WO2006137487A1

WO2006137487A1 - β遮断薬に対する反応性予測に有用な遺伝子多型

Info

Publication number: WO2006137487A1
Application number: PCT/JP2006/312519
Authority: WO
Inventors: Junichi Azuma; Yasushi Fujio; Shinpei Nonen; Tsuyoshi Fukuda; Akira Kitabatake; Hiroshi Okamoto; Junichi Yoshikawa; Minoru Yoshiyama; Yasuhiko Takemoto
Original assignee: The New Industry Research Organization; Osaka University; Japan Health Sciences Foundation; National University Corporation Hokkaido University
Priority date: 2005-06-24
Filing date: 2006-06-22
Publication date: 2006-12-28
Also published as: JP5002748B2; JPWO2006137487A1; WO2006137487A9

Abstract

　本発明は、被検者の遺伝子多型に基づいてβ遮断薬に対する反応性を予測する方法を提供することを目的とする。本発明者は、心機能またはβ1受容体機能に関係すると考えられる遺伝子を多数抽出し、これらの遺伝子に存在する各多型とβ遮断薬反応性との相関について網羅的な解析を行った。その結果、β遮断薬に対する反応性予測に有用な複数の遺伝子多型を見出すと共に、これらの遺伝子多型を用いてβ遮断薬反応性を高精度に予測できることを明らかにした。本発明は、β遮断薬を用いた心不全治療その他心機能の改善を目的としたβ遮断薬治療における検査、診断などに有用である。

Description

明細書

β遮断薬に対する反応性予測に有用な遺伝子多型

技術分野

[0001] 本発明は、被検者の遺伝子多型に基づいて β遮断薬に対する反応性を予測する方法に関するものである。本発明は、特に、心不全治療などの心機能の改善を目的とした薬物治療における検査、診断に有用な技術を提供するものである。

背景技術

[0002] 心不全治療に用いられる主要な薬剤として、利尿薬、血管拡張薬、ジギタリス剤のほかに、現在では β遮断薬 ( βブロッカー）が挙げられる。 β遮断薬は、交感神経系の β受容体（ ι8アドレナリンレセプター)機能を抑制するため、心収縮力や心拍数を低下させると考えられ、心機能が低下した心不全症状に対して β遮断薬を使用することは従来むしろ禁忌とされていた。しかし、 1990年代に入って力も複数の遮断薬について心不全患者に対する臨床試験が実施され、患者の死亡率の低下やその他 β遮断薬の有効性を裏づける数多くのェビデンスが報告されるようになり、現在では β遮断薬は慢性心不全治療の重要な薬剤と考えられて!/ヽる。

[0003] こうして β遮断薬の有効性は確実なものとなったが、安全で有効な治療を行うには適応となる患者を正しく選定することが必須である。特に、 |8遮断薬の効果は個人差が非常にあり、しかも症状の改善は通常 β遮断薬の投与開始後数週間から数ケ月、遅い場合は半年程度経って力ようやくあらわれる。そのため、治療初期には j8遮断薬に対する患者の応答性 (反応性)、即ち患者が β遮断薬に対して効果を示すレスポンダー (responder)である力、効果を示さな、ノンレスポンダー (non responder)であるかを判断できず、長期投与した結果ノンレスポンダーであつたと判断されることもおこりえた。したがって、心不全患者に対する j8遮断薬治療においては、患者の j8 遮断薬反応性を投与前に予測することの重要性が特に指摘されているが、 β遮断薬の心機能改善効果がどのような作用機序によるものか、その薬理作用が未だ明らかになっておらず、このことが予測を一層困難なものにさせていた。

[0004] 上記の点に関連して、下記の特許文献 1 · 2には、 β アドレナリン受容体および j8 アドレナリン受容体における多型の検出方法、さらに、そのような方法を心血管系疾患、肥満、糖尿病の診断、治療などのために使用することが開示されている。

特許文献 1：特表 2001— 520021号公報

特許文献 2 :国際公開 W099Z19512号パンフレット

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0005] 本発明は、上記の問題点、即ち β遮断薬反応性を投与前に予測することの重要性に鑑みなされたものであり、その目的は、被検者の遺伝子多型 (polymorphism)に基づいて β遮断薬に対する反応性を予測する方法を提供することにある。

課題を解決するための手段

[0006] 本発明者は、これまでの研究結果などを踏まえ、心機能または 13受容体 (特に 13

1 受容体)の機能に関係すると考えられる遺伝子を多数抽出し、これらの遺伝子に存在する各多型と β遮断薬反応性との相関について網羅的な解析を行った。その結果、）8遮断薬に対する反応性予測に有用な複数の遺伝子多型を見出すと共に、これらの遺伝子多型を用いて β遮断薬反応性を高精度に予測できることを明らかにし、本発明を完成させるに至った。

[0007] 即ち、本発明は、産業上有用な発明として、下記 A)〜0)の発明を包含するものである。

Α) ノノレェピネフリントランスポーター (Norepinephrine transporter)、 BNP (Natriur etic peptide precursor B : B型ナトリウム利尿ペプチド）、エンドセリン 1 (Endothelin 1) 、エンドセリン受容体 A (Endothelin rececptor A)、アンギオテンシン受容体 2 (Angiot ensin II receptor type2)、アデ-ノレ酸シクラーゼ 9 (Adenylate cyclase 9)、インター口ィキン 10 (Interleukin 10)、 G蛋白 j8サブユニット 4 (G- protein β subunit 4)、マトリツタスメタ口プロテアーゼ 8 (Matrix Metalloproteinase 8)、アドレナリン oc IB受容体（Adr energic receptor IB)、 ^ネフノレコノレチコイド受¾?体、 TNF (Tumor necrosis factor— a：腫瘍壊死因子）、リアノジン受容体 3、アデウーシン 1、アデノシン 1リン酸脱ァミノ酵素 1、アドレナリン a 2C受容体、エンドセリン受容体 B、アンギオテンシン受容体 1、リアノジン受容体 2、 βアレスチン 1、パラォキソナーゼ 2、 SOD (superoxide dismutas e) 2、アドレナリン受容体 j8 3,エンドセリン 2、 ANP、パラォキソナーゼ 1、 GATA6、 ADRBK1 (アドレナリン受容体 j8 K1)、およびアドレナリン受容体 a 1Aをそれぞれコードする遺伝子群力選ばれる 1又は 2以上の遺伝子の多型を検査し、その結果に基づき、被検者の β遮断薬に対する反応性を予測する方法。

Β) 心不全治療その他心機能の改善を目的とした薬物治療において、 |8遮断薬に対する患者の反応性予測に使用する、上記 Α)記載の方法。

C) 上記 Α)記載の方法にお!、て、 2以上の遺伝子多型に基づ、て被検者の β遮断薬反応性を予測する方法であって、各遺伝子多型につ!、てそれぞれの遺伝子型に対して固有の値を割り振り、各遺伝子多型の値を検査により決定した後、これらの値の合計値に基づき、）8遮断薬反応性を予測する方法。

D) 上記 Α)記載の方法にぉ、て、 2以上の遺伝子多型に基づ、て被検者の β遮断薬反応性を予測する方法であって、各遺伝子多型にっ、て判別係数を設定すると共にそれぞれの遺伝子型に対して固有の値を割り振り、各遺伝子多型の値を検査により決定した後、各値にそれぞれの判別係数を乗じた値の合計値に基づき、 /3遮断薬反応性を予測する方法。

Ε) 上記判別係数は、各遺伝子多型と β遮断薬反応性との関連を示す先のデータその他の情報を考慮して設定され、新たな情報に応じて適宜更新されることを特徴とする、上記 D)記載の方法。

F) 上記 Α)記載の方法にお!、て、 2以上の遺伝子多型に基づ、て被検者の β遮断薬反応性を予測する方法であって、 2以上の遺伝子多型によって決定木を構成すると共に各遺伝子多型につ、てそれぞれの遺伝子型に対して固有の値を割り振り、各遺伝子多型の値を検査により決定した後、上記決定木にしたがって β遮断薬反応性を予測する方法。

G) 上記 C)〜F)の、ずれかに記載の方法を用いて、被検者の β遮断薬反応性予測をコンピュータに実行させる、 β遮断薬反応性予測用プログラム。

Η) 上記 Α)記載の方法にお!、て、遺伝子多型の検査は、被検者から調製したゲノム DNAを铸型にして、多型部位を挟む遺伝子領域を増幅する工程と、得られた増幅断片をもとに遺伝子型を決定する工程とを含む方法。 I) 上記 A)記載の方法にお!、て、 DNAチップ等の遺伝子多型検査器具を用いて遺伝子多型を検査する方法。

J) 上記 K)記載の方法に使用される、遺伝子多型検査用オリゴヌクレオチド。 K) 上記に記載される分子の、ずれかを標的 (創薬ターゲット）とした心機能改善薬のスクリーニング方法。

L) 上記 A)〜F)の、ずれかに記載の方法による β遮断薬反応性を予測のために使用する遺伝子多型マーカー。

Μ) 上記 A〜F)の、ずれかに記載の方法による β遮断薬反応性を予測するための遺伝子多型の使用。

Ν) 上記 A〜F)の、ずれかに記載の方法による β遮断薬反応性を予測して、前記 β遮断薬を投与する β遮断薬の投与方法。

Ο) 上記 A〜F)のいずれかに記載の方法により β遮断薬反応性を予測して、 β遮断薬を投与するカゝ否かを診断する診断方法。

発明の効果

[0008] 本発明によれば、遺伝子多型に基づいて β遮断薬に対する反応性を簡易迅速かつ客観的に予測することができるので、 β遮断薬を用いた心不全治療その他心機能の改善を目的とした β遮断薬治療にぉ、て、 β遮断薬に対する患者の反応性予測に好適に使用することができる。前述のように、 j8遮断薬の効果は個人差が非常にあり、し力も治療初期には β遮断薬に対する患者の反応性を判断することが困難であつた。本発明は、投与前に患者の |8遮断薬反応性を予測することを可能とし、有効で安全な β遮断薬治療を実現するものである。

図面の簡単な説明

[0009] [図 1]各遺伝子多型と β遮断薬反応性との関連性を示す図 (その 1)である。

[図 2]各遺伝子多型と β遮断薬反応性との関連性を示す図 (その 2)である。

[図 3]各遺伝子多型にっ、て、多型部位およびその近傍配列を示す表 (その 1)である。表中、下線部が多型部位に相当する。

[図 4]各遺伝子多型にっ、て、多型部位およびその近傍配列を示す表 (その 2)である。表中、下線部が多型部位に相当する。圆 5]各遺伝子多型にっ、て、多型部位およびその近傍配列を示す表 (その 3)である。表中、下線部が多型部位に相当する。

圆 6]本発明の実施形態における、判別分析による予測方法を説明する図である。圆 7]本発明の実施形態における、決定木 1による予測方法を説明する図である。圆 8]本発明の実施形態における、決定木 2による予測方法を説明する図である。圆 9]本発明の実施形態における、決定木 1を構成する遺伝子多型の一覧を示す図である。

圆 10]本発明の実施形態における、決定木 2を構成する遺伝子多型の一覧を示す図である。

圆 11]各遺伝子多型の位置を示す数値等の決定方法を説明する図である。

圆 12]各遺伝子多型と β遮断薬反応性との関連性を示す図 (その 3)である。

圆 13]各遺伝子多型と β遮断薬反応性との関連性を示す図 (その 4)である。

圆 14]各遺伝子多型と β遮断薬反応性との関連性を示す図 (その 5)である。

圆 15]本発明の実施形態における、判別分析による予測方法を説明する図である。圆 16]本発明の実施形態における、決定木 3による予測方法を説明する図である。圆 17]本発明の実施形態における、決定木 3を構成する遺伝子多型の一覧を示す図である。

圆 18]本発明の実施形態における、決定木 4による予測方法を説明する図である。圆 19]本発明の実施形態における、決定木 4を構成する遺伝子多型の一覧を示す図である。

[図 20]各遺伝子多型につ、て、多型部位およびその近傍配列を示す表 (その 4)である。

[図 21]各遺伝子多型につ、て、多型部位およびその近傍配列を示す表 (その 5)である。

[図 22]各遺伝子多型につ、て、多型部位およびその近傍配列を示す表 (その 6)である。

[図 23]各遺伝子多型につ、て、多型部位およびその近傍配列を示す表 (その 7)である。 [図 24]各遺伝子多型にっ、て、多型部位およびその近傍配列を示す表 (その 8)である。

[図 25]各遺伝子多型につ、て、多型部位およびその近傍配列を示す表 (その 9)である。

発明を実施するための最良の形態

[0010] 以下、本発明の好ましい態様について説明する。なお、本明細書および図面において、塩基 ·アミノ酸等を略号で表記する場合、その表記は IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、例えば以下のとおりである。

[0011] DNAの塩基の表記については、 Aまたは a :アデニン、 Gまたは g :グァニン、 Cまたは c :シトシン、 Tまたは t :チミン、 Rまたは r:アデニンまたはグァニン、 Mまたは m:ァデニンまたはシトシン、 Wまたは w:アデニンまたはチミン、 Sまたは s :グァニンまたはシトシン、 Kまたは k:グァニンまたはチミン、 Yまたは y:シトシンまたはチミン、である。

[0012] アミノ酸については、 Gまたは Gly:グリシン、 Aまたは Ala :ァラニン、 Vまたは Val:

ノリン、 Lまたは Leu:ロイシン、 Iまたは lie :イソロイシン、 Sまたは Ser:セリン、 Tまたは Thr:スレオニン、 Cまたは Cys :システィン、 Mまたは Met:メチォニン、 Eまたは G1 u:グルタミン酸、 Dまたは Asp :ァスパラギン酸、 Kまたは Lys :リジン、 Rまたは Arg : アルギニン、 Hまたは His :ヒスチジン、 Fまたは Phe :フエ二ルァラニン、 Yまたは Tyr: チロシン、 Wまたは Trp :トリプトファン、 Pまたは Pro :プロリン、 Nまたは Asn:ァスパラギン、 Qまたは Gin:グルタミンである。

[0013] また、多型部位の位置を示す数値は、 DDBJ/EMBL/GenBank databasesなどの主要データベースに掲載されている遺伝子配列 (及びアミノ酸配列）に付された数値を参酌して解釈されるものとする。

[0014] [1] |8遮断薬の反応性予測に有用な遺伝子多型とそれを利用した予測法

本発明者は、前述のように、解析対象として抽出した候補遺伝子に存在する各多型と β遮断薬反応性との関連性の有無について網羅的な解析を行った結果、 β遮断薬に対する反応性予測に有用な複数の遺伝子多型を見出した。図 1及び図 2はその結果の一例（Α)であり、図 12〜図 14は、その他の例（Β)である。 [0015] 解析方法は概略以下のとおりである。即ち、拡張型心筋症と診断された患者のうち、）8遮断薬が投与されている患者力今回の解析について承諾を得た後、血液を採取した。血液を採取した患者数は，例 (A)では 69名であり、例（B)では 80名であり、このうち j8遮断薬に対して効果を示したレスポンダー（responder)は、例（A)では 47 名、 β遮断薬に対して効果を示さなかったノンレスポンダー（non responder)は 22名であり、例（B)では、レスポンダーが 53名であり、ノンレスポンダーが 27名であった。ここでは、 %FS (左室内径短縮率）が 3%以上回復したかどうかをレスポンダーの基準とした。

[0016] 採取した血液から DNA試料を調製後、各遺伝子多型を検査し、各多型部位における塩基及びそれによつて規定される遺伝子型を決定した。検査方法にっヽては後述するが、 Primer extension法（プライマー伸長法）により正確性を向上させると共に、 PCR- RFLP法、 Allele- specific PCR法、 SSCP法、 direct sequence法を用いたバリデーシヨンを行うことで、誤判定が極力起こらな、よう配慮した。

[0017] 上記方法により各遺伝子多型を検査し、それぞれの多型部位によって規定される遺伝子型を決定後、各遺伝子多型において、遺伝子型の相違に応じて、レスボンダ一とノンレスポンダーとの間の比率に有意差の生じるものを χ二乗検定により検出した。その結果、複数の遺伝子多型について、遺伝子型の相違と j8遮断薬反応性の有無との間に有意差ある高い相関が認められた。例えば、ノルェピネフリントランスポ一ター（Norepinephrine transporter)遺伝子の多型「- 182 T/C」については、多型部位の塩基力のアレルを有する遺伝子型ではレスポンダーの比率が高ぐ多型部位の塩基が Cのアレルをホモで有する遺伝子型「C/C」ではレスポンダーの比率が低かつた（図 1参照)。この場合、単独解析における p値は「0.001」であり、この遺伝子多型単独で ι8遮断薬反応性の予測可能な程度に高い有意差を示した。なお、多型部位の表記「-182 T/C」とは、当該遺伝子の第— 182番目の塩基が「T」又は「C」のいずれかである多型を示す。多型部位の表記の詳細については、後述する。また、図 1、図 2、図 12、図 13および図 14において、「n」は各遺伝子型の患者数を示し、「IVS」はイントロンを示す。

[0018] 同様に、エンドセリン 1 (Endothelin 1)遺伝子の多型「198 Lys/AsnJは、当該多型に応じて、コードされる第 198番目のアミノ酸残基がァスパラギン又はリジンとなるアミノ酸置換を伴うものである力多型部位の塩基が Tのアレルを有する遺伝子型ではレスポンダーの比率が低ぐ多型部位の塩基が Gのアレルをホモで有する遺伝子型「G/ G」ではレスポンダーの比率が高かった。この場合も、単独解析における p値は「0.008 」と高い有意差を示した。

[0019] このように、図 1、図 2、図 12、図 13、図 14に掲げる遺伝子多型については、いずれも β遮断薬反応性との間に高い相関を示したので、各遺伝子多型単独で被検者の ι8遮断薬反応性を高精度に予測することが可能である。なお、図 2に掲げるアンギォテンシン受容体 2 (Angiotensin II receptor type 2)遺伝子は X染色体上に存在するため、男女 (maleと female)を分けて解析した。

[0020] 図 1、図 2、図 12、図 13、図 14に掲げる遺伝子多型を含め、今回の解析により /3遮断薬の反応性予測に有用と判断された遺伝子多型を下記の表 1〜表 9に掲げた。また、図 3〜図 5および図 20〜図 25にはこれらの各遺伝子多型について、多型部位及びその近傍配列 (検査のため増幅した配列）を示した。

[表 1]

SNPJD 遺伝子多型部位単独解 PCR に使増幅し fc フ'ライマ-伸長増幅したァクセシン番号単独で判別決定決定下段 rs (別称）析にお用したフ' 7 長さ法用フ' 配列など p<0.05 分析木 1 木 2 ける P値イマ -配列配列

SNP_001 ノルェビネフリ T-182C 0.001 配列番号 312 配列番号配列番号雇— 001043 0 o 〇 rs2242446 ントランスポー 1 · 2 3 4 NT— 01049S

ター 9304624

SNP—002 BN P T-381C 0.004 5 ， 6 80 7 8 画— 002521 0 o

rsl98389 NT— 021937

6456638

SNP— 003 ェンドセリン 1 Lysl98 Asn 0.008 9 - 1 0 89 1 1 1 2 NM_001955 o 〇 ◎ rs5370 [T594G] NT— 007592

3154513

SNP— 004 エンドセリン受 C2507T 0.011 1 3 - 1 4 163 1 5 1 6 顧— 001957 o ◎ rs5343 容体 A (C1363T) NT— 016354

72960123

SNP一 005 アンギ才テン-ン A-1342G 0.011 1 7 - 1 8 78 1 9 20 謹—000686 o o o rs 1403543 ン受容体 2 (イントロン 1 NT_028405

A-29G) 1723426

SNP一 006 アデニル酸シクイントロン 4 0.017 2 1 - 22 81 23 24 画一 001116 o

rs2072341 ラーゼ 9 T-44C (イント NT_037887

ロン 5 T-44C) 3979142

SNP— 007 ィンターロイキ A-1H7G 0.029 25 - 26 87 2 7 2 8 画—000572 o 〇

rsl漏 896 ン 1 0 (A-1082G) NT— 021877

410004

SNP— 008 ィンターロイキ G-1387A 0.029 2 9 - 30 90 3 1 3 2 NM_000572 〇 o

rsl800893 ン 1 0 NT— 021877

i

i

i [0021] 表 1〜表 3には、合計 21個の遺伝子と、その遺伝子上に存在する 25個の遺伝子多型を示した。また、表 4〜表 9には、合計 35個の遺伝子多型を示した。ただし、表 1〜 9において、重複して遺伝子多型を示しており、遺伝子多型の合計は、 42個である。本発明は、これらの遺伝子多型のうち、 1又は 2以上の遺伝子多型に基づいて被検者の β遮断薬反応性を予測する方法を包含するものであるが、本発明はこれに制限されるものではない。例えば、上記の遺伝子は今回の解析により j8遮断薬反応性との関連性が認められた遺伝子群であり、これらの遺伝子上に存在する他の遺伝子多型に基づいて遮断薬反応性を予測することも十分可能である。特に、上記 42個の何れかの遺伝子多型と連鎖し、ハプロタイプを形成するような他の遺伝子多型については、同様に j8遮断薬の反応性予測に利用することができる。これらの遺伝子多型は、 j8遮断薬の反応性予測のための遺伝子多型マーカーとして使用できる。また、これらの遺伝子多型により |8遮断薬の反応性を予測して、この予測に基づき、 /3遮断薬を投与することもでき、また、投与のための診断にも利用できる。

[0022] また、今回の解析と同様の解析を行うことで β遮断薬の反応性予測に有用な遺伝子多型を上記の遺伝子以外からも発見できる可能性がある。その場合は、上記の遺伝子以外の遺伝子多型に基づいて β遮断薬反応性を予測することができる。

[0023] 表 1〜表 9、図 3〜図 5および図 20〜25中の各遺伝子多型の ID番号には便宜上「 SNP」の語を付している力遺伝子多型は 1塩基多型に制限されるものではない。例えば、 ID番号「SNP_017」のアドレナリン a 2C受容体遺伝子上の多型、及び、「SNP_0 18」のアンギオテンシン変換酵素遺伝子上の多型については、 1塩基多型ではなぐ欠損部分の有無による多型である（図 4参照)。即ち、前者の多型は「GGGGCGGGG CCG」の 12塩基の有無によって当該 12塩基を有する「挿入型 (ins又は I)」とこの部分を欠く「欠失型 (del又は D)」との間の多型である。また、後者の多型は、図 4の該当欄下線部に示される長さ 288塩基の欠損部分を有する「挿入型 (ins又は I)」とこの部分を欠く「欠失型 (del又は D)」との間の多型である。本発明は、 1塩基多型に限らず、このような欠損部分の有無による遺伝子多型に基づいて β遮断薬反応性を予測してあよ、し、転位など他の遺伝子多型に基づ、て β遮断薬反応性を予測してもよ!/ヽ [0024] 表 1〜表 9に掲げた各遺伝子多型の検査は、患者の血液から調製した DNA試料中のゲノム DNAを铸型にして、多型部位を挟む遺伝子領域を増幅し、得られた増幅断片をもとにプライマー伸長法などで遺伝子型を決定することにより行った。遺伝子の増幅には PCR法を使用した。各遺伝子多型について、 PCR法に使用したプライマ一配列、および、プライマー伸長法に使用したプローブ配列を配列表に記載した。表 1〜表 9には、各配列が記載される配列表中の配列番号が示される。

[0025] 表 1〜表 9に示すように、 PCR法により増幅した各配列についても配列表に記載した。配列表に記載した各増幅配列は、基本的に図 3〜図 5および図 20〜図 25に記載の配列と同じであるが、多型部位の塩基をそれぞれユニバーサルコードにより表記した点で異なる（1塩基多型の場合)。前述した欠損部分の有無による遺伝子多型の場合は、配列表には挿入型の塩基配列を記載した (配列番号 67と 70など)。

[0026] 表中の「ァクセッション番号など」の欄には、各遺伝子について、データベースに登録 '掲載されている mRNAのァクセッション番号、コンティグ（contig)のァクセッション番号、及び同ァクセッション番号における遺伝子多型の位置を示す番号をそれぞれ、上段、中段、下段に記載した。また表中、 ID番号の下段には、遺伝子多型の番号（ rs no.)を ti載し 7こ。

[0027] 多型部位の位置を示す各数値等は、下記 (i)〜 (iii)の方法にしたがって定め、表記することとした (図 11参照)。

(i)翻訳開始点より下流に存在し、ェキソン上にある遺伝子多型の場合：

各多型の数値は、翻訳開始点から当該遺伝子多型までの mRNA上における塩基数を示す。

たとえば、多型 (ィ）は「C2507T」と特定され、表記される。

(ii)翻訳開始点より下流に存在し、イントロン上にある遺伝子多型の場合：各多型は、イントロンの番号と、そのイントロンの末端から当該遺伝子多型までの塩基数で示される。正の数の場合は、イントロンの上流末端から当該遺伝子多型までの塩基数、負の数の場合は、イントロンの下流末端から当該遺伝子多型までの塩基数を示す。たとえば、多型（口）は「イントロン 3 A+60G」、多型（ハ）は「イントロン 5 A-13C 」とそれぞれ特定され、表記される。 (iii)翻訳開始点より上流に存在する遺伝子多型の場合：

各多型の数値は、翻訳開始点から当該遺伝子多型までの塩基数を負の数で示す

。たとえば、多型（二）は「T-182C」、多型（ホ）は「G-1387A」とそれぞれ特定され、表記される。

[0028] 例えば、前述したように（図 1〜図 2参照）、ノノレェピネフリントランスポーター、 BNP 、エンドセリン 1、エンドセリン受容体 A、アンギオテンシン受容体 2、アデ-ル酸シクラーゼ 9、インターロイキン 10、 G蛋白 j8サブユニット 4、マトリックスメタ口プロテアーゼ 8 、及びアドレナリン α 1B受容体の各遺伝子多型については、単独解析における ρ値力 S0.05未満と高、有意差を示したので、各遺伝子多型単独での反応性予測が可能である。勿論、複数の遺伝子多型の検査結果を組み合わせて β遮断薬の反応性予測を行ってもよい。ただし、この場合は予測方法があまり複雑にならないよう留意することが好ましい。

[0029] 2以上の遺伝子多型に基づいて β遮断薬反応性を予測する 1つの好ましい方法は、各遺伝子多型について判別係数を設定すると共にそれぞれの遺伝子型に対して固有の値を割り振り、各遺伝子多型の値を検査により決定した後、各値にそれぞれの判別係数を乗じた値の合計値に基づき、 β遮断薬反応性を予測する方法である。この予測方法の具体例について図 6を参照しながら説明する。なお、図 15も同様である。

[0030] ここでは、 12個の遺伝子多型の検査結果を組み合わせて |8遮断薬の反応性予測を行う方法について説明する（これらの遺伝子多型は、表 1〜表 3の「判別分析」の欄に〇印が付されている)。各遺伝子多型には、今回の解析結果を踏まえて、判別係数 (重み）が付与される。また、各遺伝子多型において、それぞれの遺伝子型に対して固有の値が割り振られる。固有の値は互いに異なる値としてもよいし、一部共通する値としてもよい。図 6に示す例では、「ノルェピネフリントランスポーター T-182CJの遺伝子多型に、判別係数「6.85」が付与されると共に、「TT」「TC」「CC」の各遺伝子型にそれぞれ「1」「2」「3」の値が割り振られている。

[0031] 検査により各遺伝子多型における遺伝子型が決定される。これによつて各遺伝子多型の値が決定されるので、各値にそれぞれの判別係数をかけ、すべてを合計することで個人の判別値を求める。本例では更に定数項「22.29」を加えた合計値を個人の判別値とした。そして、この判別値が正であればノンレスポンダー、負であればレスポンダーと判定した。この方法により今回の DNA試料について予測した場合、誤判定率は 3/69=0.043であった。このように、各遺伝子多型をスコア化した判別分析の手法によって、複数の遺伝子多型の検査結果から簡易に、し力も精度良く被検者の )8 遮断薬反応性を予測することができる。

[0032] 上記判別分析による予測方法において、各遺伝子多型に付与される判別係数は、各遺伝子多型と β遮断薬反応性との関連を示す既存のデータなどを考慮して任意に設定することができる。また、この判別係数は、新規データに応じて随時更新されることが好ましい。

[0033] 2以上の遺伝子多型に基づ、て β遮断薬反応性を予測する他の好ま、方法は、決定木などの分類モデルを用いた予測方法である。例えば、 2以上の遺伝子多型によって決定木を構成すると共に各遺伝子多型についてそれぞれの遺伝子型に対して固有の値を割り振り、各遺伝子多型の値を検査により決定した後、上記決定木にしたがって β遮断薬反応性を予測する。この予測方法の具体例について図 7及び図 8 を参照しながら説明する。なお、図 16及び図 18も同様である。

[0034] 図 7に示す例は、エンドセリン受容体 Α遺伝子の多型「C1363T」を先頭とした 6個の遺伝子多型によって決定木 1を構成して β遮断薬の反応性予測を行う方法である。これらの遺伝子多型は、表 1〜表 3の「決定木 1」の欄に〇印が付されている（決定木 1の先頭になる遺伝子多型は◎印で示している）。一方、図 8に示す例は、エンドセリン 1遺伝子の多型「198 Lys/Asn」を先頭とした 7個の遺伝子多型によって決定木 2を構成して j8遮断薬の反応性予測を行う方法である。これらの遺伝子多型は、表 1〜表 3の「決定木 2」の欄に〇印が付されている（決定木 2の先頭になる遺伝子多型は ◎印で示している）。

[0035] 各遺伝子多型にお!ヽては、今回の解析結果を踏まえて、それぞれの遺伝子型に対して固有の値が割り振られている（図 9及び図 10参照、図 16および図 18の場合は、図 17および図 19参照)。検査により各遺伝子多型における遺伝子型を決定し、これにより各遺伝子多型の値を決定した後、決定木 1 · 2にしたがって 13遮断薬反応性を予測する。決定木 1を用いた予測の場合、図 7に示す決定木 1にしたがって先頭から順番に最後の枝まで進み、レスポンダーであるカゝノンレスポンダーであるかを決定する。図中〇印を付した枝は誤判定が生じた場合でそれぞれ誤判定数が付されて!ヽる。それ以外の枝では誤判定はなぐレスポンダーであるカゾンレスポンダーであるかをすべて正しく予測することができた。誤判定率は 5/69=0.072であり、精度良く j8遮断薬反応性を予測することができた。

[0036] 同様に、決定木 2を用いた予測の場合、図 8に示す決定木 2にしたがって先頭から順番に最後の枝まで進み、レスポンダーであるカゝノンレスポンダーであるかを決定する。図中〇印を付した枝は誤判定が生じた場合でそれぞれ誤判定数が付されて!ヽる。それ以外の枝では誤判定はなぐレスポンダーであるカゾンレスポンダーであるかをすべて正しく予測することができた。誤判定率は 6/69=0.087であり、精度良く j8遮断薬反応性を予測することができた。

[0037] 以上説明した各予測方法をプログラムを利用して行うことは好ましぐ本発明はこのような ι8遮断薬反応性予測用プログラムを包含するものである。即ち、本発明の予測用プログラムは、前述した少なくともいずれ力 1つの予測方法をコンピュータに実行させ、これにより検査結果から被検者の β遮断薬反応性予測を実行させるものである。本発明のプログラムは、これを記録した、コンピュータで読み取り可能な記録媒体として提供することができる。このような記録媒体としては、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ等の磁気記憶媒体、 CD-ROM, CD-R, CD-RW, DVD -ROM, DVD-RAM, DVD— RW等の光学記憶媒体、 RAMや ROM等の電気記憶媒体、および MO等の磁気 Z光学記憶媒体を例示することができるが、これらに限定されるものではない。

[0038] 本発明は、心不全治療その他心機能の改善を目的とした薬物治療において、 /3遮断薬に対する患者の反応性予測に好適に使用することができる。心不全治療のほかに、高血圧症、虚血性心疾患、不整脈などの各症状、疾患に対して |8遮断薬を使用する場合、その他 ι8遮断薬を用いた治療一般に有効と考えられる。）8遮断薬は、 13

1 受容体機能の抑制作用を有するものであればよぐ更に他の作用を有するもの（例えば、 α受容体にも作用する等）であってもよい。例えば、現在ではカルベジロール (ca rvedilol)、メトプロローノレ (metoprolol)、ビソプロローノレ (bisoprolol)などの j8遮断薬が心機能の改善を目的として使用されて、るが、その他の β遮断薬を使用する際に本発明を利用してもよいし、今後得られる β遮断薬を使用する際に本発明を利用してもよい。

[0039] [2]各遺伝子多型の検査方法

本発明において、各遺伝子多型を調べる方法は特に制限されるものではなぐ遺伝子上の多型を直接的または間接的に調べることが可能な従来公知の方法を適用することができ、今後開発される方法を使用してもよい。今回の解析に用いた、 PCR 法により各遺伝子多型を検査する方法は簡易な方法であり、精度も良好であるので、以下ではこの方法につ!、て簡単に説明する。

[0040] 検査に供する DNA試料は、被検者の任意の器官'組織'細胞 (血液、羊水中の細胞、採取した組織等を培養した細胞を含む)力ゝら常法に従って DNAを精製'抽出すればよい。なお、 PCR法による遺伝子増幅が可能な限りにおいて、 DNAの精製 '抽出工程は省略又は簡略ィ匕してもよい。

[0041] 次に、多型部位に基づく遺伝子型の同定 (遺伝子タイピング)のため、上記の方法で調製した DNA試料中のゲノム DNAを铸型にして PCR法を行、、多型部位を挟む遺伝子領域を増幅する。その後、得られた増幅断片をもとに、 Primer extension法 (プライマー伸長法）、 PCR-RFLP法、または電気泳動により増幅断片の長さを調べる方法などによって遺伝子型を決定する。

[0042] 上記 PCR法における各条件、使用する試薬 *プライマーなどは特に制限されるものではないが、各遺伝子多型の検査において PCR法に使用したフォワードプライマー及びリバースプライマーの配列は、前記表 1〜表 9記載の各配列番号に示したとおりである。表 1〜表 9には、プライマー伸長法に使用したプローブの配列を記載した各配列番号についても示される。なお、「SNP_017」のアドレナリン _a 2C受容体遺伝子上の多型については、 PCR-RFLP法によりタイピングを行った。また、「SNP_018」のァンギオテンシン変換酵素遺伝子上の多型については、電気泳動により増幅断片の長さを調べる方法によってタイピングを行った。

[0043] 勿論、各遺伝子多型の検査は、 PCR法以外の方法を使用してもよい。遺伝子上の多型を直接的または間接的に検定可能な方法であれば、一塩基多型 (SNP)における塩基を検定する方法 (SNPタイピング）、欠損部分の有無による多型を検定する方法、など従来公知の種々の方法を適用することができる（例えば、文献「ポストシークエンスのゲノム科学（1) SNP遺伝子多型の戦略」（中山書店)参照)。

[0044] 一例として、 DNAチップ等の遺伝子多型検査器具を用いた検査方法を挙げることができる。この方法は、前記 25個の遺伝子多型のうち 1又は 2以上の多型を検定するためのプローブを基板上に配置した DNAチップ (または同種の器具)を作製し、この DNAチップ等を用いて被検者カゝらの遺伝子試料とプローブとのハイブリダィゼーションシグナルの有無により、遺伝子のタイピングを行う方法である。プローブには、前記 25個の各遺伝子多型にっ、て、多型部位の塩基を含む近傍の塩基配列またはその相補配列等力もなるオリゴヌクレオチドを用いることができる。尚、ここで、「DNAチップ」とは、主として、合成したオリゴヌクレオチドをプローブに用いる合成型 DNAチップを意味する力 PCR産物などの cDNAをプローブに用いる貼り付け型 DNAマイクロアレイを使用してもょ、。

[0045] その他にも、各遺伝子多型の検査方法として、 PCR-SSCP法などの点変異検出法を用いてもよいし、 PCR法以外の他の増幅方法 (例えば、 RCA法など）を用いてもよい。また、 DNA増幅後に塩基配列決定装置 (シークェンサ一)などで直接増幅断片の塩基配列を決定し、遺伝子のタイピングを行ってもょ、。

[0046] 勿論、各遺伝子のタイピングは、タンパク質をコードするコード配列以外に、イントロン配列や制御配列などに存在する多型に基づいて決定してもよい。また、多型 (変異 )がコード配列上の変異であれば、 RNA、または mRNA力調製した cDNAをもとに、当該多型 (変異)を検出することも可能である。さらに、アミノ酸置換を伴う多型（変異)であれば、タンパク質のアミノ酸配列などから当該多型 (変異)を検出してもよい。

[0047] [3]本発明のスクリーニング方法

前述のように、心不全治療における j8遮断薬の有効性は現在認められているところであるが、しかし、 |8遮断薬の心機能改善効果がどのような作用機序によるものか、その薬理作用は依然として明らかになつて、な、。 [0048] 今回の解析により、前記 21個の遺伝子上に存在する各多型と β遮断薬反応性との関連性が認められた。このことは、これらの遺伝子によってコードされる分子 (タンパク質)が β遮断薬による心機能改善効果に関係している可能性を示すものといえ、上記いずれかの分子について、その活性、機能、発現量、他の物質との結合などに影響を与える物質を探索することによって、効率の良い心不全治療薬を含めた心機能改善薬の開発が期待できる。本発明は、このような上記いずれかの分子を標的 (創薬ターゲット）とした心機能改善薬のスクリーニング方法を包含するものである。

[0049] 本発明のスクリーニング方法としては、遺伝子'タンパク質の発現量、タンパク質の活性変化等を調べる従来公知の種々の方法を適用することができ、特に限定されるものではない。また、本発明以降に新たに開発されたスクリーニング方法を使用するものであってもよい。 in vitro及び in vivoスクリーニング系のいずれであってもよいし、 c ell-free systemでスクリーニングを行ってもよい。また、スクリーニングに使用する遺伝子'タンパク質は、ヒト由来のもののほか、マウスその他の動物由来のものを使用してもよい。勿論、タンパク質の立体構造に関する情報を利用してスクリーニングを行ってちょい。

産業上の利用可能性

[0050] 本発明は、以上のように、被検者の遺伝子多型に基づいて β遮断薬に対する反応性を予測する方法に関するものであり、前述したとおり、）8遮断薬を用いた心不全治療その他心機能の改善を目的とした β遮断薬治療における検査、診断などに利用することができる。

Claims

請求の範囲

[1] ノノレエピネフリントランスポーター (Norepinephrine transporter)、 BNP (Natriuretic peptide precursor B : B型ナトリウム利尿ペプチド）、エンドセリン 1 (Endothelin 1)、ェンドセリン受容体 A (Endothelin rececptor A)、アンギオテンシン受容体 2 (Angiotensi n II receptor type2)、アデ-ノレ酸シクラーゼ 9 (Adenylate cyclase 9)、インターロイキン 10 (Interleukin 10)、 G蛋白 j8サブユニット 4 (G- protein β subunit 4)、マトリックスメタ口プロテアーゼ 8 (Matrix Metalloproteinase 8)、アドレナリン a IB受容体（Adrene rgic receptor IB)、 ^ネフノレコノレチコイド受¾?体、 TNF (Tumor necrosis factor- ：腫瘍壊死因子）、リアノジン受容体 3、アデウーシン 1、アデノシン 1リン酸脱ァミノ酵素 1、アドレナリン a 2C受容体、エンドセリン受容体 B、アンギオテンシン受容体 1、リアノジン受容体 2、 βアレスチン 1、パラォキソナーゼ 2、 SOD (superoxide dismutase) 2 、アドレナリン受容体 j8 3,エンドセリン 2、 ANP、パラォキソナーゼ 1、 GATA6、 AD RBK1 (アドレナリン受容体 j8 K1)、およびアドレナリン受容体 a 1Aをそれぞれコードする遺伝子群力選ばれる 1又は 2以上の遺伝子の多型を検査し、その結果に基づき、被検者の β遮断薬に対する反応性を予測する方法。

[2] 心不全治療その他心機能の改善を目的とした薬物治療において、 |8遮断薬に対する患者の反応性予測に使用する、請求項 1記載の方法。

[3] 請求項 1記載の方法において、 2以上の遺伝子多型に基づいて被検者の β遮断薬反応性を予測する方法であって、各遺伝子多型につ!、てそれぞれの遺伝子型に対して固有の値を割り振り、各遺伝子多型の値を検査により決定した後、これらの値の合計値に基づき β遮断薬反応性を予測する方法。

[4] 請求項 1記載の方法において、 2以上の遺伝子多型に基づいて被検者の β遮断薬反応性を予測する方法であって、各遺伝子多型にっ、て判別係数を設定すると共にそれぞれの遺伝子型に対して固有の値を割り振り、各遺伝子多型の値を検査により決定した後、各値にそれぞれの判別係数を乗じた値の合計値に基づき β遮断薬反応性を予測する方法。

[5] 上記判別係数は、各遺伝子多型と β遮断薬反応性との関連を示す先のデータその他の情報を考慮して設定され、新たな情報に応じて適宜更新されることを特徴とする、請求項 4記載の方法。

[6] 請求項 1記載の方法において、 2以上の遺伝子多型に基づいて被検者の β遮断薬反応性を予測する方法であって、 2以上の遺伝子多型によって決定木を構成すると共に各遺伝子多型についてそれぞれの遺伝子型に対して固有の値を割り振り、各遺伝子多型の値を検査により決定した後、上記決定木にしたがって β遮断薬反応性を予測する方法。

[7] 請求項 3〜6のいずれか 1項に記載の方法を用いて、被検者の β遮断薬反応性予測をコンピュータに実行させる、 β遮断薬反応性予測用プログラム。

[8] 請求項 1記載の方法にぉ、て、遺伝子多型の検査は、被検者カも調製したゲノム

DNAを铸型にして、多型部位を挟む遺伝子領域を増幅する工程と、得られた増幅断片をもとに遺伝子型を決定する工程とを含む方法。

[9] 請求項 1記載の方法において、 DNAチップ等の遺伝子多型検査器具を用いて遺伝子多型を検査する方法。

[10] 請求項 9記載の方法に使用される、遺伝子多型検査用オリゴヌクレオチド。

[11] 請求項 1に記載される分子のヽずれかを標的 (創薬ターゲット)とした心機能改善薬のスクリーニング方法。

[12] 請求項 1から 6のいずれかに記載の方法による β遮断薬反応性を予測のために使用する遺伝子多型マーカー。

[13] 請求項 1から 6のいずれかに記載の方法による β遮断薬反応性を予測するための遺伝子多型の使用。

[14] 請求項 1から 6の、ずれかに記載の方法による β遮断薬反応性を予測して、前記 β遮断薬を投与する β遮断薬の投与方法。

[15] 請求項 1から 6のいずれかに記載の方法により β遮断薬反応性を予測して、 β遮断薬を投与するか否かを診断する診断方法。