nature、
第343巻、第651-653頁(1990)〕。活性化されたＭＡＰキ
ナーゼと特異的に結合する抗体を得るために、参考例１
で合成した、配列が Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ
−Ｌｅｕ−（Ｔｈｒ−ＰＯ3Ｈ2）−Ｇｌｕ−（Ｔｙｒ−
ＰＯ3Ｈ2）−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ である
合成ペプチドを、グルタルアルデヒド(和光純薬)を用い
てＢＴＧに結合させた（この配列は、ヒトＥＲＫ１、ヒ
トＥＲＫ２、ラットＥＲＫ１およびＥＲＫ２において、
同一である。）。実施例５で述べたのと同じ方法でウサ
ギを免疫し、血清を得て、ＩｇＧ画分にまで精製した。
実施例５−（１）と同じ方法で、免疫に用いたのと同じ
合成ペプチドを結合させたカラムに、上記のＩｇＧを通
し、結合した画分を回収した。さらに、アミノ酸配列に
関係なく、リン酸化チロシンさえあれば結合する抗体を
除くため、リン酸化チロシンを結合させたカラムを作製
し、先の回収画分をこのカラムに通し、素通りした画分
を集めた。さらに、リン酸化スレオニンを結合させたカ
ラムを通し、素通り画分を得た。最後に、免疫したペプ
チドと同じアミノ酸配列を含む非リン酸化ペプチド（図
６のｐｅｐｔｉｄｅ−２）を結合させたカラムを通し、
素通り画分を回収して、以後の実験に用いた。
【００４０】実施例７ 実施例６で得られた抗体の特異
性の検討 上述の各精製の段階で、特異性が向上しているかどう
か、ウエスタンブロッティング法で調べた。ヒト由来の
細胞であるＡ−４３１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５５５）
を培養シャーレ（ＦＡＬＣＯＮ ３００３）に１０％の
牛胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で５％ＣＯ2、３７℃の
条件で培養し、培地を血清を含まないものと交換してか
ら１６時間後に、終濃度１００ｎｇ／ｍｌのヒトＥＧＦ
を加えて１０分間培養を続けた。培地を除去し、冷却し
たＰＢＳ（実施例２−（５））で２回洗浄した後、電気
泳動用溶解液（６２．５ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ６．
８）、２％ＳＤＳ、５％メルカプトエタノール、１０％
グリセロール）５００μｌを加えて細胞を溶解させ、９
５℃で５分間加熱した。この細胞溶解液を、ＥＧＦ刺激
していない細胞から作成した溶解液と並べて１０％ゲル
でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、各精製段階の抗体を用い
て、実施例３−（１）と同じ方法でウエスタンブロッテ
ィングを行った（図９）。ＩｇＧ、および免疫に用いた
合成ペプチドでのアフィニティー精製までの段階では、
ＥＲＫ１とＥＲＫ２以外にも、いくつかのバンドが検出
された。しかし、リン酸化チロシンに結合する成分を除
いた抗体を用いると、ＥＲＫ１とＥＲＫ２以外のバンド
はほとんど検出されなかった。また、ＥＧＦを添加して
いない細胞のＥＲＫ１とＥＲＫ２は、非常に弱くしか検
出されなかった。以上の結果から、リン酸化チロシンを
結合させたカラムを素通りさせた段階で、活性化された
ＭＡＰキナーゼに対して高い特異性をもつ抗体が得られ
たことが分かった。
性の検討 上述の各精製の段階で、特異性が向上しているかどう
か、ウエスタンブロッティング法で調べた。ヒト由来の
細胞であるＡ−４３１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５５５）
を培養シャーレ（ＦＡＬＣＯＮ ３００３）に１０％の
牛胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で５％ＣＯ2、３７℃の
条件で培養し、培地を血清を含まないものと交換してか
ら１６時間後に、終濃度１００ｎｇ／ｍｌのヒトＥＧＦ
を加えて１０分間培養を続けた。培地を除去し、冷却し
たＰＢＳ（実施例２−（５））で２回洗浄した後、電気
泳動用溶解液（６２．５ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ６．
８）、２％ＳＤＳ、５％メルカプトエタノール、１０％
グリセロール）５００μｌを加えて細胞を溶解させ、９
５℃で５分間加熱した。この細胞溶解液を、ＥＧＦ刺激
していない細胞から作成した溶解液と並べて１０％ゲル
でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、各精製段階の抗体を用い
て、実施例３−（１）と同じ方法でウエスタンブロッテ
ィングを行った（図９）。ＩｇＧ、および免疫に用いた
合成ペプチドでのアフィニティー精製までの段階では、
ＥＲＫ１とＥＲＫ２以外にも、いくつかのバンドが検出
された。しかし、リン酸化チロシンに結合する成分を除
いた抗体を用いると、ＥＲＫ１とＥＲＫ２以外のバンド
はほとんど検出されなかった。また、ＥＧＦを添加して
いない細胞のＥＲＫ１とＥＲＫ２は、非常に弱くしか検
出されなかった。以上の結果から、リン酸化チロシンを
結合させたカラムを素通りさせた段階で、活性化された
ＭＡＰキナーゼに対して高い特異性をもつ抗体が得られ
たことが分かった。
【００４１】実施例８ サンドイッチＥＩＡ法による活
性型ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）の定量 （１）抗体のビオチン化 精製された、活性型ＭＡＰキナーゼに特異的な抗体を、
実施例５−（２）に記載したと同様の方法でビオチン標
識した。 （２）試験管内でのＭＡＰキナーゼの活性化 活性型ＭＡＰキナーゼを得るために、ＭＡＰキナーゼを
リン酸化により活性化させる酵素（ＭＥＫ）を精製し、
それを用いて、試験管内で、ＭＡＰキナーゼを活性化さ
せた。精製法は、Ｎａｔａｌｉｅ Ｇ．Ａｈｎらの報告
〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA、第90巻、第5143-5147頁（1
993）〕に従った。実施例７に記載したのと同様の方法
で培養細胞Ａ４３１をＥＧＦで５分間刺激した後、シャ
ーレを氷冷した５ｍｌのＰＢＳで２回洗い、シャーレ当
り０．５ｍｌのＭＡＰキナーゼ活性測定用細胞溶解液
（１０ｍＭ トリス・塩酸ｐＨ７．５、１５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、２ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ Ｎ
ａ3ＶＯ4、０．１ｍＭ Ｎａ2ＭｏＯ4、２ｍＭ ＤＴＴ、
５ｍＭ ２−Ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１ｍ
Ｍ ＮａＦ、１０μｇ／ｍｌ Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、１０
μｇ／ｍｌ Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、１％ ＴｒｉｔｏｎＸ
−１００）を加え、溶解液を集めて、３０秒間の超音波
処理の後、１２０００ｒｍｐ、１０分の遠心を行い、上
清を回収した。緩衝液Ｓ（４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ・ｐＨ
７．４、２ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ Ｎ
ａＦ、５％グリセリン、０．０１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−
１００）で２倍に希釈し、同緩衝液で平衡化した１ｍｌ
のＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ファルマシア バ
イオテク社）にかけた。０．３ＭのＮａＣｌを含む３ｍ
ｌの緩衝液Ｓで溶出を行い、ＮａＣｌを含まない緩衝液
Ｓで５倍に希釈した。これを同緩衝液で平衡化したｍｏ
ｎｏＱカラム（ファルマシアバイオテク社）にかけ、０
Ｍから０．３ＭのＮａＣｌの濃度勾配により蛋白を溶出
し、抗ＭＥＫポリクローナル抗体（サアンタクルーズ
バイオテクノロジー社）を用いたウエスタンブロッティ
ングで、ＭＥＫ蛋白を含む画分を特定し、以後の実験に
用いた。実施例３−（２）で述べた実験で得られたＧＳ
Ｔ蛋白とヒトＭＡＰキナーゼとの融合蛋白（ＧＳＴ−ヒ
トＥＲＫ１蛋白及びＧＳＴ−ヒトＥＲＫ２蛋白）を８μ
ｇずつとり、５０ｍＭトリス・塩酸ｐＨ７．５、２ｍＭ
ＥＧＴＡ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、２ｍＭ ＮａＦ、１ｍ
Ｍ ＤＴＴ、２００μＭ ＡＴＰを含む溶液中で、上記の
ＭＥＫ蛋白を用いて、３７℃で活性化させた。 （３）活性型ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）のサンド
イッチＥＩＡ系の設定 実施例２で得られたモノクローナル抗体を、１０μｇ／
ｍｌになるように１０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ８．０）で
希釈し、その１００μｌを９６穴イムノプレート（ヌン
ク社）の各穴に入れ、４℃で一夜放置し、固相に抗体を
結合させた。ＰＢＳで２回洗浄した後、余剰の結合部位
を塞ぐため、ブロックエース（雪印乳業）を２０％含有
するＰＢＳを３００μｌずつ各穴へ注入し、使用するま
で冷所に保存した。ＭＥＫ蛋白で活性化させたＧＳＴ−
ヒトＥＲＫ１蛋白及びＧＳＴ−ヒトＥＲＫ２蛋白、ある
いは活性化していないそれぞれの融合蛋白を０．３μｇ
ずつとり、ブロックエースを２０％含有するＰＢＳで７
５μｌにし、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで
３回洗浄した各プレートの穴に注入した。さらに、ブロ
ックエースを含むＰＢＳで５倍ずつ、３１２５倍まで希
釈した溶液を作り、７５μｌずつ注入した。４℃で一夜
放置し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで４回
洗浄した。実施例８−（１）に記載した、ビオチン標識
した、活性型ＭＡＰキナーゼに特異的な抗体を、ＢＳＡ
を０．１％含むＰＢＳで１０００倍に希釈し、１００μ
ｌずつ穴に注入した。室温で４時間放置し、０．０５％
Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで４回洗浄した。３０分前
から、ＢＳＡを０．１％含むＰＢＳで１０００倍希釈で
混合しておいたアビジンとビオチン標識ＨＲＰ（共にベ
クタステイン エリート ＡＢＣキット、ベクターラボラ
トリーズ社）を１００μｌずつ加え、室温で１時間放置
した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで６回洗
浄した後、ＨＲＰ基質溶液を加え、実施例２−（３）記
載と同様の方法で酵素反応を行い、４９２ｎｍにおける
吸光度を測定した。結果のグラフ（図１０）から、モノ
クローナル抗体ＨＥ１１３を、固相に結合させた場合に
は、活性化されたヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）を添
加した場合にのみ、吸光度の上昇が認められ、活性化し
ていないヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）や、活性化の
有無にかかわらず、ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ２）を
添加した場合には、吸光度の上昇が見られなかった。以
上の結果から、上記の系で、活性化されたヒトＭＡＰキ
ナーゼ（ＥＲＫ１）を、活性化されていない蛋白や、ヒ
トＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ２）と区別して定量できるこ
とが分かった。
性型ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）の定量 （１）抗体のビオチン化 精製された、活性型ＭＡＰキナーゼに特異的な抗体を、
実施例５−（２）に記載したと同様の方法でビオチン標
識した。 （２）試験管内でのＭＡＰキナーゼの活性化 活性型ＭＡＰキナーゼを得るために、ＭＡＰキナーゼを
リン酸化により活性化させる酵素（ＭＥＫ）を精製し、
それを用いて、試験管内で、ＭＡＰキナーゼを活性化さ
せた。精製法は、Ｎａｔａｌｉｅ Ｇ．Ａｈｎらの報告
〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA、第90巻、第5143-5147頁（1
993）〕に従った。実施例７に記載したのと同様の方法
で培養細胞Ａ４３１をＥＧＦで５分間刺激した後、シャ
ーレを氷冷した５ｍｌのＰＢＳで２回洗い、シャーレ当
り０．５ｍｌのＭＡＰキナーゼ活性測定用細胞溶解液
（１０ｍＭ トリス・塩酸ｐＨ７．５、１５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、２ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ Ｎ
ａ3ＶＯ4、０．１ｍＭ Ｎａ2ＭｏＯ4、２ｍＭ ＤＴＴ、
５ｍＭ ２−Ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１ｍ
Ｍ ＮａＦ、１０μｇ／ｍｌ Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、１０
μｇ／ｍｌ Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、１％ ＴｒｉｔｏｎＸ
−１００）を加え、溶解液を集めて、３０秒間の超音波
処理の後、１２０００ｒｍｐ、１０分の遠心を行い、上
清を回収した。緩衝液Ｓ（４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ・ｐＨ
７．４、２ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ Ｎ
ａＦ、５％グリセリン、０．０１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−
１００）で２倍に希釈し、同緩衝液で平衡化した１ｍｌ
のＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ファルマシア バ
イオテク社）にかけた。０．３ＭのＮａＣｌを含む３ｍ
ｌの緩衝液Ｓで溶出を行い、ＮａＣｌを含まない緩衝液
Ｓで５倍に希釈した。これを同緩衝液で平衡化したｍｏ
ｎｏＱカラム（ファルマシアバイオテク社）にかけ、０
Ｍから０．３ＭのＮａＣｌの濃度勾配により蛋白を溶出
し、抗ＭＥＫポリクローナル抗体（サアンタクルーズ
バイオテクノロジー社）を用いたウエスタンブロッティ
ングで、ＭＥＫ蛋白を含む画分を特定し、以後の実験に
用いた。実施例３−（２）で述べた実験で得られたＧＳ
Ｔ蛋白とヒトＭＡＰキナーゼとの融合蛋白（ＧＳＴ−ヒ
トＥＲＫ１蛋白及びＧＳＴ−ヒトＥＲＫ２蛋白）を８μ
ｇずつとり、５０ｍＭトリス・塩酸ｐＨ７．５、２ｍＭ
ＥＧＴＡ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、２ｍＭ ＮａＦ、１ｍ
Ｍ ＤＴＴ、２００μＭ ＡＴＰを含む溶液中で、上記の
ＭＥＫ蛋白を用いて、３７℃で活性化させた。 （３）活性型ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）のサンド
イッチＥＩＡ系の設定 実施例２で得られたモノクローナル抗体を、１０μｇ／
ｍｌになるように１０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ８．０）で
希釈し、その１００μｌを９６穴イムノプレート（ヌン
ク社）の各穴に入れ、４℃で一夜放置し、固相に抗体を
結合させた。ＰＢＳで２回洗浄した後、余剰の結合部位
を塞ぐため、ブロックエース（雪印乳業）を２０％含有
するＰＢＳを３００μｌずつ各穴へ注入し、使用するま
で冷所に保存した。ＭＥＫ蛋白で活性化させたＧＳＴ−
ヒトＥＲＫ１蛋白及びＧＳＴ−ヒトＥＲＫ２蛋白、ある
いは活性化していないそれぞれの融合蛋白を０．３μｇ
ずつとり、ブロックエースを２０％含有するＰＢＳで７
５μｌにし、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで
３回洗浄した各プレートの穴に注入した。さらに、ブロ
ックエースを含むＰＢＳで５倍ずつ、３１２５倍まで希
釈した溶液を作り、７５μｌずつ注入した。４℃で一夜
放置し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで４回
洗浄した。実施例８−（１）に記載した、ビオチン標識
した、活性型ＭＡＰキナーゼに特異的な抗体を、ＢＳＡ
を０．１％含むＰＢＳで１０００倍に希釈し、１００μ
ｌずつ穴に注入した。室温で４時間放置し、０．０５％
Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで４回洗浄した。３０分前
から、ＢＳＡを０．１％含むＰＢＳで１０００倍希釈で
混合しておいたアビジンとビオチン標識ＨＲＰ（共にベ
クタステイン エリート ＡＢＣキット、ベクターラボラ
トリーズ社）を１００μｌずつ加え、室温で１時間放置
した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで６回洗
浄した後、ＨＲＰ基質溶液を加え、実施例２−（３）記
載と同様の方法で酵素反応を行い、４９２ｎｍにおける
吸光度を測定した。結果のグラフ（図１０）から、モノ
クローナル抗体ＨＥ１１３を、固相に結合させた場合に
は、活性化されたヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）を添
加した場合にのみ、吸光度の上昇が認められ、活性化し
ていないヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）や、活性化の
有無にかかわらず、ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ２）を
添加した場合には、吸光度の上昇が見られなかった。以
上の結果から、上記の系で、活性化されたヒトＭＡＰキ
ナーゼ（ＥＲＫ１）を、活性化されていない蛋白や、ヒ
トＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ２）と区別して定量できるこ
とが分かった。
【００４２】実施例９ ＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）特
異的ポリクローナル抗体、および、ＭＡＰキナーゼ（Ｅ
ＲＫ２）特異的ポリクローナル抗体の作製 （１）免疫原の作製と免疫 ＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）に特異的な抗体を作製する
ために、図６に示したｐｅｐｔｉｄｅ−３〔ヒトＭＡＰ
キナーゼ（ＥＲＫ１）の２８３番目から３００番目まで
のアミノ酸配列のぺプチド〕およびｐｅｐｔｉｄｅ−４
〔ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）の３６４番目から３
７９番目までのアミノ酸配列のぺプチド〕のアミノ末端
にシステインを付加したペプチドをそれぞれ合成し、Ｇ
ＭＢＳ〔Ｎ−（Ｍａｌｅｉｍｉｄｏ−ｂｕｔｙｒｙｌｏ
ｘｙ）Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ、同仁化学研究所〕を用
いて、そのシステインのＳＨ基を介してＢＴＧ（Ｂｏｖ
ｉｎｅ Ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ、シグマ）に結合
させた。ＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ２）に特異的な抗体を
作製するためには、図１１に示したｐｅｐｔｉｄｅ−５
〔ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ２）の２６６番目から２
８３番目までのアミノ酸配列のぺプチド〕およびｐｅｐ
ｔｉｄｅ−６〔ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ２）の３４
７番目から３６０番目までのアミノ酸配列のぺプチド〕
のアミノ末端にシステインを付加したペプチドをそれぞ
れ合成し、上記と同じ方法で、ＢＴＧに結合させた。ウ
サギ（ニュージーランドホワイト、オス、２．５ｋｇ）
に対し、上記のペプチドの結合したＢＴＧ（０．２ｍｇ
のペプチドを含む）とフロインド完全アジュバント（Ｄ
ｉｆｃｏ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，米国）の混合物
を皮下に接種した。その後は、不完全アジュバントとの
混合物を２週間おきに接種し、４回目の接種から一週間
後に採血を行い、血清を得た。 （２）特異的抗体の精製 得られた血清を同じ体積の飽和硫安と混合し、沈殿した
蛋白質を遠心により回収した。この沈殿をＰＢＳ（８．
１ｍＭリン酸二ナトリウム、１．５ｍＭリン酸カリウ
ム、２７ｍＭ塩化カリウム、１３７ｍＭ塩化ナトリウ
ム、ｐＨ７．２）に溶解し、血清の時と同じ体積の溶液
にした。これを、ポアサイズ０．２２μｍのフィルター
（ミリポア社）で濾過した後、２０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）で２倍に希釈し、Ｈｉ Ｔｒａｐ Ｐｒ
ｏｔｅｉｎ Ｇ カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈ社）にかけた。１０ｍｌの２０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７．０）でカラムを洗浄した後、３ｍｌの０．
１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．７）でＩｇＧを溶
出し、１５０μｌの１．０Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
９．０）を加えて中和した。得られたＩｇＧ画分を、５
００ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）で２倍に希釈し、それぞれの抗体を、各
抗原（ペプチド）を結合させたＨｉ Ｔｒａｐ ＮＨＳ
−ａｃｔｉｖａｔｅｄ カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に結合させ、５００ｍＭの塩化ナト
リウムを含む１００ｍＭグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ
２．０）で溶出し、上記と同様に中和した。ｐｅｐｔｉ
ｄｅ−３を抗原として作成した抗体については、ＥＲＫ
２と結合する成分を除くため、さらにｐｅｐｔｉｄｅ−
５を結合させたカラムに通し、素通り画分を得た。同様
に、ｐｅｐｔｉｄｅ−６を抗原として作成した抗体につ
いては、ＥＲＫ１と結合する成分を除くため、ｐｅｐｔ
ｉｄｅ−４を結合させたカラムに通し、素通り画分を得
た。 （３）抗体の特異性の検定 得られた抗ｐｅｐｔｉｄｅ−３抗体、および、抗ｐｅｐ
ｔｉｄｅ−６抗体が、ＥＲＫ１とＥＲＫ２をどの程度厳
密に区別できるか、ＥＩＡ法で調べた。実施例３−
（２）で報告したのと同じ方法で、各抗体の特異性につ
いて調べたところ、抗ｐｅｐｔｉｄｅ−３抗体は、ＧＳ
Ｔ−ヒトＥＲＫ１蛋白には強く結合したが、ＧＳＴ−ヒ
トＥＲＫ２蛋白には結合しなかった。一方、抗ｐｅｐｔ
ｉｄｅ−６抗体は、ＧＳＴ−ヒトＥＲＫ２蛋白には強く
結合したが、ＧＳＴ−ヒトＥＲＫ１蛋白には結合しなか
った（図１２）。以上の結果から、これらの抗体を用い
て、ＥＲＫ１とＥＲＫ２を厳密に区別できることが分か
った。
異的ポリクローナル抗体、および、ＭＡＰキナーゼ（Ｅ
ＲＫ２）特異的ポリクローナル抗体の作製 （１）免疫原の作製と免疫 ＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）に特異的な抗体を作製する
ために、図６に示したｐｅｐｔｉｄｅ−３〔ヒトＭＡＰ
キナーゼ（ＥＲＫ１）の２８３番目から３００番目まで
のアミノ酸配列のぺプチド〕およびｐｅｐｔｉｄｅ−４
〔ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）の３６４番目から３
７９番目までのアミノ酸配列のぺプチド〕のアミノ末端
にシステインを付加したペプチドをそれぞれ合成し、Ｇ
ＭＢＳ〔Ｎ−（Ｍａｌｅｉｍｉｄｏ−ｂｕｔｙｒｙｌｏ
ｘｙ）Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ、同仁化学研究所〕を用
いて、そのシステインのＳＨ基を介してＢＴＧ（Ｂｏｖ
ｉｎｅ Ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ、シグマ）に結合
させた。ＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ２）に特異的な抗体を
作製するためには、図１１に示したｐｅｐｔｉｄｅ−５
〔ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ２）の２６６番目から２
８３番目までのアミノ酸配列のぺプチド〕およびｐｅｐ
ｔｉｄｅ−６〔ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ２）の３４
７番目から３６０番目までのアミノ酸配列のぺプチド〕
のアミノ末端にシステインを付加したペプチドをそれぞ
れ合成し、上記と同じ方法で、ＢＴＧに結合させた。ウ
サギ（ニュージーランドホワイト、オス、２．５ｋｇ）
に対し、上記のペプチドの結合したＢＴＧ（０．２ｍｇ
のペプチドを含む）とフロインド完全アジュバント（Ｄ
ｉｆｃｏ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，米国）の混合物
を皮下に接種した。その後は、不完全アジュバントとの
混合物を２週間おきに接種し、４回目の接種から一週間
後に採血を行い、血清を得た。 （２）特異的抗体の精製 得られた血清を同じ体積の飽和硫安と混合し、沈殿した
蛋白質を遠心により回収した。この沈殿をＰＢＳ（８．
１ｍＭリン酸二ナトリウム、１．５ｍＭリン酸カリウ
ム、２７ｍＭ塩化カリウム、１３７ｍＭ塩化ナトリウ
ム、ｐＨ７．２）に溶解し、血清の時と同じ体積の溶液
にした。これを、ポアサイズ０．２２μｍのフィルター
（ミリポア社）で濾過した後、２０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）で２倍に希釈し、Ｈｉ Ｔｒａｐ Ｐｒ
ｏｔｅｉｎ Ｇ カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈ社）にかけた。１０ｍｌの２０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７．０）でカラムを洗浄した後、３ｍｌの０．
１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．７）でＩｇＧを溶
出し、１５０μｌの１．０Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
９．０）を加えて中和した。得られたＩｇＧ画分を、５
００ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）で２倍に希釈し、それぞれの抗体を、各
抗原（ペプチド）を結合させたＨｉ Ｔｒａｐ ＮＨＳ
−ａｃｔｉｖａｔｅｄ カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に結合させ、５００ｍＭの塩化ナト
リウムを含む１００ｍＭグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ
２．０）で溶出し、上記と同様に中和した。ｐｅｐｔｉ
ｄｅ−３を抗原として作成した抗体については、ＥＲＫ
２と結合する成分を除くため、さらにｐｅｐｔｉｄｅ−
５を結合させたカラムに通し、素通り画分を得た。同様
に、ｐｅｐｔｉｄｅ−６を抗原として作成した抗体につ
いては、ＥＲＫ１と結合する成分を除くため、ｐｅｐｔ
ｉｄｅ−４を結合させたカラムに通し、素通り画分を得
た。 （３）抗体の特異性の検定 得られた抗ｐｅｐｔｉｄｅ−３抗体、および、抗ｐｅｐ
ｔｉｄｅ−６抗体が、ＥＲＫ１とＥＲＫ２をどの程度厳
密に区別できるか、ＥＩＡ法で調べた。実施例３−
（２）で報告したのと同じ方法で、各抗体の特異性につ
いて調べたところ、抗ｐｅｐｔｉｄｅ−３抗体は、ＧＳ
Ｔ−ヒトＥＲＫ１蛋白には強く結合したが、ＧＳＴ−ヒ
トＥＲＫ２蛋白には結合しなかった。一方、抗ｐｅｐｔ
ｉｄｅ−６抗体は、ＧＳＴ−ヒトＥＲＫ２蛋白には強く
結合したが、ＧＳＴ−ヒトＥＲＫ１蛋白には結合しなか
った（図１２）。以上の結果から、これらの抗体を用い
て、ＥＲＫ１とＥＲＫ２を厳密に区別できることが分か
った。
【００４３】実施例１０ サンドイッチ酵素免疫測定法
によるＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）の定量 （１）抗体のビオチン化 精製された抗ｐｅｐｔｉｄｅ−４抗体を実施例５−
（２）と同様の方法でビオチン化した。 （２）定量系の設定 実施例２で得られたヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）に
特異的に結合するモノクローナル抗体（ＨＥ１１３）、
および、実施例９で得られたＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ
１）に特異的に結合するポリクローナル抗体（抗ｐｅｐ
ｔｉｄｅ−３抗体）を１０ｍＭの炭酸水素ナトリウム緩
衝液（ｐＨ８．０）で２０μｇ／ｍｌに希釈し、ＥＩＡ
用の９６穴プレート（コーニング社、Ｎｏ．４３０４８
０）の各穴に１００μｌずつ加え、４℃で一晩放置し、
固相に抗体を結合させた。ＰＢＳ（８．１ｍＭリン酸二
ナトリウム、１．５ｍＭリン酸カリウム、２７ｍＭ塩化
カリウム、１３７ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）で
２回洗浄した後、２５％ブロックエース（雪印乳業）を
含むＰＢＳを３００μｌずつ各穴に加え、使用時まで冷
所に保存した。このプレートを、０．０５％のＴｗｅｅ
ｎ２０を含むＰＢＳで２回洗浄し、上記のブロックエー
スを含むＰＢＳで種々の濃度に希釈したＧＳＴ−ヒトＥ
ＲＫ１蛋白の溶液を、１００μｌずつ各穴に加え、４℃
で一晩静置した。０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰ
ＢＳで３回洗浄した後、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳで
１０００倍に希釈した、ビオチン標識した抗ｐｅｐｔｉ
ｄｅ−４抗体を１００μｌずつ各穴に加え、室温で２時
間静置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで
４回洗浄した後、あらかじめ３０分間混合しておいた、
ビオチン標識された西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲ
Ｐ）とアビジン（共にベクター ラボラトリー社製、ベ
クタステイン エリート ＡＢＣキットを１０００倍希
釈）を１００μｌずつ各穴に加えて、室温で１時間静置
した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで６回洗
浄した後、ＨＲＰ基質溶液を加え、実施例２−（３）記
載と同様の方法で酵素反応を行い、４９２ｎｍにおける
吸光度を測定した（図１３）。その結果、モノクローナ
ル抗体ＨＥ１１３を固相に結合させた場合の検出限界は
約７０ｐｇヒトＥＲＫ１／ａｓｓａｙ、抗ｐｅｐｔｉｄ
ｅ−３抗体を結合させた場合には約５０ｐｇヒトＥＲＫ
１／ａｓｓａｙであった。これらの系では、ヒトＭＡＰ
キナーゼ（ＥＲＫ２）は検出されず、高い特異性が明ら
かになった。
によるＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）の定量 （１）抗体のビオチン化 精製された抗ｐｅｐｔｉｄｅ−４抗体を実施例５−
（２）と同様の方法でビオチン化した。 （２）定量系の設定 実施例２で得られたヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）に
特異的に結合するモノクローナル抗体（ＨＥ１１３）、
および、実施例９で得られたＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ
１）に特異的に結合するポリクローナル抗体（抗ｐｅｐ
ｔｉｄｅ−３抗体）を１０ｍＭの炭酸水素ナトリウム緩
衝液（ｐＨ８．０）で２０μｇ／ｍｌに希釈し、ＥＩＡ
用の９６穴プレート（コーニング社、Ｎｏ．４３０４８
０）の各穴に１００μｌずつ加え、４℃で一晩放置し、
固相に抗体を結合させた。ＰＢＳ（８．１ｍＭリン酸二
ナトリウム、１．５ｍＭリン酸カリウム、２７ｍＭ塩化
カリウム、１３７ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）で
２回洗浄した後、２５％ブロックエース（雪印乳業）を
含むＰＢＳを３００μｌずつ各穴に加え、使用時まで冷
所に保存した。このプレートを、０．０５％のＴｗｅｅ
ｎ２０を含むＰＢＳで２回洗浄し、上記のブロックエー
スを含むＰＢＳで種々の濃度に希釈したＧＳＴ−ヒトＥ
ＲＫ１蛋白の溶液を、１００μｌずつ各穴に加え、４℃
で一晩静置した。０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰ
ＢＳで３回洗浄した後、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳで
１０００倍に希釈した、ビオチン標識した抗ｐｅｐｔｉ
ｄｅ−４抗体を１００μｌずつ各穴に加え、室温で２時
間静置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで
４回洗浄した後、あらかじめ３０分間混合しておいた、
ビオチン標識された西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲ
Ｐ）とアビジン（共にベクター ラボラトリー社製、ベ
クタステイン エリート ＡＢＣキットを１０００倍希
釈）を１００μｌずつ各穴に加えて、室温で１時間静置
した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで６回洗
浄した後、ＨＲＰ基質溶液を加え、実施例２−（３）記
載と同様の方法で酵素反応を行い、４９２ｎｍにおける
吸光度を測定した（図１３）。その結果、モノクローナ
ル抗体ＨＥ１１３を固相に結合させた場合の検出限界は
約７０ｐｇヒトＥＲＫ１／ａｓｓａｙ、抗ｐｅｐｔｉｄ
ｅ−３抗体を結合させた場合には約５０ｐｇヒトＥＲＫ
１／ａｓｓａｙであった。これらの系では、ヒトＭＡＰ
キナーゼ（ＥＲＫ２）は検出されず、高い特異性が明ら
かになった。
【００４４】実施例１１ サンドイッチ酵素免疫測定法
によるＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ２）の定量 （１）抗体のビオチン化 実施例９で得られた、精製された抗ｐｅｐｔｉｄｅ−５
抗体を、実施例５−（２）と同様の方法でビオチン化し
た。 （２）定量系の設定 実施例９で得られたＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ２）に特異
的に結合するポリクローナル抗体（抗ｐｅｐｔｉｄｅ−
６抗体）を、実施例１０−（２）と同様の方法で９６穴
プレートに結合させた。さらに同様の方法で、種々の濃
度に希釈したＧＳＴ−ヒトＥＲＫ２蛋白をプレートの各
穴に加え、ビオチン化した抗ｐｅｐｔｉｄｅ−５抗体を
用いて検出を行った（図１４）。その結果、検出限界は
約５０ｐｇヒトＥＲＫ２／ａｓｓａｙであった。この系
では、ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）は検出されず、
高い特異性が明らかになった。
によるＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ２）の定量 （１）抗体のビオチン化 実施例９で得られた、精製された抗ｐｅｐｔｉｄｅ−５
抗体を、実施例５−（２）と同様の方法でビオチン化し
た。 （２）定量系の設定 実施例９で得られたＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ２）に特異
的に結合するポリクローナル抗体（抗ｐｅｐｔｉｄｅ−
６抗体）を、実施例１０−（２）と同様の方法で９６穴
プレートに結合させた。さらに同様の方法で、種々の濃
度に希釈したＧＳＴ−ヒトＥＲＫ２蛋白をプレートの各
穴に加え、ビオチン化した抗ｐｅｐｔｉｄｅ−５抗体を
用いて検出を行った（図１４）。その結果、検出限界は
約５０ｐｇヒトＥＲＫ２／ａｓｓａｙであった。この系
では、ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）は検出されず、
高い特異性が明らかになった。
【００４５】実施例１２ サンドイッチ酵素免疫測定法
による活性型ＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）および活性型
ＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ２）の定量 （１）抗体のビオチン化 実施例６で得られた活性型ＭＡＰキナーゼに特異的に結
合するポリクローナル抗体を、実施例５−（２）と同様
の方法でビオチン化した。 （２）試験管内でのＭＡＰキナーゼの活性化 活性化型ＭＡＰキナーゼを得るため、ＭＡＰキナーゼを
リン酸化により活性化させる酵素（ＭＥＫ）を精製し、
それを用いて、試験管内で、ＭＡＰキナーゼを活性化さ
せた。精製法は、Ｎａｔａｌｉｅ Ｇ．Ａｈｎらの報告
〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳ
Ａ、第９０巻、第５１４３−５１４７頁（１９９３）〕
に従った。実施例７に記載したのと同様の方法で培養細
胞Ａ４３１をＥＧＦで５分間刺激した後、シャーレを氷
冷した５ｍｌのＰＢＳで２回洗い、シャーレ当り０．５
ｍｌのＭＡＰキナーゼ活性測定用細胞溶解液（１０ｍＭ
トリス・塩酸、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２
ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ Ｎａ3Ｖ
Ｏ4、０．１ｍＭ Ｎａ2ＭｏＯ4、２ｍＭ ＤＴＴ、５
ｍＭ ２−Ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１ｍＭ
ＮａＦ、１０μｇ／ｍｌ Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、１０
μｇ／ｍｌ Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００）を加え、溶解液を集めて、３０秒間の超
音波処理の後、１２０００ｒｐｍ、１０分の遠心を行
い、上清を回収した。緩衝液Ｓ（４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ
・ｐＨ７．４、２ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＤＴＴ、１
ｍＭ ＮａＦ、５％グリセリン、０．０１％Ｔｒｉｔｏ
ｎ Ｘ−１００）で２倍に希釈し、同緩衝液で平均化し
た１ｍｌのＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ファルマ
シア バイオテク社）にかけた。０．３ＭのＮａＣｌを
含む３ｍｌの緩衝液Ｓで溶出を行い、ＮａＣｌを含まな
い緩衝液Ｓで５倍に希釈した。これを同緩衝液で平均化
したｍｏｎｏ Ｑカラム（ファルマシア バイオテク
社）にかけ、０Ｍから０．３ＭのＮａＣｌの濃度勾配に
より蛋白を溶出し、抗ＭＥＫポリクローナル抗体（サン
タクルーズ バイオテクノロジー社）を用いたウエスタ
ンブロッティングで、ＭＥＫ蛋白を含む画分を特定し、
以後の実験に用いた。実施例３−（２）で述べた実験で
得られたＧＳＴ蛋白とヒトＭＡＰキナーゼとの融合蛋白
（ＧＳＴ−ヒトＥＲＫ１蛋白及びＧＳＴ−ヒトＥＲＫ２
蛋白）を８μｇずつとり、５０ｍＭ トリス塩酸ｐＨ
７．５、２ｍＭ ＥＧＴＡ、１０ｍＭＭｇＣｌ2、２ｍ
Ｍ ＮａＦ、１ｍＭ ＤＴＴ、２００μＭ ＡＴＰを含
む溶液中で、上記のＭＥＫ蛋白を用いて、３７℃で活性
化させた。 （３）活性型ＥＲＫ１および活性型ＥＲＫ２の酵素免疫
測定法による定量系の設定 活性型ＥＲＫ１についての測定を行うために、実施例２
に記載した、ヒトＥＲＫ１に特異的なモノクローナル抗
体ＨＥ１１３、および、実施例９に記載した、ヒトＥＲ
Ｋ１に特異的な抗ｐｅｐｔｉｄｅ−３抗体を、それぞれ
１０μｇ／ｍｌになるように１０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ
８．０）で希釈し、その１００μｌを９６穴イムノプレ
ート（ヌンク社）の各穴に入れ、４℃で一夜放置し、固
相に各抗体を結合させた。また、活性型ＥＲＫ２につい
ての測定を行うために、実施例９に記載したＥＲＫ２に
特異的な抗ｐｅｐｔｉｄｅ−６抗体を、上記と同様に、
固相に結合させた。ＰＢＳで２回洗浄した後、余剰の結
合部位を塞ぐため、ブロックエース（雪印乳業）を２０
％含有するＰＢＳを３００μｌずつ各穴へ注入し、使用
時まで冷所に保存した。ＭＥＫ蛋白で活性化させたＧＳ
Ｔ−ヒトＥＲＫ１蛋白及びＧＳＴ−ヒトＥＲＫ２蛋白、
あるいは、活性化していないそれぞれの融合蛋白を０．
３μｇずつとり、ブロックエースを２０％含有するＰＢ
Ｓで７５μｌにし、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰ
ＢＳで３回洗浄した各プレートの穴に注入した。さら
に、ブロックエースを含むＰＢＳで５倍ずつ、３１２５
倍まで希釈した溶液を作り、７５μｌずつ注入した。４
℃で一夜放置し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢ
Ｓで４回洗浄した。実施例１２−（１）に記載した、ビ
オチン標識した、活性型ＭＡＰキナーゼに特異的な抗体
を、ＢＳＡを０．１％含むＰＢＳで１０００倍に希釈
し、１００μｌずつ各穴に注入した。室温で４時間放置
し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで４回洗浄
した。３０分前からＢＳＡを０．１％含むＰＢＳで１０
００倍希釈で混合しておいたアビジンとビオチン標識さ
れたＨＲＰ（共にベクタステインエリート ＡＢＣキッ
ト、ベクターラボラトリーズ社）を１００μｌずつ加
え、室温で１時間静置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０
を含むＰＢＳで６回洗浄した後、ＨＲＰ基質溶液を加
え、実施例２−（３）記載と同様の方法で酵素反応を行
い、４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。結果のグラ
フ（図１５）から、ＨＥ１１３モノクローナル抗体、お
よび、抗ｐｅｐｔｉｄｅ−３抗体を固相に結合させた場
合には、活性化されたＧＳＴ−ヒトＥＲＫ１蛋白を添加
した場合にのみ、吸光度の上昇が認められ、活性化して
いないＧＳＴ−ヒトＥＲＫ１蛋白や、活性化の有無にか
かわらず、ＧＳＴ−ヒトＥＲＫ２蛋白を添加した場合に
は、吸光度の上昇が見られなかった。一方、抗ｐｅｐｔ
ｉｄｅ−６抗体を固相に結合させた場合には、活性化さ
れたＧＳＴ−ヒトＥＲＫ２蛋白を添加した場合にのみ吸
光度の上昇が認められ、活性化していないＧＳＴ−ヒト
ＥＲＫ２蛋白や、活性化の有無にかかわらず、ＧＳＴ−
ヒトＥＲＫ１蛋白を添加した場合には、吸光度の上昇が
見られなかった。以上の結果から、上記の系で、活性化
されたＭＡＰキナーゼを、ＥＲＫ１とＥＲＫ２を区別し
て定量化することができるということが分かった。
による活性型ＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）および活性型
ＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ２）の定量 （１）抗体のビオチン化 実施例６で得られた活性型ＭＡＰキナーゼに特異的に結
合するポリクローナル抗体を、実施例５−（２）と同様
の方法でビオチン化した。 （２）試験管内でのＭＡＰキナーゼの活性化 活性化型ＭＡＰキナーゼを得るため、ＭＡＰキナーゼを
リン酸化により活性化させる酵素（ＭＥＫ）を精製し、
それを用いて、試験管内で、ＭＡＰキナーゼを活性化さ
せた。精製法は、Ｎａｔａｌｉｅ Ｇ．Ａｈｎらの報告
〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳ
Ａ、第９０巻、第５１４３−５１４７頁（１９９３）〕
に従った。実施例７に記載したのと同様の方法で培養細
胞Ａ４３１をＥＧＦで５分間刺激した後、シャーレを氷
冷した５ｍｌのＰＢＳで２回洗い、シャーレ当り０．５
ｍｌのＭＡＰキナーゼ活性測定用細胞溶解液（１０ｍＭ
トリス・塩酸、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２
ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ Ｎａ3Ｖ
Ｏ4、０．１ｍＭ Ｎａ2ＭｏＯ4、２ｍＭ ＤＴＴ、５
ｍＭ ２−Ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１ｍＭ
ＮａＦ、１０μｇ／ｍｌ Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、１０
μｇ／ｍｌ Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００）を加え、溶解液を集めて、３０秒間の超
音波処理の後、１２０００ｒｐｍ、１０分の遠心を行
い、上清を回収した。緩衝液Ｓ（４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ
・ｐＨ７．４、２ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＤＴＴ、１
ｍＭ ＮａＦ、５％グリセリン、０．０１％Ｔｒｉｔｏ
ｎ Ｘ−１００）で２倍に希釈し、同緩衝液で平均化し
た１ｍｌのＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ファルマ
シア バイオテク社）にかけた。０．３ＭのＮａＣｌを
含む３ｍｌの緩衝液Ｓで溶出を行い、ＮａＣｌを含まな
い緩衝液Ｓで５倍に希釈した。これを同緩衝液で平均化
したｍｏｎｏ Ｑカラム（ファルマシア バイオテク
社）にかけ、０Ｍから０．３ＭのＮａＣｌの濃度勾配に
より蛋白を溶出し、抗ＭＥＫポリクローナル抗体（サン
タクルーズ バイオテクノロジー社）を用いたウエスタ
ンブロッティングで、ＭＥＫ蛋白を含む画分を特定し、
以後の実験に用いた。実施例３−（２）で述べた実験で
得られたＧＳＴ蛋白とヒトＭＡＰキナーゼとの融合蛋白
（ＧＳＴ−ヒトＥＲＫ１蛋白及びＧＳＴ−ヒトＥＲＫ２
蛋白）を８μｇずつとり、５０ｍＭ トリス塩酸ｐＨ
７．５、２ｍＭ ＥＧＴＡ、１０ｍＭＭｇＣｌ2、２ｍ
Ｍ ＮａＦ、１ｍＭ ＤＴＴ、２００μＭ ＡＴＰを含
む溶液中で、上記のＭＥＫ蛋白を用いて、３７℃で活性
化させた。 （３）活性型ＥＲＫ１および活性型ＥＲＫ２の酵素免疫
測定法による定量系の設定 活性型ＥＲＫ１についての測定を行うために、実施例２
に記載した、ヒトＥＲＫ１に特異的なモノクローナル抗
体ＨＥ１１３、および、実施例９に記載した、ヒトＥＲ
Ｋ１に特異的な抗ｐｅｐｔｉｄｅ−３抗体を、それぞれ
１０μｇ／ｍｌになるように１０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ
８．０）で希釈し、その１００μｌを９６穴イムノプレ
ート（ヌンク社）の各穴に入れ、４℃で一夜放置し、固
相に各抗体を結合させた。また、活性型ＥＲＫ２につい
ての測定を行うために、実施例９に記載したＥＲＫ２に
特異的な抗ｐｅｐｔｉｄｅ−６抗体を、上記と同様に、
固相に結合させた。ＰＢＳで２回洗浄した後、余剰の結
合部位を塞ぐため、ブロックエース（雪印乳業）を２０
％含有するＰＢＳを３００μｌずつ各穴へ注入し、使用
時まで冷所に保存した。ＭＥＫ蛋白で活性化させたＧＳ
Ｔ−ヒトＥＲＫ１蛋白及びＧＳＴ−ヒトＥＲＫ２蛋白、
あるいは、活性化していないそれぞれの融合蛋白を０．
３μｇずつとり、ブロックエースを２０％含有するＰＢ
Ｓで７５μｌにし、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰ
ＢＳで３回洗浄した各プレートの穴に注入した。さら
に、ブロックエースを含むＰＢＳで５倍ずつ、３１２５
倍まで希釈した溶液を作り、７５μｌずつ注入した。４
℃で一夜放置し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢ
Ｓで４回洗浄した。実施例１２−（１）に記載した、ビ
オチン標識した、活性型ＭＡＰキナーゼに特異的な抗体
を、ＢＳＡを０．１％含むＰＢＳで１０００倍に希釈
し、１００μｌずつ各穴に注入した。室温で４時間放置
し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで４回洗浄
した。３０分前からＢＳＡを０．１％含むＰＢＳで１０
００倍希釈で混合しておいたアビジンとビオチン標識さ
れたＨＲＰ（共にベクタステインエリート ＡＢＣキッ
ト、ベクターラボラトリーズ社）を１００μｌずつ加
え、室温で１時間静置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０
を含むＰＢＳで６回洗浄した後、ＨＲＰ基質溶液を加
え、実施例２−（３）記載と同様の方法で酵素反応を行
い、４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。結果のグラ
フ（図１５）から、ＨＥ１１３モノクローナル抗体、お
よび、抗ｐｅｐｔｉｄｅ−３抗体を固相に結合させた場
合には、活性化されたＧＳＴ−ヒトＥＲＫ１蛋白を添加
した場合にのみ、吸光度の上昇が認められ、活性化して
いないＧＳＴ−ヒトＥＲＫ１蛋白や、活性化の有無にか
かわらず、ＧＳＴ−ヒトＥＲＫ２蛋白を添加した場合に
は、吸光度の上昇が見られなかった。一方、抗ｐｅｐｔ
ｉｄｅ−６抗体を固相に結合させた場合には、活性化さ
れたＧＳＴ−ヒトＥＲＫ２蛋白を添加した場合にのみ吸
光度の上昇が認められ、活性化していないＧＳＴ−ヒト
ＥＲＫ２蛋白や、活性化の有無にかかわらず、ＧＳＴ−
ヒトＥＲＫ１蛋白を添加した場合には、吸光度の上昇が
見られなかった。以上の結果から、上記の系で、活性化
されたＭＡＰキナーゼを、ＥＲＫ１とＥＲＫ２を区別し
て定量化することができるということが分かった。
【００４６】実施例１３ 実施例１２の定量系の検出限
界についての検討 実施例１２で用いたＭＡＰキナーゼは、活性型と不活性
型との混合物であったため、測定系の検出限界を知るこ
とができなかった。そこで、実施例６で得られた抗体を
利用し、活性型ＭＡＰキナーゼの精製を行い、検出限界
について検討を行った。 （１）活性型ＭＡＰキナーゼの精製 実施例６で得られた、活性型ＭＡＰキナーゼと特異的に
結合する抗体１．７ｍｇをＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ
Ｈｉ−Ｔｒａｐカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａｂｉｏｔ
ｅｃｈ社）に結合させた。実施例１２−（２）で得られ
た活性型ＭＡＰキナーゼ（ＧＳＴとＥＲＫ１またはＥＲ
Ｋ２との融合蛋白）を、０．５Ｍ ＮａＣｌと０．０５
％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）で５倍に希釈し、カラムに添加し、素通り画分
をもう一度添加した。希釈に用いたのと同じ組成の緩衝
液５ｍｌでカラムを洗浄し、０．５Ｍ ＮａＣｌと０．
０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む０．１Ｍ グリシン−塩
酸緩衝液（ｐＨ２．０）を５ｍｌ添加して、蛋白を溶出
させ、２５０μｌの１Ｍ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
９．０）を加えて中和した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２
０を含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で３倍に
希釈し、１００μｌのグルタチオンセファロース４Ｂ
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ）を加え、４℃
で１時間混合し続けた。遠心操作でグルタチオンセファ
ロース４Ｂを集め、ＰＢＳで洗浄した後、１０ｍＭグル
タチオンと０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む５０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を０．５ｍｌ加え
て、蛋白をグルタチオンセファロース４Ｂから解離さ
せ、回収した。 （２）検出限界についての検討 得られた活性型ＭＡＰキナーゼを含む溶液の一部をと
り、実施例１０あるいは実施例１１に記載した系で蛋白
量の定量を行った。蛋白量を明らかにした活性型ＭＡＰ
キナーゼを含む溶液を用いて、実施例１２に記載した系
での測定を行ったところ、ＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）
についての検出限界は１８ｐｇ／ａｓｓａｙ、ＭＡＰキ
ナーゼ（ＥＲＫ２）については５ｐｇ／ａｓｓａｙとい
う値が得られた。
界についての検討 実施例１２で用いたＭＡＰキナーゼは、活性型と不活性
型との混合物であったため、測定系の検出限界を知るこ
とができなかった。そこで、実施例６で得られた抗体を
利用し、活性型ＭＡＰキナーゼの精製を行い、検出限界
について検討を行った。 （１）活性型ＭＡＰキナーゼの精製 実施例６で得られた、活性型ＭＡＰキナーゼと特異的に
結合する抗体１．７ｍｇをＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ
Ｈｉ−Ｔｒａｐカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａｂｉｏｔ
ｅｃｈ社）に結合させた。実施例１２−（２）で得られ
た活性型ＭＡＰキナーゼ（ＧＳＴとＥＲＫ１またはＥＲ
Ｋ２との融合蛋白）を、０．５Ｍ ＮａＣｌと０．０５
％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）で５倍に希釈し、カラムに添加し、素通り画分
をもう一度添加した。希釈に用いたのと同じ組成の緩衝
液５ｍｌでカラムを洗浄し、０．５Ｍ ＮａＣｌと０．
０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む０．１Ｍ グリシン−塩
酸緩衝液（ｐＨ２．０）を５ｍｌ添加して、蛋白を溶出
させ、２５０μｌの１Ｍ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
９．０）を加えて中和した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２
０を含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で３倍に
希釈し、１００μｌのグルタチオンセファロース４Ｂ
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ）を加え、４℃
で１時間混合し続けた。遠心操作でグルタチオンセファ
ロース４Ｂを集め、ＰＢＳで洗浄した後、１０ｍＭグル
タチオンと０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む５０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を０．５ｍｌ加え
て、蛋白をグルタチオンセファロース４Ｂから解離さ
せ、回収した。 （２）検出限界についての検討 得られた活性型ＭＡＰキナーゼを含む溶液の一部をと
り、実施例１０あるいは実施例１１に記載した系で蛋白
量の定量を行った。蛋白量を明らかにした活性型ＭＡＰ
キナーゼを含む溶液を用いて、実施例１２に記載した系
での測定を行ったところ、ＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）
についての検出限界は１８ｐｇ／ａｓｓａｙ、ＭＡＰキ
ナーゼ（ＥＲＫ２）については５ｐｇ／ａｓｓａｙとい
う値が得られた。
【００４７】実施例１４ 培養細胞ＰＣ−１２をＮＧＦ
で刺激したときのＭＡＰキナーゼの活性変化の酵素免疫
測定による検出 ラット由来培養細胞ＰＣ−１２（Ａｄｒｅｎａｌ ｐｈ
ｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１
７２１）を、１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭを培地と
して、２．８×１０6個ずつ６ｃｍシャーレ（ＦＡＬＣ
ＯＮ ３００２）にまき、３７℃、５％ＣＯ2の条件下
で一晩培養した。培養液を無血清のものに交換し、さら
に１時間培養した後、培養液を１００ｎｇ／ｍｌ ＮＧ
Ｆと０．１％ ＢＳＡを含むＤＭＥＭに交換した。様々
な時間、培養した後、培地を除き、氷冷ＰＢＳで２回洗
浄した。実施例１２−（２）に記載したＭＡＰキナーゼ
活性測定用細胞溶解液を２５０μｌずつ各シャーレに加
えて細胞を溶解させて、エッペンドルフチューブへ移し
た。氷上に５分間静置した後、１６０００ｘｇで５分間
遠心し、上清を得た。この上清に含まれる、活性型ＭＡ
Ｐキナーゼ（ＥＲＫ１）と活性型ＭＡＰキナーゼ（ＥＲ
Ｋ２）の量を、実施例１２に記載した酵素免疫測定法で
定量した。また、実施例１２−（２）で得られた、試験
管内で活性化させたＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）および
ＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ２）のリン酸化活性を、Ｔａｄ
ａｙｏ Ｍｉｙａｓａｋａらの方法〔Ｊ． Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．、第２６５巻、第４７３０−４７３５頁、
（１９９０）〕に従って測定し、活性の明らかになった
酵素を、上記のＰＣ−１２の溶解液と並べて酵素免疫測
定を行った。得られた値を比較することにより、吸光度
の値をリン酸化活性の値に変換した。結果を図１６に示
した。この結果から、ＰＣ−１２をＮＧＦで刺激した時
のＭＡＰキナーゼの活性の変化が、実施例１２に記載し
た系で、ＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）とＭＡＰキナーゼ
（ＥＲＫ２）の両方について測定できることが明らかに
なった。この活性化のパターンは、既に報告されている
結果〔例えばＧｏｔｏｈ Ｙ．ら、ユーロピアン・ジャ
ーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ． Ｊ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、第１９３巻、第６６１−６６９頁
（１９９０）〕と良く一致する。また、この結果から、
実施例１２の測定系は、ラットのＭＡＰキナーゼ（ＥＲ
Ｋ１）およびＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ２）に対しても適
用できることが分かった。
で刺激したときのＭＡＰキナーゼの活性変化の酵素免疫
測定による検出 ラット由来培養細胞ＰＣ−１２（Ａｄｒｅｎａｌ ｐｈ
ｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１
７２１）を、１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭを培地と
して、２．８×１０6個ずつ６ｃｍシャーレ（ＦＡＬＣ
ＯＮ ３００２）にまき、３７℃、５％ＣＯ2の条件下
で一晩培養した。培養液を無血清のものに交換し、さら
に１時間培養した後、培養液を１００ｎｇ／ｍｌ ＮＧ
Ｆと０．１％ ＢＳＡを含むＤＭＥＭに交換した。様々
な時間、培養した後、培地を除き、氷冷ＰＢＳで２回洗
浄した。実施例１２−（２）に記載したＭＡＰキナーゼ
活性測定用細胞溶解液を２５０μｌずつ各シャーレに加
えて細胞を溶解させて、エッペンドルフチューブへ移し
た。氷上に５分間静置した後、１６０００ｘｇで５分間
遠心し、上清を得た。この上清に含まれる、活性型ＭＡ
Ｐキナーゼ（ＥＲＫ１）と活性型ＭＡＰキナーゼ（ＥＲ
Ｋ２）の量を、実施例１２に記載した酵素免疫測定法で
定量した。また、実施例１２−（２）で得られた、試験
管内で活性化させたＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）および
ＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ２）のリン酸化活性を、Ｔａｄ
ａｙｏ Ｍｉｙａｓａｋａらの方法〔Ｊ． Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．、第２６５巻、第４７３０−４７３５頁、
（１９９０）〕に従って測定し、活性の明らかになった
酵素を、上記のＰＣ−１２の溶解液と並べて酵素免疫測
定を行った。得られた値を比較することにより、吸光度
の値をリン酸化活性の値に変換した。結果を図１６に示
した。この結果から、ＰＣ−１２をＮＧＦで刺激した時
のＭＡＰキナーゼの活性の変化が、実施例１２に記載し
た系で、ＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）とＭＡＰキナーゼ
（ＥＲＫ２）の両方について測定できることが明らかに
なった。この活性化のパターンは、既に報告されている
結果〔例えばＧｏｔｏｈ Ｙ．ら、ユーロピアン・ジャ
ーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ． Ｊ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、第１９３巻、第６６１−６６９頁
（１９９０）〕と良く一致する。また、この結果から、
実施例１２の測定系は、ラットのＭＡＰキナーゼ（ＥＲ
Ｋ１）およびＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ２）に対しても適
用できることが分かった。
【００４８】
【発明の効果】本発明のモノクローナル抗体は、ヒトＭ
ＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）に高感度に結合し、またその
結合能も高いので、種々の細胞由来のヒトＭＡＰキナー
ゼ（ＥＲＫ１）の検出または測定用試薬などとして、有
利に用いることができる。従って、ヒトＭＡＰキナーゼ
（ＥＲＫ１）の細胞、組織内での発現の分布および発現
を知ることができる。加えて、本発明の抗ＥＲＫ１抗体
および抗ＥＲＫ２抗体は、それぞれの型のＭＡＰキナー
ゼに対して高感度に結合し、その結合能も高いので、上
記と同様に、それぞれのＭＡＰキナーゼの検出、測定用
試薬などとして、有利に用いることができる。また、本
発明の抗活性型ＭＡＰキナーゼ抗体（抗リン酸化ペプチ
ド抗体）は、活性型ＭＡＰキナーゼに高感度に結合し、
またその結合能も高いので、この抗体を用いれば、種々
の細胞由来の活性型ＭＡＰキナーゼの検出または測定、
言い換えればＭＡＰキナーゼの活性の検出または測定
を、放射性化合物等を用いずに行なえる。さらに、本発
明の種々のＭＡＰキナーゼに特異的な抗体と組み合わせ
ることにより、特定のＭＡＰキナーゼのみの活性を、他
のＭＡＰキナーゼと区別して、高感度に検出または測定
するために用いることができる。このようにして、種々
の型のＭＡＰキナーゼの細胞、組織内での発現の分布お
よび発現量、刺激による活性の変化などを知ることがで
き、また各種ＭＡＰキナーゼの役割をさらに解明するこ
とができる。また、これらの検出または測定法は、種々
のＭＡＰキナーゼ関連疾患の診断に用いることができ、
適切な治療法の選択や疾患の原因の究明のためなどに役
立てることができる。さらに、種々の薬物の作用機作の
解明のためにも用いることができる。
ＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）に高感度に結合し、またその
結合能も高いので、種々の細胞由来のヒトＭＡＰキナー
ゼ（ＥＲＫ１）の検出または測定用試薬などとして、有
利に用いることができる。従って、ヒトＭＡＰキナーゼ
（ＥＲＫ１）の細胞、組織内での発現の分布および発現
を知ることができる。加えて、本発明の抗ＥＲＫ１抗体
および抗ＥＲＫ２抗体は、それぞれの型のＭＡＰキナー
ゼに対して高感度に結合し、その結合能も高いので、上
記と同様に、それぞれのＭＡＰキナーゼの検出、測定用
試薬などとして、有利に用いることができる。また、本
発明の抗活性型ＭＡＰキナーゼ抗体（抗リン酸化ペプチ
ド抗体）は、活性型ＭＡＰキナーゼに高感度に結合し、
またその結合能も高いので、この抗体を用いれば、種々
の細胞由来の活性型ＭＡＰキナーゼの検出または測定、
言い換えればＭＡＰキナーゼの活性の検出または測定
を、放射性化合物等を用いずに行なえる。さらに、本発
明の種々のＭＡＰキナーゼに特異的な抗体と組み合わせ
ることにより、特定のＭＡＰキナーゼのみの活性を、他
のＭＡＰキナーゼと区別して、高感度に検出または測定
するために用いることができる。このようにして、種々
の型のＭＡＰキナーゼの細胞、組織内での発現の分布お
よび発現量、刺激による活性の変化などを知ることがで
き、また各種ＭＡＰキナーゼの役割をさらに解明するこ
とができる。また、これらの検出または測定法は、種々
のＭＡＰキナーゼ関連疾患の診断に用いることができ、
適切な治療法の選択や疾患の原因の究明のためなどに役
立てることができる。さらに、種々の薬物の作用機作の
解明のためにも用いることができる。
【００４９】
配列番号：１ 配列の長さ：12 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 His Thr Gly Phe Leu Thr Glu Tyr Val Ala Thr Arg 12 1 5 10。
【００５０】配列番号：2 配列の長さ：19 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Cys Ser Leu Pro Ser Lys Thr Lys Val Ala Trp Ala Lys Leu Phe Pro 1 5 10 15 Lys Ser Asp。
【００５１】配列番号：3 配列の長さ：17 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Cys Ile Phe Gln Glu Thr Ala Arg Phe Gln Pro Gly Val Leu Glu Ala 1 5 10 15 Pro 。
【００５２】配列番号：4 配列の長さ：19 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Cys Ser Leu Pro His Lys Asn Lys Val Pro Trp Asn Arg Leu Phe Pro 1 5 10 15 Asn Ala Asp 。
【００５３】配列番号：5 配列の長さ：15 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Cys Ile Phe Glu Glu Thr Ala Arg Phe Gln Pro Gly Tyr Arg Ser 1 5 10 15。
【００５４】配列番号：6 配列の長さ：17 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Cys Glu His Asp His Thr Gly Phe Leu Thr Glu Tyr Val Ala Thr Arg 1 5 10 15 Trp。
【００５５】配列番号：7 配列の長さ：16 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ile Phe Gln Glu Thr Ala Arg Phe Gln Pro Gly Val Leu Glu Ala Pro 1 5 10 15。
【００５６】配列番号：8 配列の長さ：379 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Ala Ala Ala Ala Ala Gln Gly Gly Gly Gly Gly Glu Pro Arg Arg 1 5 10 15 Thr Glu Gly Val Gly Pro Gly Val Pro Gly Glu Val Glu Met Val Lys 20 25 30 Gly Gln Pro Phe Asp Val Gly Pro Arg Tyr Thr Gln Leu Gln Tyr Ile 35 40 45 Gly Glu Gly Ala Tyr Gly Met Val Ser Ser Ala Tyr Asp His Val Arg 50 55 60 Lys Thr Arg Val Ala Ile Lys Lys Ile Ser Pro Phe Glu His Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Cys Gln Arg Thr Leu Arg Glu Ile Gln Ile Leu Leu Arg Phe Arg 85 90 95 His Glu Asn Val Ile Gly Ile Arg Asp Ile Leu Arg Ala Ser Thr Leu 100 105 110 Glu Ala Met Arg Asp Val Tyr Ile Val Gln Asp Leu Met Glu Thr Asp 115 120 125 Leu Tyr Lys Leu Leu Lys Ser Gln Gln Leu Ser Asn Asp His Ile Cys 130 135 140 Tyr Phe Leu Tyr Gln Ile Leu Arg Gly Leu Lys Tyr Ile His Ser Ala 145 150 155 160 Asn Val Leu His Arg Asp Leu Lys Pro Ser Asn Leu Leu Ile Asn Thr 165 170 175 Thr Cys Asp Leu Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Ile Ala Asp 180 185 190 Pro Glu His Asp His Thr Gly Phe Leu Thr Glu Tyr Val Ala Thr Arg 195 200 205 Trp Tyr Arg Ala Pro Glu Ile Met Leu Asn Ser Lys Gly Tyr Thr Lys 210 215 220 Ser Ile Asp Ile Trp Ser Val Gly Cys Ile Leu Ala Glu Met Leu Ser 225 230 235 240 Asn Arg Pro Ile Phe Pro Gly Lys His Tyr Leu Asp Gln Leu Asn His 245 250 255 Ile Leu Gly Ile Leu Gly Ser Pro Ser Gln Glu Asp Leu Asn Cys Ile 260 265 270 Ile Asn Met Lys Ala Arg Asn Tyr Leu Gln Ser Leu Pro Ser Lys Thr 275 280 285 Lys Val Ala Trp Ala Lys Leu Phe Pro Lys Ser Asp Ser Lys Ala Leu 290 295 300 Asp Leu Leu Asp Arg Met Leu Thr Phe Asn Pro Asn Lys Arg Ile Thr 305 310 315 320 Val Glu Glu Ala Leu Ala His Pro Tyr Leu Glu Gln Tyr Tyr Asp Pro 325 330 335 Thr Asp Glu Pro Val Ala Glu Glu Pro Phe Thr Phe Ala Met Glu Leu 340 345 350 Asp Asp Leu Pro Lys Glu Arg Leu Lys Glu Leu Ile Phe Gln Glu Thr 355 360 365 Ala Arg Phe Gln Pro Gly Val Leu Glu Ala Pro 370 375 379。
【００５７】配列番号：9 配列の長さ：18 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Gly Met Val Ser Ser Ala Tyr Asp His Val Arg Lys Thr Arg Val Ala 1 5 10 15 Ile Lys。
【００５８】配列番号：10 配列の長さ：16 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Glu His Asp His Thr Gly Phe Leu Thr Glu Tyr Val Ala Thr Arg Trp 1 5 10 15。
【００５９】配列番号：11 配列の長さ：18 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ser Leu Pro Ser Lys Thr Lys Val Ala Trp Ala Lys Leu Phe Pro Lys 1 5 10 15 Ser Asp。
【００６０】配列番号：12 配列の長さ：16 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ile Phe Gln Glu Thr Ala Arg Phe Gln Pro Gly Val Leu Glu Ala Pro 1 5 10 15。
【００６１】配列番号：13 配列の長さ：19 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Cys Gly Met Val Ser Ser Ala Tyr Asp His Val Arg Lys Thr Arg Val 1 5 10 15 Ala Ile Lys。
【００６２】配列番号：14 配列の長さ：360 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Gly Pro Glu Met Val Arg Gly 1 5 10 15 Gln Val Phe Asp Val Gly Pro Arg Tyr Thr Asn Leu Ser Tyr Ile Gly 20 25 30 Glu Gly Ala Tyr Gly Met Val Cys Ser Ala Tyr Asp Asn Val Asn Lys 35 40 45 Val Arg Val Ala Ile Lys Lys Ile Ser Pro Phe Glu His Gln Thr Tyr 50 55 60 Cys Gln Arg Thr Leu Arg Glu Ile Lys Ile Leu Leu Arg Phe Arg His 65 70 75 80 Glu Asn Ile Ile Gly Ile Asn Asp Ile Ile Arg Ala Pro Thr Ile Glu 85 90 95 Gln Met Lys Asp Val Tyr Ile Val Gln Asp Leu Met Glu Thr Asp Leu 100 105 110 Tyr Lys Leu Leu Lys Thr Gln His Leu Ser Asn Asp His Ile Cys Tyr 115 120 125 Phe Leu Tyr Gln Ile Leu Arg Gly Leu Lys Tyr Ile His Ser Ala Asn 130 135 140 Val Leu His Arg Asp Leu Lys Pro Ser Asn Leu Leu Leu Asn Thr Thr 145 150 155 160 Cys Asp Leu Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Val Ala Asp Pro 165 170 175 Asp His Asp His Thr Gly Phe Leu Thr Glu Tyr Val Ala Thr Arg Trp 180 185 190 Tyr Arg Ala Pro Glu Ile Met Leu Asn Ser Lys Gly Tyr Thr Lys Ser 195 200 205 Ile Asp Ile Trp Ser Val Gly Cys Ile Leu Ala Glu Met Leu Ser Asn 210 215 220 Arg Pro Ile Phe Pro Gly Lys His Tyr Leu Asp Gln Leu Asn His Ile 225 230 235 240 Leu Gly Ile Leu Gly Ser Pro Ser Gln Glu Asp Leu Asn Cys Ile Ile 245 250 255 Asn Leu Lys Ala Arg Asn Tyr Leu Leu Ser Leu Pro His Lys Asn Lys 260 265 270 Val Pro Trp Asn Arg Leu Phe Pro Asn Ala Asp Ser Lys Ala Leu Asp 275 280 285 Leu Leu Asp Lys Met Leu Thr Phe Asn Pro His Lys Arg Ile Glu Val 290 295 300 Glu Gln Ala Leu Ala His Pro Tyr Leu Glu Gln Tyr Tyr Asp Pro Ser 305 310 315 320 Asp Glu Pro Ile Ala Glu Ala Pro Phe Lys Phe Asp Met Glu Leu Asp 325 330 335 Asp Leu Pro Lys Glu Lys Leu Lys Glu Leu Ile Phe Glu Glu Thr Ala 340 345 350 Arg Phe Gln Pro Gly Tyr Arg Ser 355 360 。
【００６３】配列番号：15 配列の長さ：18 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ser Leu Pro His Lys Asn Lys Val Pro Trp Asn Arg Leu Phe Pro Asn 1 5 10 15 Ala Asp 。
【００６４】配列番号：16 配列の長さ：14 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ile Phe Glu Glu Thr Ala Arg Phe Gln Pro Gly Tyr Arg Ser 1 5 10。
【００６５】配列番号：17 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 GGCATATGGC GGCGGCGGCG GCTCA 25。
【００６６】配列番号：18 配列の長さ：28 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 CCGGATCCGG CTAGGGGGCC TCCAGCAC 28。
【図１】ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）ｃＤＮＡのＰ
ＣＲによる増幅に用いたプライマーの塩基配列を示す。
ＣＲによる増幅に用いたプライマーの塩基配列を示す。
【図２】ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）蛋白質を大腸
菌内で誘導的に合成させるために用いるプラスミドＤＮ
Ａの構築方法を示す。
菌内で誘導的に合成させるために用いるプラスミドＤＮ
Ａの構築方法を示す。
【図３】大腸菌内で発現させたヒトＭＡＰキナーゼ（Ｅ
ＲＫ１）の精製の最終段階であるＭｏｎｏ Ｑカラム
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）でのクロマトグラフィーのフラ
クションを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、クマジー染色した結
果を示す。
ＲＫ１）の精製の最終段階であるＭｏｎｏ Ｑカラム
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）でのクロマトグラフィーのフラ
クションを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、クマジー染色した結
果を示す。
【図４】実施例３で得られた、抗ヒトＭＡＰキナーゼ
（ＥＲＫ１）モノクローナル抗体（ＨＥ１１３）および
市販の抗ＭＡＰキナーゼ抗体を用いた、各種細胞のウエ
スタンブロッティングの結果を比較して示す。
（ＥＲＫ１）モノクローナル抗体（ＨＥ１１３）および
市販の抗ＭＡＰキナーゼ抗体を用いた、各種細胞のウエ
スタンブロッティングの結果を比較して示す。
【図５】実施例３で得られた、ＧＳＴとヒトＥＲＫ１、
もしくはヒトＥＲＫ２との融合蛋白質と、抗ヒトＭＡＰ
キナーゼ（ＥＲＫ１）モノクローナル抗体（ＨＥ１１
３）との結合を、ＥＩＡで調べた結果を示す。
もしくはヒトＥＲＫ２との融合蛋白質と、抗ヒトＭＡＰ
キナーゼ（ＥＲＫ１）モノクローナル抗体（ＨＥ１１
３）との結合を、ＥＩＡで調べた結果を示す。
【図６】ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）のアミノ酸配
列および実施例３で用いた４種の合成ペプチドの配列を
示す。
列および実施例３で用いた４種の合成ペプチドの配列を
示す。
【図７】実施例３で得られた、ヒトＥＲＫ１蛋白と抗ヒ
トＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）モノクローナル抗体（Ｈ
Ｅ１１３）との結合の、図６で示した合成ペプチドによ
る阻害をＥＩＡで調べた結果を示す。
トＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）モノクローナル抗体（Ｈ
Ｅ１１３）との結合の、図６で示した合成ペプチドによ
る阻害をＥＩＡで調べた結果を示す。
【図８】実施例５で得られた、抗ヒトＭＡＰキナーゼ
（ＥＲＫ１）モノクローナル抗体（ＨＥ１１３）と抗ｐ
ｅｐｔｉｄｅ−４ポリクローナル抗体を用いたサンドイ
ッチＥＩＡ法で、ＧＳＴとヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ
１）の融合蛋白を検出した結果を示す。
（ＥＲＫ１）モノクローナル抗体（ＨＥ１１３）と抗ｐ
ｅｐｔｉｄｅ−４ポリクローナル抗体を用いたサンドイ
ッチＥＩＡ法で、ＧＳＴとヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ
１）の融合蛋白を検出した結果を示す。
【図９】実施例７で得られた、リン酸化ペプチドに対す
るポリクローナル抗体の特異性をウエスタンブロッティ
ングで調べた結果を示す。
るポリクローナル抗体の特異性をウエスタンブロッティ
ングで調べた結果を示す。
【図１０】実施例８で得られた、抗ヒトＭＡＰキナーゼ
（ＥＲＫ１）モノクローナル抗体（ＨＥ１１３）と抗活
性型ＭＡＰキナーゼポリクローナル抗体を用いたサンド
イッチＥＩＡ法で、活性化したヒトＭＡＰキナーゼ（Ｅ
ＲＫ１）の検出を行った結果を示す。
（ＥＲＫ１）モノクローナル抗体（ＨＥ１１３）と抗活
性型ＭＡＰキナーゼポリクローナル抗体を用いたサンド
イッチＥＩＡ法で、活性化したヒトＭＡＰキナーゼ（Ｅ
ＲＫ１）の検出を行った結果を示す。
【図１１】実施例９で用いた合成ペプチドの配列を示
す。
す。
【図１２】実施例９で得られた、ＧＳＴとヒトＥＲＫ
１、もしくはヒトＥＲＫ２との融合蛋白と、抗ｐｅｐｔ
ｉｄｅ−３抗体、もしくは抗ｐｅｐｔｉｄｅ−６抗体と
の結合を、ＥＩＡで調べた結果を示す。
１、もしくはヒトＥＲＫ２との融合蛋白と、抗ｐｅｐｔ
ｉｄｅ−３抗体、もしくは抗ｐｅｐｔｉｄｅ−６抗体と
の結合を、ＥＩＡで調べた結果を示す。
【図１３】実施例１０で得られた、サンドイッチＥＩＡ
法で、ＧＳＴとヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）との融
合蛋白質を検出した結果を示す。
法で、ＧＳＴとヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）との融
合蛋白質を検出した結果を示す。
【図１４】実施例１１で得られた、サンドイッチＥＩＡ
法で、ＧＳＴとヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ２）との融
合蛋白質を検出した結果を示す。
法で、ＧＳＴとヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ２）との融
合蛋白質を検出した結果を示す。
【図１５】実施例１２で得られた、サンドイッチＥＩＡ
法で、活性型ＭＡＰキナーゼの検出を行った結果を示
す。
法で、活性型ＭＡＰキナーゼの検出を行った結果を示
す。
【図１６】実施例１４で得られた、ＰＣ−１２をＮＧＦ
で刺激した時のＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）およびＭＡ
Ｐキナーゼ（ＥＲＫ２）の活性の変化を、サンドイッチ
ＥＩＡで測定した結果を示す。
で刺激した時のＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）およびＭＡ
Ｐキナーゼ（ＥＲＫ２）の活性の変化を、サンドイッチ
ＥＩＡで測定した結果を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/02 ＺＮＡ Ｇ０１Ｎ 33/573 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/08 33/577 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/573 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｐ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ａ６１Ｋ 39/395 9282−4Ｂ 15/00 ＺＮＡＣ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (35)
- 【請求項１】 ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）を免疫
原とし、ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）に結合性を示
す、ＩｇＧ型モノクローナル抗体。 - 【請求項２】 ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）に結合
性を示し、かつヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ２）、ラッ
トＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）、及びラットＭＡＰキナ
ーゼ（ＥＲＫ２）に結合性を示さないモノクローナル抗
体。 - 【請求項３】 モノクローナル抗体ＨＥ１１３である請
求項１または２記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項４】 ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）で免疫
した哺乳動物の脾臓細胞と、同種または異種のリンパ球
様細胞からなるクローン化されたハイブリドーマ。 - 【請求項５】 マウスハイブリドーマＨＥ１１３である
請求項４記載のハイブリドーマ。 - 【請求項６】 ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）で免疫
した哺乳動物の脾臓細胞と、同種または異種のリンパ球
様細胞とを細胞融合し、クローニングすることを特徴と
する請求項４記載のハイブリドーマの製造法。 - 【請求項７】 請求項４または５記載のハイブリドーマ
を液体培地中または哺乳動物の腹腔内で増殖させること
を特徴とする請求項１、２または３記載のモノクローナ
ル抗体の製造法。 - 【請求項８】 請求項１、２または３記載のモノクロー
ナル抗体を用いることを特徴とするヒトＭＡＰキナーゼ
（ＥＲＫ１）の検出または定量法。 - 【請求項９】 酵素免疫測定法である請求項８記載の検
出または定量法。 - 【請求項１０】 請求項１、２または３記載のモノクロ
ーナル抗体を用いることを特徴とするヒトＭＡＰキナー
ゼ（ＥＲＫ１）の精製法。 - 【請求項１１】 配列がＨｉｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈ
ｅ−Ｌｅｕ−（Ｔｈｒ−ＰＯ3Ｈ2）−Ｇｌｕ−（Ｔｙｒ
−ＰＯ3Ｈ2）−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｒｇである
ペプチドに特異的に結合する抗ＭＡＰキナーゼ抗体。 - 【請求項１２】 請求項１１記載の抗体を用いることを
特徴とする、活性型ＭＡＰキナーゼの検出または定量
法。 - 【請求項１３】 酵素免疫測定法である請求項１２記載
の検出または定量法。 - 【請求項１４】 請求項１１記載の抗体を用いることを
特徴とする、活性型ＭＡＰキナーゼの精製法。 - 【請求項１５】 請求項１、２または３記載のモノクロ
ーナル抗体と請求項１１記載の抗体とを用いることを特
徴とする、活性型ヒトＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１）の検
出または定量法。 - 【請求項１６】 酵素免疫測定法である請求項１５記載
の検出または定量法。 - 【請求項１７】 Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌ
ｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ａｌ
ａ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ
−Ａｓｐを含有するアミノ酸配列を有するペプチドに特
異的に結合する抗ＭＡＰキナーゼ抗体。 - 【請求項１８】 Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｔ
ｈｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌ
ｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏを含有す
るアミノ酸配列を有するペプチドに特異的に結合する抗
ＭＡＰキナーゼ抗体。 - 【請求項１９】 Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｌ
ｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｓ
ｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ
−Ａｓｐを含有するアミノ酸配列を有するペプチドに特
異的に結合する抗ＭＡＰキナーゼ抗体。 - 【請求項２０】 Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔ
ｈｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌ
ｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｓｅｒを含有するアミノ酸配列を
有するペプチドに特異的に結合する抗ＭＡＰキナーゼ抗
体。 - 【請求項２１】 Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｔ
ｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｔｙ
ｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｔｒｐを含有す
るアミノ酸配列を有するペプチドに特異的に結合する抗
ＭＡＰキナーゼ抗体。 - 【請求項２２】 ＭＡＰキナーゼ、ＭＡＰキナーゼのム
テインもしくはＭＡＰキナーゼのフラグメントに特異的
に結合する抗体を用いることを特徴とするＭＡＰキナー
ゼの定量法。 - 【請求項２３】 抗体が請求項１７、１８、１９、２０
または２１記載のものである請求項２２記載のＭＡＰキ
ナーゼの定量法。 - 【請求項２４】 酵素免疫測定法である請求項２２また
は２３記載の定量法。 - 【請求項２５】 サンドイッチ法による請求項２４記載
の定量法。 - 【請求項２６】 ＭＡＰキナーゼがＥＲＫ１である請求
項２２、２３、２４または２５記載の定量法。 - 【請求項２７】 請求項１７，１８もしくは２１記載の
抗体を用いる請求項２６記載の定量法。 - 【請求項２８】 ＭＡＰキナーゼがＥＲＫ２である請求
項２２、２３、２４または２５記載の定量法。 - 【請求項２９】 請求項１９もしくは２０記載の抗体を
用いる請求項２８記載の定量法。 - 【請求項３０】 ＭＡＰキナーゼが活性型ＥＲＫ１であ
る請求項２２、２３、２４または２５記載の定量法。 - 【請求項３１】 請求項１１記載の抗体と請求項１７，
１８もしくは２１記載の抗体とを用いる請求項３０記載
の定量法。 - 【請求項３２】 ＭＡＰキナーゼが活性型ＥＲＫ２であ
る請求項２２、２３、２４または２５記載の定量法。 - 【請求項３３】 請求項１１記載の抗体と請求項１９も
しくは２０記載の抗体とを用いる請求項３２記載の定量
法。 - 【請求項３４】 被検体と請求項１，２，３，１１，１
７，１８，１９，２０または２１記載の抗体とを接触さ
せ、被検体中のＭＡＰキナーゼを定量することを特徴と
するＭＡＰキナーゼ関連疾患の診断法。 - 【請求項３５】 請求項１，２，３，１１，１７，１
８，１９，２０または２１記載の抗体を含有することを
特徴とするＭＡＰキナーゼ関連疾患の診断剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8071659A JPH09216900A (ja) | 1995-03-28 | 1996-03-27 | 抗体を用いるｍａｐキナーゼまたは活性型ｍａｐキナーゼの定量法 |
Applications Claiming Priority (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7012595 | 1995-03-28 | ||
| JP7-305456 | 1995-11-24 | ||
| JP30545695 | 1995-11-24 | ||
| JP32057795 | 1995-12-08 | ||
| JP7-320577 | 1995-12-08 | ||
| JP7-70125 | 1995-12-08 | ||
| JP8071659A JPH09216900A (ja) | 1995-03-28 | 1996-03-27 | 抗体を用いるｍａｐキナーゼまたは活性型ｍａｐキナーゼの定量法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09216900A true JPH09216900A (ja) | 1997-08-19 |
Family
ID=27465212
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8071659A Withdrawn JPH09216900A (ja) | 1995-03-28 | 1996-03-27 | 抗体を用いるｍａｐキナーゼまたは活性型ｍａｐキナーゼの定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09216900A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11471502B2 (en) | 2017-11-24 | 2022-10-18 | University College Cardiff Consultants Ltd | Neuroprotective peptide |
-
1996
- 1996-03-27 JP JP8071659A patent/JPH09216900A/ja not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11471502B2 (en) | 2017-11-24 | 2022-10-18 | University College Cardiff Consultants Ltd | Neuroprotective peptide |
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